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Mem Inst Oswaldo Cruz, Río de Janeiro, vol. 98 (1): 1-12, enero de 2003 1

¿Debería Trypanosoma cruzi llamarse complejo cruzi?

Una revisión de la diversidad de parásitos y el potencial de seleccionar
Población después del cultivo in vitro e infección en ratones
Rodolfo Devera, Octavio Fernandes / *, José Rodrigues Coura / +
Departamento de Medicina Tropical, Instituto Oswaldo Cruz-Fiocruz, Av. Brasil 4365, 21045-900 Río de Janeiro, RJ, Brasil
* Departamento de Patología, Facultad de Ciencias Médicas, Uerj, Rio de Janeiro, RJ. Brasil

La diversidad morfobiológica de Trypanosoma cruzi se conoce desde los primeros trabajos de Chagas en 1909. Varios
estudios posteriores confirmaron las diferencias morfológicas entre las cepas del parásito, que fueron aisladas de diferentes reservorios y
vectores, así como de seres humanos. A principios de los años sesenta, se encontraron diferencias antigénicas en la
cepas parasitarias de diversas fuentes. Estas diferencias, unidas a la observación de variaciones regionales de la
enfermedad, llevó a la propuesta del término complejo cruzi para designar al taxón T. cruzi. Desde entonces este protozoario ha
tipificados en distintos biodemas, zimodemas y linajes que fueron agrupados consensualmente en T. cruzi I, T. cruzi II
y en cepas no agrupadas. Caracterización genotípica de T. cruzi , realizada inicialmente por análisis de esquizodemas y
más recientemente mediante varias otras técnicas, ha mostrado una gran diversidad de cepas de parásitos. De hecho, T. cruzi es
formado por grupos de subpoblaciones heterogéneas, que presentan características específicas, entre ellas un histotropismo distinto. La
interacción de los diferentes clones infectantes del complejo cruzi y el huésped humano determinará la
morbilidad de la enfermedad.

Palabras clave: Trypanosoma cruzi - complejo “cruzi” - diversidad genética

Trypanosoma cruzi es un protozoario parásito que presenta 1998). Para estudiar el papel de la diversidad de parásitos en
dos hospederos alternos durante su ciclo de vida: insectos vectores de la patogenia de la enfermedad de Chagas, un estudio integral
la Familia Triatominae y vertebrados, incluyendo una amplia la caracterización de las poblaciones que se encuentran en la naturaleza es
variedad de mamíferos. Son hemoflagelados del Orden Kinetoplastida crucial.

que albergan una mitocondria diferenciada, el cinetoplasto,
correspondiente a una condensación de ADN situada en el interior
del orgánulo único y ramificado.
(Hoare 1964).
El taxón no está compuesto por una especie homogénea. En los
años sesenta, cuando las herramientas moleculares actuales fueron
no disponible, Coura et al. (1966) defendió el uso de la
término complejo “cruzi” para designar al protozoario, basado
sobre la variación morfológica, las características inmunológicas, la
virulencia distintiva y las diferencias en el patrón regional e individual
de la enfermedad de Chagas (Coura 1966). Hoy en día
se sabe que T. cruzi es una especie heterogénea que consta de
varias subpoblaciones del parásito que circulan entre varios
vertebrados salvajes y domésticos y
huéspedes invertebrados (Morel et al. 1986, Zingales et al. 1998).
Se han observado variaciones intraespecíficas entre T. cruzi basadas
en (i) el comportamiento biológico de las cepas
en animales de laboratorio, (ii) características bioquímicas de los
aislados, y (iii) características moleculares de las poblaciones (Bice
& Zeledón 1970, Petana & Coura 1974, Miles et al. 1977,
Melo y Brener 1978, Morel et al. 1980, Andrade 1985,
Araújo & Chiari 1988, Carneiro et al. 1991, Macedo y Peña
+ Autor de correspondencia. Fax: + 55-21-2280.3740. Correo electrónico:
coura@ioc.fiocruz.br
Recibido el 24 de junio de 2002
Aceptado el 25 de septiembre de 2002
Como T. cruzi está compuesto por poblaciones heterogéneas,
un mismo huésped puede estar infectado simultáneamente por
cepas diferentes. En este escenario, un concepto importante es el
clara existencia de clones más representativos, siendo
encontrado en varios huéspedes en diferentes áreas geográficas de
América Latina (Tybarenc & Brenière 1988, Lauria-Pires et al.
Alabama. 1996, 1977, Lauria-Pires & Teixeira 1996, Andrade &
Campos 1998, Andrade 1999). Hoy en día se sabe que
T. cruzi tiene una estructura poblacional clonal (Tibayrenc et al.
1986a, Tibayrenc & Ayala 1988, 1991). Esto explica la
existencia de organismos independientes con características
biológicas discretas que explican el hallazgo de un gran número de
clones en diferentes áreas geográficas (Tibayrenc & Brenière
1988).
Estudios recientes que utilizan herramientas moleculares demuestran que
estos clones principales de áreas endémicas podrían responder a
algunas manifestaciones clínicas y quimioterapia
respuesta (Campos & Andrade 1996, Andrade & Campos
1998, Andrade 1999).
Una hipótesis actual sugiere que (i) la heterogeneidad y (ii) la
multiclonalidad de una cepa determinan el tropismo tisular diferencial
y, en consecuencia, las variaciones en el
presentación clínica de la enfermedad (Andrade 1999). A
correlación entre la diversidad genética de T. cruzi y
su patogenicidad fue propuesta recientemente como el clonal
modelo histotrópico que se basa en los dos mencionados
(Macedo et al. 1992, Oliveira et al. 1998, 1999,
Macedo & Peña 1998).
Para caracterizar una cepa parásita utilizando las técnicas
actuales, es necesario aislar T. cruzi a través de
inoculación en animales de laboratorio, xenodiagnóstico y/o in vitro
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2 ¿Debería llamarse T. cruzi complejo cruzi? Rodolfo Devera et al.
cultura. Estos enfoques pueden conducir a la selección de un
subpoblación específica del parásito que estaba presente
en el inóculo original, que difieren de los del huésped
sangre o tejido. Además, debido al tropismo diferencial de las diversas
cepas, los clones circulantes y
por lo tanto disponible para hemocultivo puede ser diferente de
los que están causando la lesión tisular, soportando el
modelo histotrópico clonal de la enfermedad de Chagas (Macedo &
Peña 1998). Algunas pruebas experimentales refuerzan esta
propuesta (Andrade 1999) y se ha demostrado que los clones
en el tejido cardíaco de algunos pacientes resultó ser diferente de los
del esófago. Esto significa que diferentes genotipos de T. cruzi
presentan una distribución favorita en
tejidos de pacientes chagásicos crónicos, lo que sugiere que la
La variabilidad genética del parásito es uno de los principales
factores a la forma clínica de la enfermedad (Vago et al. 2000).
POR QUÉ DEBEMOS LLAMAR A T. CRUZI COMO T. CRUZI YO Y T.
¿ CRUZ II?
La diversidad genética de T. cruzi ha sido revelada por
marcadores enzimáticos (Miles et al. 1978, Miles 1983, Tibayrenc
& Ayala 1988), polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción
(RFLP) del ADN del cinetoplasto (Morel et al. 1980), cariotipos
moleculares (Henrikson et al. 1993), huellas dactilares de ADN
(Macedo et al. 1992) y por amplificación aleatoria.
análisis de ADN polimórfico (RAPD) (Steindel et al. 1993,
Tibayrenc et al. 1993). Alternativamente, cuando se utilizan marcadores
derivados de genes constitutivos, como el 24Sÿ
rRNA y los genes mini-exón, se revela un resultado diferente. Sobre la
base de estos dos objetivos, se ha observado
que T. cruzi se puede dividir en dos grandes bien definidos
grupos que coinciden con la dicotomía isoenzimática
propuesta a finales de los setenta y corroborada en la
noventa (Miles et al. 1977, 1980, Tibayrenc et al. 1993,
Souto et al. 1996, Fernández et al. 1998).
A la luz de esta dicotomía, las cepas de T. cruzi ahora están
clasificado en dos grandes grupos llamados T. cruzi I y T.
cruzi II, denominación surgida de un consenso alcanzado
por especialistas, quienes propusieron la unificación de las diversas
clasificaciones en función de distintos marcadores (Anónimo 1999).
T. cruzi I se observa principalmente en mamíferos salvajes y
triatominos silvestres, mientras que T. cruzi II se encuentra generalmente en
humanos (Fernandes et al. 1998, Zingales et al. 1998).
Fernández et al. (1999a) revelaron la presencia de ambos
grupos en el ciclo selvático del parásito y la asociación preferencial de
los principales linajes filogenéticos de T. cruzi
con diferentes anfitriones, lo que ilustra la complejidad del ciclo del
parásito en la naturaleza. Estos hallazgos han ayudado a comprender
cómo se conectan los ciclos selvático y doméstico y, por lo tanto, esta
nueva clasificación de T. cruzi
ha hecho importantes contribuciones a la definición de
la ecoepidemiología de la enfermedad de Chagas.
DIVERSIDAD BIOLÓGICA Y BIODEMAS
La caracterización adecuada de un determinado aislado de T.
cruzi es esencial para determinar el papel putativo que el
diferentes cepas pueden jugar en la patogénesis, geográfica
variación, presentación clínica y morbilidad de Chagas
enfermedad y también en las distintas tasas de curación después de
quimioterapia (OMS 1991).
Comportamiento biológico en animales de laboratorio, en su mayoría de
la Familia Muridae, es uno de los parámetros utilizados para
caracterizar las diferentes cepas de T. cruzi.
Aunque los experimentos realizados sobre la infección por T. cruzi
en modelos animales no reproducen fielmente la infección humana, el
ratón se ha utilizado ampliamente para estudiar varios aspectos de la
infección. El uso común de este
animal se justifica por (i) el tamaño pequeño, (ii) la gran disponibilidad,
(iii) fácil mantenimiento, y (iv) manipulación sencilla. El
el linaje del ratón también juega un papel importante y su elección
Depende del tipo de investigación que se lleve a cabo.
fuera. Las diferentes susceptibilidades y tasas de supervivencia
dependen del linaje del ratón y de la cepa utilizada del
parásito (Andrade 2000, Araújo-Jorge 2000).
La gran mayoría de las caracterizaciones biológicas
de cepas de T. cruzi se han realizado en estudios no isogénicos
Ratones suizos (Silva & Nussenzweig 1953, Andrade et al.
1970, 1985, Mello & Brener 1978, Andrade 1990). suizo
ratón pertenece a un grupo heterogéneo y por lo tanto
debe considerarse el mejor representante de las características de la
población humana de las zonas endémicas.
Sin embargo, otros linajes han sido utilizados para estudios de
caracterización (Bice & Zeledón 1970, Andrade et al.
1985, Araújo & Chiari 1988, Oliveira et al. 1993). Más
Recientemente, se ha enfatizado el uso de linajes isogénicos para
obtener infecciones estándar (Andrade 2000).
Sin embargo, esos linajes son más utilizados para estudios lógicos
inmunopáticos.
El comportamiento biológico de las cepas de T. cruzi se basa en
presentó virulencia y patogenicidad; por lo tanto, es esencial definir
estos conceptos. La virulencia es la capacidad de
el parásito se multiplique dentro de un huésped de laboratorio. La
patogénesis, por otro lado, se refiere a una forma más intrínseca y
característica constante del parásito y está relacionada con
la capacidad de producir lesiones tisulares y mortalidad
(Andrade 1985).
Muchos estudios de caracterización biológica han demostrado
que las cepas de T. cruzi provenientes de humanos,
reservorios y vectores de distintas regiones geográficas
muestran un comportamiento diferente en animales de laboratorio
(parasitemia, tropismo tisular y tasas de mortalidad) (Badinez
1945, Marca et al. 1949, Taliaferro y Pizzi 1955, Deane et al.
1963, Andrade & Magalhaes 1997). Este fenómeno es
influenciado por factores ambientales e inmunológicos,
virulencia, patogenicidad y posible selección de cepas
y clones después de interactuar con vectores y vertebrados
Hospedadores. La combinación de varios de estos factores podría
explicar la variabilidad en el comportamiento biológico de los
parásito (Andrade et al. 1970, Bice & Zeledón 1970,
Magallanes et al. 1996).
Vianna (1911) demostró que T. cruzi se podía encontrar en
distintos tejidos del huésped vertebrado, aunque el parásito prefiere
ciertos grupos celulares, según Baldinez
teorías en 1945. Desde entonces, otros autores demostraron
que el tropismo de cepa es una característica biológica importante a
considerar en animales de laboratorio (Andrade
et al. 1970, Bice & Zeledón 1970, Andrade 1974, Hanson
y Roberson 1974, Melo y Brener 1978).
Algunas cepas prefieren el tejido muscular (esquelético o cardíaco)
y se llaman miotrópicos, otros se llaman reticulotrópicos
cepas porque prefieren el mononuclear fagocítico
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Mem Inst Oswaldo Cruz, Río de Janeiro, vol. 98 (1), enero de 2003
células y hay un tercer grupo que prefiere otros tejidos
(sistema nervioso, reproductivo y otros) (Dias 1934,
Silva y Nussenzweig 1953, Taliaferro y Pizzi 1955, Andrade
& Andrade 1966, 1968, Watkins 1966, Andrade et al. 1970,
Bice & Zeledón 1970, Tay et al. 1973, Andrade 1974, Hanson
& Roberson 1974, Amaral et al. 1975, Melo y Brener 1978,
Lenzi et al. 1998).
El primer intento de agrupar cepas de T. cruzi se basó
en criterios morfobiológicos. Chagas (1909) observó la
presencia de parásitos circulantes de formas anchas y esbeltas.
Brener y Chiari (1963) y Brener (1965) confirmaron esto
hallazgo que demuestra que estas formas de distintas
stocks, circulan en ratones con diferentes porcentajes. El
las formas delgadas predominan en cepas de extrema virulencia
y tropismo a los macrófagos (Brener 1965, Andrade 1974).
Las formas anchas son más comunes en las cepas miotrópicas y
cepas de baja virulencia. Además, las formas delgadas son más
susceptible al sistema inmunitario del huésped (Brener & Chiari
1963, Brener 1969). Brener (1977) sugirió la clasificación de las
poblaciones en dos tipos polares basados en la morfología y el
tropismo tisular, describiendo un polo agresivo
representado por las cepas Y y un polo benigno ejemplificado por
la cepa CL. Es importante enfatizar que
estos son “elementos de caracterización” y no lo son, por
mismos, suficientes para clasificar las cepas de T. cruzi .
El principal problema con respecto a la caracterización
biológica es la comparación de las cepas que puede ser
extremadamente difícil si el análisis se hace stock por stock,
por su gran variedad. Teniendo en cuenta esta diversidad y
utilizando parámetros biológicos de la interacción ratón-parásito,
como parasitemia, morfología, tejido
tropismo y lesiones histopatológicas, tres grupos de T.
se propusieron cepas cruzi y se denominaron biodemas
(Andrade 1974).
El biodema I, cuyos prototipos son las cepas Y y Peruana,
consiste en un rápido crecimiento in vitro, alta
parasitemia y mortalidad de ratones, que se produce entre
el día 7 y 12 post-infección. Se presentan mayoritariamente
formas delgadas de tripomastigotes y presentan tropismo a los
macrófagos en la fase inicial de la infección. El São
La cepa Felipe es el prototipo de biodema II que presenta
una multiplicación lenta con picos de parasitemia irregular
entre el día 12 y 20 post-infección, período de
la mayor mortalidad. En la fase inicial de la infección,
predominan las formas anchas con un bajo porcentaje de formas
delgadas, así como el miotropismo, dañando el músculo cardíaco.
Biodeme III, cuyo prototipo es la cepa colombiana,
se multiplica lentamente con picos de parasitemia tardía entre
el día 20 y 30 después del inóculo y baja tasa de mortalidad -
alrededor del día 50 de la infección. Las formas anchas son
común, dañando especialmente el músculo esquelético. Además,
estos tipos biológicos corresponden a patrones específicos de
zimodemas (Andrade et al. 1983, Andrade &
Magallanes 1997).
CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA
Electroforesis de enzimas
La electroforesis enzimática utiliza extractos crudos y solubles
de un organismo para evaluar la actividad particular de una
proteína después de la electroforesis y la incubación con un
sustrato apropiado, revelando el producto de la actividad
3
a través de una reacción de color. En condiciones controladas, el
diferencias en la movilidad isoenzimática implican en genética
diferencias (Miles 1985, Miles y Cibulkis 1986). Los resultados se
analizan a través de una simple inspección visual o
través de procedimientos matemáticos, basados en tasas de
similitud o distancias genéticas (Ready & Miles 1980, Miles
1985, Miles y Cibulkis 1986).
Perfiles de electroforesis enzimática (alanina aminotransferasa,
ALAT y aspartato aminotransferasa, ASAT)
fueron introducidos para el estudio de los tripanosomas
simultáneamente por Kilgour y Godfrey (1973) y Bagster y
Parr (1973), quien logró clasificar a los tripanosomes africanos en
especies y subespecies.
Para los tripanosomas del Nuevo Mundo, Toyé (1974) fue el
primero en utilizar isoenzimas, observándose diferencias entre T.
muestras cruzadas . Millas et al. (1977, 1978, 1980, 1981a, b)
realizaron varios estudios sobre la variabilidad de isoenzimas entre T.
cruzi del nordeste de Brasil y, posteriormente, de
diferentes regiones de este país, empleando seis enzimas:
ALAT, ASAT, glucofosfato isomerasa (GPI), glucosa
6 fosfato deshidrogenasa (G6PDH), enzima málica (ME)
y fosfoglucomutasa (PGM), determinando la existencia
de dos grupos diferentes de cepas denominadas zimodemas 1
(Z1) y 2 (Z2).
Zymodeme 1 marsupiales agrupados y triatominos salvajes
stocks y aislamientos domésticos agrupados Z2 derivados de
humanos y mamíferos domiciliados. Estudios adicionales
mostró un tercer zimodema (Z3), también asociado con ambientes
silvestres. La diversidad en Z2 es especialmente clara,
aunque esta heterogeneidad se encuentra en los tres
zimodemas (Miles et al. 1977, 1980). Esta agrupación fue
confirmado además por la taxonomía numérica (Miles et al. 1978,
Barret et al. 1980, Ready & Miles 1980).
Romanha (1982) y Carneiro et al. (1990) extendido
el análisis de electroforesis enzimática multiloci (MLEE)
(ocho enzimas - ALAT, ASAT, ME, PGM, G6PD, GPI, 6-
fosfato deshidrogenasa - 6PGD, y malato deshidrogenasa - MDH),
clasificándose los aislados en cuatro grupos isoenzimáticos
diferentes (ZA, ZB, ZC y ZD), identificando un
zimodema que alberga las cepas salvajes (ZB) y otro
una característica del ciclo de transmisión nacional de
el parásito denominado ZA que correspondía al Z2 antes
mencionado (Miles et al. 1980).
Tibayrenc y Ayala (1988) analizaron la actividad enzimática
perfil de 645 muestras de T. cruzi utilizando 15 loci. Las muestras
variado en su origen geográfico y había sido aislado
de un gran número de triatominos y vertebrados
Hospedadores. Se detectó una alta variabilidad genética y se
identificaron 43 zimodemas distintos, denominados alternativamente
clones. Basado en los hallazgos del mismo clon en distantes
áreas geográficas, los autores propusieron una estructura
poblacional clonal para T. cruzi.
La gran heterogeneidad de cepas de T. cruzi de distintos
hospederos y países de América Latina, a través de MLEE
ha sido descrito (Tibayrenc & Miles 1983, Miles et al.
1984, Bogliolo et al. 1985, Saravia et al. 1987, Carneiro et al.
1991, Montamat et al. 1992, Solari et al. 1992, Rodríguez et al.
Alabama. 1998, Araújo 2000, Pinho et al. 2000, Acosta et al. 2001)
y los perfiles isoenzimáticos asociados a otros parámetros, tales
como (i) manifestaciones clínicas y geográficas
(Barrett et al. 1980, Apt et al. 1987, Brenière et al.
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4 ¿Debería llamarse T. cruzi complejo cruzi? Rodolfo Devera et al.

1989, Montamat et al. 1996, Andrade & Magalhaes 1997,
Rodríguez et al. 1998, Acosta et al. 2001), (ii) biológica
comportamiento (Andrade et al. 1983, Carneiro et al. 1990, 1991,
Gómez et al. 1991, Steindel et al. 1995, Andrade y
Magalhães 1997, Araújo 2000), (iii) resistencia a la quimioterapia (Castro-
Silva et al. 1989) y (iv) marcadores moleculares (Solari et al. 1992,
perfiles diferentes cuando estas cepas se mantienen en animales de
laboratorio o en cultivo in vitro, ya que estas condiciones
podría favorecer la selección de subpoblaciones del parásito (Morel et
al. 1980, 1986, Deane et al. 1984a, b, Gonçalves
et al. 1984, Carneiro et al. 1990, Gomes et al. 1991, Alves y
Alabama. 1994).

Steindel et al. 1993, Tibayrenc et al.

Gen mini-exón
1993, Lauria-Pires et al. 1996, Fernández et al. 1997, Brisse
En cuanto al ADN nuclear, existen varias herramientas moleculares
et al. 1998, 2000, Jaramillo et al. 1999). Sin embargo, usando disponibles para caracterizar las cepas de T. cruzi . El
MLEE no se ha encontrado hasta ahora una correlación clara, con
El gen mini-exón (ME) está presente en el genoma nuclear de
el resultado clínico de la enfermedad de Chagas (Barrett et al. 1980,
la Kinetoplastida en cerca de 200 ejemplares dispuestos en
Apto et al. 1987, Brenière et al. 1989).
secuencias repetidas en tándem, que consisten en tres
La estabilidad de las isoenzimas de T. cruzi también ha sido
regiones: exón, intrón y región intergénica. El exón es un
se han descrito objetivos de investigación por parte de varios grupos y
Secuencia de 39 pb, altamente conservada entre los componentes.
resultados no coherentes. Aunque la estabilidad del perfil enzimático,
de la Orden, añadiéndose post-transcripcionalmente a todos
especialmente cuando se clona
ARN mensajero nuclear (ARNm). El intrón está moderadamente
se estudian las poblaciones, se ha observado (Dvorak et al.
conservado entre las especies del mismo género o
Alabama. 1980, Miles y Cibulkis 1986, Gomes et al. 1991), también se
subgénero y la región intergénica o no transcrita
han evidenciado variaciones. Por lo tanto, se puede concluir que el perfil
spacer (NTS-ME) es particularmente diferente entre las especies. En
isoenzimático no siempre es estable
relación con T. cruzi en particular, una hipervariable
(Romanha et al. 1979, Romanha 1982, Goldberg & Pereira
La mancha del NTS-ME se puede amplificar a través de la reacción en
1983, Tanuri y Almeida 1984, Bogliolo y Godfrey 1987,
cadena de la polimerasa (PCR), lo que permite clasificar diferentes
Carneiro et al. 1990).
aislados en los dos grupos taxonómicos principales.
De hecho, incluso cuando se utilizan clones, los resultados pueden ser
- T. cruzi I y T. cruzi II (Fernandes 1996, Souto et al.
discordante. Campos y Andrade (1996) estudiaron clones
1996, Fernández et al. 1998). Un enfoque más práctico
y subclones de las cepas 21SF que muestran perfiles estables. Por otro
recientemente se propuso tipificar cepas de T. cruzi mediante una PCR
lado, Gomes et al. (1991) observó
multiplex basada en el NTS-ME, permitiendo determinar si
homogeneidad isoenzimática en algunos clones y heterogeneidad en
un cierto aislamiento es T. cruzi I, T. cruzi II, T. cruzi Z3 o T.
otros. Goldberg y Pereira (1983) y Montamat
rangeli (Fernandes et al. 2001).
et al. (1997) también observaron variaciones isoenzimáticas en
poblaciones clonadas. Alves et al. (1993) enfatizó la Análisis RAPD
posibilidad de cambios reversibles en los perfiles enzimáticos en Diferencias entre las cepas, su diversidad genética.
Cepas de T. cruzi mantenidas en cultivo in vitro durante un largo período. o variabilidad, se revelan fácilmente mediante el uso de RAPD
análisis, que demostró ser una herramienta útil para
Análisis de esquizodema
tripanosomátidos y otros parásitos protozoarios (Dias Neto
La biología molecular contribuyó con varias técnicas
et al. 1993, Steindel et al. 1993, 1994, Tibayrenc et al. 1993,
enfoques, que permitieron la identificación y clasificación de cepas y
Gómez et al. 1995, Fernández et al. 1997, Urdaneta et al.
clones, sin necesidad de
2001). Desde su introducción en 1990, esta técnica ha
aislamiento y cultivo de los parásitos (Sturm et al. 1989,
Se ha utilizado en estudios de taxonomía y tipificación de
Ávila et al. 1991, Veas et al. 1991, Brenière et al. 1992, Vago
microorganismos. Es una técnica mediada por PCR que utiliza cortos
et al. 1996, Andrade et al. 1999, Bosseno et al. 2000). Sin embargo, el
cebadores de secuencias aleatorias, que pueden amplificar fragmentos
uso de poblaciones cultivadas de parásitos para
anónimos del ADN diana, generando múltiples
La extracción de ADN es una limitación que todavía se enfrenta en la mayoría de los
patrones de bandas que pueden ser específicos de la cepa. Las ventajas
técnicas moleculares, que conducen a una eventual selección de
de esta técnica son (i) el requisito de mínimo
clones presentes en la mezcla original.
cantidades de ADN diana, (ii) la aceptación de un número ilimitado de
Una de las técnicas que sí requiere previamente
cebadores, (iii) ningún requisito de
parásitos cultivados es el RFLP del genoma mitocondrial (ADN
conocimiento de las secuencias a amplificar (Welsh &
cinetoplasto - ADNk) o análisis de esquizodemas.
McClelland 1990, Willians et al. 1990, Steindel et al. 1993).
El RFLP del kDNA fue introducido por primera vez por Mattei et al.
En cuanto a T. cruzi, el análisis RAPD se juzga como un
Alabama. (1977) para la clasificación intrínseca de los tripanosomas.
herramienta útil para obtener marcadores de ADN altamente variables,
Más tarde, Morel et al. (1980) empleó este método para
estableciendo relaciones genéticas entre los aislados (Dias Neto et al.
genotipado de cepas de T. cruzi y propuso el término
Alabama. 1993, Steindel et al. 1993, Tibayrenc et al. 1993, Souto y
esquizodema para referirse a grupos de parásitos que presentan la
Alabama. 1996, Fernández et al. 1997, Basrenta y Brenière 1998,
mismo RFLP del kDNA. Esta técnica se basa en la
Brisse et al. 1998, 2000, Murta et al. 1998). Aunque los perfiles de
separación electroforética de fragmentos de restricción de la
banda complejos se pueden evidenciar individualmente, cuando
ADNk. Desde entonces, ha sido ampliamente utilizado (Deane et al.
estos patrones se analizan numéricamente, se observa
1984a, Carreño et al. 1987, Gomes et al. 1991, Mimori et al.
que T. cruzi, como taxón, se puede dividir en dos principales
1992, Solari et al. 1992, Alves et al. 1994, González et al.
(Tibayrenc 1995, Souto et al. 1996, Murta et al.
1995, Jaramillo et al. 1999).
1998, Brisse et al. 2000). Estos dos grupos corresponden a
Aunque se consideran marcadores estables, la alta heterogeneidad
los principales linajes filogenéticos del parásito coinciden con T. cruzi I
de algunas cepas puede conducir a la observación de
y II (Steindel et al. 1993, Tibayrenc et al.
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1993, Tibayrenc 1995, Souto et al. 1996, Fernández et al.
1997, Brisse et al. 1998, 2000, Murta et al. 1998).
Utilizando el análisis RAPD, Carrasco et al. (1996) reconocieron
que en México, diversas poblaciones pertenecientes a
Circulaban Z2 y Z3 (Miles et al. 1980). Steindel et al.
Alabama. (1994) también confirmaron la utilidad del análisis RAPD sis
para diferenciar T. cruzi y T. rangeli, un
Tripanosoma del Nuevo Mundo de varias regiones de América
America.
Tipificación de región interna (RFLP-ITS rDNA)
Los genes del ARN ribosómico (ARNr) (ADNr) son altamente
conservado y tiene potencial para el análisis filogenético
de tripanosomátidos. En estos protozoos, el ADNr se encuentra
como secuencias repetidas. Las regiones codificantes de los grandes
y las subunidades pequeñas están separadas por espaciadores
transcritos internos (ITS) que flanquean el gen rRNA 5.8S. El
Los ITS presentan secuencias de gran variabilidad y como
están flanqueados por segmentos altamente conservados, es posible
para diseñar cebadores de PCR que hibridan en estas últimas regiones
(Cupolillo et al. 1995, Fernandes et al. 1999b). cupolillo y
Alabama. (1995) estandarizaron, utilizando Leishmania como modelo, la
RFLP del ITS rDNA, que se denominó tipificación de regiones
intergénicas (IRT). Los productos amplificados corresponden a
el gen 5.8S rRNA más los dos ITS que lo flanquean.
La variación en las secuencias de los ITSs rDNA demostró
que la metodología fue capaz de distinguir entre las especies de
Leishmania ( Cupolillo et al. 1995). Este método fue
adaptada y aplicada a la caracterización molecular de
Cepas de T. cruzi (Fernandes et al. 1999b). Los resultados preliminares
mostraron que el RFLP-ITS rDNA es poderoso para distinguir la
variabilidad intraespecífica en T. cruzi. También permitió el agrupamiento
geográfico de los aislamientos pertenecientes
a T. cruzi II (Santos et al. com. pers.) y confirmó
la división del taxón en dos grupos principales.
Mendonça et al. (2002) analizaron recientemente la genética
diversidad entre las poblaciones Z3 de la Amazonía brasileña utilizando
el enfoque RFLP-ITS rDNA, lo que demuestra que tales aislamientos
podrían dividirse en dos subgrupos con distintas
orígenes filogenéticos (Kawashita et al. 2001).
Microsatélites
Los microsatélites son una clase de ADN repetitivo de matriz en
tándem, en general alrededor de 1 a 6 pb, que son
dispersos en el genoma eucariótico. Se pueden clasificar según el
número de bases y por eso se denominan
mononucleótidos, dinucleótidos, trinucleótidos, tetranucleótidos,
pentanucleótidos y hexanucleótidos (Weber 1990). Su número de
copias de la unidad repetida en un
loci específicos es extremadamente polimórfico y la variación en el
número de repeticiones también ocurre entre los alelos.
La tasa de mutación de los microsatélites varía de
10-6 a 10-2 (Harr et al. 2000). Esta tasa cambia en consecuencia
al número de repeticiones en la matriz (Bachtrog et al.
2000, Xu et al. 2000).
Debido a este polimorfismo, los microsatélites son considerados
los marcadores de elección con grandes aplicaciones en áreas
biomédicas como la ecología, la genética de poblaciones y
reconstrucción filogenética (Oliveira et al. 1998, Hawley
y Mori 1999, Bachtrog et al. 2000, Harr et al. 2000).
La principal estrategia empleada en el análisis de
El polimorfismo de microsatélites es la amplificación por PCR de
5
los loci, utilizando un par de cebadores específicos que flanquean el
segmento que contiene las repeticiones, con más análisis de
el tamaño de los fragmentos generados (Hawley & Mori 1999).
Para T. cruzi, se ha utilizado el análisis de microsatélites para
estudios de genética de poblaciones, reconstrucción filogenética,
y definir la clonalidad de una determinada cepa (Oliveira et al.
Alabama. 1998, Macedo et al. 2001). La metodología fue desarrollada
originalmente por Oliveira et al. (1998) como un basado en PCR
técnica que amplifica loci polimórficos de microsatélites,
con repeticiones de citosina-adenina (CA) del genoma de T. cruzi . Una
biblioteca genómica de la cepa CL Brener, enriquecida
Se utilizaron 15 veces para repeticiones de CA y 17 microsatélites
(CA) se seleccionaron n donde n > 6, de los cuales 8 fueron
polimórfico.
La metodología se incrementó aún más con la
uso de cebadores fluorescentes para la PCR y análisis de los
fragmentos amplificados en secuenciador automático determinando
el tamaño de los alelos (Oliveira et al. 1998). Este enfoque
mostró claramente que las cepas de T. cruzi son diploides y
multiclonal (Oliveira et al. 1998, 1999).
Las cepas que presentan uno o dos picos (uno o dos
alelos, correspondientes a diploides) se consideran monoclonales. La
aparición de más de dos picos en diferentes loci, es indicativo de que
más de una población está
presente (policlonalidad). Oliveira et al. (1998, 1999) observaron que la
mayoría de las cepas aisladas de enfermedades crónicas
los pacientes chagásicos son clonales mientras que los de no humanos
hosts tiene multiclonal.
Selección de poblaciones de T. cruzi : el papel de los vertebrados
anfitriones y medios de cultivo
Los aislamientos de T. cruzi se componen de poblaciones
heterogéneas del parásito y el cultivo in vitro y animales
la inoculación puede seleccionar ciertas subpoblaciones de esta mezcla
(Deane et al. 1984a, b, c, Gonçalves et al. 1984, Lamel
et al. 1985, Miles y Cibulkis 1986, Morel et al. 1986, Aguiar
2002).
Estos “filtros” podrían seleccionar aquellas poblaciones o
clones más aptos para el nuevo entorno. En el
caso de cultivo in vitro, esta selección se puede lograr
cambiando la composición de los nutrientes en el medio. En huéspedes
vertebrados, el sistema inmunitario puede tener un
papel importante en este fenómeno (Lana et al. 1996,
Oliveira et al. 1998).
Infección animal
El mantenimiento a largo plazo de T. cruzi en laboratorio
animales conduce a alteraciones en las características biológicas de
la cepa original. En cuanto a la virulencia, por ejemplo, la
los resultados son impares: informes de declinación (Menezes, 1970a, b,
Brener et al. 1974, Schlemper jr. 1982, Araújo 2000) y
intensificación (Schlemper Jr. 1982, Carneiro et al. 1991)
Son descritos.
Veloso et al. (1996) informaron una disminución en el T. cruzi
virulencia después del mantenimiento a largo plazo en perros. Lana y
Chiari (1986) describió resultados similares en ratones y perros,
comparando la cepa Berenice original y otra cepa
aislado del mismo paciente 16 años después.
Existen claras evidencias que avalan la selectiva
Papel del huésped vertebrado. Informes de cambios en los perfiles de
enzimas de isoen y en el RFLP del kDNA después de animales
la inoculación de un aislado son comunes (Deane et al. 1984a,
Machine Translated by Google
6 ¿Debería llamarse T. cruzi complejo cruzi? Rodolfo Devera et al.
b, c, Morel et al. 1986, Carneiro et al. 1990, Alves et al.
1993, Lauria-Pires et al. 1996, Lauria-Pires & Teixeira 1996,
Santana et al. 1998).
Morell et al. (1986), luego de mantener a T. cruzi en C3H
ratones durante 18 meses, observó que 5 de 13 cepas
cambiaron sus isoenzimas y RFLP del perfil de kDNA,
confirmando la selección de subpoblaciones del parásito. Después de
infectar ratones con dos cepas diferentes de T. cruzi ,
Dean et al. (1984a, b, c) pudo reaislar solo uno de ellos.
También confirmaron el potencial del huésped vertebrado,
en este caso marsupial, en la selección de subpoblaciones del
parásito cuando se evidencian cambios en el esquizodema
análisis. Más recientemente, luego de mantener la Munantá
cepa en ratones Balb/c, Santana et al. (1998) detectó que
de 9 de las enzimas estudiadas, solo una presentó variación.
Cultivo in vitro
El cultivo in vitro a largo plazo de T. cruzi conduce a
la disminución de la virulencia e infectividad de la cepa
a animales de laboratorio y este fenómeno ha sido explicado por la
selección de subpoblaciones que se adaptan mejor a los medios de
cultivo in vitro (Goble 1951, Pizzi
& Prager 1952b, Caballero y collares 1965, Lambbrecht
1965, Bice & Zeledón 1970, Chiari et al. 1973, Chiari 1974a,
b, Postan et al. 1983, Deane et al. 1984a, Magalhaes et al.
1985, Alves et al. 1993, Contreras et al. 1994).
Pizzi y Parger (1952a) inocularon secuencialmente, C3H
ratones con formas de cultivo de T. cruzi , cada 10 días durante 6 años,
y observó la disminución de la infectividad corroborada por la
ausencia de parasitemia tras las últimas infecciones. Caballero
y Collares (1965) demostraron que la cepa Y presenta
sus características biológicas cambiaron después del cultivo in vitro.
Menezes (1970a, b) y Chiari (1974a, b) observaron una
disminución de la infectividad y virulencia de una cepa de T. cruzi
después de un mantenimiento a largo plazo en medios de cultivo.
Algunas poblaciones se desarrollan mejor que otras en
sistemas in vitro, lo que resulta en modificaciones en el perfil genético
original (Engel et al. 1982). Clones con un corto
el tiempo de duplicación puede ser seleccionado por cultivo en
la segunda cuando tenía 71 años. Los zimodemas
comparación con aquellos que presentan un tiempo de duplicación largo (Mangia
1995).
Contreras et al. (1994) mantuvieron dos cepas de T. cruzi
durante tres años, con sucesivos pasajes en culturas,
detectándose después de este período que la metaciclogénesis había
reducida, disminuyendo la virulencia.
Lima et al. (1995) estudiaron tres clones de un stock aislado de un
marsupial naturalmente infectado, que se mantuvieron durante cuatro
años en medio LIT con pases mensuales, y compararon su cinética de
crecimiento y su tiempo de duplicación. Los parámetros estudiados se
consideraron
no estables y no deben utilizarse como marcadores biológicos,
enfatizando que el cultivo in vitro selecciona T. cruzi
subpoblaciones.
Rodríguez et al. (1998) examinaron siete cepas de T. cruzi
aislado de diferentes hospederos en Colombia. Uno de ellos
presentó cuatro perfiles distintos de electroforesis enzimática
de 13, después de ser mantenido durante 35 pases in vitro.
El cultivo in vitro a largo plazo es determinante de las alteraciones
fenotípicas - disminución de la infectividad, virulencia y
cambios en los perfiles de electroforesis enzimática, y también de
modificaciones genotípicas, como cambios en el RFLP de
el ADNk (Romanha et al. 1979, Romanha 1982, Goldberg
& Pereira 1983, Tanuri & Almeida 1984, Morel et al. 1986,
Bogliolo & Godfrey 1987, Carneiro et al. 1990).
Alves et al. (1993) observaron diferentes isoenzimáticos
perfiles en distintos clones de la cepa Y de T. cruzi que fueron
sometidos a cultivo in vitro a largo plazo. Posteriormente, fue
comprobó que estos cambios fueron seguidos por alteraciones
en el RFLP del kDNA. Este fenómeno se llama
transkinetoplastid (Alves et al. 1994) y consiste en rápido
cambios en la población de minicírculos de kDNA que conducen a
diferentes perfiles de restricción. El fenómeno transcinetoplástido se
observó principalmente en células clonadas de Leishmania amazonensis
sometidas a selección de fármacos y se juzga
ser reversible. Probablemente, los componentes del medio de cultivo
interfieren con la transcripción de ciertos genes, regulando actividades
esenciales de los minicírculos de ADNk, que
Las transcripciones son necesarias para la mitosis adecuada (Lee et al.
1992).
infección humana
Forma aislada de cepas de T. cruzi , diferentes triatominos,
y se ha demostrado que los huéspedes vertebrados son poblaciones
multiclonales (Dvorak 1984, Murfin et al. 1985, Morel et al. 1986,
Oliveira et al. 1998, 1999). En un paciente chagásico crónico,
estas poblaciones pueden seleccionarse durante el largo T humano.
interacción cruzi y tropismo tisular diferencial
puede interferir con la distribución de las subpoblaciones
(Vago et al. 2000). Esto justifica el hallazgo común de población
homogénea aislada de enfermedades crónicas.
pacientes chagásicos (Gomes et al. 1998, Oliveira et al. 1999)
en comparación con las poblaciones aisladas durante las fases agudas
y de componentes del ciclo selvático (triatomino
y mamíferos) (Morel et al. 1980, Fernandes et al. 1997,
Oliveira et al. 1998, Solari et al. 1998).
Berenice, el primer caso humano de enfermedad de Chagas, puede
ejemplifican un claro papel selectivo que desempeña el huésped
humano. Se aislaron dos poblaciones de T. cruzi de
esta paciente: la primera cuando tenía 55 años y
y los perfiles de esquizodemes fueron diferentes entre ellos
(Lana et al. 1996) y podría atribuirse a una reinfección
con una nueva cepa del parásito o por la presencia de una población
heterogénea en el paciente desde el primer aislamiento. La interacción
a largo plazo de Berenice y T. cruzi
promovió la selección de una población diferente de T. cruzi
así lo evidenciaron las diferencias encontradas en el segundo stock.
No hay correlación entre la variabilidad genética de los
parásito con el resultado clínico de la enfermedad ha sido
establecido. Probablemente el entendimiento si un paciente
ser asintomáticos o presentar la forma cardiaca o digestiva
de la enfermedad sólo será posible con la completa
caracterización del parásito y de la compleja relación humano-parásito
que se evidencia en la enfermedad de Chagas
facilitar.
complejo "cruz"
Los diferentes enfoques biológicos y moleculares que
se han utilizado para estudiar T. cruzi han mostrado la diversidad de los
distintos aislamientos del parásito. El reciente
Machine Translated by Google
Mem Inst Oswaldo Cruz, Río de Janeiro, vol. 98 (1), enero de 2003
La propuesta de definir dos grupos para designar los principales
linajes filogenéticos de los protozoos, con base en varias dianas
moleculares, ha recibido el apoyo de la comunidad científica. Sin
embargo, todavía hay puntos que deben abordarse, como el Andrade SG, Carvalho ML, Figueira R 1970. Caracterización
origen filogenético de Z3 y la importancia de los híbridos genéticos.
El concepto de complejo “cruzi”, propuesto por Coura et al.
(1966) debería revitalizarse no como una nomenclatura
taxonómica sino como una forma clara de representar la
diversidad que se encuentra en el taxón T. cruzi.
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