Fis conecta dos vías sensoriales, la de quórum y la de superficie, para controlar la motilidad en

Vibrio parahaemolyticus

El factor de estimulación de la inversión (Fis) es un regulador global que se expresa en gran

medida durante el crecimiento en fase exponencial y es indetectable en el crecimiento en fase
estacionaria. La detección del quórum (QS) es un mecanismo regulador global que controla la
expresión de los genes en respuesta a los cambios en la densidad celular y la fase de crecimiento.
En Vibrio parahaemolyticus, una especie marina y un importante patógeno humano, los ARNs
reguladores del QS, Qrr1 a Qrr5, se expresan durante el crecimiento exponencial y regulan
negativamente el regulador maestro del QS de alta densidad celular OpaR. OpaR es un regulador
positivo de la formación de polisacáridos de la cápsula (CPS), que se requiere para la formación de
biopelículas, y es un represor de los flagelos laterales necesarios para la motilidad de enjambre. En
V. parahaemolyticus, demostramos que Fis es un regulador positivo de la expresión de los ARNs
qrr. En un mutante de deleción de Fis dentro del marco, la expresión de qrr fue reprimida y la
expresión de opaR fue inducida. El mutante Δfis produjo CPS y biofilm, pero la motilidad de
enjambre quedó abolida. Además, el mutante con deleción de fis era más sensible a la polimixina
B. La motilidad de enjambre requiere la expresión del operón scrABC de detección de superficie y
del operón laf de flagelos laterales. Nuestros datos mostraron que en el mutante Δfis los genes laf
y scrABC estaban reprimidos. Fis controla la motilidad de enjambre indirectamente a través de la
vía QS y directamente a través de la vía de detección de superficie. Para determinar los efectos de
Fis en el metabolismo celular, realizamos ensayos de competencia de crecimiento in vitro, y
descubrimos que Δfis era superado por el tipo salvaje en medios mínimos suplementados con
moco intestinal como única fuente de nutrientes. Los datos mostraron que Fis modulaba
positivamente los componentes del moco L-arabinosa, D-gluconato y la expresión génica del
catabolismo de la N-acetilD-glucosamina. En un ensayo de competencia de colonización in vivo,
Δfis fue superado por el tipo salvaje, lo que indica que Fis es necesario para la aptitud. En general,
estos datos demuestran un papel regulador global de Fis en V. parahaemolyticus que incluye la EQ,
la motilidad y el metabolismo.

El factor de estimulación de la inversión (Fis) es una proteína asociada al nucleoide (NAP) que
tiene dos funciones principales en las bacterias, la organización del cromosoma y la regulación de
los genes (Azam et al., 1999; Ishihama, 2010). Fis, junto con otras NAPs, es un importante
regulador de la expresión de ribosomas, ARNt y ARNr (Bokal et al., 1997; Auner et al., 2003;
Schneider et al., 2003; Dennis et al., 2004). Como regulador transcripcional, puede actuar tanto
como activador como represor de un gran número de genes (Keane y Dorman, 2003; Kelly et al.,
2004; Browning et al., 2005; Grainger et al., 2006). Como activador, Fis puede unirse directamente
a la ARN polimerasa para afectar a la transcripción, o controlar indirectamente la transcripción a
través del superenrollamiento del ADN en los promotores (Bokal et al., 1997; McLeod et al., 2002;
Auner et al., 2003; Cróinín et al., 2006). Fis controla la topología del ADN regulando las girasas del
ADN (gyrA y gyrB) y la topoisomerasa I del ADN (topA), necesaria para el superenrollamiento
negativo del ADN en Escherichia coli y Salmonella enterica (Schneider et al., 1999; Keane y
Dorman, 2003; Weinstein-Fischer y Altuvia, 2007). En las especies entéricas, Fis demostró ser un
regulador global que respondía a las fases de crecimiento y al estrés abiótico (González-Gil et al.,
1996; Goldberg et al., 2001; Kelly et al., 2004; Browning et al., 2005; Bradley et al., 2007; Lautier y
Nasser, 2007; Steen et al., 2010; Zhang et al., 2012; Wang et al., 2013; Lv et al., 2018). En E. coli,
Fis es una de las proteínas más abundantes, altamente expresada en células de fase exponencial
temprana y ausente en células de fase estacionaria, en condiciones de crecimiento aeróbico
(Osuna et al., 1995; Mallik et al., 2004). Fis se une a sitios específicos, aunque con una
conservación de secuencia limitada (Finkel y Johnson, 1992). Fis es conocida como una proteína
estructuradora de nucleoides que provoca la flexión del ADN, permitiendo cambios en la expresión
génica (Finkel y Johnson, 1992; Bétermier et al., 1994; Skoko et al., 2006). Los estudios de todo el
genoma han mostrado más de 1.000 picos de unión para Fis en E. coli que controlan una quinta
parte de los genes cromosómicos (Grainger et al., 2006; Cho et al., 2008; Kahramanoglou et al.,
2011). También se ha demostrado que muchas regiones reguladoras contienen múltiples sitios de
unión a Fis (BS; Hengen et al., 2003; Shao et al., 2008), que a veces se superponen. El análisis
genético, bioquímico y estructural en E. coli de los sitios de unión de alta afinidad de Fis ha
demostrado la presencia de una secuencia central de 15 pb flanqueada por pares de bases G/C
(posición -7) y C/G (posición +7) con una región central rica en A/T (posición 0) (Cho et al., 2008;
Shao et al., 2008; Kahramanoglou et al., 2011; Hancock et al., 2016).

En E. coli y S. enterica, los estudios han demostrado que Fis puede controlar la virulencia, la
motilidad y el metabolismo (González-Gil et al., 1996; Kelly et al., 2004; Grainger et al., 2006;
Bradley et al., 2007). Estos estudios identificaron 100 s de genes cuya expresión in vivo es
potenciada o reprimida por Fis. En S. enterica, los genes del flagelo polar, y los genes dentro de
varias islas de patogenicidad, se expresaron diferencialmente entre un mutante de Δfis y el tipo
salvaje (Osuna et al., 1995; Cróinín et al., 2006; Wang et al., 2013). En el patógeno de las plantas,
Dickeya zeae, una cepa mutante de Δfis mostró un total de 490 genes significativamente regulados
por Fis (Ouafa et al., 2012; Prigent-Combaret et al., 2012; Lv et al., 2018). En Vibrio cholerae, se ha
demostrado que Fis modula la expresión de los ARNs reguladores no codificantes de detección de
quórum (Qrr), qrr1 a qrr4 (Lenz y Bassler, 2007). La detección de quórum (QS) es un término
utilizado para describir la comunicación bacteriana mediada por señales químicas que permite a
las bacterias controlar la expresión génica global en respuesta a los cambios de densidad celular
(Nealson et al., 1970; Fuqua et al., 1994; Gray et al., 1994; Bassler et al., 1997; Bassler, 1999; Miller
y Bassler, 2001; Swift et al., 2001; Miller et al., 2002). En V. cholerae, se propuso que Fis actúa
junto con el regulador de respuesta QS LuxO, un activador del factor sigma-54, para transcribir los
cuatro sRNAs qrr1 a qrr4. Los sRNAs Qrr reprimieron el regulador maestro de la QS de alta
densidad celular (HCD) HapR y activaron el regulador de la QS de baja densidad celular (LCD)
AphA. En un mutante Δfis de esta especie, los sRNAs qrr fueron reprimidos y hapR se expresó a
niveles de tipo salvaje (Lenz y Bassler, 2007). Este es el único otro estudio que examina el papel de
Fis entre las especies de Vibrio. Vibrio parahaemolyticus es un halófilo marino y la principal causa
de gastroenteritis bacteriana transmitida por los mariscos en todo el mundo, con una mayor
incidencia de la infección debido al cambio climático (Nair et al., 2007; Su y Liu, 2007; Froelich y
Noble, 2016; Froelich y Daines, 2020). Una infección por V. parahaemolyticus causa diarrea
inflamatoria y sus principales factores de virulencia son dos sistemas de secreciones de tipo 3 y sus
proteínas efectoras (Makino et al., 2003; O'Boyle y Boyd, 2014; Kodama et al., 2015; De Souza
Santos y Orth, 2019; Miller et al., 2019). A diferencia de V. cholerae que solo produce un único
flagelo polar, V. parahaemolyticus produce tanto un flagelo polar como flagelos laterales
expresados desde los loci Flh (Fli) y Laf, respectivamente (Belas et al., 1986; McCarter et al., 1988;
Stewart y McCarter, 2003). El flagelo polar, necesario para la motilidad natatoria, se produce en
células cultivadas en medio líquido y está bajo el control del factor sigma RpoN (σ54) y su
activador FlaK, y del factor sigma FliAP (σ28). Los flagelos laterales, necesarios para la motilidad de
enjambre en superficies sólidas, están bajo el control de RpoN y su activador LafK, y un segundo
factor σ28 FliAL (McCarter y Wright, 1993; Stewart y McCarter, 2003; Jaques y McCarter, 2006;
Gode-Potratz et al., 2011; Kernell Burke et al., 2015)

La interrupción de rpoN suprime toda la motilidad,

mientras que la supresión de cualquiera de los dos factores sigma σ28, FliAP

(FliA) o FliAL, suprime la natación y el enjambre, respectivamente

(Stewart y McCarter, 2003; Whitaker et al., 2014). En general,

el control de la motilidad en el sistema flagelar dual de V.

parahaemolyticus difiere significativamente de los sistemas monoflagelares

de las especies entéricas (Klose y Mekalanos, 1998; McCarter, 1999;

Prouty et al., 2001). Anteriormente, se demostró que la motilidad y el metabolismo

la motilidad y el metabolismo bacterianos requieren una vía QS funcional en

V. parahaemolyticus (Kalburge et al., 2017). En esta especie, se

En esta especie, se demostró que la supresión del regulador de la respuesta QS luxO

provocaba la represión de los cinco genes qrr y la expresión constitutiva

expresión de opaR (el homólogo de hapR). El mutante ΔluxO

tenía una motilidad de natación reducida, pero la motilidad de enjambre fue

de enjambrazón, mientras que el mutante ΔopaR era hipermóvil y

y enjambrazón (Kalburge et al., 2017). El regulador de la EQ OpaR es

es un represor directo del operón laf, necesario para la síntesis del flagelo

de los flagelos laterales y la motilidad de enjambre (Güvener y McCarter, 2003;

Jaques y McCarter, 2006; Gode-Potratz y McCarter, 2011;

Kernell Burke et al., 2015). OpaR es un activador de la cps

operón, necesario para la formación de polisacáridos capsulares (CPS), un componente importante

de la biopelícula (McCarter, 1998; Boles y McCarter, 2002; Kim y McCarter, 2007; Kalburge et al.,
2017). Además, los estudios han demostrado que el operón de detección de superficie scrABC de
V. parahaemolyticus activa la motilidad de enjambre y reprime la formación de CPS mediante la
reducción de los niveles intracelulares de c-di-GMP (Boles y McCarter, 2002; Ferreira et al., 2008;
Trimble y McCarter, 2011). Una deleción del operón scrABC induce altos niveles de c-di-GMP que
reprimen el operón laf e inducen la expresión del gen cps (Boles y McCarter, 2002; Ferreira et al.,
2008; Trimble y McCarter, 2011). El programa regulador de la colonización de superficie (Scr) en V.
parahaemolyticus contiene un centenar de genes, 70 de los cuales están implicados en la
motilidad de enjambre y 30 genes implicados en la formación de biopelículas que son controlados
por los niveles intracelulares de c-di-GMP (Boles y McCarter, 2002; Kim y McCarter, 2007; Gode-
Potratz y McCarter, 2011; Ferreira et al., 2012). Además, la EQ también puede modular los niveles
de c-di-GMP para controlar el comportamiento de enjambre (Gode-Potratz et al., 2011). Aquí,
caracterizamos el papel de Fis en V. parahaemolyticus, un halófilo marino y patógeno
gastrointestinal. Este trabajo muestra que Fis conecta las vías de señalización de la EQ y de la
superficie en esta especie para controlar la motilidad de los enjambres. Determinamos el patrón
de expresión de fis a lo largo de la curva de crecimiento y construimos un mutante de deleción de
Δfis dentro del marco para examinar su papel en la fisiología de V. parahaemolyticus. Por ejemplo,
el mutante fis produjo más cápsula y fue más sensible al péptido antimicrobiano polimixina B.
Demostramos un papel de fis en la vía QS, específicamente su modulación de los cinco sRNAs
reguladores no codificantes, qrr1 a qrr5, así como el regulador maestro QS HCD, OpaR. Se
determinaron los efectos de una deleción de Fis en la motilidad de natación y enjambre y se
descubrió un papel esencial de Fis en la motilidad de enjambre. Los ensayos de unión al ADN y los
ensayos de reportero de proteína verde fluorescente (GFP) demostraron la regulación por Fis de
los genes qrr sRNA, el operón del flagelo lateral laf y el operón scrABC de detección de superficie.
Realizamos ensayos de competencia de crecimiento in vitro y un ensayo de colonización in vivo
entre el mutante Δfis y una cepa WT de lacZ knock-in, WBWlacZ, para demostrar un efecto de
aptitud cuando se elimina fis. Además, nuestros datos muestran que Fis modula positivamente la
expresión de los genes del metabolismo de la L-arabinosa, el D-gluconato y la N-acetil-D-
glucosamina (NAG). Este estudio demuestra que Fis integra las vías de la EQ y de la detección de
superficies para controlar la motilidad de los enjambres y es importante para el control del
metabolismo y la aptitud in vivo.
MATERIAL Y METODOS.