MINISTERIO DE

INIA CIENCIA E
INNOVACIÓN
Instituto Nacional de
Investigación y
Tecnología Agraria y
Alimentaria
XVIII CURSO INTERNACIONAL
TEORICO-PRACTICO DE
DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN
DE VIRUS, VIROIDES Y
FITOPLASMAS

17 - 28 noviembre de 2008

MADRID, ESPAÑA
CARACTERÍSTICAS
GENERALES DE LOS
PATÓGENOS
INTRACELULARES:
INTRODUCCIÓN AL
DIAGNÓSTICO
 Planta

Patógeno Medio ambiente

ENFERMEDAD
CARACTERÍSTICAS DE LOS PATÓGENOS
INTRACELULARES DE VEGETALES

❖ INCURABLES (No sistema inmune)

❖ INCULTIBABLES IN VITRO
❖ IMPOSIBLE CONTROL QUÍMICO
❖ TRANSMISIBLES: vegetativamente (injerto,
multiplicación vegetativa), semilla, polen,
vectores (Insectos, hongos, nematodos...)

SELECCIÓN SANITARIA DE PLANTAS MADRE

 CARACTERÍSTICAS DE LOS PATÓGENOS
INTRACELULARES DE VEGETALES

❖ FRECUENTES (Fácil infección, tiempo

exposición largo especialmente en plantas
leñosas ...)

❖ GRANDES POBLACIONES HOMOGÉNEAS

DE PLANTAS CULTIVADAS

NUMEROSAS MUESTRAS
 VIRUS
Entidades cuyos genomas son elementos de
ácido nucleico que replican en el interior de las
células, usando la maquinaria de síntesis celular
y ocasionan la síntesis de elementos
especializados (viriones) que pueden transferir el
genoma a otras células
 MAS DE 100 AÑOS DE VIROLOGÍA

❖ 1882 IWANOSKI: identifica una enfermedad que pasa los

filtros bacterianos.
❖ 1898 BEIJERINCK: repite el experimento y denomina al
agente causal “virus”.
❖ 1922 KUNKEL: demuestra la transmisión por insectos.
❖ 1928 BEALE: demuestra que plantas infectadas con TMV
tienen un antígeno específico.
❖ 1935 STANLEY: purifica TMV.
❖ 1936 BAWDEN: identifica ácido nucleico en una preparación
de virus purificado.
❖ 1939 KAUSCHE: observa TMV en el microscopio electrónico.
❖ 1949 MARKHAM y SMITH: muestran que el RNA del virus era
infeccioso.
 MAS DE 100 AÑOS DE VIROLOGÍA II

❖ 1950s La microscopía electrónica era la técnica dominante

para estudiar los virus de plantas.
❖ 1960s Aparecen los primeros diagnósticos masivos usando
anticuerpos.
❖ 1970s Identificación de virus DNA en plantas. Se descubren
los RNAs satélites, viroides y fitoplasmas. Desarrollo del
método ELISA.
❖ 1980s y 1990s: Desarrollo de métodos de diagnóstico
masivos y mas sensibles: Hibridaciones, PCR, NASBA.
BIOLOGIA MOLECULAR
❖ Siglo XXI: Nuevas aplicaciones, nuevas maquinas, nuevos
métodos : micromatrices, polisondas, qPCR etc.
 Diferenciar entre DNA y RNA

ALKALI: RNA es degradado en incubación al 0.5 M de KOH

durante 30-60 min. A temperatura ambiente. El DNA no es
afectado.

RNAsas: Degradación selectiva del RNA mediante una

RNAsa libre de DNAsa. Incubar a 10 mg/ml en TE a 37 ºC por
1 h.

 DNAsas: Degradación selectiva del DNA por una DNAsa

libre de RNAsa. Usar DNAsa I siempre en presencia de DTT e
inhibidor de RNAsa.
 Diferenciar entre cadena simple y doble

 Enzimáticos: Nucleasa S1 digiere solamente ácidos

nucleicos de cadena sencilla. RNAsa A degrada solamente
cadena sencilla en alta sal (300 mM NaCl) y cadena simple y
doble en baja sal (50 mM NaCl).

 Naranja de acridina: Al teñir los ácidos nucleicos muestra

fluorescencia roja para la cadena simple y fluorescencia
verde para la doble.

 Electroforesis: Las de cadena doble cambian su tamaño

cuando son desnaturalizadas Ej.: hirviéndolas con 50 % de
formamida.
Los virus son microscópicos:

Fotos de virus al microscopio electrónico

Estos organismos tan pequeños producen enfermedades
en las plantas

Fríjol
 BGMV

Amarillamiento
BLRV BsbMV
BYMV
Calabaza
Virus del “Mopt top” de la papa (Solanum tuberosum), en el valle del Mantaro
 Geranio

Patata
 Vein
clearing
 Ring spot en nectarina

Patata
 Sharka

Melocotonero
Rododendrun

Mosaico de la rosa
Albaricoques
TSWV
TSWV
Cacahuete
Cacahuete
TSWV

Cacahuete
TYLCV
 Violeta africana

Orquídea
 TSWV

Pimiento
PPV

Albaricoque
 Sharka

Nectarina

Melocotón
 Cerezas

Sharka
Sharka
 SqLCV

Virus de Calabazas
CiMV

Mandarina
Stony pit virus infection

Of

Pear cv. Rogue Red

 Semillas

Sharka
TRANSMISIÓN
DE LOS
VIRUS
2.- Por cúscuta.
3.- mecánica
Movimiento
de los virus
en las
plantas
inoculadas.
4.- Por insectos

Pulgones
5.- Por nemátodos, ácaros y hongos
 Por hongos

Género Virus Hongo

Tombusvirus CNV Olpidium bornavanus

Carmovirus MNSV, CLSV, CSBV Olpidium bornavanus
SqNV Olpidium bornavanus
Necrovirus TNV, ChNV, LNV Olpidium brassicae
Dianthovirus RCNMV Olpidium bornavanus
Furovirus SBWMV, OGSV, RSNV Polymyxa graminis
Pecluvirus PCV, IPCV Polymyxa graminis
Benyvirus BNYVV, BSBV Polymyxa betae
Pomovirus PMTV Spongospora subterranea
Bymovirus BaMMV, BaYMV, OMVPolymyxa graminis
RNMV,QSSMV Polymyxa graminis
Varicosavirus LBVV,TSV,FLNV Olpidium bornavanus
6.- Por semilla
 Nº de miembros % transmisión por
Género semilla
En el género Semilla

Alfamovirus 1 1 1-23
Bromovirus 6 1 --
Capillovirus 4 1 1-60
Carlavirus 60 2 2-90
Carmovirus 18 2 10-40
Caulimovirus 34 1 1-100
Closterovirus 28 1 --
Comovirus 15 6 1-90
Cryptovirus 31 31 100
Cucumovirus 3 3 <1-1
Enanovirus 1 1 1-2
Geminivirus 102 1 --
Hordeivirus 4 1 --
Ilarvirus 17 8 1-90
Nepovirus 40 17 3-100
Potexvirus 36 4 1-6
Potyvirus 179 16 <1-80
Rhabdovirus 15 1 --
Sobemovirus 14 4 1-80
Tobamovirus 17 7 1-20
Tobravirus 3 3 1-35
Tospovirus 13 1 1-95
Tombusvirus 13 1 --
Tymovirus 23 3 --
Viroides 15 5 --
 7.- Por polen.
Género Virus Planta
Ilarvirus BlShV Arándano
PDV Frutales de hueso
PNRSV Frutales de hueso
TSV Varios
Nepovirus AYRSV Alcachofa
BLMoV Arándano
CLRV Nogal, betula
Sobemovirus SoMV Chenopodium
Idaeovirus RBDV Frambruesa
Viroides ASSVd Manzana
ASBVd Aguacate
CSVd Crisantemo, Tomate
CEVd Citricos, tomate
CCCVd Coco
HSVd Pepino, lupulo,vid, tomate
PSTVd Patata, tomate
8.- Por el suelo y agua.

Tobamovirus

Tombusvirus

Carmovirus etc.
 MOLÉCULAS
SUBVIRALES

RNAs
SATÉLITES DEFECTIVOS
QUIMÉRICOS

RNAs VIRUS RNAs VIRUS

VIRU DEFECTIVOS
SATÉLITES SATÉLITES DEFECTIVOS
S
 Partículas Replicación Síntesis Homología de
subvirales independiente directa de secuencia con
proteínas el virus
auxiliar
Viroides Si No --

RNAs satélites No Si/No No

Virusoides No Si/No No

DNAs y RNAs No Si/No Si

defectivos
Efectos biológicos de los DI-RNAs de BBMV
 VIROIDES
Son los entes biológicos mas simples
descritos hasta el momento, son capaces
de replicarse autónomamente en células
susceptibles, están constituidos por una
sola molécula de RNA circular y carecen de
actividad de RNA mensajero, por lo que su
estructura primaria y conformación
tridimensional determinan sus propiedades
biológicas y moleculares.
Viroids are plant pathogens that consist of circular ssRNA of about
300b (220 to 380 bases, the smallest is 220b). E.g. potato spindle tuber
viroid (PSTVd) which causes infectious disease in potato plants. They
code for no proteins and have no protein capsid or protein-coat at all:
they are naked infectious RNA molecules and thus one of the simplest
parasites conceivable. Their replication requires RNA polymerase II,
provided by the host cell and occurs by rolling circle replication. The
RNA has a 2D/3D structure, with some regions pairing by hydrogen-
bonding between the bases to give double-stranded regions, and the
molecule is rod-shaped. Some are ribozymes, meaning that they fold to
form structures with enzymatic activity, such as catalysis of cutting the
concatemers (produced by rolling circle replication) into individual
viroids.
PSTVd
CHSVd y PLMVd
 FITOPLASMAS
Estos procariotas pertenecientes a la
clase Mollicutes, son similares a las
bacterias, pero están desprovistos de
pared celular, este rasgo es el responsable
de la mayoría de las características de esta
clase: gran plasticidad, pleomorfismo,
capacidad de atravesar los filtros de
bacterias, gran sensibilidad a la lisis y total
resistencia a la penicilina
Doi et al., (1967) Ann. Phytopha. Soc. Japan 33: 259-266.
Ishiie et al., (1967) Ann. Phytopha. Soc. Japan 33: 267-275.
 X disease
phytoplasma

Melocotonero
Fitoplasma

En

cítricos
Melocotonero
Sauce
Pinus

Spartium
FITOPLASMAS
EN
Spartium
junceum
'CaPhytoplasma spartii
 Otros fitoplasmas:
'Ca.Phytoplasma pini
'Ca.Phytoplasma fraxini
‘Ca.Phytoplasma ulmi
'Ca.Phytoplasma pini
'Ca.Phytoplasma fraxini
 New Disease Reports (2008) 17, 7.
First report of alder yellows phytoplasma on common
alder (Alnus glutinosa) in Serbia
T. Cvrković1, J. Jović1, M. Mitrović1, A. Petrović1, S.
Krnjajić1, S. Malembic-Maher2 and I. Toševski3*

1 Institute for Plant Protection and Environment,

Department of Plant Pests, Banatska 33, 11080 Zemun,
Serbia
2 UMR1090, Génomique, Diversité et Pouvoir
Pathogéne, INRA, Université Victor Ségalen Bordeaux
2, BP 81, F-33883 Villenave d'Ornon, France
3 CABI Europe - Switzerland, 1 Rue des Grillons, 2800
Delémont, Switzerland72.

Figure 1: Yellowing symptoms on common alder (Alnus glutinosa). The tree shown was positive for AldY phytoplasma
Figure 2: RFLP analyses of the 1050 bp 16SrRNA gene amplified by nested PCR with primer pair P1/P7 followed with
16r758f/M23Sr primers, digested with TaqI and separated by electrophoresis through 13% polyacrylamide gels. AL 1-
alder samples from Central Serbia; AL 18-21: alder samples from East Serbia; EY: elm yellows phytoplasma maintained
periwinkle (provided by W.A. Sinclair, New York); FD-C: field growing infected grapevine from Central Serbia; FD-D
field growing infected grapevine from Veneto region (provided by E. Angelini, Conegliano), M: marker, ФX174
DNA/BsuRI (HaeIII), Fermentas; fragment sizes (bp) from top to bottom: 1353, 1078, 872, 603, 310,281,271, 234, 194, 11
CICLO DE INFECCIÓN VIRAL

- Vectores virales

- Polen

- Semillas
- Hongos
- Animales
- Hombre: hábitos de cultivo,
propagación material infectado.

- Agua
- Viento

Bióticos:
Abióticos: - Áfidos de raíces.
- Contacto raíces. - Hongos (zoosporas-20 años).
- Agua (virus estables) - Nemátodos.
Síntomas pueden ser producidos por :

 Virus
 Viroides
 Fitoplasmas
 Toxinas (artrópodos)
 Anormalidades genéticas
 Deficiencias nutricionales
 Daños por hormonas
 Interés del diagnóstico
 Determinación de presencia o ausencia del patógeno para
posible control sanitario.

 Estudios epidemiológicos para estimar incidencia de

pérdidas.

 Análisis del material en los programas de mejora.

Cuarentena de material vegetal y esquemas de certificación

de material libre de virus.

 Determinación de la eficacia de las medidas de control:

Lucha contra vectores, termoterapia, cultivo de tejidos, etc.
 Interés del diagnóstico (2)

 Identificación de nuevos patógenos.

 Estudios de funciones en la patogénesis.

 Relaciones taxonómicas y evolutivas.

 Estimación de resistencias en programas de selección y
cruce de plantas silvestres y cultivadas.

 Análisis de resistencias naturales, inducidas,

transformación etc.

 Identificación de vectores de patógenos intracelulares.

TODO ELLO SUPONE: CONTROL

❖ PRODUCCIÓN DE REACTIVOS Y DISEÑO DE

MÉTODOS ESPECÍFICOS, SENSIBLES, FIABLES
Y CAPACES DE SER USADOS EN GRAN
ESCALA CON MATERIAL VEGETAL BRUTO
(Cuarentena, erradicación, selección sanitaria)

❖ SANEAMIENTO (termoterapia, cultivo tejidos

in vitro-regeneración)
❖ PRODUCCIÓN DE PLANTAS RESISTENTES A
LA INFECCIÓN (Mejora genética clásica o
Ingeniería genética)
➢ DETECCIÓN EN NUMEROSAS MUESTRAS,
DE FORMA RÁPIDA, SENSIBLE, ESPECÍFICA,
PRECISA Y A SER POSIBLE DE FORMA
SENCILLA
➢ LOS MÉTODOS UTILIZADOS EN PATOLOGÍA
VEGETAL SON DIRECTOS YA QUE TRATAN DE
DETECTAR LA PRESENCIA DEL AGENTE
PATÓGENO, DE ALGUNA DE SUS DIANAS O
METABOLITOS.

y pueden ser: GENERALES Ó ESPECÍFICOS.

DIAGNÓSTICO DE VIRUS VEGETALES

COMPONENTE COMPONENTE
PROTEICO GENÓMICO

• ISEM • ds RNAS
• DIBA • HIBRIDACIÓN
• INMUNO- TISSUE Bioensayo MOLECULAR (“dot-blot”)
PRINTING • TISSUE-PRINTING
• ELISA • PCR
• NASBA

• Técnicas híbridas:
• Inmuno captura-PCR
• etc.
Laboratorio de Virología Vegetal, INIA, Madrid

¿Qué patógeno tengo?

 ¿Es un ...?

Virus
Fitoplasma

Viroide
Métodos Generales: detectan la presencia del
patógeno, pero no lo identifican.

Plantas indicadoras

✓ Inoculación mecánica
✓ Inoculación por inyección
✓ Inoculación por injerto
✓ Inoculación por cúscuta
Con algunos
huéspedes
diferenciales
es posible
identificar
algunos
virus
La inoculación por injerto de
plantas indicadoras continúa
siendo el único método
empleado para el diagnóstico
de enfermedades de etiología
desconocida
Author(s)
Büttner, C., Bargen, S. von, Bandte, M., Mühlbach, H. P.,2013. Forest Diseases Caused by
Viruses. DOI: 10.1079/9781780640402.0050
Microscopía óptica
Microscopía electrónica
Purificación de RNAs Bicatenarios

RNAs-ds en plantas de cítricos

infectadas con CTV
Métodos específicos: identifican al patógeno, a
nivel de especie.

➢Serología

Elisa Inmunoimpresión

Doble difusión en agar

Existen muchas empresas biotecnológicas que ofrecen reactivos para
diagnóstico de agentes fitopatógenos.
La técnica ELISA convencional ha hecho
posible la realización de millones de
muestras de forma rutinaria.
Su único inconveniente: la necesidad de
realizar extractos
Diferentes métodos
de preparar los
extractos
Hibridación Molecular
Resultados
PCR (Reacción en cadena de
la polimerasa)
 PCR Electroforesis en gel de agarosa

3-4 horas

Producto final Observación en

UV
 Sensibilidad de dos métodos de PCR

243bp

IC-RT-PCR IC-RT-nested-PCR
Secuenciación
 ¿ Como se transmite?

➢ Semillas
➢ Polen
➢ Injertos
➢ Cúscuta
➢ Hongos ➢ Bacteria
➢ Insectos ➢ Nematódos
➢ Ácaros ➢ Suelo

➢ Avión, automóvil, barco, tren, correo, DHL etc

EL HOMBRE
 ¿Tengo un Virus?

CONTROL
¿ Tengo este virus?
INTEGRADO
¿Cómo se transmite?
 MEDIDAS PROTECCIÓN RESISTENCIAS
PREVENTIVAS CRUZADA NATURALES

PROTECCIÓN DE CULTIVOS

RESISTENCIAS
OTRAS MEDIDAS
DERIVADAS DE
SILENCIAMIENTO
PATÓGENO
GÉNICO
MEDIDAS PREVENTIVAS

Medidas encaminadas a eliminar focos de

contaminación así como evitar las dispersión viral
1. Detección viral.
2. Soluciones Antivirales.
3. Tratamientos contra vectores virales.
4. ….
 MEDIDAS PREVENTIVAS
1. Virosis en clavel
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
A
B 30
C
Análisis
D
E
25 Hibridación Molecular
F
G 20
H
% de Limpieza con
I 15 NaOH CarMV
J infección CERV
K
10
L

5
Jabón Lejía Na3PO4 NaOH Dimanin Etanol Etanol
(%) (%) (%) (%) (%) (%) flameado
0,1 0,5 1 3 5 7 2 5 10 0,1 0,5 1 0,1 0,5 25 50 1 100 ml 0
CarMV + + + + + - + + + + - - + + + + - - 1993 1995 may-96 1997
CERV + + + - - - + + - + - - + - + - - -
CLV + + + - - - + + + + - - + - + + - -
CVMV + + + - - - - - - - - - + - + - - - 30.000 muestras/año
CRSV + + + + + - + + + + - - + + + + - -
CIRV + + + + - - + + + + - - + + + + - -

NUEVA SOLUCIÓN DE LIMPIEZA:

NaOH 0,5%

2. Virus de la sharka
Campaña detección y erradicación:
400.000 albaricoqueros y 300.000 ciruelos arrancados en
Valencia y Murcia desde 1992.
GRACIAS
GRACIAS

Madrid, noviembre
2008