SIEMBRA DE LA BACTERIA Rhizobium

Dejar raíz con

tierra Raíces sin tierra

Trébol con Extracción de Transportar al Lavar las

nódulos raíces laboratorio raíces

Colocar los nódulos Separar los

Repetir el Lavar los nódulos en un tubo de
lavado 6 veces desinfectados nódulos
ensaye

Con agua Añadirle 4 ml Con bisturí

Transportar los estéril de NaClO y/o navaja
nódulos a cajas Petri
Agregar 5 Tomarlo con Con la flama del
gotas de agua un asa mechero Fisher

Colocar la mezcla en un
Mezclar Dejar secar Sellar el frotis
portaobjetos (frotis)

TINCION DE GRAM
Realizar tinción de
Gram al frotis

Puente de vidrio Colocar en una tarja

y el frotis

Añadir cristal Cubrir completamente

violeta portaobjetos

Añadir Lugol

Eliminar exceso del Cubrir completamente Eliminar exceso

Agua destilada colorante portaobjetos del colorante
 Safranina de 30 a Acetona de 5
Agua destilada
60 segundos a 10 gotas

Eliminar exceso Enjuagar

Colocar colorante Colocar alcohol
de colorante inmediatamente

Secado Observar al
microscopio a 100x

Aceite de
inmersión

SIEMBRA DE LA BACTERIA Rhizobium

Preparación de los nódulos para la obtención de la bacteria Rhizobium
1. Extraer una pequeña parte del trébol cuidando que las raíces contengan bastante
tierra.
2. Lavar cuidadosamente las raíces del trébol con abundante agua hasta que no queden
residuos de tierra.
3. Separar cuidadosamente con un bisturí y/o navaja, los nódulos de las raíces y
colocarlos en el tubo de ensayo de 13 X 100.
4. Cubrir los nódulos con 4 ml de hipoclorito de sodio (5%), dejar actuar de 1-3
minutos.
5. Lavar los nódulos desinfectados con agua estéril, repetir el lavado mínimo de 6
veces.
6. Transferir los nódulos, en condiciones de sepsis a una caja de Petri estéril y agregar
5 gotas de agua.
7. Mezclar el nódulo con el agua, tomar un asa y colocar esta mezcla en un
portaobjetos (frotis).
8. Dejar secar el frotis, sellar el frotis con la flama del mechero Fisher pasándolo
rápidamente por la flama.
9. Realizar tinción de Gram al frotis.
 TINCION DE GRAM
a) Colocar en la tarja un puente de vidrio y colocar el frotis.
b) Colocar cristal violeta hasta cubrir completamente el portaobjetos y dejar actuar 1
minuto.
c) Eliminar el exceso del colorante con agua destilada.
d) Colocar Lugol hasta cubrir completamente el portaobjetos y dejar actuar durante 1
minuto.
e) Eliminar el exceso del colorante con agua destilada.
f) Colocar Alcohol – acetona de 5 – 10 gotas y enjuagar inmediatamente.
g) Colocar colorante Safranina de 30-60 segundos.
h) Eliminar el exceso del colorante con agua destilada
i) Dejar secar cerca del mechero Fisher.
j) Observar al microscopio a 100x con aceite de inmersión.
 PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

gr de Agar sal manitol 500 ml de gr de ASM

con rojo Congo agua

Pesar en balanza Verter en

Añadir al Homogenizar
granataria matraz
matraz hasta disolver
graduado

Esperar Esterilizar Agregar 500

Taparlo ml
enfriamiento autoclave

15 min a 120 °C Gorro de papel de Agua

estraza y cinta
Sacar y dejar enfriar
Por cada
vaciado Medio de siembra

Esperar a que
Encender Flamear boca del matraz Vaciar a cajas
solidifique
mechero Petri

Poner en
refrigeración

PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

1. En una balanza granataria pesar gr de Agar sal manitol con rojo Congo.
2. En un matraz graduado agregar 500 ml de agua, añadir el gr de Agar y homogenizar
hasta que se disuelva perfectamente.
3. Agregar los otros 500 ml de agua, taparlo con un tapón de gasa.
4. Tapar con un gorro hecho de papel estraza con cinta indicadora.
5. Esterilizar en el autoclave 15 min a 120°C
6. Posterior al tiempo de esterilizado sacar y dejar enfriar solo un poco.
7. Prender el mechero, para poder vaciar en las cajas Petri. Para el vaciado es
importante flamear la boa del matraz cada vez que se vaya a vaciar en las cajas
Petri.
8. Dejar enfriar hasta que se hagan sólidas.
 SEMBRADO EN LOS MEDIOS DE CULTIVO
Con bisturí y/o
9. Almacenar para posteriormente sembrar en ellas. navaja
Raiz con tierra del Abundante
trébol agua

Transportar a Separar
Extracción Lavar Raíz
laboratorio nódulos

Agua esteril

Lavar nódulos Colocar en tubo

Dejar actuar Cubrir nódulos de ensaye
desinfectados

6 veces

4 ml de hipoclorito de Tubo de 13
1 a 3 minutos
sodio al 5% x 100
Repetir lavado
Agregar 5 Por estriado en
gotas de agua Asa disolución
bacteriológica

Sembrar en caja
Transferir Caja Petri esteril Tomar muestra Petri
nódulos

En condiciones de A 28 °C Incubar
sepsis por 7 dias

Aplicar nuevamente Seleccionar Observar

Prepara frotis
tinción gram colonias desarrollo

Blancas y mucosas

Observar en Presencia de Gram

microoscopio Negativos bacilos cortos
 SEMBRADO EN LOS MEDIOS DE CULTIVO
1. Extraer una pequeña parte del trébol cuidando que las raíces contengan bastante
tierra.
2. Lavar cuidadosamente las raíces del trébol con abundante agua hasta que no queden
residuos de tierra.
3. Separar cuidadosamente con un bisturí y/o navaja, los nódulos de las raíces y
colocarlos en el tubo de ensayo de 13 X 100.
4. Cubrir los nódulos con 4 ml de hipoclorito de sodio (5%), dejar actuar de 1-3
minutos.
5. Lavar los nódulos desinfectados con agua estéril, repetir el lavado mínimo de 6
veces
6. Transferir los nódulos, en condiciones de sepsis a una caja de Petri estéril y agregar
5 gotas de agua.
7. Con un asa bacteriológica tomar un poco de esta mezcla y sembrar en la caja Petri
por estriado en dilución.
8. Incubar a 28 °C de 3 a 7 días.
9. Observar el desarrollo de la bacteria en el medio de cultivo, seleccionar colonias
aisladas blancas y mucosas (Ver Anexo…)
10. A partir de una de las colonias típicas seleccionadas, preparar un frotis, y aplicar
nuevamente una tinción de Gram y observar al microscopio, al observar deben
existir la presencia de Gram Negativos bacilos cortos (ver anexo…)