UNIVERSIDAD LAICA “ELOY ALFARO”DE MANABÍ

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

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UNIVERSIDAD LAICA ELOY ALFARO DE MANABÍ

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

CARRERA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

ANTEPROYECTO

TEMA:

Estudio antimicrobiano in vitro de extractos de semillas de cuatro variedades de

papaya (Carica papaya L.) frente a Escherichia coli, Salmonella spp y Listeria
monocytogenes.

AUTOR:
Jimena Omayra Gavilanez Rosado
Paul Isaac Burgos Palma

TUTOR:
PhD. Víctor Otero Tuárez

MANTA - MANABI - ECUADOR

2021
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1. TEMA:

Estudio antimicrobiano in vitro de extractos de semillas de cuatro variedades de

papaya (Carica papaya L.) frente a Escherichia coli, Salmonella spp y Listeria
monocytogenes.

2. ANTECEDENTES
2.1. ESTADO ACTUAL DEL TEMA

Debido a las nuevas tendencias en cuidado de la salud, el consumo de frutas

exóticas se ha incrementado dramáticamente en los últimos años (Parniakov et
al., 2015). La industria alimentaria, ha creado alimentos funcionales enfocados
a lo “natural y saludable” utilizando diversas pulpas y jugos de frutas. Este tipo
de productos, ya sean procesados o no, utilizan una parte de la fruta, dejando
de lado algunos subproductos como las cáscaras (Dorta et al., 2011). La
papaya, forma parte de los frutos económicamente más importantes a nivel
mundial, del cual se separan las semillas y la cáscara, considerándose esta
última, un problema de eliminación, ya que contribuye a la contaminación
orgánica (Koubala et al., 2014).

La papaya (Carita papaya L) tiene una importancia económica mundial, debido

a su alta actividad antioxidantes y su agradable aroma (Nieto et al., 2016). Esta
fruta pertenece a la familiar Caricaceae y es originaria de las regiones
tropicales y subtropicales de América y África (Yanty et al., 2014).

Es un fruto de grandes propiedades nutricionales y funcionales, principalmente

de vitamina C y compuestos fenólicos con valores superiores a muchos frutos
de consumo tradicional, al mismo tiempo, es fruto de vida útil corta por lo cual,
se debe aportar con opciones tecnológicas que solucionen los problemas de la
sociedad involucrada. El consumo de este fruto es muy escaso, debido al poco
conocimiento sobre sus beneficios. En países como Chile y Ecuador es fruto
reconocido y consumido en comida gourmet y otras presentaciones. También,
es transformada por la industria, en almíbar y mermeladas (Balcázar, 2014).
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En Carica papaya L. se han identificado metabolitos secundarios (MS) como
compuestos de carácter fenólico en diversos tipos de tejido, tales como hoja,
tallo y raíz de importancia industrial y farmacéutica (Flores, 2017). El contenido
de compuestos en las plantas y frutos tiene variaciones que dependen del
genotipo, especie, condiciones ambientales, grado de madurez, composición
del suelo, ubicación geográfica y condiciones de almacenamiento (Valencia et
al., 2017).

La semilla de papaya se caracteriza por ser bitegumentada, pues el tegumento

interno origina el tegmen y el externo a la testa, la cual es multiplicativa hasta
con 60 capas y tres estratos distintivos: endotesta, mesotesta y exotesta
(sarcotesta). Ésta última de consistencia semipermeable, humedad alta y
concentra compuestos fenólicos que, en conjunto, inducen latencia (Kubitzki,
2003). Lo anterior, ocasiona la inhibición del intercambio de líquidos y gases,
deshidratación tardía y colonización de microorganismos patógenos
(Tokuhisa et al., 2007).

Se destaca la utilización de sus semillas como desparasitante y antipirético,

además de sus propiedades medicinales como antiséptico, antiparasitario,
antiinflamatorio, antidiabético y anticonceptivo (Cuéllar et al., 2012; Bamisaye
et al., 2013). Asimismo, por su alto contenido de papaína, esta fruta que tiene
gran aceptación en los mercados internacionales para uso en la industria
farmacéutica y en la de alimentos como ablandador de carne. (Morales y
Duque, 2005).
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3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

A nivel global, se calcula que se pierden 1,3 billones de toneladas anuales de

alimentos producidos (Vilariño et al., 2017; Xue y Liu, 2019; Abbade, 2020). Las
pérdidas pueden ocurrir en cualquier etapa a lo largo de toda la cadena de
producción, desde la etapa de producción agraria hasta el consumo por parte
del cliente final (Vilariño et al., 2017). Los productos vegetales, especialmente
las frutas, poseen una variedad de compuestos químicos que actúan como
agentes antioxidantes, sustancias que pueden neutralizar, prevenir o retrasar
gran parte del proceso de oxidación (Cheok et al., 2018; Ben-Othman et al.,
2020). La presencia de las vitaminas C, E y otros compuestos bioactivos son
los principales antioxidantes presentes, siendo los fenoles el grupo más
importante y prominente que actúan de forma directa e independiente del
sistema enzimático (Coronado et al., 2015). Los grupos hidroxilo de los
compuestos fenólicos son los principales secuestradores de los radicales libres
durante el proceso oxidativo (Mosquera et al., 2016; Zeb, 2020).

En el procesamiento del fruto (Carica papaya L) se obtiene como desecho, una

cantidad importante de cáscara, semillas y fibras. El destino final de estos
subproductos es disponerlas en sitios inadecuados, o verterlas en fuentes de
agua, generando procesos de contaminación ambiental y desarrollo de
enfermedades (Zhang et al., 2017; Bugge et al., 2019).

En la literatura no hay muchas investigaciones relacionadas con el uso

industrial de estos residuos, pero existen sustancias como: pectina,
carotenoides, polifenoles, vitaminas, entre otros (Nieto et al., 2016; Gold et al.,
2017; Zhang et al., 2017); que son utilizados en el ámbito alimentario,
farmacéutico o cosmetológico, ya que previenen y combaten algunas
enfermedades degenerativas al actuar como antioxidantes bioactivos (Ordoñez
et al., 2013; Ordoñez et al., 2014).

El presente proyecto se basa en la línea 8 de investigación que trata del

Desarrollo de programas y proyectos encaminados a incrementar el valor
agregado de las producciones del sector agropecuario identificado en las
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cadenas productivas, dispuesto por la Universidad Laica “Eloy Alfaro” de
Manabí.

4. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

 ¿Cuál será el grado de capacidad antimicrobiana, de los extractos de

semillas en las cuatro variedades de papaya, frente a las cepas
patógenas seleccionadas para el estudio?

5. HIPOTESIS

 Los extractos de semilla de las cuatro variedades de papaya, tienen

capacidad antimicrobiana frente a las cepas patógenas seleccionadas
para el estudio.

6. OBJETIVOS DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN

6.1. OBJETIVO GENERAL

 Determinar la capacidad antimicrobiana de los extractos de semilla de

cuatro variedades de papaya, para inhibir el crecimiento de bacterias
patógenas en los alimentos.

6.2. OBJETIVO ESPECIFICO

 Cuantificar el contenido total de polifenoles presentes en los extractos de

semillas en cuatro variedades de papayas.
 Evaluar el poder antimicrobiano de los extractos de semilla de cuatro
variedades de papaya frente a Escherichia coli, Salmonella spp y
Listeria monocytogenes.
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7. METODOLOGIA

UBICACIÓN DEL LABORATORIO DE INVESTIGACIÓN

Para la presente investigación se realizará en los laboratorios de la Facultad de

Ciencias Agropecuarias de la Universidad Laica Eloy Alfaro de Manabí.

7.1. Diseño Experimental N° 1

7.1.1. Variables
7.1.1.1. Variables Independientes
A. Parte Anatómica de la papaya
1. Extracto de semilla Solo
2. Extracto de semilla Tainung
3. Extracto de semilla Maradol
4. Extracto de semilla Hawaina

B. Concentración de Compuestos fenólicos

1. 0,5 %
2. 1 %
3. 2 %

C. Microorganismos
1. Listeria monocytogenes
2. Escherichia coli
3. Salmonella spp

7.1.1.2. Variables Dependientes

1. Contenido total de polifenoles
2. Capacidad antimicrobiana
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7.2. DISEÑO EXPERIMENTAL

7.2.1. Tipo de diseño 

Para la investigación se utilizará un diseño completamente al azar con un

arreglo Trifactorial.

7.2.2. Análisis Estadístico

Se realizará un análisis de varianza ADEVA y la prueba mínima de

comparación de acuerdo con Tukey al 5%. Todos los datos serán analizados
por triplicado y los resultados serán procesados por el programa informático
Infostat versión 2020.

Tabla 1. Análisis de Varianza (ANOVA) del diseño experimental

Fuente de G.L
variación
Total (t*r - 1) 107
Tratamientos (t - 1) 35
Repetición  r-1 2
Factor A FA - 1 3
Factor B FB - 1 2
Factor C FC - 1 2
Interacción (AxB) (FA * FB) 6
Interacción (AxC) (FA * FC) 6
Interacción (BxC) (FB * FC) 4
Interacción (AXBXC) (FA * FB * FC) 12
Control C-1 2
Error experimental (t-1) (r-1) 70

Coeficiente de variación (%) CV=

√CM ERROR ∗100
X
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7.3.3.- Tratamientos

En la tabla N° 2, del diseño experimental se muestran los 36 tratamientos de

las combinaciones de los factores de estudio tales como; A: parte anatómica
de la papaya B: concentraciones de compuestos fenólicos y C:
microorganismos.

Tabla 2. Tratamientos de estudio

Concentración
N Mejores
Tratamientos de Compuestos Microorganismos
° tratamientos
fenólicos
Extracto de
1 A1B1C1 0,5 % L. monocytogenes
semilla Solo
Extracto de
2 A1B1C2 0,5 % E. Coli
semilla Solo
Extracto de
3 A1B1C3 0,5 % Salmonella spp
semilla Solo
Extracto de
4 A1B2C1 1% L. monocytogenes
semilla Solo
Extracto de
5 A1B2C2 1% E. Coli
semilla Solo
Extracto de
6 A1B2C3 1% Salmonella spp
semilla Solo
Extracto de
7 A1B3C1 2% L. monocytogenes
semilla Solo
Extracto de
8 A1B3C2 2% E. Coli
semilla Solo
Extracto de
9 A1B3C3 2% Salmonella spp
semilla Solo
Extracto de
10 A2B1C1 0,5 % L. monocytogenes
semilla Tauning
Extracto de
11 A2B1C2 0,5 % E. Coli
semilla Tauning
Extracto de
12 A2B1C3 0,5 % Salmonella spp
semilla Tauning
Extracto de
13 A2B2C1 1% L. monocytogenes
semilla Tauning
Extracto de
14 A2B2C2 1% E. Coli
semilla Tauning
Extracto de
15 A2B2C3 1% Salmonella spp
semilla Tauning
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Extracto de
16 A2B3C1 2% L. monocytogenes
semilla Tauning
Extracto de
17 A2B3C2 2% E. Coli
semilla Tauning
Extracto de
18 A2B3C3 2% Salmonella spp
semilla Tauning
Extracto de
19 A3B1C1 0,5 % L. monocytogenes
semilla Maradol
Extracto de
20 A3B1C2 0,5 % E. Coli
semilla Maradol
Extracto de
21 A3B1C3 0,5 % Salmonella spp
semilla Maradol
Extracto de
22 A3B2C1 1% L. monocytogenes
semilla Maradol
Extracto de
23 A3B2C2 1% E. Coli
semilla Maradol
Extracto de
24 A3B2C3 1% Salmonella spp
semilla Maradol
Extracto de
25 A3B3C1 2% L. monocytogenes
semilla Maradol
Extracto de
26 A3B3C2 2% E. Coli
semilla Maradol
Extracto de
27 A3B3C3 2% Salmonella spp
semilla Maradol
Extracto de
28 A4B1C1 0,5 % L. monocytogenes
semilla Hawaina
Extracto de
29 A4B1C2 0,5 % E. Coli
semilla Hawaina
Extracto de
30 A4B1C3 0,5 % Salmonella spp
semilla Hawaina
Extracto de
31 A4B2C1 1% L. monocytogenes
semilla Hawaina
Extracto de
32 A4B2C2 1% E. Coli
semilla Hawaina
Extracto de
33 A4B2C3 1% Salmonella spp
semilla Hawaina
Extracto de
34 A4B3C1 2% L. monocytogenes
semilla Hawaina
Extracto de
35 A4B3C2 2% E. Coli
semilla Hawaina
Extracto de
36 A4B3C3 2% Salmonella spp
semilla Hawaina
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1 Control - - L. monocytogenes
2 Control  - - E. Coli
3 Control  - - Salmonella spp

7.4. MÉTODOS DE ANÁLISIS

a) Preparación de la muestra
Las semillas de la papaya (Solo, Tainung, Maradol y
Hawaiana) se obtendrán luego de la desinfección de la fruta con una
solución de hipoclorito de sodio al 0.5% durante 2 minutos. Luego se
procederá al pelado y despulpado del mismo, para su conservación se
almacenará en bolsas herméticas (ziploc) y se llevará a congelación a
una temperatura (-18°C).

b) Liofilización de la muestra
Las muestras se congelarán por 48 horas, posteriormente se colocarán
en un Cooler termo-térmico de espuma flex, para ser trasladadas a la
empresa JoyFood (Quito - Ecuador), la cual realizaran el proceso del
liofilizado de las muestras respectivas (semillas de papayas).
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7.4.1. Protocolo de polifenoles totales.

Los compuestos fenólicos totales se determinaran de acuerdo al método

Folin-Ciocalteu descrito por (Otero et al., 2020). Del concentrado
extraído de cada una de las muestras se tomará 5 mL de etanol (95%
v/v) y agua destilada hasta que se obtenga un volumen total de 100 mL
(Solución madre), de tal solución se tomará 0,1 ml, se añadirá 0,5 ml de
reactivo de Folin-Ciocalteu y se dejará en reposo 5 minutos,
posteriormente se adicionará 1 mL una solución de carbonato de sodio
(5%) (5 g de bicarbonato de sodio aforado a 100 mL H 2 Od ) a la mezcla
y se afora a 25 mL con agua destilada. La solución se dejará en reposo
en la oscuridad durante 1 hora. De la solución resultante se tomará 3 mL
en una celda y se medirá la absorbancia a 760 nm en un
espectrofotómetro, de los cuales se obtendrá los resultados de la
absorbancia. Para la cuantificación de los compuestos fenólicos totales
se empleara una curva de calibración utilizando ácido gálico como
estándar (2g  de Ac. Gálico/100mL H 2 Od ). Todo los tratamientos se
realizaran por triplicado y los resultados se expresaran en mg GAE
(equivalente de ácido gálico) / 100 g de la muestra.

7.4.2. Protocolo de actividad antimicrobiana in vitro.

La actividad antimicrobiana se determinará de acuerdo a lo propuesto

por Irisarri y Otero (2018), se llevará a cabo en las cepas de Escherichia
coli, Salmonella spp y Listeria monocytogenes. Se preparan medios de
cultivos sólidos, y se sembrará 0.1 mL de bacteria en cada caja Petri. Se
utilizará papel filtro (Fisher Scientific Q2) de 5 mm de diámetro, que
serán sumergidos en solución de compuestos fenólicos durante 5
segundos, los discos se colocaran por triplicado y se dejaran incubando
a 37 °C por 24 horas. Después de 24 horas se procederá a medir el halo
de inhibición en cm.
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PLAN DE TRABAJO DETALLADO

Mayo Junio Julio Agosto Septiembre Octubre

Actividades S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Revisión Bibliográfica
Elaboración de
anteproyecto
Presentación del
anteproyecto
Liofilización de las
muestras
Cuantificación de
compuestos fenólicos
totales
Efecto antimicrobiano in
vitro
Análisis e interpretación
de resultados
Redacción del
documento final
Sustentación de Ensayo
Científico
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