Extracción de ADN Genómico

Para que extraer ADN?

• DNA fingerprinting
• Medicina forense: investigaciones criminales
• Pruebas de paternidad
• Análisis/determinación de ancestros
• Pruebas médicas/clínicas de diagnóstico
• Ingeniería genética/biotecnología
• Desarrollo de vacunas, hormonas
DNA fingerprinting
Métodos de extracción: células sanguíneas
Etapas del proceso de extracción de ADN
1. Separación de células sanguíneas
• Centrifugación: separar leucocitos
• Superior: parte líquida (Plasma). Que es Suero?
• Inferior: eritrocitos
• Medio: leucocitos + plaquetas
2. Rompimiento de leucocitos (Lisis)
• Detergentes: desestabilizan membrana citoplasmática
• SDS, Triton X100
• Adición de químicos protectores del ADN
• Tris HCl: buffer
• Sacarosa: mantener osmolaridad
• MgCl2: inactiva Dnases (ADNasas) y separación de proteínas
Etapas del proceso de extracción de ADN
3. Separación del ADN de proteínas y otros desechos celulares
• Cloruro de sodio 6M: Precipitación de proteínas (alta concentración de sal)
• Perclorato de sodio 5M: remover detergente (lisis) y proteínas
• EDTA: inhibir DNases
• Sodio (carga positiva): ayudan a separación ADN – Agua. Porque?
4. Purificación/limpieza del ADN
• Etanol absoluto frío: separar el ADN (insoluble en etanol)
• ADN se observa como precipitado incoloro (”fibras”)
• Etanol 70%: remover impurezas (limpiar)
• Agua ultrapura: resuspensión y mantenimiento del ADN
5. Confirmación de la presencia de ADN en la muestra
• Gel de agarosa (próximo lab)
Discusion
1. Cual es la funcion de SDS y Triton X en la lisis celular?
2. Porque se deben inactivar las ADNasas durante la extraccion de ADN?
3. Explique brevemente porque las proteinas se precipitan en soluciones
con alta concentracion salina
4. Porque se utiliza sales de sodio para separar el ADN de soluciones
acuosas?
5. Porque etanol a bajas temperaturas incrementa la precipitacion del
ADN?
6. Algunos procedimientos de extraccion utilizan la enzima Proteinase K.
Cual es la funcion de esta enzima durante la extraccion
7. Algunos procedimientos de extraccion utilizan Fenol. Porque?
Procedimiento
Procedimiento
Procedimiento