LABORATORIO N0 3

OBSERVACIÓN DE BACTERIAS

INTRODUCCIÓN:

Las bacterias son seres unicelulares de tamaño variable cuyo límite inferior está en las 0,2 µm y el superior
en las 50 µm. Las bacterias son notables también porque carecen de núcleo y al ser más pequeñas   y más
primitivas que las células eucarióticas, se dice que las bacterias son células procarióticas, de la palabra
griega  que significa “antes del núcleo”, es decir, existían antes de que se hubiera desarrollado el núcleo.
 
Igualmente son muy diferentes a los virus, las cuales solo pueden desarrollarse dentro de las células y que
sólo contienen un ácido nucleico. El tamaño de las bacterias dificultó los estudios acerca del "núcleo"
bacteriano, sin embargo en el curso de las investigaciones destinadas a su esclarecimiento la utilización de
los métodos citoquímicos y la microscopía electrónica demostraron su existencia.
El gran poder de resolución del microscopio electrónico no solo amplia la típica forma bacteriana, sino que
revela claramente la organización procariota.
 
Casi todas las clases de bacterias poseen una capa protectora resistente llamada pared celular, esta le da su
forma y le permite vivir en una amplia gama de ambientes. La pared celular da a la bacteria su forma,
algunas especies están además rodeadas por una cápsula, esta hace a la célula resistente a los productos
químicos destructivos. Todas las bacterias tienen una membrana celular dentro de la pared celular.  Las
pequeñas moléculas del alimento se incorporan a la célula a través de poros de esta membrana, pero las
moléculas grandes no la pueden atravesar. 
Dentro de la membrana está el citoplasma, este contiene productos químicos llamados enzimas, que ayudan
a dividir el alimento y construyen partes de la célula.
 
Como todas las células, estas contienen ADN que controla el crecimiento de la célula, la reproducción, y el
resto de las actividades. El ADN,de una célula bacteriana forma un área del citoplasma llamado el
nucleoide. En el resto de los organismos excepto las cianobacterias (algas azul-verdes), el ADN está en el
núcleo, una parte de la célula separada del citoplasma por una membrana. Los científicos dividen a las
bacterias en grupos según su forma: Los cocos son células esféricas que se pueden agrupar en parejas
(diplococos), racimos (estafilococos), cadenas (estreptococos), de a cuatro (tétradas) o en cubos
(sarcinas).Los bacilos son células en forma de bastón que pueden presentarse individualmente, en cadenas o
en palizadas. Los espirales son células que presentan forma helicoidal y generalmente no se agrupan.

El estudio microscópico de la célula bacteriana es el primer paso para la identificación y clasificación de un

género bacteriano por tanto es de gran ayuda en la investigación de los mismos. La observación al
microscopio de las bacterias nos permite diferenciar formas típicas como lo son los cocos, bacilos y espirales.

Este estudio se puede realizar mediante los siguientes métodos:

 Preparaciones no coloreadas (examen en fresco): Con este método se observan las bacterias vivas,
lo cual hace que podamos detectar con facilidad la movilidad en las que la poseen y su forma. En
estos montajes muchas veces no se aprecian muy bien las células, debido a la falta de contraste por
eso es necesario realizar tinciones especiales.

 Preparaciones coloreadas (frotis teñido): Como las bacterias son incoloras, es necesario utilizar
colorantes para poderlas visualizar. Los métodos para observar bacterias, proporcionan las
siguientes ventajas:

- Un contraste entre la bacteria y el medio que la rodea, permitiendo diferenciar los tipos
morfológicos bacterianos.
 - Una visualización de las estructuras internas y externas tales como: esporas, nucleoide, gránulos
citoplasmáticos, pared celular, capsulas y flagelos.

Las tinciones son técnicas que permiten observar microorganismos en función de la capacidad de los
mismos para retener (o no) determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la célula y
del colorante.
Estos colorantes pueden ser de distintos tipos:

a. Catiónicos. Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las células y las tiñen.
Ejemplos: Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina.

b. Aniónicos. Con carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no tiñen las células, sino el
entorno. En este caso se habla de tinción negativa. Ejemplos: Eosina, Nigrosina.

c. Liposolubles. Se mezclan con los lípidos celulares y los tiñen. Ejemplo: Negro sudán.

Por otro lado las tinciones pueden realizarse siguiendo distintos métodos.

• Simples. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las células tienen una composición
química diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un
colorante. El colorante tiñe las células (Azul de metileno, Safranina) o no (Nigrosina).

• Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen distinta composición química, y
por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tinción, lo que permite clasificar los
microorganismos en
diferentes grupos, según su capacidad de tinción. En este apartado están dos tinciones de importancia
taxonómica y médica: la tinción de Gram y la de ácido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas tinciones
utilizan más de un colorante.

• Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composición
química, de modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes. Ej; tinción de esporas, de flagelos, de
paredes celulares,
de corpúsculos metacromáticos. Pueden utilizarse uno o más colorantes.

OBJETIVOS:

 Aprender y practicar los distintos métodos de observación de las bacterias.

 Conocer las distintas formas de acción de los colorantes de acuerdo al carácter químico de éstos.
 Identificar al microscopio las diferentes formas bacterianas.
 Realizar frotis de muestras faríngeas.

MATERIALES:

 Muestras bacterianas de origen natural: sarro dental, yogur, vinagre, suelo etc.
 Cultivos bacterianos
 Portaobjetos y cubreobjetos
 Asas
 Mecheros
 Colorantes (ácidos y básicos)
 Puentes de coloración
 Frasco lavador
 Aceite de inmersión
  Papel absorbente
 Microscopios
 Solución salina isotónica
 Metanol
 Palillos

PROCEDIMIENTO:

1. Preparaciones no coloreadas (preparación en fresco)

a. Cuando la muestra a analizar se encuentra en un medio líquido, proceda así: Con el asa estéril deposite
una gota de cultivo bacteriano en el centro de un portaobjeto limpio. Coloque un cubreobjeto sobre la
gota evitando la formación de burbujas. Observe con objetivos de 10x y 40x. Haga esquemas y describa
lo observado.

b. Si la muestra a analizar se encuentra en un medio sólido se debe proceder de la siguiente forma:

Coloque una gota de solución salina sobre un portaobjeto, toque con el asa una colonia de cultivo y
haga con esta muestra una emulsión en la gota. Cubra la preparación con el cubreobjetos. Observe al
microscopio. Haga esquemas y describa lo observado.

2. Preparaciones coloreadas

A. Con colorantes básicos (Coloración simple o directa). Los colorantes básicos más empleados son:
azul de metileno, cristal violeta, safranina, fascina y verde malaquita.

El procedimiento para preparar y fijar las bacterias para la tinción es el siguiente:

a. Coloque la muestra de cultivo en el portaobjeto procediendo de acuerdo al tipo de

muestra que posea (líquida o sólida).
b. Extienda la gota sobre el portaobjeto formando una película fina (casi transparente).
c. Seque la preparación, pásela rápidamente sobre la llama de un mechero. (Evite un
excesivo calentamiento).
d. Después de este procedimiento las bacterias quedan fijas y listas para la tinción.

Tincion simple con azul de metileno (Tinción positiva).

1. Coloque los portaobjetos sobre un puente de coloración.

2. Cubra el extendido con una pequeña cantidad de azul de metileno y déjelo actuar por 2 minutos.
3. Lave con agua hasta eliminar el exceso de colorante.
4. Seque la preparación al aire libre.
5. Examine las preparaciones teñidas al microscopio con el objetivo de inmersión. Haga esquemas y
describa lo observado.

B. Con coloración negativa o indirecta.

Tinción simple con nigrosina. La nigrosina es uno de los colorantes ácidos más utilizados, la cual no
tiñe directamente la célula sino que se deposita alrededor de ella facilitando así su observación al
microscopio.Se trata de un colorante aniónico, proporciona una visión de la forma y el tamaño
celulares al observarse los microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro.

En esta coloración se procede de la siguiente manera:

1. Limpie un portaobjetos con alcohol y gasa para liberarlo de grasa.

 2. Coloque una gota de nigrosina sobre el extremo del portaobjeto.
3. Mezcle dos asadas de cultivo con la gota de nigrosina sin extender la muestra.
4. Con el borde de otro portaobjeto, extienda la gota suavemente hasta el otro extremo del
portaobjeto.
5. Deje secar el extendido al aire libre.
6. Observe al microscopio con el objetivo de inmersión. Haga esquemas y describa lo
observado.

3. Bacterias del yogur probióticos

El yogur es un producto lácteo producido por la fermentación natural de la leche. A escala industrial se
realiza la fermentación añadiendo a la leche dosis del 3-4% de una asociación de dos cepas bacterianas: el
Streptococcus termophilus, poco productor de ácido, pero muy aromático, y el Lactobacillus bulgaricus, muy
acidificante. En esta preparación se podrán, por tanto, observar dos morfologías bacterianas distintas (cocos
y bacilos) y un tipo de agrupación (estreptococos). Además, el tamaño del lactobacilo (unos 30μm de
longitud) facilita la observación aunque no se tenga mucha práctica con el enfoque del microscopio.

1. Realizar el frotis disolviendo una mínima porción de yogur en una pequeña gota de agua.
2. Fijar con metanol para eliminar parte de la grasa.
3. Teñir con un colorante indicado por él docente durante 1-2 minutos.
4. Observar al máximo aumento del microscopio.

4. Bacterias del vinagre (casero)

El vinagre es una solución acuosa rica en ácido acético resultante de la fermentación espontánea del vino o
de bebidas alcohólicas de baja graduación. La acetificación del vino es producida por bacterias aeróbicas del
ácido acético, principalmente Acetobacter aceti, aunque también Gluconobacter. Se trata de bacilos rectos
con flagelos polares.

1. Tomar con una aguja enmangada una pequeña porción de madre de vinagre natural o de la telilla
que se forma sobre la superficie de los vinos agriado.
2. Extender la muestra en el portaobjetos con una gota de agua y hacer el frotis.
3. Dejar secar y fijar con calor.
4. Teñir 2-3 minutos, lavar el exceso de colorante y secar.

5. Bacterias del sarro dental

El sarro dental es un depósito consistente y adherente localizado sobre el esmalte de los dientes. Está
constituido principalmente por restos proteicos, sales minerales y bacterias junto con sus productos
metabólicos. La flora bacteriana de la cavidad bucal es muy variable dependiendo de las condiciones que se
den en el momento de hacer la preparación, pero suelen abundar bacterias saprófitas, pudiéndose observar
gran variedad de morfologías: espiroquetas, cocobacilos, diplococos y bacilos.
1. Con una aguja enmangada tomar una pequeña porción de sarro dental y disolverla en una gota de
agua sobre el portaobjetos.
2. Dejar secar y fijar con calor.
3. Teñir 2-3 minutos, lavar el exceso de colorante (indicado por él docente) y secar.

TOME NOTAS Y REALICE DIBUJOS DE LO OBSERVADO DE FORMA CLARA Y PRECISA JUNTO A LOS DATOS QUE
CONOCE (Nombre del microorganismo, tipo de medio de cultivo, origen de la muestra etc.)

PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN

1. ¿Qué tipos de morfología y agrupación aparecen en los frotis de los cultivos?

2. ¿Qué fin tiene la fijación de muestras al realizar un frotis bacteriano?
3. Señale las ventajas y desventajas de la tinción simple respecto del examen en fresco.
4. Investigue ¿Cuál es el fundamento de la técnica de coloración Ziehl-Neelsen?¿Para qué tipo de
microorganismos está diseñada esta técnica?
5. Investigue. ¿Qué técnicas se pueden emplear para tinción de flagelos, esporas y capsulas bacterianas?
6. Explica el fundamento de las técnicas de la pregunta anterior.