INGENIERÍA METABÓLICA DE ESCHERICHIA COLI PARA

LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO MÁLICO

Abstract

El ácido málico es un ácido dicarboxílico C4 y un intermedio del ciclo del ácido

tricarboxílico (TCA). Ha sido ampliamente utilizado en las industrias de
polímeros, alimentos y farmacéutica. El análisis del flujo metabólico se realizó
para encontrar una estrategia para mejorar la producción de ácido málico en
Escherichia coli. Los resultados de la simulación sugirieron que la
amplificación del flujo de carboxilación de fosfoenolpiruvato (PEP) permitió
una mayor producción de ácido málico.
Como la PEP carboxilasa de E. coli convierte la PEP en oxaloacetato sin generar
ATP, perdiendo así el enlace fosfato de alta energía de PEP, se eligió la PEP
carboxiquinasa, que genera ATP durante esta conversión. Sin embargo, la
carboxinasa PEP de E. coli cataliza la reacción que convierte el oxaloacetato en
PEP en lugar de la reacción opuesta deseable. Por lo tanto, clonamos la
carboxinasa PEP (encontrada por el gen pckA) de Mannheimia
succiniciproducens, que convierte la PEP en oxaloacetato como reacción
favorable. La cepa de E. coli mutante pta. WGS-10 que alberga el
El plásmido p104ManPck que contiene el gen pckA de M. succiniciproducens
se construyó y cultivó a 37 ° C. La concentración final de ácido málico de 9,25
g / L se pudo obtener después de 12 h de cultivo aeróbico.

1. Introducción
El ácido málico es un miembro de la familia del ácido dicarboxílico C4 y un
intermedio del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) (Fig. 1). Industrialmente, el
ácido málico se ha empleado para la preparación de aditivos alimentarios y la
síntesis de diversos productos químicos finos [1–3]. El ácido málico se puede
producir mediante diversos métodos, como la extracción de plantas, la
conversión enzimática y la síntesis química. La extracción de ácido málico de
la fruta ha sido un método tradicional de producción, pero este método no tiene
un uso práctico debido a la pequeña capacidad de producción [3]. El ácido
málico puede sintetizarse químicamente por hidratación del ácido maleico o
fumárico. La conversión enzimática del ácido fumárico utilizando fumarasa
también permite la producción de ácido málico [1–3]. Sin embargo, estos dos
procesos requieren un agente de resolución quiral bastante costoso, procesos de
reacción complejos o enzima costosa, lo que hace que sean difíciles de usar en
la práctica [1]. La fermentación de especies de Aspergillus y la comuna de
Schizophyllum también permite la producción de ácido málico a partir de
materias primas renovables [3,4], pero la productividad del ácido málico es
bastante baja a 0.1-0.6 g / L / h [1,4]. Por lo tanto, se requiere el desarrollo de
un sistema de producción de ácido málico más eficiente para que el proceso
biológico de producción de ácido málico sea económicamente factible.
Fig. 1. Vías metabólicas centrales en E. coli. Las enzimas codificadas por los
genes mostrados son: aceE / F, complejo multienzimático de piruvato
deshidrogenasa; acnA / B, aconitasa; adhE / C, alcohol deshidrogenasa; fumA
/ B / C, fumarasa; gltA, citrato sintasa; icdA, isocitrato deshidrogenasa; ldhA,
d-lactato deshidrogenasa; mdh, malato deshidrogenasa; pckA,
fosfoenolpiruvato carboxiquinasa; ppc, fosfoenolpiruvato carboxilasa; pta /
ackA, fosfato acetiltransferasa / acetato quinasa; ptsG, una enzima del sistema
de fosfotransferasa; pykA, piruvato quinasa; sfcA, enzima málica; sdhA / B / C
/ D, succinato deshidrogenasa; complejo sucA / B-lpdA, -ketoglutarato
deshidrogenasa; sucC / D, succinil-CoA sintetasa.

La ingeniería metabólica [5,6] puede emplearse para rediseñar la red metabólica

para la producción mejorada de metabolitos deseables. Recientemente, varias
herramientas computacionales desarrolladas para el análisis del flujo
metabólico (MFA) están permitiendo estimar los flujos intracelulares, que
pueden usarse para descifrar las características metabólicas bajo condiciones
genéticas y ambientales dadas y, en consecuencia, sugerir que los genes objetivo
sean manipulados para una producción mejorada de metabolitos [7–9].
En este estudio, presentamos una nueva estrategia para la producción de ácido
málico en Escherichia coli. La fosfoenolpiruvato (PEP) carboxiquinasa de
Mannheimia succiniciproducens MBEL55E, que se aisló del rumen bovino, se
sobre expresó para aumentar la producción de ácido málico en E. coli
recombinante [10]. MFA también evaluó los efectos de la introducción del gen
de la PEP carboxinasa de M. succiniciproducens en E. coli.

2. Materiales y métodos
2.1. Cepas bacterianas
Las cepas utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla 1. Las células se
cultivaron rutinariamente en medio Luria Bertani (LB) que contenía 10 g / L de
triptona, 5 g / L de extracto de levadura y 10 g / L de NaCl. E. coli cepa W3110,
WGS-3 (W3110 ldhA: Cm pta: Kn adhE: Tc) y WGS-10 (W3110 pta: Kn) se
utilizaron para la producción de ácido málico. La cepa mutante WGS-3 perdió
la actividad del lactato deshidrogenasa, fosfotransacetilasa y alcohol
deshidrogenasa mediante la inserción del gen de resistencia al cloranfenicol
(Cmr), resistencia a la kanamicina (Knr) y resistencia a la tetraciclina (Tcr) en
el medio del gen ldhA, pta y adhE genes, respectivamente. La cepa mutante
WGS-10 perdió la actividad de fosfotransacetilasa por la inserción del gen Knr
en el medio del gen pta. El procedimiento para la interrupción de estos genes se
describe a continuación.
2.2. Plásmidos
Los plásmidos utilizados en este estudio también se enumeran en la Tabla 1.
Para integrar los genes Cmr, Knr y Tcr en el cromosoma de E. coli W3110 de
tipo salvaje, se usó el vector de reemplazo génico pKO3 [11]. El plásmido
pKO3 contiene un origen de replicación sensible a la temperatura y un marcador
Cmr para la selección positiva de la integración cromosómica. Primero, los
genes ldhA, pta y adhE se clonaron por PCR de E. coli XL1-Blue (Stratagene
Cloning Systems, La Jolla, CA). Los cebadores de PCR (Tabla 2) fueron
diseñados en base a la secuencia del genoma de E. coli informada [12]. La PCR
se realizó usando un PCR Thermal Cycler MP TP3000 (Takara Shuzo Co.,
Shiga, Japón) y el Sistema de PCR de alta fidelidad (Boeringer Mannheim,
Mannheim, Alemania). Los genes amplificados ldhA, pta y adhE se insertaron
en los sitios BamHI, SmaI y BamHI de pUC19 para construir pUCldhA,
pUCpta y pUCadhE, respectivamente [13]. El gen Cmr y Tcr también se
amplificaron por PCR de pACYC184, y el gen Knr de pACYC177. El gen Cmr
amplificado se clonó en el sitio KpnI de pUCldhA, que está presente en el medio
del gen ldhA, para producir pUCldhACm. El gen Knr amplificado se clonó en
el sitio BamHI del gen pta en pUCpta para hacer pUCptaKn. El gen Tcr
amplificado se clonó en el sitio NcoI del gen adhE en pUCadhE para construir
pUCadhETc. El gen ldhA insertado con Cmr, el gen pta insertado con Knr y el
gen adhE insertado con Tcr se clonaron en los sitios BamHI, SmaI y BamHI del
vector de reemplazo pKO3 para producir pKOldhACm, pKOptaKn y
pKOadhETc, respectivamente.

El gen pckA, que codifica la PEP carboxiquinasa, fue clonado por PCR de E.
coli XL1-Blue y M. succiniciproducens [10]. Los genes pckA de E. coli y M.
succiniciproducens amplificados se insertaron en los sitios EcoRI y XbaI de
p10499A para construir p104ColiPck y p104ManPck, respectivamente (Fig. 2).
El plásmido p10499A contiene un promotor constitutivo gntT104 [14,15].

2.3. Reemplazo genético

Primero, la cepa de E. coli W3110 se transformó con pKOptaKn por
electroporación para construir WGS-10 (W3110 pta :: Kn). Las células se
sembraron en placas LB precalentadas que contenían 30 g / ml de Cm, y se
incubaron a 30 ° C. De la placa, se recogieron de una a cinco colonias y se
transfirieron a 10 ml de caldo LB, y se subcultivaron de cuatro a cinco veces a
42 ° C para permitir que ocurriera la recombinación. El caldo de cultivo diluido
se sembró en una placa LB que contenía 30 g / ml de Km a 30 ° C. Las colonias
obtenidas en la placa LB-Km fueron replicadas en la placa LB-Cm para
encontrar aquellas colonias que perdieron el plásmido pKOptaKn. El reemplazo
del gen se confirmó por PCR utilizando los cebadores que flanquean el gen
objetivo. De manera similar, WGS-10 se transformó con pKOadhETc y
pKOldhACm por electroporación para la construcción de la cepa mutante
WGS-3 (W3110 ldhA :: Cm pta :: Kn adhE :: Tc). El reemplazo correcto del
gen también se confirmó por PCR.

Fig.
2.

Construcción de los plásmidos p104ColiPck y p104ManPck.

2.4. Fermentación
Las fermentaciones se llevaron a cabo a 37 ° C en un biorreactor de 5 L (BioFlo
3000, New Brunswick Scientific, Edison, NJ) que contenía 3 L de medio R / 2
suplementado con 20 g / L de glucosa. El medio R / 2 contiene por litro:
KH2PO4, 6,75 g / L; (NH4) 2HPO4, 2 g / L; ácido cítrico, 0.85 g / L; MgSO4
· 7H2O, 0.7 g / L; solución de trazas metálicas (HCl 5 M; FeSO4 · 7H2O, 10 g
/ L; CaCl2, 2 g / L; ZnSO4 · 7H2O, 2.2 g / L; MnSO4 · 5H2O, 0.54 g / L;
CuSO4 · 5H2O, 1 g / L ; (NH4) Mo7O24 · 4H2O, 0.1 g / L; Na2B4O7 · 10H2O,
0.02 g / L), 5 mL / L. El pH se controló a 6,7 con NaOH 5 M. El nivel de oxígeno
disuelto (OD) se mantuvo por encima del 40% de la saturación de oxígeno
durante el cultivo. Se agregaron ampicilina (Ap), Km y Cm a concentraciones
de 100, 30 y / o 30 g / ml, respectivamente, dependiendo del plásmido y las
cepas empleadas.

2.5. Procedimiento analítico

El crecimiento celular se controló midiendo la densidad óptica a 600 nm
(OD600). Los productos de fermentación en el medio se analizaron mediante
cromatografía líquida de alto rendimiento (sistema de cromatografía Hitachi,
Tokio, Japón) equipada con una columna Aminex HPX-87H (300 mm × 7.8
mm, Bio-Rad Laboratories, Herculules, CA) y un índice de refracción. detector
(L3300, sistema de cromatografía Hitachi). La columna se eluyó
isocráticamente con H2SO4 5 mM.

2.6. Análisis de flujo metabólico

Los análisis de respuesta de flujo in silico se realizaron utilizando el modelo
metabólico a escala del genoma E. coli MBEL979 que consta de 979 reacciones
metabólicas y 814 metabolitos (144 metabolitos extracelulares y 670
intermedios), que es una red ligeramente modificada de iJR904 informada por
Palsson y colegas [ 16,17]. Con el fin de examinar la correlación entre la tasa
de producción de ácido málico y la tasa de crecimiento celular, la tasa de
producción de ácido málico se perturbó desde su valor mínimo al valor máximo
utilizando una función objetiva de la maximización de la tasa de crecimiento.
El gráfico de perfil de flujo se genera comparando la tasa de producción de
ácido málico en el eje Y y la tasa de crecimiento en el eje X. Para investigar la
distribución de flujo de las cepas modificadas genéticamente en la producción
de ácido málico, se realizó un análisis de flujo basado en restricciones utilizando
datos de fermentación de fase de crecimiento exponencial de WGS-10, WGS-
10 (p104ColiPck) y WGS-10 (p104ManPck). Para el análisis de flujo de WGS-
10 (p104ManPck), la reacción de PEP carboxilasa se reemplazó con PEP
carboxiquinasa reversible. La tasa de absorción de glucosa se normalizó a 10
mmol / gDCW / h. MFA se llevó a cabo utilizando el paquete de programas
MetaFluxNet
3. Resultados y discusión
3.1. Predicción de la vía óptima de producción de ácido málico
MFA se llevó a cabo para predecir la vía óptima de producción de ácido málico.
Aunque el ácido málico es un metabolito, producido favorablemente en
condiciones anaeróbicas, al igual que el ácido succínico, la condición de
simulación no se limitó a la condición anaeróbica considerando una mayor tasa
de crecimiento celular en condiciones aeróbicas (Tabla 3). La tasa de consumo
de oxígeno se limitó a estar por debajo de una tasa promedio de consumo de
oxígeno de E. coli, que es 20 mmol / gDCW / h [19]. Para obtener soluciones
factibles, se aplicaron restricciones en las tasas de absorción y excreción de
metabolitos (Tabla 3).
Fig. 3. Plano de fase fenotípica para la tasa de formación de biomasa y la tasa
de producción de ácido málico. Las líneas punteadas y continuas representan
los espacios de solución sin y con la introducción del gen pckA. Los símbolos
representan puntos reales de WGS10 (p10449A) (), WGS10 (p104ColiPck) () y
WGS-10 (p104ManPck) ().
Para predecir la distribución óptima del flujo metabólico intracelular que
permite una alta producción de ácido málico y un buen crecimiento celular, la
tasa de producción de ácido málico se alteró del valor mínimo al máximo
durante la optimización basada en la programación lineal utilizando la
maximización del crecimiento como una función objetivo. Los resultados de
MFA mostraron que se pueden lograr 19 mmol / gDCW / h de flujo de ácido
málico sin crecimiento celular, y disminuyó linealmente a medida que
aumentaba el flujo de biomasa (Fig. 3). La reacción catalizada por la PEP
carboxiquinasa reversible se introdujo en la red metabólica de E. coli porque la
red metabólica original contiene solo la reacción irreversible de la PEP
carboxiquinasa, que convierte el oxaloacetato en PEP. En general, se ha
sugerido que la PEP carboxiquinasa es más apropiada que la PEP carboxilasa
ya que la PEP carboxiquinasa produce ATP durante la conversión de PEP a
oxaloacetato. Cuando se introdujo la PEP carboxinasa que trabaja hacia la
reacción de carboxilación, el flujo máximo de crecimiento celular y el flujo de
ácido málico aumentaron en un 1,4 y un 5%, respectivamente. El espacio de la
solución se expandió, lo que sugiere un mayor crecimiento celular y producción
de ácido málico mediante la introducción de la carboxinasa PEP reversible en
E. coli (Fig. 3).
En base a estos resultados de MFA, se propuso la producción aeróbica de ácido
málico usando las cepas con actividad de carboxinasa de PEP amplificada como
la vía de ácido málico más eficiente. Por sobreexpresión de la PEP
carboxiquinasa, la PEP se convertirá en oxaloacetato sin perder el enlace fosfato
de alta energía, y se convertirá aún más en ácido málico mediante el malato
reversible deshidrogenasa y el ciclo TCA. En condiciones aeróbicas, se
expresan fumarasa y succinato deshidrogenasa, y el ciclo TCA funciona para
convertir el oxaloacetato en ácido málico a través del ácido succínico. El ácido
málico producido no se convierte más en ácido succínico, sino que se acumula
en condiciones aeróbicas porque no se expresan la fumarasa anaeróbica y la
fumarato reductasa. En condiciones anaeróbicas, el ácido málico se convierte
en ácido succínico por la fumarasa anaeróbica y la fumarato reductasa, y el
ácido succínico se produce como producto final. Para realizar y verificar la vía
propuesta del ácido málico, el gen pckA de M. succiniciproducens, que codifica
la carboxinasa PEP, se sobre expresó en E. coli recombinante. Además, como
comparación, el gen pckA de E. coli también se sobre expresó en E. coli.
Fig. 4. Perfiles de tiempo del cultivo OD600 () y concentraciones de glucosa (g
/ L,), ácido acético (g / L,) y ácido málico (g / L,) durante la fermentación
discontinua de WGS- 10 que albergan p104ManPck a partir de 20 g / L de
glucosa.

3.2. Fermentación
Se llevaron a cabo fermentaciones de E. coli W3110, WGS-10 que albergaban
p104ColiPck o p104ManPck, y los resultados se resumen en la Tabla 4. No se
produjo ácido málico en E. coli W3110 independientemente del plásmido
introducido. Para dirigir más flujo de carbono hacia la vía del ácido málico y
para prevenir la producción de ácido acético, se construyó la cepa mutante del
gen pta. E. coli WGS-10. Cuando el gen pckA de E. coli se sobre expresó en
WGS-10, se produjeron 1,42 g / L de ácido málico. Por otro lado, la
concentración final de ácido málico alcanzó hasta 9.25 g / L por la
sobreexpresión del gen pckA de M. succiniciproducens. Estos resultados
sugieren que M. succinici produce la PEP carboxinasa es más adecuada para la
producción de ácido málico al convertir eficientemente la PEP en oxaloacetato.
Este resultado es consistente con nuestro informe anterior de que M.
succiniciproducens es un productor eficiente de ácido succínico que utiliza la
carboxinasa PEP como enzima clave que proporciona un alto flujo hacia el ciclo
reductor de TCA [20]. La concentración celular final no mostró mucha
diferencia a pesar del gran aumento de la concentración final de ácido málico,
lo que sugiere que el crecimiento de E. coli recombinante no se vio afectado
negativamente por la amplificación del flujo de carboxilación de PEP.
Los perfiles de tiempo del crecimiento celular y las concentraciones de glucosa,
ácido málico y ácido acético obtenidos con WGS-10 (p104ManPck) se
presentan en la Fig. 4. La glucosa se consumió por completo en 12 h de cultivo.
Al final de la fermentación de WGS-10 (p104ManPck), se produjeron 9,25 g /
L de ácido málico con una productividad de 0,74 g / L / h (Tabla 4). El
rendimiento del ácido málico fue de 0,75 moles / mol de glucosa, y no se
produjo ningún subproducto, como el ácido acético.

Fig. 5. Los valores calculados de los flujos intracelulares (mmol / gDCW / h)

en recombinanteE. coliWGS-10 (p10499A) / WGS-10 (p104ColiPck) / WGS-10
(p104ManPck). Las abreviaturas son: G6P, glucosa-6-fosfato; D6PGL,
gluconolactona-6-fosfato; D6PGC, 6-fosfo gluconato; RL5P, ribulosa-5-
fosfato; X5P, xilurosa-5-
fosfato; R5P, ribosa-5-fosfato; S7P, sedoheptulosa-7-fosfato; E4P, eritrosa-4-
fosfato; F6P, fructosa-6-fosfato; FBP, fructosa-1,6-bisfosfato; GAP,
gliceraldehído-3-fosfato; DHAP, fosfato de dihidroxiacetona; GBP, 1,3-
bisfosfoglicerato; PEP, fosfoenolpiruvato; PYR, piruvato; ACA, acetil-CoA;
CIT, citrato; ICIT, isocitrato; AKG, -ketoglutarato; SUCOA, succinil-CoA;
SUC, succinato; FUM, fumarato; MAL, malato; OAA, oxaloacetato.

Aunque no se detectaron subproductos significativos, decidimos inactivar aún

más el ldhA y adhEgenes, además del gen pta. ya noqueado, para su uso en
cultivos de lotes alimentados donde las células pueden encontrar una condición
micro aerobia. Cuando E. coli y M. succiniciproducens PEP carboxinasa se
sobre expresaron en esta cepa mutante pta., ldhA y adhE WGS3, no se observó
una mejora adicional de la productividad y el rendimiento del ácido málico,
aunque no se produjeron ácido láctico y etanol (Tabla 4). Al final de la
fermentación de WGS3 (p104ManPck), las concentraciones de ácido málico y
acético fueron 9.62 y 0.86 g / L, respectivamente. La productividad de ácido
málico obtenida con WGS-3 (p104ManPck) fue de 0,69 g / L / h, que es
ligeramente inferior a la obtenida con WGS-10 (p104ManPck). Creemos que
estas dos cepas recombinantes pueden emplearse para mejorar la producción de
ácido málico mediante cultivo alimentado por lotes, que será nuestro estudio
futuro.

3. Análisis de flujo metabólico

El MFA se realizó en base a los datos de fermentación de WGS-10 (p10499A),
WGS-10 (p104ColiPck) y WGS-1 (p104ManPck) para ver si los flujos
metabólicos intracelulares se reorientan como se esperaba. La típica red
metabólica de E. coli, que tiene una reacción irreversible de PEP carboxinasa,
se empleó para el análisis de flujos metabólicos en cepas WGS-10 (p10499A)
y WGS-10 (p104ColiPck). Para el análisis de los flujos metabólicos en WGS-
10 (p104ManPck), se usó la reacción reversible de PEP carboxiquinasa en lugar
de la reacción irreversible original de PEP carboxiquinasa. Los resultados de
MFA para WGS-10 (p10499A), WGS-10 (p104ColiPck) y WGS-10
(p104ManPck) se muestran en la Fig. 5
Los resultados de MFA mostraron que el flujo de ácido málico y el flujo de
carboxilación PEP aumentaron ligeramente por la sobreexpresión del gen pckA
de E. coli. Solo se produjo una pequeña cantidad de ácido málico, que no fue
inconsistente con el informe anterior de que la sobreexpresión del gen pckA de
E. coli no condujo a una mayor producción de ácido succínico [21]. Sin
embargo, también se ha informado que las actividades de la PEP carboxilasa y
la PEP carboxilasa están correlacionadas entre sí; la actividad de la PEP
carboxilasa es proporcional a la actividad de la PEP carboxiquinasa, mientras
que la de la derivación de glioxilato es inversamente proporcional a la actividad
de la PEP carboxiquinasa [22]. Por lo tanto, podría ser posible que la
sobreexpresión del gen pckA de E. coli elevara el nivel de expresión o la
actividad de la PEP carboxilasa. Luego, el flujo de carboxilación de PEP se
incrementó por la acción de la actividad mejorada de carboxilasa de PEP. No
obstante, el grado de aumento fue bastante pequeño, y la distribución global del
flujo metabólico de WGS-10 (p104ColiPck) no fue muy diferente de la de
WGS-10 (p10499A). Estos resultados sugieren que la introducción del gen
pckA de E. coli no permitió la redistribución del flujo hacia una mayor
formación de ácido málico
Por otro lado, WGS-10 (p104ManPck) mostró una distribución de flujo
diferente de la de WGS-10 (p10499A) y WGS-10 (p104ColiPck). Uno de los
cambios más notables fue la activación del flujo de PEP carboxiquinasa. En
WGS-10 (p10499A) y WGS-10 (p104ColiPck), que tienen una red metabólica
típica de E. coli, el flujo de PEP a oxaloacetato fue mediado solo por PEP
carboxilasa. El resultado de MFA propuso que la carboxilación de PEP fue
catalizada por la PEP carboxinasa de M. succiniciproducens introducida en
WGS-10 (p104ManPck). El oxaloacetato producido de este modo se convirtió
adicionalmente en ácido málico en WGS-10 (p104ManPck). Por otro lado, el
ácido málico se convirtió en oxaloacetato en cepas WGS-10 (p10499A) y
WGS10 (p104ColiPck). Los resultados de MFA propusieron que la ruta de la
pentosa fosfato (PP) y los flujos de biosíntesis de aminoácidos disminuyeron
mientras que el flujo glucolítico aumentó en WGS-10 (p104ManPck). Estos
resultados sugieren que el metabolismo de WGS-10 (p104ManPck) se alteró
para favorecer la formación de ácido málico mediante la introducción del gen
pckA de M. succiniciproducens.
El metabolismo alterado de WGS-10 (p104ManPck) también se presenta en la
Fig. 3, que muestra los resultados de MFA obtenidos con WGS10 (p10449A),
WGS10 (p104ColiPck) y WGS10 (p104ManPck). WGS10 (p10449A) se
encuentra en el eje X porque no se produjo ácido málico. WGS10
(p104ColiPck) se encuentra en la línea discontinua, lo que sugiere que WGS10
(p104ColiPck) produjo la mayor cantidad de ácido málico posible ya que la
línea discontinua representa el espacio metabólico factible del sistema E. coli.
En el caso de WGS-10 (p104ManPck), se encuentra en el espacio de solución
expandida (área gris oscuro) lo que indica que el metabolismo de WGS-10
(p104ManPck) se alteró más allá del límite metabólico original de WGS10
(p104ColiPck) y produjo más málico ácido. La cepa recombinante WGS-10
(p104ManPck) y su derivado adicional WGS-3 (p104ManPck) deberían ser
útiles para la producción de ácido málico por fermentación a partir de biomasa
renovable.

4. Conclusión
Para la producción mejorada de componentes C4 como el ácido málico y el
ácido succínico, se requiere la reorientación del flujo de carbono de los
compuestos C2 y / o C3 a los compuestos C4 [23,24]. En este estudio, se utilizó
MFA para predecir la vía óptima de producción de ácido málico y, en
consecuencia, una estrategia racional de ingeniería metabólica. Se podría
determinar una distribución de flujo de silico más confiable considerando tanto
la tasa de producción de ácido málico como la tasa de crecimiento durante la
simulación.
Aunque los valores de flujo metabólico calculados no representan los valores
de flujo reales, son útiles para comprender todas las características metabólicas
y para desarrollar estrategias de ingeniería metabólica. Según el resultado de
MFA, los genes de PEP carboxiquinasa de M. succiniciproducens y E. coli se
sobre expresaron por el posible aumento del flujo de la PEP del componente C3
al oxaloacetato del componente C4 [10,25,26]. Las cepas de E. coli
recombinantes WGS-10 y WGS-3 que albergan p104ManPck, así equipadas
con el gen pckA de M. succiniciproducens, pudieron producir ácido málico
eficientemente en condiciones aeróbicas. Considerando una mayor tasa de
crecimiento celular en condiciones aeróbicas, estas cepas pueden aplicarse para
la producción de ácido málico a una alta concentración con alta productividad
mediante cultivo alimentado por lotes. Además, la estrategia de ingeniería
metabólica descrita aquí puede ser útil para desarrollar cepas para la producción
de otros metabolitos a partir de recursos renovables.