REACTIVIDAD CRUZADA DE LAS PROTEÍNAS DE MYCOBACTERIUM SMEGMATIS CON SUEROS

POSITIVOS A TUBERCULOSIS BOVINA

M.C. Quevedo Rocha Gilberto1, Dra Gaxiola Camacho Soila Maribel2 , Dra. Enriquez Verdugo Idalia2 , Dr. López Pérez
Héctor2
1
Docente-Investigador del Centro de Bachillerato Tecnológico Agropecuario Núm. 261 de Villa Juarez, Navolato,Sinaloa
2
Docente-Investigador de la Facultas de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad autónoma de Sinaloa

INTRODUCCIÓN.
El éxito de Mycobacterium tuberculosis como patógeno deriva de su fácil adaptación al medio intracelular
de los macrófagos humanos (Mehrotra et al., 2014) La patogénesis de Mycobacterium tuberculosis
depende de la secreción de factores clave de virulencia, tales como el objetivo antigénico ESAT-6 Los
mecanismos de patogenicidad del complejo Mycobacterium tuberculosis se relacionan con su capacidad
de sobrevivir en un ambiente hostil dentro de los macrófagos. Al estar atrapadas en el interior de las
células del hospedero M. tuberculosis debe responder a las condiciones de carencia de nutrientes. Lo
que implica que se inducen determinadas proteínas, las cuales dependen del tipo de nutriente limitado
(Groat et al., 1986; Siegele y Kolter, 1992). Por lo que algunos aspectos de la patogenicidad son una
respuesta de supervivencia al agotamiento de nutrientes (Siegele y Kolter, 1992). De la misma manera
que la antigenicidad como se ha demostrado con la síntesis del antígeno b de 38 kDa que se induce bajo
la carencia de fosfato, lo que indica que la proteína está involucrada en el metabolismo del fosfato en M.
tuberculosis (Andersen et al., 1990), con la consecuente generación de antígenos que se reconocerán
por los mecanismos de defensa del hospedero, las funciones metabólicas que sirven para la adaptación a
las condiciones cambiantes hacen que varíe la antigenicidad de las micobacterias patógenas (Brodinet
al., 2004). Mientras que las micobacterias avirulentas como M. smegmatis, en un esfuerzo por sobrevivir
a las condiciones hostiles, pueden sacar una respuesta similar a M. tuberculosis en los hospederos
aunque sin prosperar por largos periodos, debido a que estas enzimas ortólogas no están adaptadas para
responder a las condiciones imperantes.Tal como se demuestra en M. smegmatis que induce una
activación sostenida de la proteína p38 o MAPKs(acrónimo en inglés: Mitogen-Activated Protein Kinases)
y la ERK½ (por sus siglas en inglés: Extracelular signal-Regulated Kinases) en los macrófagos derivados
de la médula ósea de ratón (Ganguly et al., 2007). La activación de MAPKs eleva los niveles de
producción de factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-α) durante la infección de M. smegmatis, a diferencia
de lo que sucede con la proteína MAPKs producida por las micobacterias del complejo M. tuberculosis
(Roach y Schorey, 2002; Yadav et al., 2004). En M. tuberculosis, las acciones de MAPKs permiten
manipular la apoptosis a nivel de las caspasas (Herbst et al., 2005; Li et al., 2006; Derrick y Morris, 2007).
Así como translocarse del fagosoma al citosol (van der Wel et al., 2007; MacGurn y Cox, 2007; Simeone
et al., 2012; De Leon et al., 2012). La virulencia de M. tuberculosis le permite evadir el TNF-α de los
macrófagos, que tiene una relación inversamente proporcional en las micobacterias apatógenas como M.
smegmatis, M. tuberculosis H37Ra y M. bovis BCG (Falcone et al., 1994). Estas diferencias en M.
tuberculosis son las que le permiten permanecer en el hospedero. Sin embargo, la actividad metabólica
de las micobacterias como M. smegmatis es similar a las del complejo M. tuberculosis (Reyrat y Kahn,
2001), aunque existen diferencias muy marcadas donde se han probado que los cambios
conformacionales dependientes del pH de MtbESAT-6 y MsESAT-6, en condiciones de pH ácido,
MtbESAT-6 experimenta un cambio conformacional significativo, que se caracteriza por una mayor
hidrofobicidad expuesta a disolvente, mientras que MsESAT-6 muestra poco cambio conformacional en
respuesta a la acidificación, demostrando que MtbESAT-6 posee una única actividad de interacción de la
membrana que no se encuentra en MsESAT-6 y estableció la utilidad de rigurosos enfoques bioquímicos
en la disección de la virulencia de M. tuberculosis (De león et al., 2012), sin embargo en condiciones de
limitación de nutrientes específicamente el fosforo si expresa el gen esat-6 (López et al., 2016). Aunado
a todos estos acontecimientos se determinarán los grupos de proteínas de M. smegmatis que presentan
reactividad cruzada con sueros de bovino positivos a tuberculosis.

DESARROLLO

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El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Parasitología de la Facultad de Medicina Veterinaria y
Zootecnia de la Universidad Autónoma de Sinaloa.
Expresión de proteínas
Preparación de los medios de cultivo, la cepa de M. smegmatis que se utilizó es la mc2 155, Cultivo de M.
smegmatis:
La cepa de M. smegmatis que se utilizó es la mc2155 tipo campo, se cultivó en un medio sólido 7H9
Middlebrook Broth (Difco TM), y Agar Bacto complementado con Tween 80 al 0.05% (v/v) y 0.2% de
glicerol. Las placas se incubaron a una temperatura de 37º C por 3 días.
Preparación de los medios de cultivo para el crecimiento de las micobacterias fue en medio líquido
Middlebrook Broth (Difco TM)
A partir de este medio se inoculó una sola colonia a un medio de cultivo líquido 7H9 Middlebrook Broth
(Difco TM), al cual se le agregó 0.05% (v/v) de Tween 80, 0.2% (v/v) de glicerol, por 30 hrs a 37º C con
un agitador orbital a (250 rpm) en frascos de 225 ml el cual contenía 150 ml en medio de cultivo líquido
por triplicado. El crecimiento se llevó a media fase logarítmica, con una densidad óptica de 0.6-0.8
(OD600). (densitómetro Fisher Scientific).
De este medio de cultivo se tomó una alícuota de 100 µl la cual las bacterias se transfirió a 150 ml de
medio de cultivo Hartman’s de Bont (HdeB) con y sin fósforo; se creció y se incubo a 37º C en agitación a
250 rpm en un agitador orbital por un periodo de por 96 hrs.
Preparación de los medios de cultivo HdB
La preparación de medio de cultivo Hartman’s de Bont (HdeB) se realizó a una concentración mínima de
glicerol de 27.4mM (0.2%, vol/vol) 0.05% de tween 80, (Smeulders et al., 1999) para el experimento
limitado 100X menor en Pi (HDB<Pi) se adicionó K2HPO4 a una concentración final de 8.90 mM (15.5mg
L-1 ) y NaH2PO4 a una concentración de 7.08 mM (85 mg L-1.) para reemplazar la pérdida de capacidad
amortiguadora se agregó ácido propanolsulfonico 3-(N-morfolino) (MOPS) 50 mM (Smeulders et al.,
1999). Finalmente se agregó 0.05% Tween 80 vol/vol y 10 ml de una fuente de elementos traza que se
diluyó previamente por separado y se aforó en un litro de agua destilada. Para la preparación de los
elementos traza, las sales se agregaron en el siguiente orden: diluir en 965 mL de H2O destilada: (EDTA
[0.01 g], MgCl2•6H2O [0.1 g], CaCl2•2H2O [1 mg], NaMoO4•2H2O [0.2 mg], CoCl2•6H2O [0.4 mg],
MnCl2•2H2O [1 mg], ZnSO4•7H2O [2 mg], FeSO4•7H2O [5 mg], CuSO4•5H2O [0.2 mg]). El pH del medio
de cultivo debe quedar a 7.0. (Smeulders et al 1999).
La preparación de medio de cultivo Hartman’s de Bont (HdeB) se hizo a una concentración mínima donde
se adiciono 2.0 g de (NH4)2SO4, por Litro-1 (la concentración final de 15 mM); glicerol 27.4 mM (0.2%,
vol/vol); K2HPO4 a 8.9 mM (1.55 g por Litro-1) y NaH2PO47.08 mM (0.85 g Litro-1). Finalmente se
agregó 0.05% Tween 80 vol/vol y 10 ml de una fuente de elementos traza se diluyo previamente por
separado para posteriormente aforarse en un litro de agua destilada. Para la preparación de los
elementos traza, las sales se agregaron en el siguiente orden: diluir en 965 mL de H2O destilada: (EDTA
[0.01 g], MgCl2•6H2O [0.1 g], CaCl2•2H2O [1 mg], NaMoO4•2H2O [0.2 mg], CoCl2•6H2O [0.4 mg],
MnCl2•2H2O [1 mg], ZnSO4•7H2O [2 mg], FeSO4•7H2O [5 mg], CuSO4•5H2O [0.2 mg]). El pH 7.0
(Smeulders, et al., 1999).
Después se obtuvo el paquete celular por centrifugación a 4000 rpm/10 min, y el sobrenadante se
precipitó en alcohol absoluto 1:1, por 24 h a -70° C. Después se centrifugaron a 20000 rpm 90 min a 4° C
para extraer las proteínas del sobrenadante. El concentrado de proteínas, se suspendió en solución
amortiguadora de fosfatos (PBS) a la cual se le agregó EDTA como inhibidor de proteasas. La
concentración de proteínas se estimó mediante el método de Bradford (1976).

Detección de proteínas de reacción cruzada (molecular cloning)

Inmuno dot: (dotblot)

Para detectar la reacción cruzada delas proteínas antigénicas se realizó una modificación
inmunodetección por Western Blot, donde las proteínas obtenidas tanto de sobrenadante como
precipitado una vez determinada la curva de calibración y haciendo los cálculos necesarios se determinó
los microgramos a utilizar para determinar los micro litros a gotear en membrana de nitrocelulosa una ves
inoculada la muestra en la membrana se incubó en leche descremada al 5% (Difco BD®) en 0.05% de
PBS-Tween 20 (PBS-T), por 1 h a temperatura ambiente, se enjuagaron con PBS-T 3 veces por 10 min y
se incubaron con 30 sueros de bovinos positivos a tuberculosis durante la noche a 4° C. Las membranas

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se lavaron 3 veces por 10 min en PBS-T. Posteriormente, las membranas se incubaron con proteína A
conjugada con peroxidasa durante 2 h y se lavaron 3 veces, por 10 min, con PBS-T. La reacción
antígeno-anticuerpo fue revelada por la reacción del peróxido de hidrógeno.

RESULTADOS

Se observa la reacción antígeno anticuerpo en cada una de las membranas utilizadas

FIG. 1.- resultados de proceso de Reacción de proteínas de Ms en sueros de bovinos positivos a Tb.

Existe un complejo de proteínas del sobrenadante expresadas en limitación de fósforo que son
reconocidas por sueros de bovinos positivos a tuberculosis.

LITERATURA CITADA.

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