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Universidad de los Andes
En cumplimiento de los requisitos para obtener el título de
INGENIERA QUÍMICA
ASESOR
M.Sc, Ph.D ROCIO SIERRA
Por
RESUMEN
verdes. A pesar de la amplia gama de aplicaciones que este compuesto tiene, aún no se ha
producción de ácido láctico mediante procesos fermentativos y los altos costos que este
proceso implica. Debido a esto, es necesaria la búsqueda de un proceso que además de ser
amigable con el medio ambiente, permita una producción alta y económicamente viable. El
presente estudio tiene como objeto establecer condiciones óptimas para la fermentación de
ácido láctico, partiendo de bacterias ácido lácticas aisladas de granos de Kéfir de leche. En
extracto de carne) en el medio de adaptación, así como el porcentaje del mismo en el medio
aislamiento satisfactorio de las bacterias del ácido láctico en los granos de Kéfir, sin
embargo las condiciones a las que dichas bacterias fueron sometidas no lograron una mayor
producción de ácido láctico por lo que este no pudo ser cuantificado mediante la técnica de
cromatografía de líquidos.
ABSTRACT
The lactic acid production has always been of great interest in the industry, due to the wide
range of applications that it has, mainly in food, chemical, cosmetic and pharmaceutical
industries. In recent years, the production of lactic acid by a fermentation process has
gained greater interest because of the environmental problems that have led to the search
for compounds using green production methods. Despite the wide range of applications that
this compound, still it has not been found a synthesis process which is sufficiently
effective, because of the low productivity of lactic acid by a fermentative method and the
high costs implied by this process. Because of this, it is necessary to search for a process as
well as being friendly to the environment, enables a high production of lactic acid and also
economically viable. The present study objective is to establish optimal conditions for
lactic acid fermentation, based on lactic acid bacteria isolated from milk kefir grains. In this
study the effect of the nitrogen source (peptone, yeast extract, meat extract) in the
adaptation medium and the percentage as well in the fermentation medium, were evaluated
in order to determine the most favorable conditions for the production of lactic acid and a
liquid chromatography technique was intended to quantify the amount of lactic acid
produced. The results obtained showed a satisfactory isolation of the lactic acid bacteria in
VI
kefir grains, however, the conditions to which the bacteria were subjected not achieve a
higher production of lactic acid so that this could not be quantified by the technique of
liquid chromatography.
AGRADECIMIENTOS
Quiero dar mi más sincero agradecimiento a mis padres, Luis Alejandro Vanegas Soto
y Marlene Mantilla, y a mis hermanos, Nicolás Dario Vanegas Mantilla y Christian Camilo
Vanegas Mantilla, por todo el apoyo que me brindaron durante esta etapa tan importante de
mi vida. También quiero agradecer a todas las personas que estuvieron involucradas en la
realización de este proyecto, por la ayuda que me brindaron en el laboratorio, ya que sin
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN……………………………………………………………………………. III
ABSTRACT…………………………………………………………………………… V
AGRADECIMIENTOS………………………………………………………………... VII
VIII
TABLA DE CONTENIDO……………………………………………………………..
XII
LISTA DE FIGURAS…………………………………………………………………..
INTRODUCCION……………………………………………………………………. 1
OBJETIVOS…………………………………………………………………………… 2
Objetivo general……………………………………………………………………
Objetivo específico…………………………………………………………………
2. MARCO TEÓRICO……………………………………………………………. 3
Propiedades.……………………………………………………….. 3
Industria alimentaria…...………………………………….…….…. 4
Repostería……………………………………….…..….................. 4
Bebidas…..…………………………………………….….……….. 4
Industria Cosmética…..………….…………………….….…..........
5
Industria química.………………..…………………….….…..........
5
Industria farmacéutica...…………………………….….…..............
5
Industria polimérica…………...…………………….…………….
5
IX
Síntesis química……………………………………………………… 6
Fermentación…………………...……………………………………. 8
Metabolismo…………………………………………………………. 10
Caracterización fenotípica……...……………………………………. 15
Caracterización bioquímica…………….…….…….………………... 16
Caracterización genotípica.…...……………………………………… 17
Fuentes de carbono……………………..…….…….………………... 17
Fuentes de nitrógeno…………………...…….…….………………… 18
Fermentación batch………………...…..…….…….………………… 19
Fermentación continúa……………........…….…….………………… 21
Efecto de la temperatura…………...…..…….…….………………… 21
Efecto de la agitación…………..…........…….…….………………… 22
Adsorción……………………………………………………………. 24
3. METODOLOGÍA...……………………………………………………………. 28
3.4 Fermentación…………..……………........…….…….………….. 30
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………….
32
4.1 Cultivo de granos de Kéfir……………………………………….
32
4.2 Cultivo, caracterización e identificación de las cepas…...………. 32
4.3 Fermentación…………….………………………………………. 36
ANEXO A…………………………………………………………………………....... 44
ANEXO B…………………………………………………………………………........ 46
ANEXO C…………………………………………………………………………........ 48
ANEXO D…………………………………………………………………………....... 50
ANEXO E…………………………………………………………………………....... 52
ANEXO F……………………………………………………………………………... 53
ANEXO G…………………………………………………………………………....... 54
XII
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Estructuras del ácido láctico…………………………………………….…..
3
Figura 2. Ruta de producción química………………………………………………… 7
Figura 8. Microscopía…………………………………………………………………. 33
XIII
LISTA DE TABLAS
Pag
3
Tabla 1. Propiedades del ácido láctico…………………………………………………
INTRODUCCIÓN
El ácido láctico es producido comercialmente mediante síntesis química por hidrolisis del
lactronitrilo o por fermentación microbiana. El 90% de la producción comercial se realiza
mediante el proceso de fermentación (Kadam et al., 2006). Lo anterior se debe a que la
síntesis química lleva a la formación de una mezcla racémica de ácido láctico, lo cual es
una gran desventaja, mientras que la fermentación permite la formación de enantiómeros
D(-) y L(+), ópticamente activos, los cual permite la aplicación de este compuesto en la
industria alimenticia, química, farmacéutica y cosmética, entre otras. Además las
propiedades físicas del ácido poliláctico dependen sustancialmente de la conformación del
ácido láctico (Ali et al., 2013).
OBJETIVOS
Objetivo General:
Objetivos Específicos:
1. Aislar las bacterias ácido lácticas del kéfir de leche verificar mediante
observación microscópica, coloración diferencial de Gram e identificación
bioquímica la presencia de dichas bacterias
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
Propiedades
Propiedades Valor
Peso molecular 90.08 g/mol
Punto de ebullición 122 °C a 14 mmHg
Punto de fundición 16.8 °C
Constante de disociación, Ka a 25°C 1.37x10-4
Calor de combustión, DHc 1361 KJ/mole
Calor especifico, Cp a 20°C 190 J/mol °C
Fuente: (Narayanan et al., 2004).
4
Industria alimentaria
El ácido láctico es usado en casi todos los segmentos de la industria alimentaria por gran
variedad de aspectos y ha sido usado a través de los años para la fermentación y
preservación de alimentos para consumo humano. El mayor uso del ácido láctico es en
alimentos y aplicaciones relacionadas con el alimentos, en donde aproximadamente el 85%
del ácido láctico es empleado en este sector y el 15 % restantes es utilizado en aplicaciones
industriales no alimentarias (Vijayakumar et al., 2008).
La sal de calcio de ácido láctico (lactato de calcio) tiene una mayor solubilidad que la sal
del ácido cítrico. Es por eso, que en aquellos productos en los que la turbidez causada por la
sal del ácido cítrico es un problema, se emplea ácido láctico para obtener productos claros.
El ácido L-(+)-láctico es el ácido natural que se encuentra en los sistemas biológicos y por
tanto es usado como acidulante y no introduce al cuerpo elementos extraños. Por otro lado,
el ácido láctico también es empleado comercialmente en industria de carne procesada, para
proveer productor con mayor tiempo de conservación, mejor el sabor y un mejorar el
control de patógenos (Vijayakumar et al., 2008).
Repostería
Bebidas
Industria cosmética
El ácido láctico ofrece productor naturales para industria cosmética. A pesar de que es
empleado principalmente como crema hidratante y regulador de pH, este tiene múltiples
propiedades como la actividad antimicrobiana, para aclarar la piel y la hidratación de esta.
El efecto hidratante se debe a la capacidad de retención del agua del lactato y la acción de
aclarador en el piel es producida por la supresión de la formación de la tirosinasa. Debido a
que son ingredientes naturales del cuerpo humano, el ácido láctico y la sal de este permiten
formulaciones más naturales y seguras. Este es ampliamente utilizado actualmente como
producto químico contra el envejecimiento, pues este suaviza las líneas, reduce el daño por
la luz solar, mejor la textura de la piel y la apariencia en general (Vijayakumar et al., 2008).
Industria química
Actualmente el ácido láctico es considera como el monómero de mayor potencial para ser
empleado como materia prima para conversiones química debido a sus dos grupos
funcionales, el grupo carboxilo y el grupo hidroxilo. El ácido láctico puede ser sometido a
diversas conversiones químicas para la síntesis de productos químicos, tales como el óxido
de propileno a través de un proceso de hidrogenación, el ácido propanoico a través de la
reducción, el 2,3-pentanodiona a través de la condensación, y dilactida a través de la auto-
esterificación. En la industria química el ácido láctico es utilizado en el teñido de sedas y de
otros productos textiles, como mordiente en la impresión de tejidos de lana, en el curtido
vegetal, entre otros usos. El ácido láctico es empleado principalmente como producto
descalcificador, regulador de pH, neutralizador, agente complejante de metales, agente
antimicrobiano y humectante (Vijayakumar et al., 2008).
Industria farmacéutica
Industria polimérica
Recientemente el ácido láctico ha recibido una mayor atención, pues este es empleado para
la producción de ácido poliláctico, PLA, por sus siglas en inglés. Este polímero ha sido de
gran importancia pues este pretende remplazar el plástico por un plástico biodegradable,
amigable con el medio ambiente. Dicho polímero tiene una amplia gama de aplicaciones,
como en la ropa de protección, envasado de alimentos, bolsas de basura, recipientes rígidos,
bandejas de vida útil corta, entre otras. La polimerización del ácido láctico se puede llevar a
6
Producto Usos
Ésteres y derivados de
Empaquetado
ésteres
Existen dos rutas principales para la producción de ácido láctico, síntesis química o
mediante un proceso de fermentación. El proceso comercial para la producción sintética se
basa en la hidrólisis del lactonitrilo y ha sido descrito por Datta (1995). Este método
produce una mezcla de ácido láctico racémico.
Síntesis química
El proceso comercial para la síntesis química del ácido láctico se basa en lactonitrilo y se
lleva a cabo de acuerdo a la Figura 2, en donde materia prima fósil es convertida a etileno,
el cual es posteriormente oxidado para formar acetaldehído. Posteriormente, se añade
cianuro de hidrógeno al acetaldehído en presencia de una base para producir lactonitrilo.
Esta reacción se lleva a cabo en fase líquidos a presiones atmosféricas elevadas. El
lactonitrilo crudo se recupera y se purifica mediante destilación. Luego, se hidroliza a ácido
láctico, ya sea empleado concentrado o para producir la correspondiente sal de
amonio y ácido láctico. Finalmente, el ácido láctico se esterifica con metano para producir
lactato de metilo antes de que este sea purificado por medio de destilación y se hidroliza
7
con agua bajo un catalizador ácido para producir así el ácido láctico y metanol (Narayanan
et al., 2004). Las reacciones que se llevan a cabo se muestran a continuación:
2) Hidrolisis por
3) Esterificación
Fermentación
Los microorganismos que tienen la capacidad de producir ácido láctico se pueden dividir en
dos grupos, bacterias y hongos (Litchfield, 1996). La mayor parte de la producción de ácido
láctico se lleva a cabo con bacterias de ácido láctico y en algunos casos con hongos
filamentos. La fermentación fúngica tiene algunas ventajas, pues requiere medios de
fermentación sencillos y produce ácido L (+)-láctico. Algunas especies convierten el
almidón directamente a ácido L(+)-láctico. Sin embargo, la fermentación de hongos
conlleva a una baja tasa de producción, por debajo de 3 g/h, lo cual se debe probablemente
a la baja velocidad de reacción causado por la limitación de transferencia de masa de
sustrato, además conlleva a un bajo rendimiento lo cual se atribuye a la formación parcial
de subproductor como el ácido fumárico y etanol. Debido a los problemas que presentan las
fementaciones de hongos, las bacterias del ácido láctico son empleadas comúnmente para el
proceso fermentativo (Wee et al., 2006).
9
Las bacterias del ácido láctico, LAB, por sus siglas en inglés, son bacterias Gram positivas
microaerofílicos y catalasa negativa. Dichas bacterias se caracterizan por no formar
esporas, no presentar motilidad y forma de cocos. Son cocos y bacilos de longitud variable
y de un grosor de 0.5-0.8 . Carecen de actividad respiratoria ya que les falta la enzima
citocromo catalasa. A pesar de su metabolismo anaerobio, son anaerobios tolerantes, por lo
que en cultivos sólidos pueden formar colonias en presencia de aire (Parra, 2010). Obtiene
energía únicamente por fermentación de azucares y producen ácido láctico como su mayor
producto final debido a la fermentación de carbohidratos. Estas bacterias son las más
importantes en la fermentación de alimentos, siendo estas las responsable de la
fermentación del pan de masa agria, de todas las leches fermentadas, yuca y de la mayor
parte de los vegetales fermentados.
Las bacterias del ácido láctico tiene una gran especificidad fisiológica y los requerimiento
nutricionales de estas son complejos, motivo por el cual en la naturaleza se encuentran
asociadas a hábitats ricos en nutrientes, como en algunos alimentos ( leche, vino, carnes y
vegetales), la boca, el intestino, entre otros, en los cuales son considerados como inquilino
habituales. Por esto, en el laboratorio, el cultivo de dichas bacterias requiere de medios
complejos que contengas diversos factores que permitan el crecimiento de estas, como lo
son las vitaminas del grupo B, los aminoácidos, péptidos y bases púricas y pirimidínicas.
Además, en estos medios se deben incorporar moléculas capaces de liberar la energía
necesaria para el metabolismos de estas bacterias (Ribéreraruu-Gayon et al., 2003) y
además se debe incorporar azúcares, a partir de cuya oxidación obtendrán energía. Los
medios más empleados con el MRS (Man et al., 1960), el agar Rogosa (Rogosa et al.,
1951), el MLO (medio para Leuconostoc oeni) o el agar sangre.
La mayoría de las especies de este género tienen una alta tolerancia a pH por debajo de 5,
sin embargo, aunque toleran bien los pHs ácidos, a medida que el medio se va acidificando
como consecuencia de su crecimiento, así mismo disminuye el número de especies que son
capaces de sobrevivir. La mayoría crecen e incluso prefieren pHs comprendiendo en un
intervalo entre 4,0 y 4,5, aunque existen especies con capacidad de crecer a un pH de 3,9,
como Lactobacillus (L.)plantarum o L. brevis y otros que lo hacen a pHs comprendidos
entre 9,2 y 9,6 como las especies Streptococcus (S.) lactis y S. thermophilus o aquellas del
género Carnobacterium (Samelis et al., 1994).
El género más grande y diverso de las bacterias del ácido láctico son los Lactobacilos, las
cuales incluyen especies con propiedades bioquímicas y fisiológicas muy diferentes,
además de su característica que les permite la resistencia contra ambientes ácidos. Las
propiedades de estas bacterias conllevan tanto a una tasa de crecimiento alta como a una
alta productividad, razones por las cuales los Lactobacilos son empleados en importantes
producciones industriales. La mayoría de Lactobacillus producen una única forma
isomérica del ácido láctico. Sin embargo, algunos de ellos producen formas racémicas en
donde el isómero predominante depende de los cambios en la aireación, la cantidad de
NaCl, el tipo de fermentación, el incremento del pH y la concentración del sustrato (Garcia
et al., 2010).
Las bacterias del ácido láctico usan principalmente dos rutas para fermentar la glucosa; La
fermentación homoláctica y la fermentación heteroláctica. La fermentación homoláctica
consta de dos pasos. El primero es de formación, etapa llamada Embden-Meyerhoff-Parnas,
en la que la glucosa es transformada en ácido pirúvico y en el último paso este es reducido
a ácido láctico por el poder reductor producido anteriormente en la forma de NADH
(Figura 4). El ácido láctico se obtiene a partir de la glucosa como único producto como se
muestra en la ecuación 1(Castillo et al., 2013).
→
Los microorganismos que únicamente emplean esta ruta para el consumo de carbohidratos,
son llamados homofermentativas, en las cuales están incluidas, entre otras, Lactobacillus
acidophilus, Lactobacillus amylophilus, L. bulgaricus, Lactobacillus helveticus y L.
salivarius (Castillo, et al., 2013).
La relación entre las cantidades de ácido acético y etanol, lo cual reduce el rendimiento
teórico de , depende de la capacidad del microorganismo para oxidar el NADH
generado en las primeras etapas del proceso, junto con sus requisitos de energía. Los
microorganismos que utilizan sólo esta vía metabólica para el consumo de carbohidratos se
denominan heterofermentativas, entre los que se encuentran Lactobacillus brevis,
Lactobacillus fermentum, L. parabuchneri and L. reuteri
Las innumerables investigaciones que se han llevado a cabo sobre la fisiología y la genética
de las bacterias lácticas han hecho posible el conocimiento profundo de las mismas y esto
ha permitido mejorar e innovar sus aplicaciones en el campo de las fermentaciones
industriales, de la agricultura, del bioprocesado, la alimentación y la nutrición, y más
recientemente, en el campo de la medicina (Pérez, 2009).
En la siguiente tabla se muestran algunos ejemplos de los alimentos obtenidos mediante las
bacterias lácticas y las especies que participan el dicho proceso:
13
Tabla 4. Bacterias lácticas empleadas como cultivos iniciadores en la industria de alimentos (Leroy et
al., 2004)
Mantequilla Lc. Lactis subso. Lactis, Lc. Lactis subsp. Lactis var.
diacetylactis, Lc. Lactis subsp. Cremoris,
Ln. Mesenteroides subso. Cremoris
Vino O. oeni
Otro uso de gran importancia en la actualidad de las bacterias lácticas es como probióticos.
Los probióticos son microorganismos vivos, no patógenos que, ingeridos en determinado
número, ejercen efectos saludables, más allá de los inherentes a la nutrición básica”. Dichas
bacterias son huéspedes habituales del tracto gastrointestinal de los humanos y los
animales, en donde contribuyen en las interacciones entre la microbiota intestinal y el
hospedador, mejorando el balance nutricional y microbiano en el tracto y su vez actúa
como tratamiento y prevención de diarrea (Pérez, 2010).
14
Las bacterias ácido lácticas son aisladas de hábitats vegetales, lácteos y animales, lo cual
implica que dichas bacterias una amplia distribución y a su vez una adaptación
especializada a diferentes ambientes. La identificación y clasificación de estas bacterias
siempre ha sido una tarea compleja. La clasificación de estas consiste en agrupar las
bacterias aisladas en grupos taxonómicos en base a similitudes y relaciones de las mismas
(Boontawan, 2010).
La identificación de las bacterias ácido lácticas se puede realizar mediante métodos clásicos
de microbiología, los cuales son relativamente simples de ejecutar, sin embargo dicho
métodos usualmente carecen de poder discriminatorio. Dichos métodos se basan en el
estudio de características fenotípicas, como la morfología celular y colonial, propiedades
fisiológicas, bioquímica e inmunológicas y en el estudio de la composición de ciertos
constituyentes celulares. En ocasiones, algunas de estas pruebas son muy laboriosas y en
algunos casos también son económicamente costosas, y aunque son empleadas no son
establecidas como único criterio de identificación de cepas (Ehrmann et al., 2005). El
término bacterias ácido lácticas no se limita a un grupo de microorganismos estrictamente
taxonómico, pero comprende una amplia gama de géneros filogenéticamente relacionados
con bacterias Gram positivas con un gran número de características bioquímicas y
ecológicas en común (Boontawan, 2010).
La bacteria ácido láctica comprende una amplia gama de géneros incluyendo un número
considerable de especies. Pertenece a la rama de clostridios de las bacterias Gram positivas
y hacen parte del filo de bacterias Gram positivas con un bajo G+C, es decir un bajo
contenido de guanina y cotosina, niveles que se utilizan para predecir la temperatura de
recocido, lo cual implica una temperatura de fusión más alta.
antibióticos (Klein et al., 1998). Algunas de estas características son las que permiten el uso
de estas bacterias como probióticos, en dónde la resistencia a pH bajo y sus rangos de
temperatura de crecimiento permiten la supervivencia de estos en el tracto gastrointestinal
(Fuller, 1989).
Caracterización fenotípica
Este tipo de caracterización presenta como desventaja que no son expresados de forma
estable bajo diferentes condiciones ambientales o de cultivo, que esta no puede ser utilizada
en bacterias no cultivables, su escasa reproducibilidad debido a que algunos de estos
caracteres se pueden ver afectado por diferentes factores y su bajo poder discriminante.
Estos inconvenientes limitan su uso en estudios de tipificación de cepas.
A pesar de los problemas que estos métodos conllevan, estos métodos son ampliamente
empleados en la industria para la identificación de las bacterias ácido lácticas en
tecnologías de fermentación. Estas se realizan con el objetivo principal de controlar la
calidad de los alimentos, la conservación de los alimentos, la eficiencia de los cultivos
iniciadores y el seguimos de especies. El nivel taxonómico de la discriminación microbiana
depende de la sensibilidad de la técnica empleada y su vez de la gama de género (Guarneri
et al., 2001). Por lo general, es necesario emplear más de un método para la obtención de la
identificación y tipificación de cepas desconocidas. Pero aun así, no son suficientes para la
caracterización de sub-especies y cepas de un género.
Carácter Gram.
Determinación de la morfología celular y colonial.
Determinación de la actividad metabólica y bioquímica frente a diferentes sustrato,
producción de enzimas, fermentación de azúcares, entre otros.
Estudio de características fisiológicas, los cuales se realizan mediante la medición
del crecimiento de las bacterias a diferentes condiciones de temperatura, pH y
concentraciones de NaCl.
16
Determinación del perfil de gafos a los que es sensible la cepa de estudio, sin
embargo esta técnica tiene una utilización limitada debido a la falta de
estandarización metodológica.
Estudio de las propiedades antigénicas de las cepas mediante serotipificación, pero
su uso también es limitado debido a problemas metodológicos, además de que no
todas las cepas pueden ser tipificadas serológicamente.
Estudio de los patrones de susceptibilidad a los antibióticos, mediante
antibiotipificación. En este caso, su uso se ve limitado debido a la capacidad que
tiene los microorganismos de modificar dichos patrones.
Caracterización bioquímica
Para llevar a cabo estas pruebas se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo, como el
medio de cultivo, un indicador, un revelador, etc., que puede ser diferentes aún para el
mismo ensayo si se trata de diferentes microorganismos. Dicha identificación puede
hacerse mediante sistemas ya sean manuales o comerciales.
Existen también una gran cantidad de pruebas bioquímicas que permiten la identificación
de bacterias. A continuación se presentan las pruebas empleadas con mayor frecuencia,
agrupadas según el tipo de ensayo:
Caracterización genotípica
Las interrelaciones genéticas de los miembros de las bacterias del ácido láctico han sido
estudiadas ampliamente en secuencias de 16S ADN y mediante experimentos de
hibridación DNA-DNA. En estos métodos se utiliza en algunos casos el genoma entero,
como ocurre en experimentos DNA-DNA, o tan sólo una parte del mismo, como ocurre en
las secuenciación de los ARNs ribosomales (Boontawan, 2010).
Estos métodos muestran grandes ventajas en comparación con los métodos descritos
anteriormente. Entre estas, la universalidad, la sensibilidad, la resolución y el poder
discriminante de estos métodos son las más destacadas.
Todas las bacterias ácido lácticas requieren una fuente determinada de nutrientes para el
metabolismo. La bacteria fermentativa requiere en primer lugar carbohidratos, ya sea
azúcar simple como la glucosa y la fructosa o carbohidratos complejos como lo es la
celulosa y el almidón. Los requerimientos de energía para dichas bacterias es muy alta, y
una cantidad limitante de sustrato puede detener su crecimiento. Por esto, es necesario
complementar los medios de fermentación con cantidades suficientes de nutrientes para la
producción rápida de ácido láctico (Boontawan, 2010).
Fuentes de carbono
Fuentes de nitrógeno
tiene un mayor efecto sobre la producción de ácido láctico, especialmente en el inicio del
crecimiento. Sin embargo, si el medio contiene una cantidad suficiente de extracto de
levadura de la fabricación de la cerveza como fuente de nitrógeno y otros factores de
crecimiento, la cantidad de extracto de levadura podría reducirse de manera significativa e
incluso reemplazarla sin que esto cause una disminución en la producción de ácido láctico.
La ruta fermentativa típica de ácido láctico se inicia con alguna tipo de pretratamiento del
sustrato, el cual se realiza ya sea mediante la adición de los componentes esenciales de
crecimiento, como los minerales y nutrientes adecuado, o también por tratamiento
mecánico combinado con química enzimática de hidrolisis. El pretratamiento depende
principalmente de la materia prima y en el tipo de bacterias del ácido láctico que se
emplean. El objetivo del pretratamiento consiste en formar azúcares monoméricos mediante
la hidrolisis de los componentes de hidratos de carbono. Con el fin de obtener una alta
productividad de ácido láctico, la fermentación se lleva a cabo comúnmente en una cepa
bacteriana elegida de entre el género Lactobacillus, en donde la especie depende del tipo de
sustrato y la configuración deseada del lactato (Boontawan, 2010).
Fermentación batch
Tabla 5. Producción de ácido láctico a partir de recursos agrícolas por fermentación batch. (Wee et al., 2006).
Teniendo una alimentación exponencial de glucosa (850 g/L), a 210 g/L se logra una
concentración máxima de ácido láctico con un rendimiento de hasta 90.3%, un peso seco
máximo de células de 4.3 g/L y una productividad de 2.14 g/L/h. Al comparar estos
resultados con un proceso de fermentación batch sin alimentación, el cultivo con
alimentación batch exponencial mostró una mejora de hasta el 56.5% en la producción de
ácido láctico a partir de Lactobacillus casei. Ademas, de un aumento del 68.6% en peso
seco y un 59.7% en la productividad. (Ding et al., 2006). Las fermentación batch sin y con
alimentación logra concentraciones de ácido láctico más altos en comparación con la
fermentación continua (Boontawan, 2010).
21
Fermentación continua
Existen diversos factores que afectan la fermentación de ácido láctico. La optimización del
proceso fermentativo requiere un profundo conocimiento de aquellos factores que
determinan el metabolismo de los microbios y la influencia que los parámetros tienen en el
proceso. Entre los factores que tiene una mayor repercusión en la producción de ácido
láctico mediante fermentación son la temperatura y el pH en primera instancia, el periodo
de incubación y la agitación, son otras variables de gran importancia en el proceso. Cada
uno de estos parámetros se trata a continuación.
Efecto de la Temperatura
La temperatura es uno de los factores que más influye en la fermentación. Una baja
temperatura ha resultado positivamente en el rendimiento de la producción de ácido láctico
como consecuencia de proveer un ambiente favorable para los microorganismos (Neysens
et al., 2005). Además, la más alta productividad se logra con una temperatura inferior a la
temperatura en la que se obtiene la mayor concentración de masa de ácido láctico y el
mayor rendimiento. Para Lactobacillus amylophilus, sabiendo que crece a 15°C pero no a
45°C, las temperaturas óptimas resultaron ser a 25°C y 35°C para una máxima productiviad
y un máximo rendimiento respectivamente (Boontawan, 2010).
Efecto del pH
La influencia del pH sobre la fermentación del ácido láctico ha sido objeto de investigación
en previos estudios utilizando diferentes materias primas. Cuando se tiene melaza como
fuente de hidrato de carbono y el organismo Enterococcus faecalis RKY1, la fermentación
22
del ácido láctico se completó en un menor tiempo a un pH 7.0 conociendo con anterioridad
que el pH óptimo para el crecimiento celular de Enterococcus faecalis RKY1 es 8.0. El
crecimiento de las células a pH 5.0 casi cesó después de 10 h de fermentación, la más alta
concentración de masa de ácido láctico se obtuvo a pH 7.0 con un rendimiento comparable
con un pH 6.0 (Wee et al., 2004).
Efecto de la agitación
Como se dijo anteriormente, las diferentes cepas de bacterias ácido lácticas requieren de
condiciones diferentes para el crecimiento. The optimal condition for lactic acid is pH 5.0-
6.8, temperature 30-45°C with continuously agitating at 100-200 rpm. Ha sido reportado
para la cepa Lactobacilos rhmnosus una agitación de 1500 rpm, un pH de 6, una
temperatura de 40 °C, para la obtención máxima de ácido láctico (Timbuntam et al., 2008).
Aunque el mecanismo para la inhibición del crecimiento del ácido láctico no ha sido
completamente comprendido, el mecanismo más aceptado para la inhibición de ácidos
orgánicos débiles se relaciona con la solubilidad de la forma no disociada en la membrana
del citoplasma y la insolubilidad de la forma ionizada del ácido. Ha sido sugerido que la
capacidad de los Lactobacilos de tolerar pH más bajos que otras bacterias ácido lácticas, se
debe a su más básico del citoplasma, permitiendo así mayores concentraciones de ácidos no
disociados para ser tolerados (Gatje et al., 1991).
Con el fin de mitigar el efecto inhibidor del ácido láctico durante el proceso de
fermentación, se han llevado a cabo recientemente intentos para eliminar el ácido láctico a
medida que esté se va formando. Sin embargo, dicha medida no es fácil emplearla.
Por otro lado, procesos que implican la formación de sales han resultado viables en la
extracción del ácido láctico. Las sales con alquilaminas secundarias y terciarias son lo
suficientemente estables para ser extraídas de soluciones acuosas utilizando disolventes
orgánicos. El disolvente se evapora y la sal se descompone para dar ácido láctico libre. Para
finalizar con la extracción se lleva a cabo una esterificación, lo que implica la preparación
de un éster de ácido láctico, seguido por una destilación para eliminar impurezas e
hidrólisis para la recuperación de ácido láctico y alcohol (Boontawan, 2010).
Adsorción
Los granos de Kéfir son un grupo de microorganismos que se mantiene unidos debido a una
matriz de polisacáridos y proteínas, incluyendo principalmente bacterias ácido lácticas,
levaduras, bacterias del ácido acético y otros microorganismos que aún no han sido
identificados (Figura 6). Los microorganismos presentes en el Kéfir varían de acuerdo
donde estos hayan sido obtenidos. Una compleja comunidad microbiana de grano de Kéfir
contiene al menos más de 50 especies de bacterias y levaduras, y dependiendo de su origen,
varias especies de hongos filamentosos (Garrote et al. 2001).
26
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA
Para el desarrollo del presente trabajo fue necesario en primer lugar adquirir los granos de
Kéfir, con el fin de aislar de estos las bacterias del ácido láctico presentes. Se lograron
adquirir tan sólo 5 gramos de Kéfir, cantidad insuficiente para llevar a cabo los
experimentos necesarios. Por esto fue necesario en primer lugar, partiendo de estos 5
gramos, obtener un cultivo sostenible de dichos granos.
Luego de lograr un cultivo sostenible de los granos de Kéfir, se procedió a llevar a cabo el
cultivo de las bacterias presentes en dichos granos, para posteriormente aislarlas. Cuando se
obtuvo un cultivo puro de bacterias ácido lácticas, estas fueron sembradas en agar MRS y
se llevaron a una incubadora a una temperatura de 31 ºC durante tres días para permitir el
crecimiento de dichas bacterias. Luego, se tomaron diferentes muestras de los cultivos
obtenidos y mediante microscopia y otros métodos bioquímicos se caracterizaron los
microorganismos aislados. Cuando se identificó que efectivamente las cepas aisladas
correspondían a el grupo de bacterias ácidos lácticas, estas fueron llevadas a medios de
adaptación y posteriormente al medio de fermentación y se llevaron a incubación.
Finalmente, cuando se finalizó el proceso de fermentación, se realizó mediante una técnica
de cromatografía líquida la cuantificación del ácido láctico obtenido. Los principales pasos
que se llevaron a cabo en el laboratorio se muestran en la siguiente figura:
CUANTIFICACIÓN
DEL ÁCIDO CARACTERIZACIÓN
FERMENTACIÓN
LÁCTICO DE LOS
OBTENIDO MICRORGANISMOS
Día
Semana Lunes Martes Miércoles Jueves Viernes
1 20 mL 20 mL 20 mL 25 mL 50 mL
2 25 mL 25 mL 40 mL 40 mL 75 mL
Este procedimiento se realizó durante dos semanas en un principio y se sacó una muestra
para iniciar el proceso de aislamiento de las bacterias. Luego, se volvió a realizar durante
un mes más para obtener un cultivo lo suficientemente grande para realizar las réplicas
necesarias de cultivo.
Con el fin de llevar a cabo el aislamiento de la bacterias fue necesario en primer lugar
preparar dos caldos (uno de APT y otro de MRS), y un agar MRS. En el laboratorio se
contaba tanto con el caldo como el agar MRS, por lo cual no hubo complicación con estos.
Sin embargo, no se contaba con el caldo APT, por lo que fue necesario prepararlo de
acuerdo a las cantidades que se muestran en el Apéndice B. Cada uno de los caldos y el
agar, y a su vez los implementos que se iban a emplear para los cultivos, fueron llevados al
autoclave con el fin de esterilizarlos.
Por otro lado, se llevaron a cabo también pruebas fisiológicas y bioquímicas para la
identificación de las cepas. Entre estas pruebas, se evaluó la tolerancia de a un pH ácido de
4 y un pH básico, a una temperatura baja de 20 ºC y a una temperatura más elevada de 35
ºC, y como prueba bioquímica se evaluó la presencia de la enzima catalasa en las cepas
aisladas.
3.4 Fermentación
Para la fermentación de las bacterias ácido lácticas se preparó en primer lugar el medio de
adaptación, en donde la composición del medio fue la siguiente: 1% sacarosa, 1% fuente de
nitrógeno, 0.1% de fosfato diácido de potasio ( ,0.1% de sulfato de amonio
,0.05% de sulfato de magnesio heptahidratado, 0.05% de tiamina y 100 c.s.p de agua
destilada (Bonilla, 1995).
Se prepararon tres medios de adaptación variando la fuente de nitrógeno. Entre las fuentes
empleadas están el extracto de levadura, peptona y extracto de carne. Luego, se inocularon
los medios de adaptación con 10% (v/v) del microorganismo y se incubaron durante 24
horas a una temperatura de 48 °C (Bonilla, 1995).
Para la síntesis del ácido láctico se preparó el medio de fermentación, en el cual se varió al
igual que en el medio de adaptación el porcentaje de fuente de nitrógeno y a su vez se vario
la cantidad de fuente de nitrógeno en este. La composición de dicho medio es la siguiente:
Sacarosa de 6% (p/v), fuente de nitrógeno de 20%,25% y 30% (p/v), carbonato de calcio.
tiamina 0.005%, un litro de agua destilada c.s.p y concentración del inóculo del 2.5%.
Finalmente se inoculó el microorganismo y se incubó durante 120 horas a una temperatura
de 48 °C (Bonilla, 1995).
Luego de preparadas las muestras a analizar, se prepararon las muestras blancas de ácido
láctico y su vez la fase móvil de ácido sulfúrico 0,01M. Finalmente las muestras se
ingresaron en la columna de intercambio iónico a 25 °C, utilizando la fase móvil de ácido
sulfúrico preparado anteriormente con un flujo de 0,5 mL/min. Para esto se utilizó un
detector de absorción ultravioleta a 210 nm con un volumen de inyección de 10 (Aray, et
al. 2010).
32
CAPITULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se puede ver que las condiciones establecidas para el crecimiento de estos granos fueron
óptimas debido al rápido crecimiento que se obtuvo llegando a 14,361 gramos en sólo dos
semanas. Con esta cantidad fue posible dar inicio al proceso de cultivo de las bacterias
presentes en estos granos, pero debido a la necesidad de realizar replicas en los cultivos, fue
necesario continuar con los 4,361 gramos para futuras pruebas y los resultados del
crecimiento de estos fueron los siguientes:
Como se puede ver en la tabla anterior, al cabo de un mes se tenía cantidad suficiente para
hacer las réplicas necesarias, por lo cual el cultivo fue retirado de la incubadora y los
granos obtenidos fueron almacenados en el laboratorio. Igualmente, con el fin de evitar la
contaminación de estos o el crecimiento de otros microorganismos se realizaban lavados
tres veces por semana.
En primer lugar, se tomó de cada una de las placas con diferentes diluciones una muestra
del cultivo. Cada muestra fue sometida a la prueba de tinción de Gram, cuyo procedimiento
se muestra en el Apendice D. Luego de realizar el procedimiento adecuado, cada muestra
fue llevada al microscopio, en el cual se pudo observar que cada una adquirió un color
morado, indicando así que los microorganismos aislados son bacterias Gram positivas.
Primera característica de las bacterias ácido láctica. Por otro lado, también fue posible
observar otras características de las bacterias obtenidas, como un morfotipo de bacilos
debido a su forma alargada, y la ausencia de esporas y flagelos en estas. El resultado de lo
observado en el microscopio para una de las cepas se muestra en la siguiente figura:
Figura 8. Microscopia
También se pudo observar que dichas bacterias no tenían motilidad, es decir que no
presentaban la habilidad para moverse espontáneamente. Los resultados obtenidos del
primer aislamiento de las cepas para las diluciones seriadas ( se
muestran en la siguiente tabla:
34
Diluciones
Morfología Bacilos Bacilos Bacilos Bacilos
Tinción Gram + + + +
Motilidad No No No No
Flagelos No No No No
De acuerdo a los resultados obtenidos (Tabla 10) y según MacFaddin (1980) se puede
concluir que de acuerdo a las características observadas las bacterias aisladas de los granos
de Kéfir pertenecen al género de bacterias lácticas y Lactobacillus spp.
El procedimiento descrito anteriormente fue realizado igualmente para las réplicas de los
cultivos aislados posteriormente. Únicamente fue posible realizar dos réplicas debido a que
se presentaron complicaciones en el cultivo de las bacterias, debido a que se presentaba
contaminación cruzada llevando como resultado al crecimiento de diferentes
microorganismos en las placas de Agar. Dicha contaminación pudo deberse a los diferentes
contaminantes que se encuentran en el laboratorio y debido a que el procedimiento de
aislamiento es muy delicado y cualquier factor de contaminación en el ambiente puede
alterarlo llevando a intentos fallidos. Los resultados obtenidos para las réplicas realizadas
para cada una de las diluciones seriadas se muestran en la siguiente tabla:
Diluciones
Morfología Bacilos Bacilos Bacilos Bacilos
Tinción Gram + + + +
Motilidad No No No No
Flagelos No No No No
Diluciones
Morfología Bacilos Bacilos Bacilos Bacilos
Tinción Gram + + + +
Motilidad No No No No
Flagelos No No No No
35
Como se puede ver los resultados obtenidos para las réplicas corroboraron que
efectivamente el aislamiento de bacterias ácido lácticas fue realizado de manera adecuada y
no se presentó ninguna incongruencia en los resultados obtenidos.
Diluciones
Prueba de la
catalasa - - - -
Por otro lado, para la identificación de las bacterias también se llevaron a cabo dos pruebas
fisiológicas. La primera consistió en probar la tolerancia de los microorganismos a pH
ácido, debido a que esta es una de las características más relevantes de estas bacterias, el
igual se probó su tolerancia a un pH básico, ya que este también se comprender en el rango
del pH en que dichas bacterias crecen. Por otro lado, la segunda prueba consistió en
verificar el crecimiento de dichas bacterias a diferentes temperaturas. La primera
temperatura que se evaluó fue de 20 ºC y la segunda fue de 35 ºC, pues dichas bacterias
tienen un crecimiento óptimo en un rango de temperatura de 22 ºC a 34 ºC. Los resultados
obtenidos para cada una de las cepas de las pruebas fisiológicas se muestran en la siguiente
tabla:
pH 4 No SI Si Si
7 Si Si Si Si
Temperatura 20 Si Si Si Si
ºC 35 Si Si Si Si
De los resultados anteriores se puede ver que en sólo la primera dilución presentan
problemas, debido a que a un pH muy baja las bacterias murieron. A pesar de esto, los
demás de los casos mostraron respuestas positivas en cuanto al crecimiento en estos
diferentes ambientes de temperatura y pH. Por esto, es posible identificar dichas bacterias
36
como ácido lácticas. Estas mismas pruebas fueron realizadas para las réplicas y los
resultados obtenidos se muestran a continuación:
De acuerdo a los resultados obtenidos en ambas réplicas se puede ver una similitud con los
resultados anteriores, debido a que las muestras de mayor concentración son aquellas que
presentan un mayor problema para adaptarse a condiciones extremas como de un pH muy
ácido y una temperatura de 20 ºC. Sin embargo, las demás diluciones siempre muestran una
tolerancia a estos ambientes, características que distingues a las bacterias lácticas, razón por
la cual se puede decir que efectivamente las bacterias que se aislaron de los granos de Kéfir
corresponden a este género de bacterias.
El proceso de fermentación se llevó a cabo para cada una de las bacterias aisladas e
identificadas anteriormente, para cada uno de los medios de fermentación preparados con
las diferentes fuentes de nitrógeno y sus diferentes concentraciones. Luego de cuatro días
de fermentación se tomaron muestras de cada uno de los medios y se realizaron los
procedimientos descritos anteriormente para separar el ácido láctico y llevado al
cromatógrafo de líquidos que dispone la Universidad de los Andes. Para esto, se debió de
igual manera preparar las muestras para la curva de calibración del ácido láctico a las
siguientes concentraciones:
37
Muestra Concentración %
1 4,2
2 5,9
3 8,0
4 12,7
5 21,2
6 34,0
7 59,5
Existen diversas razones por la cual no se registró cantidad alguna de ácido láctico en el
cromatógrafo; La primera de estas puede ser debido a la identificación no exhaustiva del
género de las bacterias lácticas aisladas, ya que aunque se rectificó que estas bacterias eran
del ácido láctico debido a las diferentes pruebas realizadas en las mismas, no se identificó a
que genero pertenecían. Debido a las diferentes características que los diferentes géneros
tienen, puede que las condiciones que se establecieron para su proceso de fermentación no
hayan sido las adecuadas. Por otro lado, dado que el Kéfir puede abarcar una amplia
microflora de bacterias lácticas, en las bacterias aisladas se pudo tener más de un género de
bacterias lácticas, causando así un problema en el momento de fermentación.
La segunda puede ser debido a la falta de medición del pH durante el todo el proceso
fermentativo, puesto que este es uno de los factores que tienen un mayor efecto sobre dicho
proceso. Aunque en un principio se agregó carbonato de calcio con el fin de regular el pH
del medio fermentativo, puede que este no haya sido suficiente y durante el proceso
fermentativo la acidez del medio pudo causar la inhibición del proceso.
38
CAPITULO V
Por otro lado, la curva de calibración de ácido láctico realizada para el cromatógrafo de
líquidos pudo no ser la adecuada, pues el ácido láctico producido en cada uno de los medios
fermentativos pudo ser menor al mínimo valor tomado en la curva de calibración de ácido
láctico. Por lo cual se requiere una curva de calibración a menores concentraciones de este
compuesto, que permitan la cuantificación de pequeñas cantidades de ácido láctico.
Finalmente, teniendo en cuenta que uno de los factores que tiene un mayor efecto sobre los
procesos fermentativos es el pH, este debe ser regulado en el trascurso del proceso. En el
presente trabajo se adicionó en un principio carbonato de calcio en el medio fermentativo,
con el fin de regular dicho parámetro. Sin embargo, durante el proceso, dicho factor no fue
medido. Un exceso de acidez provocado por las mismas bacterias es posible que se haya
producido una inhibición del proceso. Otro factor que pudo causar la inhibición de ácido
láctico, es la misma producción de dicho compuesto, sin embargo es muy difícil medir el
efecto que este tiene en su misma producción y a su vez, la extracción de este a medida que
se produce para evitar dicha inhibición es de gran complejidad.
Como trabajo futuro para el presente estudio, se tiene en primer lugar la identificación
exacta de las bacterias asiladas de los granos de Kéfir, con el fin de seleccionar de acuerdo
a la literatura las condiciones que permitan el crecimiento óptimo de dichos
microorganismos. De igual manera, en el cromatógrano de líquidos se debe tener en cuenta
producciones de ácido láctico muy pequeñas, teniendo en cuenta que el proceso
39
fermentativo no conlleva a grandes producciones, razón por la cual se debe realizar una
curva de calibración que abarque concentraciones muy bajas. Es necesario también tener en
cuenta el pH a través del proceso fermentativo, por lo cual es necesario la medición de este
a través de todos el proceso, pues aunque las bacterias ácido lácticas tienen la facultada de
crecer a bajos pHs, un exceso de acidez puede llevar a la inhibición del crecimiento de
estas.
40
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44
Anexo A
En primer lugar se tomaron todos los implementos que se emplearían para el cultivo de los
granos de Kéfir y se expusieron a luz ultra violeta durante 15 minutos para eliminar
cualquier tipo de contaminante que pudiera existir en algún recipiente y en la misma cabina
donde se iba a trabajar.
Luego, los 5 gramos de Kéfir fueron colocados en un Erlenmeyer de 250 mL, al cual en
seguida se adicionaron 10 mL de leche alquería UHT. El recipiente fue tapado con gasa y
cinta con el fin de asegurar un ambiente anaerobio que promuevan el crecimiento de las
bacterias lácticas. Finalmente el Erlenmeyer fue llevado a una incubadora a una
temperatura de 25 ºC y una agitación de 130 rpm.
Para mantener el cultivo de Kéfir se debía realizar un mantenimiento cada 24 horas. Este
mantenimiento consistía en filtrar los granos, añadir una nueva cantidad de leche UHT y
realizar un lavado con agua.
45
Anexo B
Para el aislamiento de las bacterias ácido lácticas fue necesario preparar los siguientes
medios de cultivos:
En primer lugar se preparó el caldo APT, el cual fue utilizado para todas las réplicas
necesarias. Debido a que no se contaba con este en el laboratorio fue necesario prepararlos.
En la Figura B.1 se muestra cada uno de los compuestos necesarios y sus cantidades para
preparar 1 Litro de caldo APT.
Para la preparación del caldo MRS se tomó 11 gramos de caldo MRS obtenido del
laboratorio, al cual se le adicionó 200 mL de agua posteriormente. Luego, la mezcla se
calentó y agitó durante 2 minutos. El mismo procedimiento fue llevado a cabo para la
preparación del Agar MRS, pero en este caso para la preparación de 100 mL se añadió 6,7
gramos de Agar. Cada uno de los caldos preparados fue autoclavado aproximadamente por
dos horas.
Las proporciones del caldo y el Agar MRS fueron preparados teniendo en cuenta las
diluciones seriadas que se realizarían con el caldo y las cuatro placas que se emplearían
para la siembra de las bacterias. Por esto, para cada réplica se debió repetir el
procedimiento para prepararlos.
48
Anexo C
Anexo D
Tinción de Gramn
Anexo E
Anexo F
Muestra Concentración %
1 4,2
2 5,9
3 8,0
4 12,7
5 21,2
6 34,0
7 59,5
54
Apéndice G
Cromatografía de líquidos
Al cabo de una hora, las muestras fueron calentadas por 15 minutos en baño María a una
temperatura de 30 ºC. Finalmente, se filtró cada una de las muestras por acetato de celulosa
y llevadas al cromatógrafo junto con las muestras blancas de ácido láctico preparadas para
la curva de calibración. En la Figura G.1 se observan las muestras extraídas de cada medio,
al igual que las muestras preparadas para realizar la curva de calibración.
La columna de intercambio fue llevada a una temperatura de 25 ºC. La fase móvil de ácido
sulfúrico 0,01 M fue preparada e inyectada a un flujo de 0,5 mL/min. Se empleó un
detector de absorción ultravioleta a 210 nm con un volumen de inyección de 10 .