ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DE LOS COMPUESTOS

ORGÁNICOS VOLÁTILES PRODUCIDOS DURANTE LA INTERACCIÓN

ENTRE UNA LEVADURA AISLADA DE LOS AZUFRES, MICHOACÁN Y
HONGOS FITOPATÓGENOS DE INTERÉS AGRONÓMICO, OBTENIDOS
MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
Eric Ícaro Suárez-Hinojosa1, Rubén Pérez-Pérez2, Mauricio Nahuam Chávez-Avilés3.
1
Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico Superior de Ciudad Hidalgo; eric_icaro@outlook.es
2
Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico Superior de Ciudad Hidalgo; rperez@cdhidalgo.tecnm.mx
3
Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico Superior de Ciudad Hidalgo; nchavez@cdhidalgo.tecnm.mx

Resumen
Los hongos fitopatógenos generan afecciones económicas en el sector agroindustrial, entre
ellos destacan Colletotrichum acutatum, Colletotrichum gloeosporioides, Botrytis cinerea,
Fusarium oxysporum y Alternaria alternata. Los tratamientos químicos que se emplean para
combatirlos causan efectos adversos como la inducción de la resistencia de los fitopatógenos a
éstos. Una alternativa al uso de los agroquímicos es la implementación de sistemas basados
en las propiedades de los agentes de control biológico. En el presente estudio se confrontó una
levadura aislada de Los Azufres, Michoacán con los fitopatógenos mencionados a través de la
producción de Compuestos Orgánicos Volátiles (COVs). La levadura se confrontó (a diferentes
Densidades Ópticas (D.O.), con los fitopatógenos. Las confrontaciones con una D.O. de 0.5
generaron el 68.3% y 48.1% de inhibición del crecimiento de C. gloeosporioides y C. acutatum,
respectivamente. Además de provocar alteraciones en el tejido fúngico de los mismos. Así
mismo, se captaron los COVs generados durante la interacción entre la levadura y C.
gloeosporioides o C. acutatum. Los COVs captados en la resina se expusieron con el resto de
los fitopatógenos. Los COVs generaron alteraciones en el crecimiento y pigmentación de las
colonias fúngicas, lo cual sugiere que se comprometió su patogenicidad. Se evaluó la
patogenicidad de los hongos expuestos a los COVs empleando hojas de aguacate, obteniendo
que las colonias de los fitopatógenos expuestos a los COVs producidos durante la interacción
entre la levadura y Colletrotichum sp. disminuyeron la infección en las hojas.
Palabras clave: Control biológico, levadura, hongos fitopatógenos, COVs.

Introducción
En México, la producción agrícola ha tenido un alto crecimiento en las últimas décadas. Se ha
reportado una producción de 198.9 millones de toneladas de 52 de los principales cultivos que
incluyen hortalizas, frutos y algunos granos. (SAGARPA, 2015). Sin embargo, se estima que a
nivel mundial se genera un 45% de pérdidas de hortalizas y frutas, lo cual compromete la
seguridad alimentaria además de generar pérdidas económicas a los productores. Existen
factores que afectan la actividad agropecuaria, dentro de los que encontramos el cambio
climático, desastres naturales, sobreexplotación de suelos y plagas. Dentro de estos últimos
encontramos a los microorganismos fitopatógenos destacando los hongos, los cuales son los
causantes de mermas importantes en frutos y hortalizas en el sector agrícola (Trigos et al.,
2008). Alternaria, Botrytis, Fusarium y Colletotrichum, son fitopatógenos de importancia
agronómica. Su desarrollo e incidencia en los cultivos o en postcosecha, se ve favorecido por
las condiciones de temperatura (20 a 25 °C) y humedad (relativamente alta) (Rivera, 2008).
Para controlar y contrarrestar a los fitopatógenos se han implementado diversas estrategias,
como el cambio de suelo, la implementación de semillas tratadas (sanas), así como la
aplicación de algunos fungicidas químicos como captafol, clorotalonil, etc. Aunque su uso se ha
cuestionado debido a la toxicidad que éstos pueden causar, generando daños a la salud, a los
ecosistemas y al medio ambiente. Es por ello por lo que se empezó a tomar conciencia sobre
dichos efectos, por lo que actualmente se consideran otras alternativas para el control de
plagas y enfermedades (Izzeddin et al., 2011). Una de ellas es la implementación del control
biológico, en donde se emplean microorganismos antagónicos como las levaduras para
controlar el desarrollo y proliferación de los microorganismos no deseados. Éstas tienen la
capacidad de controlar patógenos, aunque los mecanismos empleados por las levaduras no se
han establecido por completo, se sugiere que emplean el parasitismo, la producción de
enzimas líticas o la antibiosis (Ghaouth et al., 1995). Este último mecanismo consiste en la
producción de metabolitos secundarios, los cuales se generan en respuesta a la interacción
que se produce entre el antagonista y el patógeno, los cuales resultan tóxicos para los
fitopatógenos. Dichos metabolitos pueden ser compuestos orgánicos difusibles o compuestos
orgánicos volátiles (CODs y COVs) (Infante, 2009). Los COVs han sido motivo de atención,
debido a sus características, pueden difundirse a la atmósfera y el suelo, pudiendo mediar
interacciones de contacto directo con algunos otros microorganismos o plantas; en el caso de
estar en contacto con los fitopatógenos puede influenciar su desarrollo (Morath et al., 2012).

Antecedentes
La implementación de levaduras como agentes de control biológico ofrece algunas ventajas
con respecto al uso de hongos filamentosos o bacterias, como la capacidad que tienen para
captar variedad de nutrientes y su tasa de reproducción (Uribe et al., 2007). En este sentido,
Montiel et al., (2018) aislaron Debaryomyces hansenii, Cryptococcus diffluens y Rhodotorula
minuta (una levadura rosada) de una microbiota oceánica, éstas fueron confrontadas en un
sistema de antibiosis mediado por COVs en contra de nueve patógenos de importancia
agronómica (Curvuluria sp., Penicillium italicum, Penicillium digitatum, Fusarium solani,
Neoscytalidium dimidiatum, Alternaria solani, A. alternata, F. oxysporum y C. gloeosporioides)
obteniendo rangos de inhibición del 44% al 59%. Las levaduras rosadas del género
Rhodotorula así como los compuestos orgánicos que éstas generan han mostrado ser aptas
para combatir fitopatógenos, teniendo la posibilidad de substituir la aplicación de fungicidas
químicos. Esta es una importante premisa que sugiere que la obtención y aplicación de los
compuestos antifúngicos producidos por levaduras podrían optimizar los procesos de control
biológico. Aunque su obtención y estabilización representa un reto debido a las características
fisicoquímicas de los COVs provenientes de un sistema biológico.

Objetivo
Evaluar el efecto de los COVs con mejor actividad de biocontrol producidos durante la
interacción entre la levadura aislada de Los Azufres, Michoacán (LAL) vs hongos fitopatógenos
sobre el resto de los hongos fitopatógenos.

Materiales y métodos
Pruebas de confrontación en sistema dual
Las confrontaciones se realizaron en cajas Petri con medio PDA, en las cuales se colocó un
disco de cada patógeno (individualmente), en un fondo de caja Petri, en otro fondo se colocó el
antagonista (LAL) a diferente densidad óptica (0.1-0.6). El antagonista se colocó en la parte
inferior y el hongo fitopatógeno en la parte superior (Chen et al., 2018). Los sistemas se
incubaron a temperatura ambiente y se monitoreó el crecimiento diametral del hongo
fitopatógeno cada 24 h hasta que el control (Fitopatógeno vs E. coli ATCC 25922) saturó la
caja.

Confrontación de los COVs obtenidos por cromatografía de adsorción vs los hongos

fitopatógenos
Para la obtención de los COVs producidos durante la interacción entre LAL (inoculada a una
D.O. de 0.5) vs C. acutatum o C. gloeosporioides; se colocó en la parte media del sistema de
confrontación un saco que contenía 2 g de resina de intercambio aniónico AG1-X8 (Bio-
RadTM) y a los tres días de confrontación los COVs adsorbidos en la resina se estabilizaron
incubando los sistemas a 4 °C. Posteriormente se extrajo el saco y se colocó en la tapa de una
caja Petri y se confrontó con los fitopatógenos. Las combinaciones implementadas se
realizaron entre los COVs obtenidos en el sistema de C. acutatum/LAL o C.
gloeosporioides/LAL vs fitopatógenos. Los sistemas se incubaron a temperatura ambiente y se
monitoreó el crecimiento diametral del hongo fitopatógeno cada 24 h hasta que el control
(Resina vs E. coli ATCC 25922) saturó la caja.

Análisis de la patogenicidad de los fitopatógenos expuestos a los COVs obtenidos por

cromatografía de adsorción
Para llevar a cabo la evaluación de la patogenicidad de los hongos fitopatógenos expuestos a
los COVs se desinfectaron hojas de aguacate siguiendo el protocolo descrito por Saint et al.,
(2020), posteriormente se colocaron dos propágulos de cada fitopatógeno expuesto a los COVs
obtenidos por cromatografía de adsorción en el envés de las hojas y se incubaron a
temperatura ambiente durante 96 h (Bae et al., 2016).

Análisis estadísticos
Los análisis estadísticos fueron realizados en el software Prism 5 (software Graphpad, La Jolla,
CA). Se realizó un ANOVA de una vía seguida de una prueba post-hoc de Tukey. Las cajas
representan el promedio de una n=4 ± DE, las letras diferentes indican diferencia significativa
entre los grupos con una P≤0.01.

Resultados y discusión
Confrontación en sistema dual entre C. gloeosporioides vs LAL por COVs
Se realizaron bioensayos de antagonismo en sistema dual. El bioensayo de C. acutatum vs
LAL por COVs a una D.O. de 0.2 generó el mayor porcentaje de inhibición 48.1% (datos no
mostrados). En el caso de C. gloeosporioides vs LAL, la D.O. 0.5 fue el que presentó el 68.3%
de inhibición sobre el fitopatógeno mediante COVs (datos no mostrados). Además, se
observaron cambios morfológicos de las colonias expuestas a LAL a las diferentes D.O.,
disminución de melanina y crecimiento irregular. Así mismo, los COVs generaron alteración
sobre el tejido fúngico a nivel microscópico en ambos fitopatógenos, tales como la presencia de
bifurcaciones (BI), distorsión (DI), enrollamiento (EN), hinchamiento (HI), adelgazamiento (AD),
granulación (GR) y artroconidias (AR), la presencia de estas estructuras sugiere una condición
de estrés de los fitopatógenos como un mecanismo de supervivencia (Guevara et al., 2016).
Con base en estos efectos, se determinó que los COVs producidos durante la interacción entre
LAL vs C. acutatum (COVs-LALCA) y LAL vs C. gloeosporioides (COVs-LALCA) generaron los
mayores porcentajes de inhibición, razón por la cual se evaluó el efecto de estos compuestos
sobre el resto de los fitopatógenos.

Análisis de fitopatógenos expuestos a los COVs-LALCA & LALCG

En los sistemas de COVs-LALCA vs C. acutatum, COVs-LALCA vs F. oxysporum,
COVs-LALCA vs B. cinerea BCV2, COVs-LALCA vs A. alternata, se generaron
porcentajes inhibición de 34%, 23.3%. 6.6% y 31.6%, respectivamente (Fig. 1P). En el
caso de los bioensayos COVs-LALCG vs C. gloeosporioides, COVs-LALCG vs F.
oxysporum, COVs-LALCG vs B. cinerea BCV2, COVs-LALCG vs A. alternata, se obtuvo
el 24.4%, 21.1%, 5.5% y 27.7% de inhibición respectivamente (Fig. 1P). Asimismo, se
generaron alteraciones morfológicas, en donde se observó la ausencia de melanina en
los tratamientos COVs-LALCA vs C. acutatum, COVs-LALCG vs C. gloeosporioides,
COVs-LALCA vs A. alternata, COVs-LALCA vs B. cinerea BCV2, COVs-LALCG vs A.
alternata y COVs-LALCG vs B. cinerea BCV2 (Fig. 1E, 1F, 1I, 1N, 1Ñ y 1O).
Sugiriéndose que la ausencia de dicho pigmento es un indicativo de la baja
patogenicidad de los fitopatógenos, debido a que dicho pigmento es crucial en el
proceso de infección de estos microorganismos (Eisenman et al., 2012). En el caso de
los bioensayos COVs-LALCA vs F. oxysporum y COVs-LALCG vs F. oxysporum sufrió
un cambio de pigmentación, tornándose de una pigmentación púrpura en la zona
central de la colonia a una amarillenta en el centro de las colonias fúngicas, este
cambio morfológico sugiere que se vio comprometida la patogenicidad de F. oxysporum
(Cambaza 2018), lo cual es un mecanismo para proteger su integridad (Fig. 1G y 1F).

Análisis de la patogenicidad de los fitopatógenos expuestos a los COVs

obtenidos por cromatografía de adsorción
En el caso de los bioensayos de patogenicidad de los sistemas COVs-LALCA vs C.
acutatum, COVs-LALCA vs F. oxysporum, COVs-LALCA vs B. cinerea BCV2, COVs-
LALCA vs A. alternata, COVs-LALCG vs C. gloeosporioides, COVs-LALCG vs F.
oxysporum, COVs-LALCG vs B. cinerea BCV2 y COVs-LALCG vs A. alternata se
observaron ligeras lesiones sobre el tejido vegetal así como clorosis en la zona de
contacto (Fig. 2G, 2H, 2I, 2J, 2K, 2L, 2M y 2N) comparado con los controles en donde
las lesiones fueron más severas (Fig. 2B, 2C, 2D, 2E y 2F), lo cual sugiere que la
capacidad de infección de los patógenos expuestos a los COVs fue comprometida,
debido a que la producción de enzimas y toxinas ayudan a infectar al hospedero.
Figura 1. Análisis de fitopatógenos expuestos a los COVs obtenidos por
cromatografía de adsorción. (A-O) Fotografías representativas de los tratamientos de
los COVs adsorbidos sobre el crecimiento de los hongos fitopatógenos. Controles: A)
C. acutatum. B) C. gloeosporioides. C) F. oxysporum. D) F. oxysporum. I y J) B. cinerea
BCV2. K y L) A. alternata. Tratamientos: E) COVs-LALCA vs C. acutatum. F) COVs-
LALCG vs C. gloeosporioides. G) COVs-LALCA vs F. oxysporum. H) COVs-LALCG vs
F. oxysporum. M) COVs-LALCA vs B. cinerea BCV2. N) COVs-LALCG vs B. cinerea
BCV2. Ñ) COVs-LALCA vs A. alternata. O) COVs-LALCG vs A. alternata. P) Porcentaje
de inhibición, los datos en el gráfico representan el promedio de una n=4 ± DE. Se
realizó un análisis de varianza ANOVA de una vía, seguida de una prueba post hoc de
Tukey con una P≤ 0.01. Las letras mostradas en el gráfico representan grupos
estadísticamente diferentes.

Figura 2. Evaluación de la capacidad de infección de fitopatógenos expuestos a

los COVs–LALCA & COVs–LALCG. Controles de fitopatógenos que no fueron
expuestos a los COVs (FP/ST): A) Medio de cultivo PDA. B) C. acutatum. C) C.
gloeosporioides. D) F. oxysporum. E) B. cinerea. F) A. alternata. Tratamientos con los
COVs–LALCA vs G) C. acutatum. H) F. oxysporum. I) B. cinerea. J) A. alternata.
Tratamientos con los COVs–LALCG vs K) C. gloeosporioides. L) F. oxysporum. M) B.
cinerea. N) A. alternata.

Conclusión
Los COVs producidos en los sistemas de confrontación dual entre la levadura LAL vs C.
acutatum o C. gloeosporioides, afectan el desarrollo y la estructura celular de los
fitopatógenos (B. cinerea, C. gloeosporioides, C. acutatum, F. oxysporum y A.
alternata), así como la producción de fitotoxinas, comprometiendo su capacidad de
infección, razón por la cual dichos COVs podrían emplearse para llevar a cabo el
control de los hongos fitopatógenos evaluados en este estudio.

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