Planteamiento del Problema

La leche cruda ahora se consume en varias naciones europeas (incluidas Italia, Eslovaquia,
Austria, Francia y otras), y generalmente se suministra a los clientes en forma de paquete o
mediante máquinas expendedoras, mientras que los queseros locales la utilizan para fabricar
quesos artesanales de leche cruda. La leche cruda, por otro lado, es innegablemente peligrosa
para la salud humana. Varias enfermedades y brotes de origen alimentario se han relacionado
con la ingesta de leche cruda y quesos artesanales debido a E. coli (EFSA, 2015). (Yoon, Lee y
Choi, 2016). Varios estudios han enfatizado las vías de contaminación del patógeno en las
primeras etapas de la producción de leche cruda, así como su proliferación en condiciones
favorables a lo largo de la cadena de suministro de leche (Perrin et al., 2015).

La ganadería lechera en Francia es actualmente una combinación de ganadería lechera a

pequeña, mediana y gran escala, siendo la pequeña escala la más frecuente, aunque la
ganadería lechera a gran escala es común en países de clima cálido como el Medio Oriente. Los
entornos de cría en este último sistema se distinguen por la presencia de equipos altamente
mecanizados y la estricta aplicación de requisitos higiénicos. Esta configuración incluye todo,
desde la cría de vacas hasta el transporte de leche cruda: prácticas veterinarias adecuadas,
control de calidad de la leche, gestión de la cadena de frío, etc. Esta técnica es responsable de
una alta productividad de leche, leche segura y un suministro constante de productos lácteos
al mercado, particularmente en áreas que antes se consideraban inadecuadas para la
producción de leche (Alqaisi, Ndambi, Uddin y Hemme, 2010). Dichos países de clima cálido
pueden ayudar a comprender lo que puede ocurrir en el futuro para varios países europeos
que ya experimentan fluctuaciones de temperatura debido al cambio climático. En este
sentido, los estudios sobre el estado microbiológico actual de los alimentos expuestos a
condiciones climáticas cálidas podrían utilizarse como sustituto o representación de posibles
implicaciones futuras para la inocuidad de los alimentos.

El Ministerio de Agricultura francés ahora regula la leche cruda destinada al consumo humano
mediante una orden administrativa (Minist'ere de l'agriculture, de l'agroalimentaire et de la
foret, 2012). Este decreto estipula la forma en que se puede vender el producto de leche
cruda, el tiempo límite desde el ordeño hasta el consumo y cómo se debe mantener la cadena
de frío. La leche cruda se proporciona a los consumidores en Francia envasada oa través de
máquinas expendedoras. Estas normas tienen por objeto cumplir los criterios de higiene de la
leche cruda frente a riesgos microbiológicos como E. coli, que es un contaminante frecuente
en la leche cruda y una indicación de criterios de higiene comúnmente utilizada (EFSA, 2015;
Martin, Trmci'c, Hsieh, Boor, y Wiedman, 2016). Varios estudios informaron el efecto
estacional sobre E. coli en el ganado, incluidos Fairbrother y Nadeau (2006), Hussein y Sakuma
(2005) y Ranjbar, Safarpoor Dehkordi, Sakhaei Shahreza y Rahimi (2018). Además, Benjamin,
Jay-Russell, Atwill, Cooley, Carychao, Larsen y Mandrell (2015) descubrieron un aumento
positivo de E. coli O157 con la temperatura del suelo (de 21 C a 261) en su análisis longitudinal
de factores de riesgo realizado en diferentes ranchos. ubicado en la costa central de California.
De acuerdo con las pautas de higiene, la concentración de E. coli en la leche cruda no puede
exceder los 2 log CFU/mL según los planes de muestreo de atributos de tres clases (Minist'ere
de l'agriculture, de l'agroalimentaire, et de la foret, 2012). Además, los productores de leche
franceses que venden leche cruda en los mercados locales respetan un requisito de higiene
interna en el que la concentración de E. coli en la leche cruda se limita a 1 log CFU/mL antes de
la venta al por menor (información proporcionada por un experto francés en producción de
leche cruda).
En este contexto, el objetivo de este trabajo fue desarrollar un modelo probabilístico para
estimar la concentración de E. coli en la leche cruda e investigar qué sucedería con la leche
cruda vendida en Francia en condiciones de cambio climático. Los enfoques de modelado
probabilístico son extremadamente útiles ya que permiten la simulación de situaciones al
tiempo que tienen en cuenta la incertidumbre y la imprevisibilidad (Koutsoumanis & Aspridou,
2016; Nauta, 2000). Se han utilizado modelos probabilísticos en la leche pasteurizada para
evaluar la seguridad de los organismos de deterioro, incluido E.coli O157:H7 (Schaffner,
Mcentire, Duffy, Montville y Smith, 2003). (Clough, Clancy y French, 2006). Este enfoque de
modelado se ha utilizado en la leche cruda para evaluar la seguridad frente a peligros
microbiológicos como Listeria monocytogenes y peligros químicos como la toxina SEA (Latorre
et al., 2011). (Crotta et al., 2016; Heidinger, Winter y Cullor, 2009). Utilizando técnicas de
modelado probabilístico, se realizaron evaluaciones de riesgo de E. coli O157:H7 en leche
cruda para determinar infecciones después del consumo de leche cruda (Giacometti et al.,
2012; Grace et al., 2008). Estas investigaciones reflejan dos escenarios minoristas distintos:
Giacometti et al. (2012) evaluaron el peligro de la venta de leche cruda, mientras que Grace et
al. (2008) evaluaron el riesgo de la leche cruda comercializada informalmente.

La primera contribución del trabajo descrito aquí es el desarrollo de un modelo de evaluación

probabilística de la granja a la mesa para analizar las concentraciones de E. coli en entornos de
clima cálido. Se recopiló y analizó un conjunto de datos original de una granja a gran escala en
el Reino de Arabia Saudita para este propósito, y luego se agregaron al modelo los métodos
actuales de manejo de leche cruda en Francia para ejecutar un escenario realista. El segundo
aspecto innovador de este trabajo es la aplicación de un modelo Monte Carlo de segundo
orden al consumo de leche cruda y la interpretación de sus resultados mediante análisis de
sensibilidad.

Los pasos actuales por los que pasa la leche cruda antes del consumo se utilizaron para dividir
el modelo en cuatro módulos (Tabla 1). Para cada módulo, también se presentan entradas y
variables latentes (es decir, no observadas ni medidas directamente pero utilizadas en el
modelo). Como la duración total del tiempo desde el ordeño hasta el consumo fue de 72 h
como máximo, se fijó la duración de los escenarios en cada uno de los módulos para cumplir
con este lapso de tiempo.

2. Materiales y métodos

2.1. Descripcion del modelo

2.5. Determinación de parámetros cinéticos de crecimiento.

Los parámetros de crecimiento de E. coli en la leche se obtuvieron de la literatura y Combase.

Primero, la búsqueda bibliográfica se realizó en Web of Science usando la combinación de los
términos del tema: crecimiento y (crudo y leche), y (Escherichia y coli) y (Temperatura). Estos
términos produjeron 77 artículos de investigación y se filtraron en función de sus títulos para
mantener solo la leche como medio de suspensión (es decir, se descartaron los estudios de
queso de leche cruda). Además, se excluyeron los estudios de prueba de desafío que
incluyeron E. coli en presencia de antimicrobianos. Cuando los estudios de crecimiento se
realizaron en un valor de temperatura, el artículo también se descartó. De esta búsqueda se
retuvieron tres trabajos de investigación, todos provenientes de un laboratorio de
investigación (Aˇcai, Valík, Medved'Ov´a, & Rosskopf, 2016; Medveˇdov´a, Gy¨oriov´a, Lehotov
´a, & Valík, 2020; Medveˇdov´a, Rosskopf, Lipt´akov´a, & Valík, 2018). Estos trabajos han
utilizado sólo una cepa de E. coli que se ha aislado de un queso de leche cruda. Los estudios de
crecimiento obtenidos a partir de estos papeles estaban estrictamente por debajo de los 30 ◦C.

En segundo lugar, los resultados de Combase también se utilizaron para obtener la cinética de
crecimiento de E. coli en leche cruda con los siguientes criterios de búsqueda: microorganismo
(E. coli), alimento (leche), Aw (0,95–1,00), Temperatura (<30 ◦C). Esto arrojó 24 registros, pero
se descartaron cuatro curvas de crecimiento porque E. coli se cultivó en leche fermentada.
Esta forma de leche podría contener metabolitos producidos por bacterias del ácido láctico
(BAL) que podrían haber ejercido propiedades inhibitorias durante el crecimiento de los otros
microorganismos. Las 20 curvas de crecimiento que se conservaron provienen de un artículo
de investigación (Kauppi, Tatini, Harrell y Feng, 1996).

La lista de cepas de E.coli obtenidas de ambos recursos (es decir, literatura y ComBase), sus
orígenes y las condiciones de temperatura se presentan en la Tabla 2.

Los investigadores estimaron el μmax obtenido de la literatura y de Combase utilizando el

modelo de Baranyi y Roberts. A continuación, para tener en cuenta la variabilidad de las
deformaciones, cada conjunto de datos de deformaciones se analizó por separado. La raíz
cuadrada de las tasas máximas de crecimiento (μmax) se ajustó frente a los valores de
temperatura. Se utilizó una ecuación derivada del modelo de Ratkowsky (Eq. (1)) para estimar
los parámetros, ya que los valores de temperatura eran subóptimos (<30 ◦C) (Ratkowsky,
Lowry, McMeekin, Stokes, & Chandler, 1983). La pendiente y el intercepto de la recta se
estimaron mediante regresión lineal en R utilizando la función lm para finalmente obtener la
Tmin, Eq. (2).

Para determinar el crecimiento potencial de E. coli (Δ log N) después de diferentes valores de

tiempo de almacenamiento en los módulos de venta al por menor y de consumo, se utilizó el
modelo exponencial, considerando la Eq. (3) (Nauta, Litman, Barker y Carlin, 2003).

La fase de empaquetado, que es un proceso de partición, se detalló utilizando la distribución

de Poisson propuesta por Nauta (2005). Cabe destacar que no se ha considerado la posible
variación en el volumen de acondicionamiento (dependiendo del tipo de equipo disponible en
la granja); esto podría haber tenido un impacto si la contaminación hubiera sido
sustancialmente menor. Sin embargo, en general, la partición es un paso crucial a considerar
cuando se desarrolla un modelo de la granja a la mesa.

Algunas bacterias E. coli pueden seguir proliferando en la leche cruda durante la venta al por
menor y el almacenamiento del consumidor, ya que la temperatura no está estrictamente
regulada a valores inferiores a 4 C y se tolera una tolerancia de hasta 8 C para vender leche
cruda en los mercados locales franceses (información proporcionado por un experto francés
en cultivo de leche cruda). Las condiciones actuales durante la venta al por menor revelaron
que un cambio de 12 horas en la concentración media estimada entre el envasado y después
de la venta al por menor resultó en un aumento de 0,22 log CFU/mL (0,23 log CFU/mL en el
percentil 95) (log N retail). Esto demuestra la importancia de la estrategia francesa de
preservar la cadena de frío durante la venta al por menor de leche cruda (máximo 8 C, máximo
12 h) para controlar los niveles de concentración de E. coli.
Los resultados del modelo, por otro lado, mostraron un aumento de E. coli durante los
diferentes escenarios de refrigeración del cliente (consumidor de log N), con la concentración
media prevista aumentando a 0,2 log (12 h), 0,58 log (36 h) y 0,88 log (60 h) log UFC/mL.
Debido a que se realizó un análisis probabilístico, el resultado también se puede interpretar
utilizando el percentil 95 de la distribución: en ese caso, el crecimiento alcanzó hasta 0,35 (12
h), 1,45 (36 h) y 2,75 (60 h) log CFU /mL. En cuanto a la variación de la temperatura doméstica,
existen dos fenómenos distintos: la variación de la temperatura del refrigerador de un hogar a
otro (Roccato et al. 2017) y la variación de la temperatura durante el día para un refrigerador
doméstico dado (Evans & Redmond, 2016) si, por ejemplo, el consumidor abre el frigorífico
para servirse un vaso de leche. La primera fuente de variabilidad se incorporó al modelo,
mientras que la segunda no se debió a la falta de datos para desarrollar una fluctuación
dinámica de la temperatura sin introducir demasiada incertidumbre. Se espera que la
variabilidad diaria de la temperatura tenga una influencia perjudicial en el nivel de
contaminación final, lo que resulta en una subestimación de la cantidad de exposición.

En general, si las concentraciones de E. coli notificadas en climas cálidos se convierten en la

norma para la Francia metropolitana en el futuro, la ingesta de leche cruda puede ser motivo
de preocupación. Esto se debe principalmente a que, como lo demuestra el modelo
probabilístico actual, el nivel inicial de contaminación por E. coli dará como resultado que la
leche cruda envasada no alcance el límite de 2 logaritmos, incluso si se mantiene la cadena de
frío. Sin embargo, el tiempo máximo de almacenamiento de 72 horas puede cuestionarse en el
futuro porque agrega una carga a la contaminación final.

El modelo construido también pudo demostrar el impacto de la incertidumbre y la variabilidad

en los resultados esperados. Para mejorar la precisión de la estimación de salida, la
incertidumbre de las entradas debe propagarse a través del modelo independientemente de la
variabilidad utilizando la técnica Monte Carlo de segundo orden (Duqu'e, Canon, Haddad,
Guillou y Membr'e, 2021). Como resultado, las estimaciones del modelo (es decir, las
características de distribución de probabilidad, como la media, el percentil 95, la probabilidad
de superar 1 o 2 log CFU/mL) se proporcionan con rangos de confianza que indican
incertidumbre. Además, aquí se demostró que la separación de incertidumbre y variabilidad es
relativamente simple de ejecutar. Esto, sin embargo, se produce a expensas de solicitar
información adicional sobre los datos. Se espera que esto conduzca a artículos adicionales de
evaluación de la exposición que utilicen la separación de la incertidumbre y la variabilidad en
sus modelos en el futuro. No obstante, aquí se demostró que Tmin tiene un amplio rango de
fluctuación e incertidumbre. El amplio rango variable reflejó el hecho de que las cepas de E.coli
pueden crecer a una variedad de temperaturas. En este sentido, nuestro modelo de evaluación
es seguro porque incluye cepas de E. coli tanto patógenas como no patógenas; De hecho, se ha
demostrado que las cepas patógenas de E. coli crecen y sobreviven a temperaturas más bajas
que las no patógenas (Farrokh et al., 2013; Vidovic, Mangalappalli-Illathu y Korber, 2011).

A pesar de que nuestro modelo fue de la granja a la mesa, es crucial recordar que el cambio
climático es un fenómeno multifacético que puede afectar varios aspectos de la cadena de
suministro de productos lácteos. Como resultado, se pueden observar otros efectos probables
del cambio climático (p. ej., temperatura más alta durante el transporte, interrupción de la
cadena de suministro debido a inundaciones). Estos sucesos, como permitir o promover el
crecimiento de E. coli, pueden tener ramificaciones para la seguridad y la calidad de los
alimentos. Una vez que se determinen, los métodos para incorporarlos al modelo
probabilístico creado se pueden investigar más en el futuro.

4.2. Uso de clima cálido y E. coli como organismos de prueba para comprender mejor el futuro
del consumo de leche cruda

De acuerdo con el presente modelo probabilístico, la ingesta de leche cruda puede plantear
problemas de calidad microbiológica de los alimentos en el futuro debido a las condiciones
climáticas cálidas provocadas por el cambio climático. Se adquirieron datos de una granja
lechera en Arabia Saudita para comprender mejor la influencia potencial de las condiciones
climáticas cálidas en la leche cruda. Se pensó que estos eran ilustrativos de cómo serían los
primeros recuentos microbianos en el futuro para los países que experimentan cambios de
temperatura debido al cambio climático. La elección de esta granja proporcionó una idea de
cómo podría ser la calidad microbiológica en el futuro en condiciones de clima cálido. Es
posible una comparación con las explotaciones en Francia ya que la granja elegida para
nuestro estudio cría vacas de raza Holstein (una raza muy extendida en Francia para la
producción de leche). Además, las mejores técnicas de producción lechera, como las buenas
prácticas veterinarias (GVP) y las buenas prácticas de higiene (GHP), que se utilizan en la granja
son equivalentes a las que se utilizan en otros lugares, con la única variación de su ubicación y
las condiciones climáticas cálidas.

Los recuentos de E. coli de los tanques de leche a granel se recopilaron y analizaron como
parte de las operaciones habituales. Estos se utilizaron para evaluar la contaminación de la
leche cruda inmediatamente después de la etapa de ordeño. Esta técnica respalda la idea de
que la ruta de contaminación por E. coli en la cadena de suministro de productos lácteos
comienza en las primeras etapas de la cadena de suministro de leche cruda (Perrin et al.,
2015). E. coli se empleó en esta investigación porque, además de ser un peligro microbiológico
prevalente asociado con el consumo de leche cruda, también es una bacteria que se espera
que represente un problema en el futuro para la leche cruda producida en condiciones de
clima cálido (Fairbrother & Nadaau, 2006). Se ha observado comúnmente que E. coli sobrevive
y se multiplica en climas cálidos y durante la temporada de verano (Hussein y Sakuma, 2005;
Ranjbar, Safarpoor Dehkordi, Sakhaei Shahreza y Rahimi, 2018). Además, es bien conocido por
su prevalencia dentro de las granjas, lo que se ve facilitado por el aumento de la muda de
vacas y el crecimiento del alimento, los cuales ocurren con frecuencia en condiciones de clima
cálido (Fairbrother & Nadeau, 2006).

Como resultado de los hallazgos del modelo, es posible que sea necesario reconsiderar la
práctica existente de beber leche cruda en Francia, ya que las normas de limpieza actuales
para la leche cruda envasada pueden ser difíciles de cumplir en el futuro si las condiciones más
calurosas se convierten en la norma. El valor medio calculado en la concentración inicial (log
N0) fue de 1,33 log CFU/mL, pero el percentil 95 fue de 2,19 log CFU/mL. Esto no está de
acuerdo con el límite de 2 log para el criterio de higiene de E. coli en Francia (Minist'ere de
l'agriculture, de l'agroalimentaire et de la foret, 2012): se calculó que el 10 % de los envases de
leche cruda superó el criterio. No obstante, este número proyectado parece ser consistente
con otros lugares, como el estado de Nueva York (el 23 % de los productores de leche tenían
más de 2 logaritmos) (Boor, Brown, Murphy, Kozlowski y Bandler, 1998). Es fundamental
recordar que estos hallazgos no constituyen un peligro para la seguridad, sino una
preocupación sanitaria. La presencia de altos niveles de E. coli indica contaminación fecal, que
es un indicador de la higiene de la granja y las prácticas veterinarias asociadas (Martin et al.,
2016). Se informó que las cepas patógenas de E. coli generadoras de toxina Shiga se
recuperaron en el 0,4-1,7 % de la leche cruda de la UE (entre 2005 y 2008), mientras que en
Francia se encontraron aislados en el 3,4-15 % de las muestras (Farrokh et al., 2013).

Los sistemas de producción lechera, como el que se usó en este estudio, crían vacas de raza
Holstein en grandes edificios de granja con ventilación natural donde no salen o solo por un
corto período de tiempo durante el día porque las vacas sufren estrés por calor cuando se
exponen a temperaturas superiores a 25 grados centígrados (información proporcionada por
un experto veterinario francés). Aunque estas técnicas se pueden encontrar en Europa, la
aceptación en estos entornos agrícolas es diferente. Esto es especialmente cierto en Francia,
donde las granjas lecheras son medianas y los equipos de producción se utilizan ampliamente
(Poczta, 'Sredzi'nska y Chenczke, 2020). No obstante, esta técnica se está utilizando en el sur
de Francia, donde la aparición recurrente de olas de calor durante el verano ha acelerado su
adopción (información facilitada por un experto veterinario francés). Otra barrera para una
adopción más amplia es la transición hacia la sostenibilidad a través de la eficiencia de los
recursos, la instalación de mecanismos de recuperación y la demanda de los consumidores
para devolver a los agricultores localizados (Thorpe, Schmalzried y Fallon, 2010). Estos
obstáculos de aceptación pueden impedir la adopción actual, pero dado el aumento de las
consecuencias del cambio climático, es posible que no la prohíban por completo. En general,
se cree que las implicaciones de los hallazgos de este estudio serían valiosas para comprender
la influencia de las condiciones climáticas cálidas provocadas por el cambio climático en la
calidad microbiológica de la leche cruda, que es probable que se vuelva más evidente.