Efecto de la manipulacin del fotoperodo en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss ), la calidad del huevo: Un estudio genmico

E. Bonnet- un , J. Montfort una , D. Esquerre b , K. Hugot b , A. Fostier una , J. Bobe una ,

el b

INRA, UR1037 SCRIBE, IFR 140, Ouest-Genepole, F-35000, Rennes, Francia INRA, DGA, UMR 314, CRB GADIE, Jouy en Josas, F-78350, Francia

http://dx.doi.org/10.1016/j.aquaculture.2007.04.027 , Cmo citar o enlazar Usando DOI Permisos y reimpresiones

Abstracto
El propsito de este estudio fue investigar el efecto de desove avanzada fotoperiodo en la calidad del huevo y huevo transcriptome. La experimentacin se realiz con 2 grupos de la trucha arco iris ( Oncorhynchus mykiss ) de una cepa de otoo-desove. En 2003, un primer grupo de mujeres fue expuesto, despus de su primer desove natural, a un rgimen de fotoperodo largo -corto a partir de enero (grupo manipulado fotoperodo, PM de grupo, n = 17), resultando en una segunda reproduccin en junio-julio. Un segundo grupo de hembras logra su primera reproduccin en el otoo (2003) y se utiliz como control ( n = 25). Para cada uno, la calidad del huevo hembra se evalu por la supervivencia de monitoreo mirando a (E) y la resorcin de saco vitelino (YSR), as como la aparicin de malformaciones en YSR. Se observ una disminucin significativa de la calidad de los huevos en el grupo AM. La supervivencia a mirando era 49 18% (media IC del 95%) en el grupo PM, mientras que se observ un 3% de supervivencia a 93 en el grupo control. En YSR, las frecuencias de alevines vivos que presentan ningn tipo de malformacin notable fueron 37 16% en el grupo de PM y 84 5% en el grupo de control. Este aumento de la mortalidad se asoci con una mayor variabilidad individual entre las hembras y un aumento de malformaciones observadas en alevines vivos.Estas malformaciones se caracterizan sobre todo por defectos de saco vitelino resorcin (48% de malformaciones observadas en PM grupo). El anlisis de transcriptoma se ha realizado mediante microarrays de nylon que muestran 9.152 trucha arco iris cDNA manchado. Anlisis diferencial permiti la identificacin de 6 genes significativamente menos abundantes en los huevos PM que en los huevos de control. Estos

resultados sugieren que la manipulacin del fotoperiodo de la fecha de desove puede inducir defectos significativos calidad del huevo. Por otra parte, el transcriptoma del ovocito no fertilizado parece estar influida por perturbaciones ambientales, como el rgimen de fotoperodo, y parece ser el reflejo de la capacidad de desarrollo de huevo despus de la fertilizacin.

Palabras clave
Fotoperodo ; La calidad del huevo ; Malformaciones ; Microarray ; MRNA materna ;

Oncorhynchus mykiss

1. Introduccin
Calidad de los huevos de pescado se puede definir como la capacidad de vulo para ser fertilizado y para dar lugar posteriormente al desarrollo de un embrin normal. No slo las tasas de mortalidad en diferentes etapas de desarrollo embrionario y larval, sino tambin malformaciones larvas deben tenerse en cuenta para evaluar plenamente la calidad del huevo ( Brooks et al., 1997 para una revisin). En la naturaleza, o en condiciones de cra, las variaciones en la calidad del huevo son considerables ( Bromage et al., 1992 ).Mejoras del conocimiento de las diferencias seran de gran valor econmico para los criaderos ( Lee, 2003 ). La mayora de los datos dedicados a la calidad del huevo de pescado es complejo debido al uso de condiciones experimentales variables y los tratamientos de los reproductores. Adems, la calidad del huevo se ha estudiado principalmente en relacin con las variaciones de las caractersticas del huevo intrnsecas, tales como antecedentes genticos ( Su et al., 1997 ), la composicin del huevo ( Craik y Harvey, 1984 y Craik, 1985 tamao), o huevo ( Springate y Bromage, 1985 ). De hecho, muchos estudios han tratado de vincular composicin yema y el xito en el desarrollo observada despus de la fertilizacin ( Kjrsvik, 1994 y Brooks et al., 1997 para una revisin). Sin embargo, aparte de algunos parmetros bioqumicos relacionados con las actividades metablicas ( Lahnsteiner y Patarnello, 2004 ), el posible papel de los componentes citoplsmicos no yolky acumula durante la ovognesis, tales como las protenas estructurales y reguladoras, el contenido de grnulos corticales y mRNAs (ARNm), ha recibido mucha menos atencin (Brooks et al., 1997 ). Sin embargo, los ARNm maternos son esenciales para el desarrollo embrionario temprano ( Dworkin y Dworkin-Rastl, 1990 y Nagler, 2000 ). Al igual que en otros animales, algunos mRNAs

materna estn involucrados en las clulas germinales embrionarias formacin en el pescado ( Hashimoto et al., 2004 ), pero otros ARNm de ovocitos, como los que participan en la regulacin del crecimiento, podran ser necesarias para garantizar un desarrollo temprano normal ( Yang et al., 1999 ). Por lo tanto, en los embriones de dos clulas de la especie bovina, una relacin entre el embrin competencia de desarrollo, evaluada en trminos de tiempo de la primera hendidura, y se inform de la expresin de ARNm de IGF-1 (Lonergan et al., 2000 ). Adems, otros estudios mostraron una relacin entre la variacin de los niveles maternos de poliadenilacin de ARN y la competencia de desarrollo de oocitos de mamferos, lo que apunta a una relacin entre la estabilidad del mRNA materna y la capacidad de desarrollo embrionario ( Brevini et al., 2002 ). Las variaciones de los factores intrnsecos, por ejemplo yema de composicin, se han planteado la hiptesis de que se correlaciona con los efectos significativos de factores externos, tales como la dieta hembra durante la ovognesis. Hasta ahora, los dos ms estudiados factores externos han sido constitucin y disponibilidad de alimentos durante la vitelognesis ( Izquierdo et al., 2001 ). Se cree que influyen en la calidad del huevo a travs de la yema de construcci n de los componentes, y por lo tanto a travs de las tiendas trficos utilizados durante el desarrollo temprano. Muchos otros factores extrnsecos tales como los regmenes de fotoperodo ( Taranger et al., 1998 ), el estrs ( Schreck et al., 2001 ), la temperatura del agua (Davies y Bromage, 2002 ), la induccin o sincronizacin de la ovulacin ( Gillet et al., 1996 y ARABACI et al., 2004 ), el exceso de la maduracin de los huevos ( Springate et al., 1984 ) podra actuar a travs de la alteracin de la composicin del huevo y, especialmente, de los componentes citoplsmicos no yolky. En efecto, la posibilidad de que los ARNm especficos tambin pueden verse afectados por factores externos se ha sugerido seriamente por un trabajo previo tratar con el efecto de huevo envejecimiento postovulatorio en los niveles de mRNA de muchos genes (~ 40) en huevos de trucha arco iris ( Aegerter et . al, 2005 ). Estudios previos llegaron a la conclusin de que la calidad de la trucha arco iris gametos no parece verse afectada por las manipulaciones de fotoperiodo ( Bromage et al., 2001 ). Sin embargo, estos trabajos se centraron en el impacto de las manipulaciones fotoperiodo sobre la fecundidad femenina. En efecto, mientras que el peso de ovocitos, nmero y tamao se utilizaron para caracterizar cada desove, no se realiz la estimacin de las capacidades de desarrollo de huevo. Debido al amplio uso de esta tcnica en acuicultura para manipular la fecha de desove, el presente estudio tiene como objetivo (1) explorar el efecto de la manipulacin del fotoperodo en la trucha arco iris y la calidad de los huevos (2) el anlisis de los posibles vnculos entre el transcriptoma huevo y capacidades de desarrollo despus de la fertilizacin . A tal efecto, la trucha arco iris de una cepa de otoo-desove fueron expuestos a un rgimen fotoperodo utilizado en piscifactoras para obtener una reproduccin avanzada durante el comienzo del verano. El desarrollo embrionario se control con especial inters para la supervivencia mirando en (E) y en la resorcin etap as del saco vitelino (YSR). Malformaciones

morfolgicas notables observados en YSR tambin fueron monitorizados cuidadosamente. Al mismo tiempo, para cada hembra, huevo transcriptome se analiz mediante la trucha arco iris cDNA microarrays.

2. Materiales y mtodos
2.1. Animales
Hombres y mujeres de la trucha arco iris de una cepa de otoo -desove se celebraron bajo fotoperiodo natural hasta su primera reproduccin en el INRA granja experimental (Sizun, Francia). Para el experimento, se realizaron los peces en 4 m 3 tanques suministrados con el ro Elorn agua resultante en un rango de temperatura de 7-18 C ( Fig. 1 ). Todos los peces recibieron una dieta similar.

. Figura 1. Efecto del fotoperodo en poca de desove de la trucha arco iris hembra de una cepa de otoodesove. Los dos paneles inferiores muestran los regmenes de fotoperiodo (curva) y el nmero de hembras en desove (barras) en el grupo control ( n = 25) y el grupo de fotoperodo manipulada (PM grupo, n = 17). El panel superior (T) muestra la temperatura del agua, que es la temperatura del ro (Elorn, Francia, lnea continua) hasta que la transferencia a un sistema de agua reciclada de la PM (lnea discontinua) y de control (lnea de puntos) grupos. Opciones Figura

Manipulado grupo Fotoperodo (PM): Despus de una primera reproduccin en el otoo de 2002, los peces fueron aisladas en los tanques a prueba de luz para ser expuestos a un fotoperiodo artificial en 2003. A partir del 15 de enero, se celebraron los peces bajo una luz constante (24L: 0D) de 490 C el da. Comenzando el 27 de marzo, se celebr a continuacin, bajo fotoperiodo corto (8L: 16D) hasta la ovulacin (1230 C el da).Luz fue suministrado por 4 tubos de nen (58 W). Grupo control: Las mujeres y los hombres lograron su primera reprod uccin en otoo de 2003.

2.2. Recogida de gametos

Tres a cuatro semanas antes de la ovulacin se esperaba, los peces de los dos grupos se transfiri a un sistema de recirculacin de agua a 12 C en las instalaciones de INRA (Rennes, Francia) ( . Fig. 1 ). Para ambos grupos, un descenso progresivo de la temperatura del agua (0.5 C / da) se realiz con el fin de alcanzar los 12 C. Cada pez se pes y etiquetada de forma individual. Antes de cada manipulacin, los peces fueron anestesiados en 0,05% 2 -fenoxi-etanol. Las hembras fueron revisadas para la ovulacin 3 veces a la semana. Cinco das despus de la ovulacin detectada, los huevos se recogieron en tubos de plstico estriles de 50 mL por el manual de extraccin. Dos lotes de 5 ml de los huevos (aproximadamente 100 a 200 huevos por grupo) se utilizaron para la fertilizacin, mientras que 10 lotes de 20 huevos no fertilizados se c ongelaron en nitrgeno lquido y se almacenaron a - 80 C hasta el anlisis posterior transcriptmica. En cada da de recoleccin de huevos, las muestras de semen se obtuvieron de 10 machos adultos con el fin de fertilizar los huevos con una piscina de esperma. Despus de la eliminacin de la orina de la vejiga de la orina, las muestras de esperma fueron cuidadosamente obtenerse a travs de presin manual sobre el abdomen y se mantuvieron a 4 C antes de su uso.

2.3. La fertilizacin y el desarrollo temprano

La fertilizacin se realiz como se ha descrito previamente con modificaciones menores ( Aegerter et al., 2004b ). Brevemente, inmediatamente antes de la fertilizacin, se descart el fluido celmico y los huevos se lavaron con 5 ml de 10 C Ovafish solucin de lavado (IMV, L'Aigle, Francia). Despus de la eliminacin de solucin de lavado (. Mediante el vertido de los huevos en un colador de plstico), 5 l de un espermatozoide se pipetearon en los huevos, y 5 ml de solucin de 10 C Actifish (activacin de la motilidad del esperma solucin salina; IMV, L'Aigle, se aadieron inmediatamente Francia). El esperma utilizado fue un grupo proveniente de 10 machos diferentes. Despus de 5 min, Actifish se dren y los huevos fertilizados fueron transferidos en bandejas de incubacin compartimentadas suministrados por agua recirculada (10 C). La temperatura del agua y la qumica se monitorizaron de forma rutinaria y se mantienen constantes durante todo el perodo de incubacin. Huevos muertos y los embriones fueron retirados peridicamente y las tasas de supervivencia se expresaron como porcentajes del nmero inicial de

huevos utilizados para la fertilizacin. La supervivencia a los mirando (150 C da) y la finalizacin de la reabsorcin de saco vitelino (YSR, 550 C da) fueron monitoreados. La ocurrencia de malformaciones morfolgicas notables de torsin (la mdula espinal, la cabeza o malformaciones aleta caudal, etc) en YSR se expres como un porcentaje de alevines vivos presentes en YSR. Se expres el nmero de alevines vivos y normal (ANA) en YSR como un porcentaje de huevos fertilizados. Adems, la ocurrencia de tipos especficos de malformaciones fue grabado en YSR. Datos sobre la calidad del huevo se analizaron estadsticamente mediante Khi -dos pruebas. El nivel de significacin utilizado en todas las pruebas fue p <0,05.

2.4. La extraccin de RNA

Las extracciones se realizaron como se ha descrito previamente ( Aegerter et al., 2004b ) con modificaciones menores. El ARN total se extrajo a partir de 20 huevos no fertilizados usando 9 ml de Trizol (Invitrogen) en tubos de polipropileno de 13 ml estriles. Cada extraccin de RNA fue seguido por una purificacin en columna (Macherey Nagel, Francia) con el fin de obtener la calidad del ARN genmico de grado. Para cada muestra de huevo, se obtuvieron, se reunieron y se precipitaron con acetato de sodio (3 M, pH 5,2) para aumentar la concentracin de ARN tres extractos de ARN. Por lo tanto, cualquier muestra de ARN utiliza para el anlisis de transcriptmi ca se origin a partir de 60 huevos no fecundados de una hembra individual.

2.5. cDNA microarrays

Microarrays de nylon (7,6 2,6 cm) se obtuvieron de INRA-GADIE (Jouy-en-Josas, Francia) el centro de recursos. Un conjunto de 9152 la trucha arco iris cDNA clones procedentes de una biblioteca combinada de tejido ( Aegerter et al., 2004a ) fueron vistos despus de la amplificacin por PCR. Los productos de PCR fueron vistos en Hybond N + membranas como se ha descrito previamente ( Nguyen et al., 1995 ). Los controles positivos (luciferasa) y negativo (agua) tambin fueron vistos en cada microarray.

2.6. Hibridacin
Cuatro muestras de ARN procedentes del grupo de control y 14 muestras de ARN procedente de la PM grupo se utilizaron para la hibridacin de microarrays de acuerdo con el siguiente procedimiento. Una primera hibridacin se realiz utilizando un oligonucletido marcado con 33P (que est presente en la extremidad de cada producto de PCR) para estimar la cantidad de ADNc en cada punto. Despus de extraccin (3 h 68 C, 0,1 X SSC, 0,2% SDS), hibridaciones se llevaron a cabo como se ha descrito previamente ( Bertucci et al., 1999 ), con modificaciones menores, en el INRA IFR140 instalacin transcriptmica (Rennes). Brevemente, las matrices se hibridaron previamente durante 1 hora a 65 C en solucin de hibridacin (5X solucin de

Denhardt, 5X SSC, 0,5% SDS). Sondas de cDNA marcadas se preparan a partir de 3 g de ARN por transcripcin inversa simultnea y etiquetado durante 1 hora a 42 C en presencia de 50 Ci [alfa33P] dCTP, 5 mM dCTP, 0,8 mM de cada dATP, dTTP, dGTP y 200 unidades de M-MLV superndice RNasa H-transcriptasa inversa (Gibco BRL) en 30 l volumen final. ARN fue degradado por tratamiento a 68 C durante 30 min con 1 l 10% de SDS, 1 l de EDTA 0,5 M y 3 l de NaOH 3 M, y despus se equilibr a temperatura ambiente durante 15 min. La neutralizacin se llev a cabo mediante la adicin de 10 l 1 M Tris-HCl adems de 3 l de HCl 2 N. Las matrices fueron incubadas con los correspondientes ADNc marcadas desnaturalizadas durante 18 horas a 65 C en solucin de hibridacin. Despus de 3 lavados (1 h 68 C, 0,1 X SSC 0,2% SDS), arrays fueron expuestos 65 horas a las placas de fsforo de imgenes que luego fueron escaneados utilizando un FUJI BAS 5000. Intensidades de seal se cuantificaron utilizando el software ArrayGauge (Sistemas FujifilmMedical, de Stanford, CT).

2.7. Microarrays de anlisis de datos

El procesamiento de seales se lleva a cabo utilizando los datos de oligonucletidos del vector para corregir la cantidad relativa de ADN presente en cada lugar. En este paso, las seales de oligonucletidos bajas (inferiores a tres veces el nivel de fondo) fueron excluidos del anlisis. Despus de la correccin, la seal se normaliz dividiendo cada valor de la expresin gnica por el valor de la mediana de la matriz. Los datos se normalizaron posteriormente por el algoritmo ms bajo ( Cleveland, 1979 ) antes de ser analizados utilizando el software estadstico SAM ( Tusher et al., 2001 ).

3. Resultados
3.1. Ovulaciones
Las hembras del fotoperodo manipulada (PM) grupo ( n = 17) ovularon en junio y julio, 3 meses antes que el grupo control ( n = 25). Se observ el pico de la ovulacin en julio en lugar de noviembre para el grupo de control ( . Fig. 1 ). En el momento de la ovulacin, los pesos corporales de peces fueron mayores en el grupo de PM que en el control (2620 300 g vs 1.810 260 g, media SD).

3.2. La calidad del huevo en los grupos de control y PM

3 Los parmetros utilizados para evaluar la calida d del huevo mostraron diferencias significativas entre los 2 grupos. En mirando, PM grupo exhibi un 49 18% (media IC del 95%) la supervivencia embrionaria, mientras que un 93 3% ( p <0,001, puntos en la Fig. 2. A) se observ

la supervivencia en el grupo de control. Esta diferencia aument an ms al saco vitelino resorcin (YSR). El porcentaje de alevines vivos que no presentan malformaciones notables (ANA, vivo y alevines normal) fue de 37 16% para el grupo de PM, mientras que se observ un 5 ANA porcentaje 84 para el grupo control ( p <0,001, puntos en la figura. 2 Un ). Frecuencia de alevines con formato incorrecto tambin fue mayor para el grupo de PM (15 8%) que para el grupo de control (5 2%, puntos en la figura. 2 B).

. Figura 2. Comparacin de los parmetros de calidad de huevo entre el control ( n = 25) y el fotoperiodo manipulados (PM, n = 17) grupos. A - diagrama de caja de supervivencias mirando a (190 C da) y vivo y alevines normal (ANA) en el saco vitelino resorcin (YSR, 550 C da) expresada como un porcentaje de huevos fertilizados. B - diagrama de caja de malformaciones morfolgicas como porcentaje de alevines vivos en YSR. Opciones Figura

En YSR, la distribucin de tipos de malformaciones fue ligeramente diferente entre los dos grupos ( . Fig. 3 A y B). Las abundancias relativas de malformaciones como una torsin de la mdula espinal, un defecto prognate u otras malformaciones conocidos no fueron significativamente diferentes entre PM y los grupos de control ( Fig. 3 A). Sin embargo, Cclope se observaron slo en el grupo de control. Adems, se observ una mayor proporcin de YSR incompleta (48%) en el grupo de PM, aunque no significativamente diferente del control ( p = 0,057).

. Figura 3. Los tipos especficos de malformaciones morfolgicas observadas en alevines vivos al saco vitelino resorcin (550 C el da). A - malformaciones especficas como porcentaje de alevines vivos en el grupo control y el fotoperodo manipulada (PM) de grupo. B - Descripcin de los 6 tipos de malformaciones morfolgicas identificadas: C, Cyclops. SCT, la torsin mdula espinal. DYSR, defecto en la reabsorcin del saco vitelino. P, prognate. Opciones Figura

En contraste con el grupo de control, se observaron grandes diferencias en trminos de calidad de los huevos entre las 17 hembras utilizados en el grupo de PM ( Fig.. 2 ). De hecho, la supervivencia mirando vari de 0% a 99%. Estas diferencias se incrementaron an ms en el YSR. En esta etapa, el porcentaje ANA permiti la identificacin de 3 sub-grupos en PM grupo ( Fig.. 4 A). Un primer sub-grupo de 7 hembras mostr una proporcin de ANA que van desde 0% a 8%. Un segundo subgrupo de 6 hembras mostr una proporcin de ANA que van desde 29% a 44%. Un ltimo sub-grupo de 5 hembras mostr una proporcin de ms del 71% de ANA.

. Figura 4. Representacin de la supervivencia individual y las malformaciones observadas en el saco vitelino-resorcin (550 C el da) en el fotoperodo manipulada (PM) de grupo. A - alevines vivos y normal (ANA) como un porcentaje de huevos fertilizados. B - malformaciones morfolgicas como porcentaje de alevines vivos a YSR en grupos extremos (alto y bajo).

Opciones Figura

3.3. Anlisis de microarrays

Entre los 9.216 puntos, 8.422 mostraron intensidades significativamente ms altas que el fondo. 85% de las secuencias (7134 clones) presenta alguna similitud con genes ya conocidos en la trucha arco iris o de otras especies. Las secuencias restantes (1288 clones) no mostr homologa significativa con otras secuencias registradas en bases de datos pblicas. El anlisis estadstico entre PM y los grupos de control con plomo a la identificacin de 6 ARNm significativamente ms abundantes en las muestras de control que en las muestras PM (Tasa de Falso Descubrimiento 15%). Despus de la identificacin de los clones correspondientes, secuencias fueron blasted contra la base de datos GenBank NR para identificar Descripcin de golpe gen ( Tabla 1 ).
. Tabla 1 Las transcripciones que muestran una menor abundancia en el grupo manipulado fotoperodo relacin con el control (la tasa de falso descubrimiento: 15%) GenBank adhesin # CA377449 BX886170 CA353335 CA351681 BX080208 CA381309 Descripcin de Hit (especies) Hit acceso # NP_955844 AAC59668 CAF96769 AAN59951 XP_691908 AAF74720 AA% de identidad de secuencia 92% 90% 78% 75% 67% 51% NGLY1 TPH1 Smbolo La abundancia relativa 0.65 0.61 0.37 0.67 0.66 0.64

Amino-cido N sub-unidadacetiltransferasa ( Danio rerio ) Precursor glucagn II ( trucha arco iris ) Producto proteico Sin nombre (Tetraodon nigroviridis ) El triptfano hidroxilasa 1 ( Danio rerio ) Protena predicha ( Danio rerio ) Pptido: N -glicanasa ( Homo sapiens )

MAK10 GLP2

Adhesin GenBank nmeros correspondientes de la trucha arco iris cDNA clones se muestran. Despus BlastX contra la base de datos NR: Descripcin de xito, nmero de afectados, y el smbolo de identidad de secuencia se muestran. Opciones de tabla

4. Discusin
4.1. El momento de la ovulacin
En el presente estudio, se observ que un rgimen de fotoperodo largo -corto, cuando a partir de enero, indujo un desove avanzada ocurren entre junio y julio en lugar de octubre a noviembre en las condiciones de control. Resultados similares se inform anteriormente despus de un rgimen de fotoperodo largo corto en esta especie ( Bromage et al., 2001 ) y otros ( Takashima y Yamada,

1984 y Carrillo et al., 1989 ). El fotoperiodo es conocido por ser el principal factor ambiental controlar el tiempo de maduracin y el desove en la trucha arco iris. Ms exactamente, el momento del desove sera dependiente del arrastre de un ritmo circanual endgeno o reloj por el cambio fotoperidico ( Bromage et al., 1992 y Bon et al., 1999 , para una revisin). Por lo tanto, nuestras observaciones estn en total acuerdo con estos estudios previos.

4.2. Supervivencia embrionaria

En el presente estudio, un rgimen de fotoperodo largo-corto indujo claramente una disminucin de la supervivencia embrionaria en las dos etapas estudiadas: mirando (E) y el saco vitelino resorcin (YSR).Adems, se observ un aume nto importante en la calidad del huevo heterogeneidad entre las hembras en el grupo de PM. En el presente trabajo se estudi la calidad del huevo en dos grupos de diferentes edades y diferentes pesos celebrado en las mismas condiciones de temperatura. En efecto, las hembras del grupo PM eran mayores y exhibieron mayor peso corporal que las hembras del grupo de control. Sin embargo, no se observ correlacin entre el peso de los peces y la calidad de los huevos en cualquiera de los dos grupos experimentales. Si bien se ha demostrado que el tamao del huevo se correlacion con el peso del cuerpo femenino, nunca se observ ninguna relacin significativa entre el tamao del huevo y de la calidad del huevo ( Springate y Bromage, 1985 , Knox et al., 1988 , Bromage et al., 1992 y Estay et al., 1994 ).Nuestras observaciones son por lo tanto, en buen acuerdo con los datos existentes. Por lo tanto, puede ser la hiptesis de que el peso corporal hembra tena poca o ninguna influencia en la calidad de los huevos en comparacin con el principal efecto de la manipulacin del fotoperodo en la calidad del huevo. Adems, las mujeres fueron recogidas durante la primera poca reproductiva en el grupo control y durante la segunda temporada reproductiva en el grupo AM. Estudios previos en la trucha arco iris manifiestan una menor fecundidad y el tamao de los huevos de las hembras de primer desove que para las mujeres el segundo desove. Sin embargo, las tasas de supervivencia no fueron significativamente diferentes ( Logan y Johnston, 1992 ). En el presente estudio, se observ una menor calidad de los huevos en la segunda temporada reproductiva. En este contexto, se puede plantear la hiptesis de que el efecto de este factor (primera o segunda poca reproductiva) en la calidad del huevo, en su caso, es menor en comparacin con el efecto de la manipulacin del fotoperodo. La mayora de los estudios existentes sobre manipulacin del fotoperodo y la calidad de los huevos a menudo involucrados los efectos de una combinacin de variaciones fotoperodo y la temperatura nombrados cambios fototrmica. De hecho, la mayora de los autores coincidieron en que el fotoperodo se utiliza para controlar la cintica oognesis y calendario de ovulacin, mientras que la temperatura del agua tuvo tambin un efecto modulador sobre la calidad del huevo en Sole ( Solea solea , Devauchelle et al., 1987), lubina ( Dicentrachus labrax L., Carrillo et al.,

1989 ), la perca amarilla ( Perca flavescens , Ciereszko et al., 1997 trucha arco iris), y ( Breton et al., 1983 y Davies y Bromage, 2002 ). En el presente experimento, durante el mes que precede a la ovulacin, la temperatura del agua se mantuvo constante a 12 C para los dos grupos. Esta temperatura se haba demostrado que no tienen ningn impacto negativo en la calidad de los huevos de trucha arco iris ( Pankhurst et al., 1996 y Aegerter y Jalabert, 2004 ). En los estudios existentes, cuando los efectos de los cambios de fotoperiodo podra estudiarse sin condiciones crticas de temperatura del agua, la mayor parte de los datos disponibles corresponden a las caractersticas de la fecundidad en lugar de un anlisis detallado calidad de los huevos. Por lo tanto, estos estudios no mostraron ninguna variacin significativa de la fecundidad mundial, incluso si se observ una disminucin del tamao de los huevos en la trucha arco iris ( Bon et al., 1997 y Davies y Bromage, 2002 ). Como se discuti previamente, el tamao del huevo no parece tener ninguna correlacin significativa con la calidad del huevo (Knox et al., 1988 y Bromage et al., 1992 ). En el presente estudio, la calidad del huevo se control de forma individual para cada mujer. De hecho, nuestros datos muestran claramente una disminucin significativa de la supervivencia en dos etapas de desarrollo y un aumento de la variacin individual dentro del grupo fotoperodo-manipulado. Si se ha demostrado que muchos factores a ser determinantes para la calidad de los huevos, como el envejecimiento post-ovulatoria ovocito ( Springate et al., 1984 , Craik, 1985 y Aegerter y Jalabert, 2004 ) o de alta temperatura del agua ( Pankhurst et al., 1996 y Aegerter y Jalabert, 2004 ), los regmenes de fotoperiodo artificial tambin tienen que ser reconsiderada como importantes factores determinantes de la variacin de la calidad del huevo.

4.3. Malformaciones morfolgicas

Correlativamente a la disminucin de la supervivencia, se observ un aumento de la aparicin de malformaciones en YSR. Un aumento de malformaciones relacionadas con una prdida de la calidad del huevo ha sido ya reportado en el siluro. La frecuencia de las larvas de malformaciones fue significativamente menor en los controles que en el grupo de edad post-ovulatorio exhibe baja calidad del huevo ( Varkonyi et al., 1999 ). Estas observaciones tambin fueron hechas en la trucha arco iris. A los 14 das de ovocitos envejecimiento post-ovulatoria result en 60% de los malformados vivos alevines concomitante con una prdida del 29% de la supervivencia embrionaria ( Aegerter et al., 2005 ). Nuestros resultados estn de acuerdo con la continuidad de las obras. En conjunto, estas observaciones sugieren que, para todos los factores experimentales capaces de afectar a la calidad del huevo, una prdida de la calidad del huevo siempre se asocia con un aumento de alevines malformaciones. En el presente estudio, se observ la rarefaccin de los tipos especficos de malformaciones como Cyclops concomitante con un aumento de otros, tales como una incompleta de saco vitelino resorcin (grupo pm 48%, p = 0,057). En pez gato, se observaron tres tipos de anormalidad, es decir, fuerte curvatura de la columna vertebral, deforma la

cola y edema pericrdico, pero no se proporcionaron detalles acerca de una ocurrencia preferencial (Varkonyi et al., 1999 ). Adems, en la trucha arco iris, el efecto del envejecimiento de la post-ovulatoria huevo en malformaciones se asoci con una mayor incidencia de malformaciones "Cyclops", que llega al 80% de los alevines malformaciones en YSR. Factores externos, tales como el envejecimiento o fotoperidico postovulatorio temporizacin de la ovulacin, parecen actuar en calidad de los huevos mediante la modulacin de los tipos de anormalidad morfolgica observada. De hecho, puede ser la hiptesis de que cada factor de variacin de la cal idad del huevo inducira tipos de malformacin preferenciales.

4.4. MRNAs materna

La hibridacin de mRNA de ovocitos en la trucha arco iris cDNA microarrays de nylon se ha realizado correctamente. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio utilizando microarrays para analizar los niveles de ARNm de los ovocitos en las especies de telesteos. En otras especies de vertebrados, tal tecnologa se ha utilizado anteriormente para analizar transcriptoma ovocito ( Leo et al., 2001 , Dalbies-Tran y Mermillod, 2003 , Wang et al., 2004 , Dobson et al., 2004 y Vallee et al., 2005 ). Mientras PCR en tiempo real (RT-PCR) permite un anlisis sensible de un nmero limitado de genes, se esperaba que el genoma de seguimiento de la expresin gnica en ovocitos utilizando microarrays de ADNc para proporcionar muchos clientes potenciales en la meiosis minera y la gametognesis ( Schlecht y Primig, 2003 , para su revisin) y en los mecanismos de calidad de los ovocitos ( Sirard et al., 2002 y Krisher, 2004 , para una revisin). En nuestro caso, el uso de la trucha arco iris cDNA microarrays podra ser considerado como una herramienta til para caracterizar los peces transcriptoma huevo. De hecho, se detectaron 8.422 puntos despus de la hibridacin de ARNm procedentes de huevos de trucha arco iris no fertilizados. Genes detectados estn involucrados en una gran variedad de funciones biolgicas. La diversidad similar fue observado previamente dentro de los 300 genes identificados en ovocitos bovinos despus de la hibridacin de un 900 macrochips ge nes humanos ( DalbiesTran y Mermillod, 2003 ). Esto ilustra la complejidad y la importancia potencial de la herencia materna ARNm para el embrin. En el presente estudio, 6 transcripciones de ms de 8422 mostraron una abundancia significativamente menor en los huevos del grupo PM. Estudios anteriores mostraron que otros factores externos pueden afectar transcriptoma ovocito. Los cambios en los niveles de los ovocitos de algunos mRNAs en relacin con las condiciones de maduracin se observaron previamente en el uso de RT-PCR bovina ( Watson et al., 2000 y Lonergan et al., 2003 ) o microarrays ( DalbiesTran y Mermillod, 2003 ) y en humana ( Metcalfe et al., 2003 ). En la trucha arco iris, un estudio de RT-PCR mostr que 8 transcripciones entre los 39 mostraron una abundancia diferencial durante huevo envejecimiento post-ovulatoria ( Aegerter et al., 2003 y Aegerter et al., 2004b ). Esos

estudios anteriores mostraron que los acontecimientos finales de oogenenic (maduracin de los ovocitos, el envejecimiento despus de la ovulacin) pueden afectar a la abundancia de algunas transcripciones heredados por va materna. En el presente estudio, tambin se puso de manifiesto que una modificacin de las condiciones de oognesis tambin puede resultar en una modificacin de la abundancia de algunos mRNAs-heredadas por va materna. Uno de los 6 transcripciones muestran una abundancia menor en PM huevos grupos tena n gran similitud de secuencia con el pez cebra ( Danio rerio ) triptfano hidroxilasa 1 (TPH1). El triptfano hidroxilasa (TPH) cataliza la reaccin limitante de la velocidad en la biosntesis de la serotonina. En humanos, se han detectado dos formas: TPH1 y TPH2 ( McKinney et al, 2005. ). En el pez cebra tambin, dos ADNc que codifican formas distintas de triptfano hidroxilasa han s ido clonados: tphD1 et tphD2 ( Bellipanni et al, 2002.). Adems, la actividad de TPH1 ha encontrado en folculos ovricos en ratones ( Amireault y Dube, 2005 ).Este hidroxilasa est implicado en los efectos celulares de modulacin de la serotonina (5-hidroxitriptamina [5-HT]) que se ha demostrado que inhibe la maduracin de ovocitos meitica en Fundulus ( Cerda et al., 1998 ). Nuestra observacin refuerza la posible participacin de TPH1 en ovocitos. MAK10, en Saccharomyces cerevisiae , es una sub-unidad auxiliar de N-acetil transferasa terminal de C (NAT C). Este gen se correlaciona con una respiracin ptima en la levadura. Hay 3 NAT en S. cerevisiae y sub-unidades de pocos auxiliar especfico para cada uno de ellos, precisamente 3 especfico para ANCT (Polevoda y Sherman, 2001 ). En una revista sobre la composicin y funcin de las unidades de sub-acetiltransferasa N-terminales eucariotas ( Polevoda y Sherman, 2003 ), la Mak10p ortlogos de mamferos, se inform T4a designado para ser expresado en el epitelio de la crnea curacin ( Yi et al., 2000 ).Expresin diferencial de este gen tambin se encontr en cultivos, que se replica autnomamente las clulas del msculo liso embrionarias y de neontima, y clulas adultas normales ( Weiser-Evans et al., 2000). Adems, en humanos, la actividad ovrica NAT se correlacion con la sntesis de la melatonina y la serotonina ( Itoh et al., 1999 ). En cucaracha ( Periplaneta americana ), NAT podra ser un gen controlada por reloj en el funcionamiento del cerebro como un regulador de salida del reloj circadiano ( Bembenek et al., 2005 ). Otra transcripcin identificada correspondi a la trucha arco iris glucagn II y tambin fue menos abundante en los huevos del grupo PM. El glucagn es una hormona peptdica de la superfamilia de las glucagn / crecimiento pptidos de liberacin hormonal ( Luna, 1998 ). En los peces, se ha demostrado que el glucagn / pptidos glucagn-como (GLP) estn involucrados en la regulacin de la glucogenolisis y la gluconeognesis heptica (re visado por Plisetskaya y Mommsen, 1996 y Luna, 1998 ). En los mamferos, los estudios admitieron que el glucagn, la hormona contra-reguladora a la insulina, desempearon un papel importante en la correccin de la hipoglucemia. Curiosamente, insuficiencias de glucosa estn involucrados en el desarrollo embrionario anormal y alteran con mayor precisin la morfologa del corazn embrionario y el

metabolismo mediante el aumento de la captacin de glucosa y la gluclisis en ratones ( Smoak, 2002 ).Glucagn tambin se han demostrado ser esencial para la induccin paracrina de la diferenciacin de otros componentes pancreticos en el pncreas embrionario temprano en ratones ( Prasadan et al., 2002 ). Estas observaciones son consistentes con la disminucin de la supervivencia observada en YSR en el grupo de PM para el cual glucagn fue menos abundante. El ltimo gen identificado es la N -glicanasa. Esta protena acta por glicoprotenas desglicosilacin antes de la degradacin en el proteasoma. Es importante destacar que pNG1 discrimina entre glicoprotenas no nativos y doblado, en consonancia con el papel de la N -glicanasa de la facturacin frente al citoplasma de las glicoprotenas ( Hirsch et al., 2003 ). Se identificaron dos mRNAs que no presenten homologa con protenas conocidas y que muestran una expresin diferencial en el ovocito despus de una manipulacin del fotoperodo. Se necesitan ms estudios para caracterizar completamente los genes correspondientes y su papel en la ovognesis. La identificacin de estos seis mRNAs materna es alentador y da nuevas pistas para la comprensin de los mecanismos implicados en la construccin de la calidad del huevo. Otros estudios estn ahora obligados a mejorar nuestro conocimiento de la calidad de los huevos de peces. De hecho, el estudio de otros factores externos que se sabe afectan la calidad del huevo en relacin con transcriptoma ovocito utilizando microarrays podra proponerse. Por otra parte, el anlisis funcional podra ser tambin cepillada para explorar una o ms ARNm especfica materna ( Boonanuntanasarn et al., 2002 ).

5. Conclusiones
El presente trabajo muestra que un rgimen de fotoperodo largo -corto de uso comn para avanzar en la fecha de desove de trucha arco iris puede inducir defectos en la calidad del huevo significativos como supervivencias inferiores a mirando y saco vitelino resorcin, mayor porcentaje malformacin y tambin mayor variacin individual entre las mujeres. Adems, las nuevas pistas sugieren una posible relacin entre las malformaciones firmas especficas y perturbaciones oognesis. Por ltimo, algunos mRNAs mostraron una abundancia diferencial entre los grupos control y PM. Esto sugiere que el transcriptoma ovocito antes de la fertilizacin puede ser influenciada por perturbaciones ambientales y refleja las capacidades de desarrollo de huevo despus de la fertilizacin.