Stem Cell Therapy Argentina Theoretica Book.

Regenerative Medicine and Regenerative Rehabilitation.

Curso Intensivo de Medicina Regenerativa y Cultivo

de Células Madre Mesenquimales.

Edición 2021.

Contenido teórico en español.

Dr. Matías Fernández Viña. MD (Argentina).

Director Médico Stem Cell Therapy Argentina.
Prólogo
Las células mesenquimales (MSC’s) tienen la capacidad de generar todo tipo de tejidos
en embriones e individuos adultos. En humanos, las células hematopoyéticas (CMH)
fueron las primeras en caracterizarse y han sido las más estudiadas hasta el momento.
El término célula madre mesenquimal (Mesenchymal Stem Cells – MSC’s) fue descrito
por primera vez por Arnold Caplan en 1988, pero Friednestein y colaboradores
alrededor de 1960, ya estaban refiriéndose a células aisladas de médula ósea (MO) y
otros tejidos, como células adherentes en cultivo. Posteriormente estas células fueron
caracterizadas por expresar antígenos de superficie como CD13, CD44, CD73, CD90
y CD105 en ausencia de marcadores hematopoyéticos y además tienen la capacidad
de diferenciarse en células como adipocitos, osteocitos y condrocitos en condiciones
específicas de cultivo.
Las MSC’s se encuentran en el estroma de la MO humana, en una proporción de
1:34.000-100.000 células mononucleares aproximadamente; con una eficiencia de
aislamiento cercana al 100 %.
Debido al fácil aislamiento, cultivo, manipulación ex vivo, y demás características que
presentan las MSCs de MO, han hecho de ellas una posible terapia útil en medicina
regenerativa; en patologías relacionadas a lesiones músculo esqueléticas, ulcerativas de
la piel, arteriales o sistémicas.

La realización de este “Curso de Medicina Regenerativa y Terapia Celular”, nos permite

optimizar el cultivo y caracterización de MSC’s de MO y Tejido Adiposo y estandarizar
protocolos de diferenciación in vitro para su correcta utilidad en el campo del
Laboratorio. A su vez, las aplicaciones clínicas reales, nos darán una perspectiva global
hacia donde la Medicina Regenerativa se encuentra trasladándose bajo buenas normas
de procedimientos protocolizados.

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Como Director Medico de esta Institución registrasda en Medicina Regenerativa, es un

placer para mí poder recibirlos en mi lugar de origen y confeccionarles este material

básico y elemental para que cada alumno/asistente se lleve de recuerdo sobre los temas
pertinentes que estaremos enfocando en el curso.

Este cuadernillo, no busca reemplazar las clases teóricas ni el contenido importante que
tiene del curso, el cuál es mucho más abarcativo y explícito, sino que sugiere acompañar
a la bibliografía sugerida por nuestro equipo tanto de la teoría como de la práctica.

El objetivo primordial mediante este contenido escrito es la de poder dejar plasmada

una base sólida para el manejo de los conceptos posteriores al curso.

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Introducción

La medicina regenerativa es una terapia de nivel celular que tiene como objetivo
mejorar la función de los tejidos u órganos dañados o enfermos mediante la introducción
de células para reemplazar las células dañadas. En la actualidad, la medicina
regenerativa se utiliza para tratar afecciones médicas en una amplia gama de
especialidades médicas. Son Terapias biológicas con un futuro prometedor para muchas
enfermedades.

El concepto de la medicina regenerativa basado en la utilización de las células

del propio organismo está adquiriendo cada vez más valor y prestigio.

Debido a su capacidad para diferenciarse en células que desempeñan los

papeles necesarios en una variedad de órganos, las células madre son una herramienta
esencial de la medicina regenerativa. Cuando las células madre se introducen en un
tejido u órgano dañado, evolucionan para llevar a cabo las funciones necesarias,
compensando las células dañadas y tratando de reestablecer la homeostasis. Como un
proceso mínimamente invasivo, la medicina regenerativa aprovecha las capacidades
naturales de las células madre y la propia capacidad del cuerpo para sanar, brindando
la oportunidad de evitar procedimientos invasivos. Para pacientes con lesiones agudas
o enfermedades crónicas, la medicina regenerativa es una fuente de esperanza más que
importante.

La medicina regenerativa investiga la capacidad de las células madre del adulto

de autorrenovarse, proliferar o diferenciarse. El objetivo es que puedan suplir a las
células destruidas o bien comunicarles los factores necesarios para que se produzca una
nueva génesis celular in vivo. Ya se va conociendo con precisión cómo las células madre
cumplen su función regenerativa propia. Su empleo permite abrir una nueva vía

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terapéutica para las enfermedades degenerativas y contar con modelos celulares de la

enfermedad. Todo ello supone un reto al diseño de nuevos fármacos.

Las células madre se plantean como una estrategia terapéutica, ya que reparan
o reemplazan el tejido dañado, o revierten una enfermedad o lesión. Una célula madre
(CM) o célula troncal (que muchas veces es llamada así), es aquélla capaz de dividirse
indefinidamente y diferenciarse a distintos tipos de células especializadas formando
clones totalmente idénticos, no sólo morfológicamente sino también en lo funcional.

La historia de las células madre comenzó ya hace dos décadas durante las cuales
se ha producido un cambio importantísimo en el destino y campo de la medicina.

Alexis Carrel fue un cirujano innovador y premio Nobel, que realizó experimentos
con trasplante y reparación de órganos, llevando avances al campo de la cirugía y
cultivos celulares. En enero de 1912 puso parte del corazón de un embrión de pollo con
medio nutriente fresco, y encontró que cada 48 horas el tejido doblaba su tamaño,
sobreviviendo por 34 años, marcando este antecedente nuevas alternativas hacia la
medicina regenerativa. Sin embargo, fue hasta 1960 cuando Ernest McCulloch y James
Till estudiaron los efectos de la radiación en la hematopoyesis de la médula ósea (MO),
realizaron una serie de experimentos que involucraron la inyección de células de MO
en ratones irradiados, observando que pequeños nódulos habían crecido en los bazos
de los ratones, en proporción al número de células de MO inyectadas. Posteriormente,
en 1961, describieron cómo estas células daban origen a colonias hematopoyéticas
multilíneas en hígado, dando las bases para su teoría de células madre (CM). Estos
investigadores, en 1963, en colaboración con Lou Siminovitch, obtuvieron pruebas de
que estas mismas células de la MO fueron capaces de autorrenovarse, un aspecto crucial
de la definición funcional de las CM.

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 Dos décadas después, en 1981, los científicos británicos Martin Evans y Matthew

Kaufman fueron los primeros en aislar exitosamente de la masa celular interna del
blastocisto células madre embrionarias (CME) de ratón y cultivarlas. Sin embargo, fue
hasta finales del siglo XX cuando el científico alemán Ernst Haeckel y su equipo de
investigación fusionaron los conceptos de filogenia y ontogenia para describir
las stammzelle (stem cell), acuñándose el término de CM, como un concepto para definir
a las células primordiales que se diferencian en diversos tipos de células y en organismos
multicelulares. Los argumentos de Haeckel se basaron en la evidencia propia de sus

observaciones del desarrollo embrionario. El término CM oficialmente entró en el

contexto científico cuando éstas fueron utilizadas por los histoembriólogos Theodor
Boveri y Valentin Haeckel, quienes describieron las características hereditarias de las
células germinales y su pluripotencialidad, así como su autorrenovación.

Entre otras perspectivas de la historia de la Medicina Regenerativa, un gran

amigo personal llamado Arnold Caplan, habiéndolo conocido en Montreal en el
Congreso Mundial de Medicina Regenerativa (ISCT) y luego mejor introducido por otro
gran amigo, el Dr. Diego Correa de la Universidad de Miami, fue quien realmente le
adjudico el término Mesenchymal Stem Cells (MSC’s) a las Células Mesenquimales que
se encuentran en todos los tejidos del ser vivo, en 1988. Alli describió que estas células
tienen el potencial regenerativo de convertirse en diversos linajes celulares que son
ideales para transformarse en otros tipos de células

En 1998, la revista Science publicó que el profesor Thomson de la Universidad de

Wisconsin había desarrollado la primera línea de células madre embrionarias humanas
(HCME), derivadas exitosamente de la masa celular interna de un blastocisto producido
por fertilización in vitro (FIV). "Esta línea celular debe ser usada en el desarrollo
biológico humano, descubrimientos farmacológicos y en la medicina del trasplante."

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 Una célula madre, es aquella que cuando nacemos, gracias a la fecundación del

óvulo con el espermatozoide, contiene toda la información genética del individuo para
el genotipo y fenotipo a expresar y es la encargada que dará origen a las distintas capas
germinales, como es el endodermo, mesodermo y ectodermo, y a gracias a éstos, los
distintos órganos. Esta célula transcurrirá por distintas etapas de mitosis, hasta formar el
feto que será gestado por 9 meses para su reproducción.

Una vez que las células madre, cumplan con su función de dar origen a distintos
tejidos, se almacenarán principalmente como fuente reservada en 3 lugares; el tejido
adiposo, la médula ósea y el cordón umbilical. Se han descriptas fuentes de obtención
de células madre en los pericitos arteriales como en diversos órganos. (Correa, Caplan,
Somoza – Nature)

Las células madre, que se producen naturalmente en el cuerpo, son "ingenuas"

o no especializadas. Esto significa que, en base a las señales de su entorno, estas células
pueden transformarse y asumir las funciones de una variedad de células diferentes en el
cuerpo. Pueden dividirse indefinidamente y diferenciarse a distintos tipos celulares
especializados, no solo morfológicamente, sino de forma funcional. La capacidad de
madurar de una manera específica del contexto es la clave del vasto potencial de las
células madre en la medicina regenerativa. Cuando se inyectan en un tejido dañado, las
células madre se especializan para llevar a cabo la función necesaria en esa área en
particular, mejorando los síntomas y la función.
Existe cuatro tipos de células madre según su potencialidad:

• Totipotenciales: tienen la capacidad de diferenciarse en tejido extra

embrionario o intraembrionario. Son células de la mórula.
• Pluripotenciales: tienen la capacidad de especializarse en cualquier tejido,
excepto el tejido placentario. Estas son las llamadas células embrionarias
y provienen del blastocito. Y las últimas descubiertas llamadas iPS.

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 • Multipotenciales: Son células adultas, Tienen capacidad de especializarse

en células de la capa germinal. Éstas son las mesenquimales o

mesenquimatosas y las células mononucleares de la médula ósea o del
tejido adiposo.
• Unipotenciales: Solo pueden diferenciarse en un solo tejido específico,
estas son células progenitoras de distintos tejidos.

Las células madre tienen una habilidad especial para moverse a tejidos
específicos a donde el cuerpo más los necesita. Esto significa que las células madre
pueden inyectarse en el torrente sanguíneo para luego moverse por sí mismas al área
afectada. Este mecanismo fue descripto durante varios años como homming.
Tienen la capacidad de:
Reparar
En el caso de daño tisular, las células madre tienen la capacidad de liberar
factores de crecimiento (Exosomas) y especializarse en varios tipos de células de tejido
que permiten la regeneración del tejido.
Inmunomodular
Cuando se introducen células extrañas en el cuerpo, la preocupación es que a
menudo generarán una respuesta inmune. Debido a que las Células Madre expresan
muy pocos antígenos en sus superficies que puedan generar una respuesta inmune (como
MHCI o MHCII), no provocan una reacción de las células T del sistema inmune del
paciente, lo que las hace seguras de usar de manera alogénica. Estas terapias aún no
han sido avaladas por la FDA/EMA pero se encuentran en etapas avanzadas de
investigación para ser aplicadas como una Droga biológica (2020).
Reducir la inflamación
Las Células Madre reducen las células de señal que promueven la inflamación
(como TNF-alfa y TNF-gamma). Si bien esta es otra función que les ayuda a evitar la

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respuesta inmune, también es esencial para la utilidad de las células madre en

enfermedades crónicas y autoinmunes caracterizadas por la inflamación.

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l10
CARACTERÍSTICAS DE LAS CÉLULAS MADRE PLURIPOTENCIALES.

Las células madre (CM) pluripotentes comparten muchas propiedades en común con las
células cancerosas, incluyendo autorrenovación, rápida proliferación y actividad de la
telomerasa. A continuación, se detallan las características de las CM:

1. División celular simétrica y asimétrica: Las CM son definidas por su capacidad de

producir una CM y una célula diferenciada mediante una división celular
asimétrica. El número de CM se mantendrá constante si únicamente se lleva a
cabo la división simétrica, siempre y cuando en cada ciclo una CM pueda dar
lugar a dos CM hijas. La división simétrica de las CM provee un mecanismo para
incrementar la población de CM después de una pérdida de las mismas.

2. Autorrenovación: Las CM tienen sus telómeros mucho más largos que cualquier
otro tejido embrionario. A partir de esta observación, se han preguntado si la
característica de estos telómeros hiperlargos son una propiedad natural de las
CM, como aquellas que se presentan en la masa celular interna del blastocisto,
en que su gran capacidad de autorrenovación se debe a la actividad de la
telomerasa. Por otro lado, también se ha demostrado que los telómeros de las
células madre pluripotentes inducidas aumentan su longitud después de su
reprogramación nuclear, hasta alcanzar la longitud de los telómeros de una CM.

3. Pluripotencialidad: Se refiere a la capacidad que tienen las blastómeras y las

células de la masa celular interna del blastocisto para generar diversos tejidos
embrionarios, líneas germinales, o como ya se ha citado antes, la capacidad que
tiene una célula madre para diferenciarse en otro tipo de célula.

Hasta el momento se han identificado tres factores de transcripción, como factores

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 reguladores de la pluripotencialidad: 1) proteína de unión octamérica-4 ( oct-4 ),

2) SRY-box que contiene el gen 2 (sox-2 ) y 3) homeobox nanog (nanog ). Oct-

4 se considera una proteína importante para la pluripotencialidad, debido a que
es un factor irremplazable en la reprogramación de las células madre
pluripotentes inducidas. Oct-4 es una proteína de unión al desoxyribonucleic
acid (DNA) que se expresa exclusivamente durante las etapas tempranas del
desarrollo embrionario. Por su parte, sox-2 fue descubierto como un factor de
transcripción que continuamente se unía al lado del motivo de oct-4, siendo lo más
importante la interacción de sox-2 con oct-4. Sox-2 colabora con oct-
4 activando fgf-4, un gen que es expresado en las células de la masa celular
interna del blastocisto y posteriormente en distintos tejidos embrionarios.
Finalmente, nanog fue descubierto por las diferencias de secuencias expresadas
en CME de ratón y las células somáticas; su nombre proviene del mito céltico " Tir
Nan Og" (tierra de la eterna juventud), ya que sin nanog , la pluripotencia no se
desarrolla y las células de la masa celular interna del blastocisto quedan
atrapadas en un estado prepluripotente, estado indeterminado, que no es viable.

4. Estrategias citoprotectoras: Muchas células han adquirido la habilidad de

resistir agentes citotóxicos mediante un sistema de detoxificación basado en
enzimas o por su habilidad de exportar rápidamente xenobióticos nocivos.

5. Inmunogenicidad: Se ha demostrado que la respuesta inmune de las CME es

baja en comparación con las CMA alogénicas, debido a la baja expresión del
complejo principal de histocompatibilidad I (MHC I) y la falta de expresión de
MHC II, aunque se ha probado en un modelo murino que aun a niveles bajos de
MHC I puede desencadenar una respuesta citotóxica.

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CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES (MSC’S)

CARACTERÍSTICAS GENERALES
Las células madre mesenquimales (MSCs) constituyen una población heterogénea de
células estromales multipotentes que proliferan in vitro adheridas al plástico, tienen
morfología semejante a la de los fibroblastos y pueden diferenciarse a células del linaje
mesodérmico como osteocitos, condrocitos y adipocitos (Fig. 1). A pesar de evidencias
que demuestran que las MSCs pueden transdiferenciarse a células de origen
endodérmico y neuroectodérmico, aún existen controversias en cuanto a la contribución

real in vivo de este proceso a la reparación de los tejidos.

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Aunque las MSCs residen prácticamente en todos los órganos posnatales y tejidos

conectivos, han sido caracterizadas fundamentalmente a partir de su aislamiento de

médula ósea. Uno de los máximos científicos que ha estudiado este tipo de Células es el
Dr. Arnold Caplan junto al Dr. Diego Correa. MSCs significó en 1988, ‘’Mesenchymal
Stem Cells’’ debido a que IN VITRO estas células pueden convertirse en células del tejido
del mesodermo. Actualmente se sugiere llamarlas Medicinal Signaling Cells, por su
potencial efecto paracrino que se ha podido describir de las mismas y su dificultad para
observar IN VIVO la modificación de un tipo celular hacia otro linaje específico.

Las MSCs carecen de un solo marcadores fenotípicos específicos de membrana (CT-

Closter of Diferentiation). Las provenientes de tejidos humanos, como consenso general,
no expresan los marcadores hematopoyéticos CD45, CD34 y CD14 o las moléculas
coestimulatorias CD80, CD86 y CD40, y expresan niveles variables de CD105 (también
conocida como endoglina o SH2), CD73 (ecto-5-nucleotidasa o SH4), CD44, CD90
(THY1), CD71 (receptor de transferrina o SH3), gangliósido GD2, CD271 y STRO-1.
Debido a su potente capacidad de auto-renovación, las MSC’s pueden ser cultivadas in
vitro con varios pases de cultivo sin pérdida significativa de sus propiedades
fundamentales. Estos tipos de marcadores únicamente pueden ser obtenidos mediante
análisis de citrometria de flujo, de ahí es donde ya comenzamos a hablar de Calidad en
Medicina Regenerativa.
Las MSC’s están involucradas en varios procesos fisiológicos y patológicos, incluido el
mantenimiento de la homeostasis tisular, el envejecimiento, el daño de los tejidos y las
enfermedades inflamatorias. La liberación de citoquinas inflamatorias en los tejidos
dañados conlleva la producción por parte de las MSC’s (residentes o reclutadas de la
médula ósea) de una plétora de factores de crecimiento, que orquestan a células
endoteliales, fibroblastos y otras células madre a promover la regeneración y reparación
de los tejidos a través de la angiogénesis, la secreción de metaloproteinasas, matriz
extracelular y la diferenciación celular.

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Aunque su potencial de diferenciación es menos amplio que el de las células madre

embrionarias (ES) o el de las células madre pluripotentes inducidas, las MSC’s son una
importante herramienta para la terapia celular de varias enfermedades. La razón es que
su uso no está restringido por la histocompatibilidad, no se favorece la formación de
teratomas como en el caso de las ES y, además, evade los conflictos éticos.
Considerando que los efectos terapéuticos de las CMM no solo se basan en su capacidad
historregeneradora, sino también en sus funciones inmunorreguladoras.

CÉLULAS MADRE PRESENTES EN LA MÉDULA ÓSEA

La médula ósea ha demostrado ser la mejor fuente de células madre del organismo
adulto; entre las más estudiadas se destacan las células madre hematopoyéticas (CMH)
que se caracterizan por su capacidad de proliferación y diferenciación en progenitores
hematopoyéticos comprometidos; se pueden hallar tanto en la médula ósea (1–3% de
los mononucleares), como en la sangre del cordón umbilical (0,2–1%) y en la sangre
periférica (0,001–0,025%). Cabe resaltar que la proporción de células madre entre los
mononucleares del cordón umbilical disminuye con la edad gestacional, así: de 11% a
las 17 semanas desciende a 1% a las 38 semanas; sin embargo, presentan una ventaja
competitiva sobre las CMH de la médula ósea, pues se injertan 10 a 50 veces mejor en
huéspedes xenógenos y los factores de crecimiento que poseen son mucho más potentes
que las de la médula ósea o tejido adiposo.
Los estudios sobre la ontogenia de las CMH indican que aparecen en el embrión entre
la tercera y cuarta semanas de la gestación; luego migran a través de la circulación
fetal, primero hacia el saco vitelino, luego al bazo y al hígado, para finalizar en el
órgano hematopoyético por excelencia del adulto: la médula ósea.
En la médula ósea se pueden reconocer dos tipos de CMH: en primer lugar las de largo
plazo (CMH–LP) (long–term hematopoietic stem cells, LT–HSC), que participan en el
mantenimiento del sistema hematopoyético durante toda la vida; así, en los modelos

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murinos, las CMH–LP cumplen un papel importante en el éxito del trasplante

hematopoyético. El otro tipo de CMH son las denominadas de corto plazo (CMH–CP)
(short term hematopoietic stem cells, STHSC), que originan los progenitores
comprometidos en el proceso de la hematopoyesis; en conjunto, las CMH se han
convertido en la base biológica de los trasplantes de médula ósea para las personas
que padecen leucemia o aplasia medular; además, se usan terapéuticamente en
pacientes con enfermedades no hematológicas como los infartos e isquemias del
miocardio.

Se reconocen en la médula ósea otros tipos de células madre, a saber: células madre
mesenquimales, células progenitoras multipotenciales adultas (CPMA) (multipotent adult
progenitor cells, MAPC) y las denominadas células madre SP (side population cells). Las
primeras, también conocidas como células estromales, son capaces de diferenciarse a
tejidos mesodérmicos funcionales, como osteoblastos, condroblastos, adipocitos y
mioblastos; su aislamiento se basa en ciertos marcadores que han hecho posible
identificarlas: SH2, SH3, CD29, CD44, CD71 y CD90 (+); sin embargo, no expresan
antígenos de superficie típicos de las CMH como CD34 y CD45 (--). Por su parte, las
CPMA poseen capacidades de proliferación y diferenciación similares a las de las células
madre embrionarias, porque presentan gran actividad de la telomerasa durante el
tiempo de cultivo, lo que les permite dividirse más de 120 veces sin envejecimiento
aparente; incluso de manera similar a las células del embrión se ha detectado activación
de los factores de transcripción Oct–4, Nanog y Rex–1, que son necesarios para
mantener el estado indiferenciado y proliferativo de la célula. A diferencia de la mayoría
de las células madre, las CPMA no expresan el CD34 (--), pero sí, aunque en niveles
muy bajos, Flk–1, Sca–1, Thy–1, y en niveles elevados marcadores como CD13, SSEA–
1 y SSEA–4.

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EL MICROAMBIENTE MEDULAR

El desarrollo de las células madre está determinado por un espacio específico en la

médula, denominado 'nicho', en el cual confluyen elementos del microambiente como
sustancias químicas, entre ellas hormonas, y diversos tipos celulares (del endotelio,
adipocitos, linfocitos T, macrófagos y fibroblastos), que intervienen en el proceso de
diferenciación celular y ofrecen a las células el soporte físico y el punto de adherencia
necesarios para sobrevivir. En el caso de las CMH, la interacción con el microambiente
incluye los factores de crecimiento y la matriz extracelular; se ha considerado que el

control derivado de este ambiente medular es de mayor importancia para el

compartimiento de las células madre que para el de las células más diferenciadas. El
cultivo de células madre in vitro ha sido posible gracias a la reproducción del
microambiente; el uso de una capa de soporte de fibroblastos mitóticamente inactivos
permite mantener líneas celulares indiferenciadas para propósitos de investigación; sin
embargo, ocurre con facilidad la diferenciación espontánea de estos linajes, situación
que plantea la necesidad de conocer los mecanismos bioquímicos y genéticos
reguladores de los procesos de autorrenovación y diferenciación en ese compartimiento
específico; en esa forma se daría respuesta a los interrogantes que rodean a las células
madre en relación con los eventos que las definen en términos moleculares o en cuanto
a las señales que controlan su diferenciación y reprogramación.

AUTORRENOVACIÓN Y DIFERENCIACIÓN

Las capacidades de autorrenovación y diferenciación son propias de los diferentes tipos

de células madre, según el microambiente y el tejido en que se encuentren. Diversas
investigaciones han tratado de hallar la razón por la que estas células siguen uno u otro
camino, pero aún quedan muchas preguntas sin resolver. Recientemente se ha podido
avanzar en el entendimiento de la biología básica de los mecanismos de
autorrenovación, diferenciación y proliferación celulares, así como en dilucidar las
diferentes vías de señalización que participan en estos eventos.

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En términos generales los diferentes nichos pueden modificar sus propiedades
reguladoras en respuesta a las necesidades particulares del tejido; sin embargo,
independientemente del nicho en cuestión, hay mecanismos comunes de señalización
que es muy importante conocer y que están mejor caracterizados en el sistema
hematopoyético; pero no ha sido sencillo el estudio de los mecanismos moleculares que
controlan la hematopoyesis, porque no se puede mantener a las CMH in vitro por largos
períodos; además, se presenta la dificultad de controlar la autorrenovación frente a la

diferenciación.
Específicamente en el proceso de autorrenovación intervienen inhibidores del ciclo
celular, genes implicados en rearreglos cromosómicos, proteínas esenciales para el
desarrollo y factores específicos como el Notch 1, Shh (Sonic hedgehog), el factor de
transcripción Hox B4, el inhibidor de la quinasa dependiente de la ciclina P21/waf 1,
las proteínas Wnt, entre otros. Para mantener con éxito el estado indiferenciado se
requiere la integración de diferentes vías de señalización intrínsecas con las señales
extrínsecas emitidas desde el microambiente. Es fundamental comprender los
mecanismos que regulan el estado de indiferenciación, por su importancia para entender
la biología de las células madre.

BASES MOLECULARES

VÍA DE SEÑALIZACIÓN WINGLESS (Wnt)

Esta vía es una cascada de señales que dirige los eventos proliferativos y de
diferenciación en el desarrollo embrionario y en el adulto. Sus proteínas son
hidrofóbicas, debido al palmilato unido a la cisteína en la posición C77 y que es vital
para su funcionamiento. Esta amplia familia de proteínas ha sido estudiada
especialmente en modelos murinos: en la médula ósea de ratones se ha descrito la

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expresión de Wnt 2B, Wnt 3A y Wnt 10B. El factor Wnt 5A, además de ejercer su

actividad en la médula, cumple un papel preferencial en el mantenimiento de las células

del estroma y, junto con el Wnt 10B, en células de hígado fetal. Todos estos factores de
transcripción propios de las células madre interactúan con los producidos por las células
del nicho con el fin de encaminar a las primeras hacia la autorrenovación o la
diferenciación.
En general las proteínas Wnt, secretadas al medio extracelular, actúan como ligandos
que se unen a receptores específicos de la membrana celular de las células productoras

y de células adyacentes. Existe una variedad de receptores que pueden interactuar con
estos ligandos, como los pertenecientes a la familia Frizzled (Fz) y la Proteína
relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad (low density lipoprotein
receptor protein, LRP); cuando el ligando se une a LRP puede formar un complejo
tetramérico con Fz. De igual manera, las proteínas relacionadas con Frizzled (FRP)
pueden antagonizar la acción de las Wnt, porque se unen directamente a ellas y
bloquean su acción.
Aunque se han propuesto diversas vías de señalización intracelular para Wnt, la
mayoría de ellas se han estudiado principalmente en el ámbito hematopoyético, donde
tienen un papel importante en la producción celular y del estroma medular. Se ha
estudiado la capacidad de ratones irradiados letalmente para reconstituir este sistema;
la presencia del factor Wnt 5A, junto con el estroma y las CMH murinas, promueve la
expansión de progenitores hematopoyéticos indiferenciados, y también participa
indirectamente en la regulación del microambiente, porque influye en la producción de
osteoblastos que a su vez son importantes reguladores del nicho de estas células.
Los estudios de los mecanismos de autorrenovación de las CMH están restringidos
principalmente a la vía de la Beta– catenina, cuyos eventos finales son la translocación
nuclear y la unión física de la Beta–catenina para activar el factor de transcripción
TCF/LEF (Tcell–specific transcription factor/lymphoid enhancer binding factor–1) y

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prevenir la diferenciación celular, colaborando así en el mantenimiento de la

pluripotencialidad.
La Beta–catenina actúa en el núcleo como un coactivador transcripcional de la familia
TCF/LEF, reemplazando a los correpresores de la familia del gen Groucho (GRG), y
recluta proteínas como CBP (Ciclic AMP binding protein), BRG1 (gen relacionado con
brama–1) y p300, que se unen a regiones promotoras presentes en los genes que
intervienen en la proliferación celular para activarlos. Así mismo, cuando esta vía no se
activa, la Beta–catenina en baja concentración se une a correpresores transcripcionales

del mismo complejo TCF/LEF para reprimir los genes blanco de Wnt. Todo este complejo
mecanismo conduce a inducir la proliferación de células progenitoras inmaduras,
incluyendo las CMH.
Esta vía también presenta una retroalimentación negativa que desestabiliza la Beta–
catenina por unión de los productos del gen supresor de tumor axina y del gen APC
(Adenomatous polyposis coli), después de lo cual, la quinasa caseína 1 (CK1) y la
quinasa glicógeno sintasa–3B axina (GSK3B) fosforilan secuencialmente la Beta–
catenina en el extremo aminoterminal; específicamente, la CK1 fosforila en el
aminoácido Ser 45, dando paso a GSK3B para fosforilar en otros 3 aminoácidos (Thr
41, Ser 37 y Ser 33) y finalmente dar lugar al complejo E3–ubiquitinaligasa que marca
la Beta–catenina para que sea degradada por el proteosoma. La translocación nuclear
es un suceso contrario a los anteriores pasos, en el cual se transfiere la proteína
citoplasmática Dishevelled (DVL) a la membrana celular cuando los ligandos Wnt se
unen con su receptor; este paso lleva a la disociación del complejo GSK3B y axina
evitando la fosforilación de la Beta–catenina y su posterior degradación; de esta manera
se acumula la Beta–catenina y es translocada al núcleo.
Esta cascada de señalización también cumple un papel importante durante el desarrollo
embrionario, la morfogénesis y la migración, proliferación y diferenciación celulares.
Estudios recientes la implican además en la proliferación de las CMH en células madre
embrionarias y neuronales; incluso se ha demostrado que el tratamiento in

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vitro de células madre epidérmicas con la proteína Wnt3a estimula la proliferación e

inhibe la diferenciación celular.

VÍA NOTCH

Esta vía la conforman principalmente cuatro proteínas llamadas Notch 1, 2, 3 y 4, que

interactúan en vertebrados con diversos ligandos (Delta, Delta like, Jagged 1 y Jagged
2). Estructuralmente las proteínas Notch son del tipo transmembrana que poseen un
dominio extracelular encargado de la unión al ligando y la activación de la vía; estos

receptores requieren una serie de clivajes por parte de los miembros de la familia de
proteasas ADAM (A disintegrin and metalloproteinase protein), así como un clivaje
transmembrana llevado a cabo por la presenilina que da lugar a la translocación nuclear
del dominio intracelular de Notch (DICN). El complejo ligando– receptor favorece la
liberación del DICN, que contiene señales de localización nuclear y secuencias OPA
(opacity associated adhesin proteins) ricas en glutamina que funcionan como activadores
de la transcripción. Una vez que se presenta la liberación del DICN se activa la molécula
CSL (abreviatura de Chisel) para mediar la transducción de señales hacia el núcleo y el
complejo se une a secuencias promotoras en el ADN para regular la expresión de
algunos genes blanco como en el caso del gen HES (Hairy/enhancer of split) que regula
negativamente la expresión génica específica de linaje.
In vitro se ha demostrado que la sobreexpresión de Notch 4 inhibe la diferenciación de
células epiteliales normales de la glándula mamaria; in vivo, esta misma proteína cumple
una función importante en el desarrollo y la carcinogénesis mamarios. Otros estudios
sustentan el papel de las proteínas Notch en la autorrenovación de las CMH; usando
genes Notch reporteros se demostró que esta vía se encuentra activa en dichas células
madre y que al irse diferenciando las células hematopoyéticas la expresión del gen
reportero presenta una baja regulación y solo una pequeña fracción de las células
maduras muestra actividad reportera in vivo; lo anterior sugiere la importancia
de esta vía para el mantenimiento del estado indiferenciado de las CMH.

l21
Puede concluirse que en cualquier tipo de célula madre la activación de Notch conduce

a la supresión transcripcional de los genes específicos de linaje, de tal manera que

inhibe la diferenciación y favorece la autorrenovación celular.

VIA HEDGEHOG

Esta vía de señalización fue identificada primero en Drosophila y hasta el momento se

sabe que tres de sus ligandos son relevantes: Sonic hedgehog (Shh), Desert hedgehog
(Dhh) e Indian hedgehog (Ihh), los cuales se unen a la proteína de interacción Hedgehog
1 (Hip1) y a la proteína Patched (Ptch), receptores transmembrana importantes para la
activación de la cascada.
En ausencia del ligando, Ptch se une a la proteína Smo (Smoothened) e inhibe su función;
una vez que se presenta la interacción ligando–receptor, Smo puede activar la
transcripción de los factores Gli 1, Gli 2 y Gli 3 que posteriormente se translocan al
núcleo para controlar la transcripción de genes blanco importantes en el control de la
proliferación celular, tales como los que codifican para las ciclinas D y E y para la
proteína Myc, así como también componentes de la vía del factor de crecimiento
epidérmico y la angiogénesis, como es el caso del Factor de crecimiento derivado de
plaquetas y el Factor de crecimiento endotelial vascular.
La presencia del ligando también actúa en el citoplasma, en donde las quinasas
transfieren grupos fosfato a regiones ricas en serina y treonina de la proteína quinasa
Fused (Fu), el supresor de Fused (Su–Fu) y la proteína Costal 2 (Cos 2). A su vez, estas
proteínas forman un complejo de alto peso molecular anclado a los microtúbulos del
citoesqueleto. En ausencia del ligando, la proteína quinasa A (PKA) fosforila al factor
de transcripción Ci (Ci155) que posteriormente es destruido por el proteosoma; este
paso permite la liberación de un péptido presente en la región amino–terminal del mismo
factor (Ci75) que funciona como represor de la transcripción. Todo lo contrario sucede
en presencia del ligando: el complejo citoplasmático se disocia de su anclaje (los

microtúbulos) y Ci155 se transloca al núcleo para activar la expresión de

l22
genes como ptc, dpp (Decapentaplegic), wg (Wingless), produciendo una respuesta final

de inhibición de la vía; de esta manera presenta una retroalimentación negativa.

Estudios recientes han demostrado que la vía Hedgehog es necesaria para el
mantenimiento de las células madre hematopoyéticas y neuronales; además, dicha vía
promueve la proliferación y supervivencia de estas células in vivo. En Drosophila esta
cascada favorece la autorrenovación de las células madre de ovario, aumentando su
proliferación.
La importancia de esta vía radica también en el desarrollo embrionario y la

morfogénesis; la ausencia de Ptch1 y Gli 2 produce defectos durante la etapa

embrionaria e hiperplasia mamaria en los seres humanos; el uso de Shh recombinante
estimula la formación de tejido mamario, que puede ser inhibido a su vez por acción de
la ciclopamina, un inhibidor de Smo; estos estudios sugieren el papel de Hedgehog en
la autorrenovación de las células madre de mama.
Así mismo, la señalización ejercida por esta vía está implicada en la carcinogénesis: la
presencia de mutaciones en algunos oncogenes que intervienen en la cascada, tales
como Smo, Shh, Gli 1 y Gli 2, se ha asociado con el desarrollo de algunos tipos de
cáncer entre ellos el meduloblastoma, carcinomas basales de la piel y cáncer de mama.

OTROS FACTORES INVOLUCRADOS EN EL PROCESO DE AUTORRENOVACIÓN

BMI–1, p16 Ink4a y ARF

El factor BMI–1 regula la expresión de p16Ink4a y ARF, genes supresores de tumores

identificados como biomarcadores del envejecimiento celular; la expresión anormal de

ambos se asocia con interferencia de la autorrenovación en CMH, puesto que detiene
la proliferación y lleva a la apoptosis; sin embargo, el papel de estos dos genes en el
control del ciclo en las células madre parece depender de su tipo. En general, actúan

l23
como reguladores de las proteínas retinoblastoma (Rb) y p53, respectivamente,

controlando la diferenciación, senescencia y supervivencia.

Estudios recientes han demostrado que mediante retroalimentación negativa este factor

regula la expresión de p16 Ink4a y ARF que se encuentran sobrerregulados en CMH y

células madre neuronales (CMN) de ratones deficientes en BMI–1.
BMI–1 hace parte del grupo Polycombo (PcG) de modificadores epigenéticos de la
cromatina; se lo identificó originalmente como un protooncogén necesario para el
mantenimiento y control de la diferenciación de las CMH murinas. Los genes PcG
intervienen en el silenciamiento de otros genes y ejercen su función formando complejos
proteicos multiméricos con actividad enzimática; la identificación de diversas histonas
deacetilasas y metilasas en dichos complejos sugiere que el PcG genera cambios
epigenéticos que contribuyen al silenciamiento de genes involucrados en la
diferenciación celular, de tal manera que su función es favorecer el proceso de
autorrenovación.
La deficiencia de BMI–1 resulta en una pérdida progresiva de CMH y en defectos en las
células madre neuronales (CMN) (Neuronal stem cells, NSC), puesto que también se ha
demostrado que es necesario para llevar a cabo eficientemente la autorrenovación de
dichas células en los sistemas nerviosos central y periférico. Los estudios de repoblación
competitiva muestran que diez semanas después del trasplante de médula ósea en
ratones Bmi–1 –/–, se presenta una disminución de las CMH, debido a su incapacidad
para autorrenovarse. También se ha demostrado que se requiere BMI–1 para la
proliferación de las células madre leucémicas y su desregulación se ha asociado con la
aparición de ciertos tipos de cáncer en humanos: meduloblastoma, neuroblastoma y
linfoma difuso de células B, lo cual abre la posibilidad de estudiar blancos terapéuticos
dirigidos a controlar la actividad de este factor.

l24
HOXB4 y proteínas parálogas

Los genes Hox codifican para factores de transcripción que regulan la embriogénesis y
la hematopoyesis. Esta gran familia de proteínas está compuesta por 39 miembros que
poseen una secuencia de 60 aminoácidos altamente conservada que actúa como un
dominio de unión al ADN.
De todos los genes Hox, el factor de transcripción HoxB4 fue el primero en ser asociado
con el mecanismo de autorrenovación; es así como la sobreexpresión de este factor en
la médula ósea se relaciona con expansión de las CMH, in vivo e in vitro, lo cual ha

demostrado su función en la autorrenovación de dichas células; además solo se

encuentra una alta expresión en las células hematopoyéticas primitivas que declina al
ocurrir la diferenciación específica de linaje. De manera similar Daga y colaboradores
mostraron que las células CD34 positivas expresan el factor de transcripción HoxC4 y
que su sobreexpresión induce la proliferación de progenitores multilinaje; los datos
reportados hasta el momento indican que la combinación de HoxB4 y HoxC4 se asocia
con la expansión de las CMH.
La activación de HoxB4 está a cargo del factor de transcripción nuclear trimérico Y (NF–
Y) en cooperación con el factor USF1/2. Los estudios realizados en ratones deficientes
en HoxB4 muestran un desarrollo hematopóyetico normal; estos resultados aportan
evidencia de que los parálogos de los genes Hox4 son capaces de compensar la pérdida
de función del HoxB4, pues poseen una estructura proteica idéntica a la de este factor
y además contienen secuencias HxRE1 y HxRE2, que son sitios de unión para NF–Y y
USF1/2.
NANOG, OCT3/4 Y SOX2

Nanog es un factor de transcripción que contiene un dominio homeobox y su actividad

es esencial para el mantenimiento in vitro e in vivo de las CMH y de las células madre
embrionarias (CME); además, durante la diferenciación se presenta una baja regulación
de este factor cuya ausencia en ratones resulta en una diferenciación primitiva del
endodermo.

l25
En su conjunto los factores Nanog, Oct3/4 y SOX2 regulan la autorrenovación y la

pluripotencia especialmente en las CME; sin embargo, hasta el presente no se han

dilucidado por completo los mecanismos de acción de estos factores ni cómo se controla
su expresión; algunos informes sugieren la intervención de Oct3/4 y SOX2 como
reguladores de Nanog, pues poseen sitios de unión a la región promotora de este factor;
sin embargo, el gen Nanog no es el único regulado por el complejo Oct–Sox, sino que
se han identificado sitios de unión para estos dos factores en las regiones promotoras de
los genes Fgf–4, Utf–1 y Fbx–15.

Oct 3/4 regula los genes 'corriente abajo' mediante la unión a secuencias de repetición
AGTCAAAT presentes en las regiones promotoras de algunos genes; este factor actúa
junto con SOX 2, un miembro de la familia SOX de los factores de transcripción HMG
box; ambos factores ejercen un papel esencial en la autorrenovación y presentan una
alta expresión en la mayoría de las líneas de células madre embrionarias. El incremento
en la expresión de Oct 3/4 promueve la formación de mesodermo y endodermo y la
baja regulación resulta en diferenciación hacia trofoectodermo; por su parte, la pérdida
de SOX2 también contribuye al desarrollo de endodermo extraembrionario. Oct 3/4, al
igual que otros factores que intervienen en el proceso de autorrenovación, se encuentra
implicado en la tumorogénesis, específicamente en las células germinales adultas; la
expresión anómala de este factor en ratones adultos conduce a la aparición de lesiones
displásicas en la piel y el intestino. Estos hallazgos abren un nuevo panorama a la
comunidad científica y el esclarecimiento de estos mecanismos de regulación en el
proceso de autorrenovación se ha convertido en un punto clave para entender la
carcinogénesis sus alternativas terapéuticas.

DIFERENCIACIÓN

Al igual que las propiedades de autorrenovación, se ha estudiado ampliamente el

proceso de diferenciación de las células madre en especial mediante ensayos con células
madre hematopoyéticas. El proceso de diferenciación está regulado por un

l26
conjunto de factores transcripcionales; la señalización ejercida por estos factores activa

una serie de genes específicos directores de un linaje determinado; el mejor ejemplo de

este mecanismo son las CMH, en las que se destacan dos categorías: la primera incluye
el factor de transcripción de la célula madre de leucemia (stem cell leukemia), el factor
de transcripción GATA–2 y el factor–1 de transcripción de leucemia mieloide aguda
(AML–1) que influyen directamente en la diferenciación de todos los linajes
hematopoyéticos; la segunda comprende los reguladores del desarrollo específico de
linaje como el GATA–1 (por la secuencia guanina–adenina–timina–adenina) y el PU–

1; sin embargo, la diferenciación no es exitosa si no intervienen los factores estimulantes

y las citoquinas que pueden variar dependiendo del linaje (eritroide, mieloide, linfoide,
monocítico o megacariopoyético).
Se han propuesto varias teorías para explicar el proceso de diferenciación de las células
madre; entre ellas está su irreversibilidad, basada en análisis de redes aleatorias
(random networks); también se ha descrito la diferenciación celular como un fenómeno
adaptativo, cuyo modelo involucra cambios en la expresión génica de estas células.
Estos aportes han sido de gran utilidad para investigaciones posteriores que se han
enfocado en las vías genéticas implicadas en el proceso de diferenciación: los factores
GATA 1 y PU–1 han sido considerados mediadores importantes en la diferenciación de
las células madre hematopoyéticas; así mismo, se ha considerado que la relación
dinámica entre los genes OCT4, SOX2 y Nanog es de gran relevancia en el proceso de
diferenciación de las células madre embrionarias. En el caso específico de la
diferenciación de las células madre hematopoyéticas, el microambiente medular y las
vías de señalización celular juegan un papel relevante; se han hecho numerosos ensayos
in vitro para estudiar el papel de las interleuquinas (IL) en este proceso, en particular la
IL–3, la IL–6 y la IL–11.
En conclusión, el conocimiento generado a partir del comportamiento biológico y las
vías implicadas en los procesos de autorrenovación y diferenciación de las células
madre, permite la apertura de un panorama alentador en la investigación

l27
básica y aplicada; así mismo, las propiedades exclusivas de estas células las hacen ver

como muy promisorias en la terapia de diferentes enfermedades; sin embargo, la

mayoría de los resultados obtenidos bajo condiciones experimentales in vitro todavía no
han sido confirmados in vivo; por otra parte, es importante resaltar que algunos de los
mecanismos moleculares estudiados requieren mayor profundización en el campo
experimental.

l28
VERSATILIDAD, FUSION CÉLULAR Y CÉLULAS MADRE ADULTAS

A pesar de los múltiples estudios publicados que sugieren la existencia de células madre
adultas pluripotenciales o incluso de la capacidad de ciertas células madre de transdife-
renciarse, existen importantes interrogantes e incluso nuevas evidencias científicas que
han cuestionado la verdadera naturaleza de estos fenómenos de diferenciación: quizá
la pregunta fundamental radica en cuál es el posible mecanismo(s) que justifica las
observaciones que hemos comentado. Cuatro serían las hipótesis que se barajan en la

actualidad.

1- La mayor parte de los estudios publicados hasta el momento que sugieren la

existencia de células madre adultas pluripotenciales no han sido capaces de
demostrar esta potencialidad a nivel clonal, es decir, una única célula dando
origen a dos poblaciones celulares diferentes. En este sentido es posible que
muchas de las observaciones realizadas, correspondan realmente a la
heterogeneidad de las células estudiadas, pudiendo existir diversas células madre
en la misma población, cada una con distintas capacidades. En este sentido, sin
embargo, si existen trabajos en los que se demuestra a nivel clonal, la
potencialidad de las células madre identificadas.
2- Varios trabajos recientes han demostrado que al menos algunas de las
observaciones de pluripotencialidad podrían estar justificadas por procesos de
fusión entre las células madre transplantadas y las células residentes. El fenómeno
de fusión se suele acompañar con la formación de células con características de
ambas poblaciones fusionadas y generalmente con doble dotación cromosómica,
lo que induce una desventaja proliferativa. La existencia del fenómeno de fusión
es indudable y la pregunta que cabe hacer es si podría justificar todas las
observaciones de pluripotencialidad realizadas hasta la fecha, lo cual parece

l29
 poco probable, e incluso hasta qué punto este fenómeno puede ser ventajoso

para la regeneración de un órgano o tejido.

3- 3- De igual forma que durante el proceso de clonación, el núcleo de la célula
somática sufre un proceso de reprogramación, es posible que las células madre
adultas, en determinadas circunstancias, puede desdiferenciarse para
posteriormente diferenciarse hacia células de distinta estirpe.
4- Finalmente, es posible que en el organismo adulto persistan células madre
indiferenciadas, remanentes de tejido embrionario con capacidad pluripotencial.

EL MICROAMBIENTE DE LA CÉLULA MADRE

El uso de una capa de soporte de fibroblastos mitoticamente inactivos para el cultivo de

células madre ha permitido mantener líneas celulares indiferenciadas para su
investigación, sin embargo la diferenciación espontánea de estos linajes ocurre con
facilidad por lo que en estas investigaciones es necesaria la creación de subcultivos de
células que aún permanezcan indiferenciadas. A pesar de nuestra capacidad para
cultivar estas células la verdadera naturaleza de las células madre solo puede ser
reconocida descubriendo los mecanismos que las regulan. Por esto el estudio del
microambiente o nicho particular que rodea a las células madre, permitiéndoles
permanecer en su estado indiferenciado y de auto perpetuación, es de gran importancia.
Sin embargo, estos nichos han sido solo parcialmente inferidos debido a la dificultad de
manipular e identificar células madre individuales.
Un nicho se reconoce porque, aunque las células madre que contiene desaparezcan,
éste se mantiene y el destino de las células madre es irrelevante para el mismo. Además,
el nicho específico de cada linaje a definir de manera precisa la forma de dividirse de
la célula madre y el destino que las células hijas tendrán. Por ejemplo, los nichos pueden
orientar la división de sus células multipotentes haciendo que solo una de las células hija
herede las moléculas de unión a la membrana basal de nicho, permitiendo que

l30
una célula se libere del nicho y proceda a diferenciarse; por el contrario, si el nicho

permite que las dos células hijas hereden las moléculas de contacto entonces la
población de células madre se mantendrá estable. Estos tipos de divisiones en un nicho
son divisiones asimétricas, que han sido denominadas asimetría invariable y asimetría
poblacional respectivamente. Durante una división celular asimétrica cada una de las
células hijas puede adquirir un potencial diferente de desarrollo, posiblemente el nicho
de las células madre en la mayoría de los tejidos de los mamíferos presente un tipo de
división asimétrica poblacional, esta división, a diferencia de la división invariable

permite la generación de un continuo de células madre y progenitoras permitiendo que

la asimetría se alcance a partir de la población y no de divisiones celulares individuales.
El nicho también ejerce control sobre la célula madre mediante factores secretados. La
secreción de factores de crecimiento y mantenimiento fue descrita inicialmente en la
hematopoyesis, en este sistema la función de los factores secretados parece ser selectiva,
mientras que en las células madre de la cresta neural los factores pueden jugar un papel
instructivo en la diferenciación. Dos familias de factores presentan una función
conservada entre especies y tejidos. El factor transformante de crecimiento b-relacionado
(TGF-b) y el factor Wnts son factores activadores de la transcripción que participan en
la diferenciación de células madre de diferentes nichos. En el nicho germinal las células
de Sertoli producen el factor TGF-b el cual afecta la proliferación de células germinales
prematuras, incluyendo a las células madre. En el nicho epidermal los factores TGF-b RII
y Wnt parecen inducir la generación de folículos pilosos, además el factor Wnt también
permite la diferenciación de las células a células foliculares y no keratinocitos, por lo
menos dos miembros de la familia TGF-b son importantes en la regulación de la
diferenciación de las células madre de la cresta neural.
La adhesión de las células madre a la membrana basal del nicho es mediada por
moléculas de adhesión, siendo las integrinas las más ampliamente caracterizadas. Las
integrinas mantienen a las células madre en posición y la pérdida o alteración de estas
moléculas causa que las células madre se diferencien o inicien la apoptosis,

l31
además las integrinas pueden activar receptores de factores de crecimiento. Las

integrinas a y b se encuentran sobre-expresadas en la capa basal del nicho germinal de

los mamíferos, lo cual permite que las células madre de las espermatogonias se
mantengan unidas al nicho.
El nicho del epiblasto pluripotente, en el embrión humano, es proporcionado por los
tejidos extraembrionarios, como el trofoblasto y el endodermo visceral. La región
anterior del endodermo visceral secreta una señal relacionada a el factor TGF-b el cual
controla la diferenciación de la parte más anterior de los linajes embrionarios. Las células

de la lÌnea germinal y mesodérmica son inducidas por el factor Bmp4 producido por las
células del trofoblasto.

FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN Y AUTO-RENOVACIÓN

Las células madre producen factores de transcripción que interactúan con los factores
producidos por las células del nicho, es probable que los factores de transcripción
controlen el destino de la célula madre así como su auto renovación, además de cada
linaje se encuentra controlado por una combinación de estos factores, inclusive estos
factores pueden ser expresados individualmente en diferentes linajes. En la
hematopoyesis del ratón los factores SCL/Tal-1 son esenciales en la formación de todos
los tipos de linajes celulares. En el epitelio intestinal y epidermal la familia de factores
Tcf/Lef juegan un papel muy importante, los cuales son activados por la b-catenina. El
factor Tcf-4 es mediador de señales que permiten la formación y el mantenimiento de las
criptas intestinales (nicho intestinal). Mutaciones en la b- catenina producen complejos
Tcf-4/b-catenina constitutivamente lo cual acelera la proliferación de las células madre.
En general los nichos pueden modificar sus propiedades reguladoras a las células madre
en respuesta a las condiciones presentes, asegurando que las células madre se
encuentren en sincronía con las necesidades particulares del organismo. Este control

l32
permite que las células madre se dividan en sincronía y la población se mantenga

estable, en condiciones normales para el organismo; sin embargo, es probable que las
células madre de un nicho no se encuentren en la misma fase del ciclo celular en el
momento en que el organismo necesita la produccio4n de progenitores. A pesar de esto
en el microambiente hematopoyético las células madre entran en división al menos cada
6 meses y el 90% de ellas lo hace cada 30 días.
A pesar de las diferencias estructurales y funcionales de los diferentes nichos, estos
pueden funcionar bajo reglas comunes. Varios de los microambientes descritos usan uno

o más grupos especializados de células de soporte. Una seńal principal originada dentro
de las células especializadas es recibida por la célula madre y controla su
comportamiento aunque la cascada de seńales sub- siguientes sea muy compleja en cada
nicho. Una membrana basal hace parte de la mayoría de los microambientes estudiados,
una matriz extracelular que ayuda a estructurar los nichos espacialmente y modula la
concentración de moléculas de las de señalizaciones y de adhesiones.
Uno de los más importantes tópicos en el entendimiento de las células madre es la
autorenovación. La autorenovación es requerida por todos los tipos de células madre
para persistir en el tiempo. El mecanismo de autorenovación es fundamental para
reconocer los mecanismos de regulación de las células cancerosas.
Los factores Notch, Shh (Sonic hedgehog) y Wnt pueden regular los mecanismos de
autorenovación. En las células madre hematopoyéticas, la activación de Notch
promueve la autorenovación o al menos el mantenimiento de la multipotencialidad. La
señalización por medio del factor Shh también se encuentra implicada en la regulación
de la autorenovación de células madre hematopoyéticas, neurales y de la línea germinal.
El factor Notch también se encuentra implicado en la señalización de estos tipos de
células madre.
El factor Wnt que también forma parte de los factores secretados, promueve la
autorenovación en una variedad de tejidos entre los cuales esta la hematopoyesis, la
generación de la epidermis y del epitelio intestinal.

l33
En el embrión de roedor las células madre embrionarias pueden mantener su condición

pluripotente cuando el factor inhibidor de leucemia (LIF) se encuentra presente y este a

su vez hace que se exprese otro factor, el Oct4, uno de los marcadores del estado
pluripotencial. Cuando el factor LIF es retirado del medio, las células rápidamente
regulan el factor Oct4 perdiendo la capacidad de autorenovación y diferenciandose en
una variedad de tipos celulares.

La vía por la cual el factor LIF promueve la autorenovación de las células madre
embrionarias de roedor ocurre por la heterodimerización de dos clases de receptores
de citoquinas tipo I, el receptor de baja afinidad a LIF (LIF-R) y la unidad común gp130.
Sin embargo el papel que juega LIF in vivo, en el desarrollo del embrión aún no es
completamente claro. Aunque como se esperaría para el mantenimiento de las células
pluripotenciales in vivo, el LIF se expresa en el trofoectodermo y su receptor en la masa
interna celular (ICM).

Células Madre Mesenquimales (MSCs)… más de ellas.

Las células madre mesenquimales (MSCs) son células adultas multipotentes, con
morfología fibroblastoide y plasticidad hacia diversos linajes celulares como condrocitos,
osteocitos y adipocitos, entre otros. Estas pueden ser aisladas y expandidas en medio
de cultivo debido a sus propiedades de adhesión al plástico, diferenciación y
proliferación in vitro.

Las MSCs se caracterizan por presentar una morfología en forma de huso con núcleo
alargado, central, que contienen de 2 a 3 nucleolos. En estudios de citometría de flujo
se han descrito tres subpoblaciones de estas células. Una de células pequeñas, fusiformes
y agranulares a las que denominaron RS-1; otra de células pequeñas y agranulares
nombrada RS-2; y la última, conformada por células grandes y granulares a las que
denominaron células mesenquimales maduras o MSCs. También se ha reportado la

l34
presencia de 2 tipos morfológicos en los cultivos, uno con forma fibroblastoide, que es
el predominante, y otro representado por células de mayor tamaño y forma romboide.

Las MSCs pueden ser aisladas de diferentes fuentes, entre ellas: la médula ósea, la
sangre de cordón umbilical, tejido adiposo, páncreas, hígado, músculo esquelético,
dermis, membrana sinovial y pulpa dental. Varios grupos de investigaciones publicadas
han señalado la posibilidad de obtener también estas células de otras fuentes
alternativas, como el líquido amniótico y la gelatina de Wharton del cordón umbilical.
No obstante, los tejidos más empleados son la médula ósea, la sangre del cordón
umbilical y el tejido adiposo. Estudios recientes han señalado que no existen
diferencias morfológicas ni inmunofenotípicas entre las células obtenidas de estos tejidos,
pero los resultados indicaron que, aunque la sangre de cordón umbilical tiene un mayor
potencial de expansión, su potencial de diferenciación es menor, al no hacerlo hacia un
linaje adipogénico.

CARACTERÍSTICAS DE LAS MSCs

En cuanto al aislamiento y cultivo a partir de tejido adiposo, las células obtenidas tienen
una morfología, fenotipo y capacidad de diferenciación similar a la médula ósea, pero
con mayor potencial de proliferación. La obtención de muestras de este tejido es poco
invasiva y puede hacerse a través de procedimientos como liposucción o
abdominoplastia.

De acuerdo con la Sociedad Internacional de Terapia Celular (International Society for

Cellular Therapy, ISCT) los requisitos mínimos para definir a las MSC humanas son:

• capacidad de adherirse al plástico en cultivo;

• capacidad de diferenciarse hacia adipocitos, osteo- citos o condrocitos;

l35
• expresión de marcadores de superficie de origen mesenquimal: CD105, CD73 y
CD90;

• ausencia de expresión de marcadores de linaje hematopoyético: CD45, CD34, CD14

o CD11b, CD79a o CD19 y el antígeno leucocitario humano (HLA) clase II.

Fisiológicamente, las dos funciones principales que cumplirían in vivo las células que
contribuyen con los cultivos de MSCs serían las de soporte, tanto de la reparación de

tejidos dañados como de la hematopoyesis. Al incorporarse a tejidos dañados las MSCs

pueden diferenciarse en componentes del tejido conectivo, colaborar con la
vasculogénesis, y/o secreción de citoquinas y factores de crecimiento, lo que facilitaría
el proceso de cicatrización.

Para que las MSCs se puedan clasificar como tales deben expresar los antígenos
mesenquimales CD73, CD90 y CD105 y no tener antígenos hematopoyéticos como
CD34, CD45, CD14 y CD11b. Además, se ha planteado que las MSCs pueden expresar

l36
los siguientes antígenos: CD13, CD29, CD44, CD116 y el receptor a del factor de
crecimiento derivado de las plaquetas.

Por otro lado, se ha comprobado que las MSCs son positivas para otros factores de
crecimiento y de matriz celular como: el receptor del factor de crecimiento neuronal, los
receptores de factores de necrosis tumoral I y II y los receptores de las interleucinas
1(CD121), 3(CD123), 4(CD124), 6(CD126) y 7(CD127). Expresan diferentes
moléculas de adhesión: ICAM-1 (CD54), ICAM-2 (CD102), ICAM-3 (CD50), VCAM
(CD106), L selectina (CD62L), LFA-3 (CD58), ALCAM (CD66), NCAM (CD56),
endoglobina (CD 105) y CD 72. Por otro lado, estas células son negativas a las
reacciones citoquímicas: fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida y negro sudán.3,14-20

Existen moléculas de gran relevancia en la hematopoyesis que son producidas y

secretadas por las MSCs. Estas moléculas incluyen componentes de la matriz extracelular
como los colágenos I, III, IV y VI, fibronectina, entre otras; y citocinas que incluyen la
interleucina 6 (IL-6), el factor inhibitorio de leucemia, el factor estimulante de colonias
de macrófagos, el factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGF-1) y 2 (FGF-2), el factor
de crecimiento vascular endotelial (VEGF), etcétera.

MSCs Y SUS EFECTOS INMUNOMODULADORES.

Debido a la capacidad inmunomoduladora que poseen estas células, pueden evitar el

rechazo alogénico mediante diferentes mecanismos. Numerosos estudios han
demostrado que las MSC’s no permiten el reconocimiento de antígenos al interferir en
la función de las células dendríticas y de los linfocitos T, por lo que tienen un efecto
inmunosupresor local debido a su capacidad de secretar citocinas. Este efecto se
potencia cuando las células son expuestas a un medio con actividad inflamatoria o
caracterizada por la presencia de altos niveles de interferón gamma.

l37
En estudios in vitro se ha demostrado que las MSC’s no expresan los antígenos del

sistema principal de histocompatibilidad de clase II, lo que indica que constituyen un

potencial terapéutico en la enfermedad injerto contra huésped porque pueden reducir o
suprimir las reacciones inmunes inducidas.

Además, pueden afectar el funcionamiento del sistema inmune por otros mecanismos. Se
ha indicado que las MSC’s pueden inhibir la proliferación de linfocitos inducida por
aloantígenos y mitógenos como fitohemaglutinina y concavalina A, así como su
activación por anticuerpos anti CD3 y CD28. También se ha señalado que las MSC’s
pueden inhibir la expresión de moléculas involucradas en la presentación de antígenos
y en cocultivo con células mononucleares de sangre periférica, incrementan la
proporción de subpoblaciones de linfocitos T con fenotipo de células reguladoras.

Se ha sugerido que muchos de estos efectos son mediados predominantemente por

factores paracrinos, pues las MSC’s secretan un número considerable de factores
inmunomoduladores. También se ha planteado que la acción inmunosupresora pudiera
estar vinculada con la participación de otros sistemas inmunorregulatorios.

Como complemento de los datos antes expuestos, se puede acotar que las MSC’s in
vitro pueden inhibir la proliferación de los linfocitos T y B, apoyan el desarrollo de células
T reguladoras, disminuyen la actividad lítica de las células citotóxicas naturales o
asesinas naturales (en inglés, natural killer cells) y de los linfocitos T citotóxicos, inhiben
la diferenciación de monocitos en células dendríticas.

Las cualidades inmunomoduladoras de las MSC’s y su baja inmunogenicidad las

convierten en una fuente atractiva de células madre a emplear en la terapia celular, ya
bien para la regeneración de tejidos o para establecer la homeostasis en sitios con
estados inflamatorios crónicos patogénicos (Enfermedades autoinmunes).

l38
Su capacidad de migrar preferencialmente a estos sitios ha convertido a estas células en

sistemas para el depósito de drogas en el microambiente tumoral para controlar la

progresión del cáncer (CAR-T Cells)

Un tema de crucial importancia es el perfil de seguridad de las MSC’s infundidas.

Aunque el uso hasta ahora se considera seguro, los efectos a largo plazo sobre la
función inmune y el riesgo de tumorigenicidad aun no se conocen y hay solida evidencia
científica de que eso no sucede. Teniendo en cuenta que la expansión in vitro de las
MSC’s puede conducir a transformación espontánea se requieren estudios precisos de
estabilidad genética para asegurar la calidad y bioseguridad de las MSCs en la práctica
clínica. Vale resaltar que de los 339 ensayos clínicos reportados en el sitio
http://clinicaltrials.gov con terapia celular basados en MSCs, aun no se ha informado
transformación maligna. Si se ha registrado que cuando se utilizan MSC’s vinculadas a
tratamientos regenerativos concomitantemente con tumores, el ‘’Tumor’’ secuestra los
factores de crecimientos regenerativos de las células mesenquimales y los utiliza para su
propio crecimiento.

De igual manera se requiere una caracterización detallada del fenotipo de las MSCs
cultivadas y de protocolos más estandarizados para su cultivo, ya que la eficacia
terapéutica está influenciada por las condiciones de cultivo, las que afectan
significativamente la función de las MSCs. Otros factores, como el número de células, el
sitio de inyección y el estado de la enfermedad, pueden determinar la eficacia
terapéutica de las MSCs. A pesar de estas limitaciones, el potencial inmunosupresor y
de restauración de los tejidos hacen de las MSCs una promesa para el tratamiento de
desórdenes mediados por el sistema inmune.

l39
APLICACIONES CLÍNICAS DE LAS MSCs

Debido a la gran capacidad multipotencial, plasticidad y acciones de las MSCs, resultan

de gran interés para la aplicación clínica. Sus características permiten utilizarlas para
modular reacciones inmunes en enfermedades autoinmunes y en el trasplante de médula
ósea; para regenerar tejidos destruidos o dañados como sucede en enfermedades
neurodegenerativas, la diabetes o en cardiopatías. Además, podrían ser utilizadas como
vehículo terapéutico de genes; como por ejemplo, en enfermedades monogénicas como
la hemofilia. Sin embargo donde más se están utilizando estas terapias regenerativas
son en lesiones músculo esqueléticas, lesiones ulcerativas de la piel y en la isquemia
arterial de miembros inferiores.

l40
El uso clínico de las MSCs está basado en una serie de investigaciones preclínicas en
modelos animales, que han demostrado la utilidad de estas células en la regeneración
de órganos y tejidos, y además se ha observado que modulan reacciones inmunes en
distintas enfermedades.

En la reparación del miocardio se reportan diferentes efectos de las MSCs sobre el tejido
cardíaco, como son su diferenciación in situ en cardiomiocitos, además de la liberación
de factores solubles y su fusión con células cardíacas. Esta aplicación se ha demostrado
en el corazón porcino donde se ha observado una reducción importante del tamaño del
tejido lesionado, neovascularización y reducción de los niveles de apoptosis.

Otra aplicación clínica de las MSCs es en la reparación de hueso. Se ha demostrado in

vivo en ratones y perros con defectos cráneo-faciales y de los huesos largos, que con la
administración directa de estas células y con el uso sobre matrices como la
hidroxiapatita/fosfato tricálcico, los resultados son satisfactorios. Recientemente se ha
planteado la posibilidad de usar este proceder para optimizar los implantes dentales.
En la actualidad, los ensayos clínicos en niños con osteogénesis imperfecta han logrado
obtener osteoblastos funcionales que aumentan el contenido mineral del hueso.

En el campo de la oftalmología, la utilización de las CMM empieza a dar sus resultados

en el tratamiento de las úlceras corneales y en las degeneraciones retinianas.

Por otro lado, se han obtenido resultados prometedores en el área de la cirugía general
en el tratamiento de fístulas de distintas localizaciones como el tracto respiratorio y
digestivo. Además, se están realizando importantes estudios en la diabetes mellitus, en
enfermedades neurodegenerativas y en la regeneración hepática.

Con resultados muy positivos se emplean estas células en quemados, en lesiones

cutáneas secundarias a radioterapia, donde se ha demostrado una regeneración

l41
epitelial, angiogénesis y una importante hidratación hística. Se están realizando

diferentes estudios para la utilización de las MSCs en la cicatrización de las heridas, ya

sea mediante una administración sistémica o por aplicación tópica en el sitio de la herida.
Debido a la naturaleza expuesta de la piel, la aplicación directa de estas células en
casos de individuos politraumatizados y en quemaduras graves es una opción muy
prometedora. El uso de las MSCs en el tratamiento de las heridas crónicas tiene objetivos
múltiples: acelerar la reparación del tejido, para amortiguar eventos inflamatorios y para
reducir o eliminar la formación de cicatrices.

Otra alternativa es utilizar las MSCs para estimular la angiogénesis. Algunos estudios
han demostrado que estas células tienen un efecto positivo en la recuperación del flujo
sanguíneo, lo cual se explica por la evidencia experimental que indica la generación e
incorporación de células endoteliales derivadas de las MSCs, a los capilares en su
formación y por los resultados de estudios recientes que han demostrado que estas
células también promueven la angiogénesis por la secreción de citocinas como VEGF-A,
FGF-2 y la IL-6.

A pesar de los avances obtenidos, los mecanismos celulares y moleculares por los cuales
las MSCs ejercen sus influencias están todavía bajo investigación. La profundización en
la caracterización fenotípica, ontogénica y funcional de las MSCs, así como los avances
en la identificación de sus funciones biológicas, ha permitido la apertura de nuevas vías
y opciones para su utilización en la medicina regenerativa en una amplia variedad de
enfermedades, lo que seguramente se irá ampliando a medida que se adquiera mayor
experiencia en este campo.

l42
Sistemas de cultivo.

El primer aislamiento de MSCs lo realizó Friedenestein et al, determinando la adherencia

de estas células a superficies plásticas a partir de muestras de médula ósea después de
3 a 5 días de cultivo, donde observaron colonias de 2 a 4 células con morfología
fibroblastoide las cuales denominaron unidades formadoras de colonias fibro- blastoides
(CFU-F).
Para obtener MSCs a partir de muestras de MO, las células mononucleares se aíslan por

gradiente de densidad, luego son cultivadas a una densidad de aproximadamente 1 x

106 células mononucleares/ cm2. El cultivo de las MSCs se realiza en medios como el

Dulbecco modificado de Eagle (DMEM), Medio Iscove modificado de Dulbecco (IMDM),

suplementados con suero fetal bovino (SFB), aminoácidos no esenciales, piruvato de
sodio, y antibióticos. El primer cambio de medio se realiza entre las 24-72 horas para
retirar las células no adherentes del cultivo y permitir la proliferación de las células hasta
obtener la confluencia deseada.
Para la diferenciación de MSCs a distintos tejidos se utilizan suplementos especiales en
el medio de cultivo base. Por ejemplo, para la diferenciación osteogénica de las CMM,
el medio basal debe ser complementado con dexametasona, alpha -glicerofosfato ( -
GP), acido ascórbico y SFB. En presencia de estos suplementos las células forman
agregados, adquieren un cambio de morfología, aumentan la actividad de la fosfatasa
alcalina y producen depósitos de cristales de hidroxiapatita. Para la inducción de las
MSCs a precursores adipogénicos, el medio basal se enriquece con dexametasona, 3-
isobutil-1-metil-xantina (IBMX), insulina recombinante humana, indometacina y SFB;
donde se observa la formación de vacuolas lipidídicas mediante la coloración con aceite
rojo O. La diferenciación condrogénica sucede cuando las células crecen suplementando
el medio basal con factor de crecimiento transformante beta (TGF- -1), dicha

l43
diferenciación se comprueba mediante la secreción de proteoglicanos específicos de

cartílago teñidos con safranina O.

La determinación de los procesos de diferenciación se realiza mediante las coloraciones
ya mencionadas, estas tinciones se consideran métodos "Gold Standard" para confirmar
la diferenciación de CMM,

Criterios de la Sociedad Internacional de Terapia Celular para la identificación de

células madre mesenquimales.

La sociedad internacional de terapia celular (ISCT) ha propuesto tres criterios para la

caracterización in vitro de MSCs, estos son: 1) Probar la adherencia en plástico de las
células aisladas con morfología fibroblastoide 2) Determinar la expresión de CD105,
CD73 y CD90, en ausencia de marcadores hematopoyéticos como CD45, CD34, CD14
o CD11b, CD79 o CD19 y HLA-DR e 3) Inducir la diferenciación in vitro de las CMM en
osteoblastos, adipoblastos y condroblastos.

Adherencia de las células a las superficies de cultivo.

Uno de los criterios establecidos por la ISCT para demostrar la presencia de MSCs es la
adherencia selectiva de estas células a superficies plásticas, característica que no
presentan las células madre hematopoyéticas.
Las propiedades de las superficies plásticas de cultivo para permitir la adherencia in vitro
de las células se relacionan con las interacciones moleculares y la topografía de dichas
superficies. El proceso de la interacción celular con el material es altamente dinámico y
depende de varios factores que repercuten en la respuesta celular; todo el proceso se
puede dividir en diferentes eventos celulares. El primero se refiere al contacto de la
célula con el fluido o medio de cultivo, seguido de la adsorción de las proteínas de
superficie al material lo cual está influenciado por las características de pH, composición
iónica y temperatura de la solución, luego ocurre la fase de contacto de las

l44
células la cual se produce de manera rápida e intervienen propiedades físico-químcas

como fuerzas de Van der Waals. La fase de adhesión celular ocurre en períodos más
largos e involucra moléculas de adhesión y del citoesqueleto, quienes interactúan juntas
para luego inducir una respuesta de proliferación, migración y diferenciación fenotípica
celular.

Las MSCs expresan una gran variedad de proteínas en su superficie celular que incluyen
integrinas, receptores de factores de crecimiento, receptores de quemoquinas y

moléculas de adhesión (tabla 2). Además producen moléculas de la matriz entre las que
se destacan fibronectina, colágeno tipo I, III, IV, laminina, hialuron y proteoglicanos. La
adhesión de las células a la superficie del material es regulada por algunas de estas
moléculas; la adhesión se realiza desde distintos sitios de contactos los cuales se
clasifican en contactos focales, contactos cerrados y contactos de la matriz extracelular
dependiendo de la distancia entre la célula y el sustrato y la presencia de las proteínas
de adhesión.

Hasta el momento no se ha identificado una molécula de superficie específica y/o única

de MSCs, sin embargo, uno de los criterios para identificar las CMM por caracterización
inmunofenotípica está basada en un extenso panel de anticuerpos monoclonales,
incluyendo la determinación de marcadores de diferenciación, moléculas de adhesión,
marcadores de la matriz extracelular y receptores de factores de crecimiento. El
inmunofenotipo aceptado para la identificación de MSCs es la coexpresión de CD44,
CD73 (SH3 y SH4), CD90, CD105 (SH2) y HLA-I, en ausencia de marcadores
hematopoyéticos como CD34 y CD45.

Estructura y función de CD44

CD44 es una proteína transmembrana que posee un peso molecular de 37 kD y hace

parte de la familia de los receptores hialurónicos. En su estructura CD44

l45
posee un dominio extracelular ligado a un dominio hialurónico en la región N-terminal,

seguido de una región de mucina; el dominio citoplasmático es fosforilado

constitutivamente en un solo residuo de serina y se puede asociar a miembros de la
familia ERM (proteínas de enlace a la membrana-citoesqueleto).
CD44 es el receptor extracelular principal para glucosaminoglicanos y ácido
hialurónico; también se ha reportado que esta proteína se une al colágeno, laminina y
fibronecti-
na. Entre sus funciones se encuentra mediar señales co-estimulatorias, adhesión, mi-

gración, presentación de factores de crecimiento y citoquinas. Se expresa en la mayoría

de los linfocitos, además en monocitos, granulocitos, timocitos, fibroblastos y MSCs.

Estructura y función de CD73.

CD73, 5’-ectonucleotidasa, SH3 o SH4, es una proteína de 70 kDa unida a una molécula
de glicosil-fosfatidilinositol (GPI) en la membrana de sus células que ha sido detectada
en diferentes células de mamíferos. La función principal de la enzima 5’ ectonucleotidasa
es catalizar la defosforilación extracelular de nucleótidos a sus correspondientes
nucleosidos. Esta reacción permite la entrada de adenosina, inosina y guanosina a la
célula y su posterior conversión en ATP y GTP para ser utilizado como fuente de energía
celular.
La molécula CD73 también ha sido establecida como una molécula coestimuladora en
la activación de los linfocitos T, su expresión en linfocitos se relaciona con el estadío
maduro de estos. Además de linfocitos T, CD73 ha sido encontrada en fibroblastos, teji-
do nervioso, células dendríticas foliculares, hepatocitos de ratas, neutrófilos de cerdos y
MSCs.

l46
Estructura y función de CD90

CD90 o Thy-1 es una pequeña proteína perteneciente al grupo de las inmunoglobulinas,

que se encuentra del lado externo de la bicapa lipídica anclada a su membrana por
medio de una molécula de GPI; posee un peso molecular de 25-37 kDa y está compuesta
de 112 aminoácidos.
CD90 es expresada en gran variedad de células incluyendo fibroblastos humanos,
neuronas, CMH, CMM, células endoteliales, células T murinas y en células de hígado de
ratas. Su función exacta es desconocida, pero se cree se encuentra involucrada en el

reconocimiento, adhesión y activación de linfocitos, señales de apoptosis, supresión de

tumores y proliferación y migración de fibroblastos; esto indica que Thy-1 es un
importante regulador de interacciones entre célula-célula y célula-matriz.

Estructura y función de CD105

También conocida como endoglina, CD105 es una glicoproteína de 180 kDa,

fosforilada, que atraviesa la membrana de las células. CD105 hace parte del complejo
receptor del (TGF)- , quien es una citoquina implicada en la proliferación, diferenciación
y migración celular.
Se han detectado niveles altos de expresión de CD105 en el endotelio microvascular de
humanos, en endotelio vascular de células en estado de angiogénesis activa, en tejidos
inflamados, células inmaduras de tumores de vasos sanguíneos, cáncer gástrico, de
próstata y pulmonar, además células no endoteliales como monocitos, macrófagos,
células B maduras, precursores eritroides, fibroblastos, melanocitos, células mesen-
quimales del corazón, células del músculo liso y MSCs.
En algunos estudios se ha demostrado que CD105 regula la expresión de ciertos
componentes de la matriz extracelular como fibronectina, colágeno e inhibidor del
activador del plasminógeno 1 (PAI-1).

l47
Diferenciación de Células Madre Mesenquimales.

La particularidad de diferenciarse en múltiples células de tipo mesodérmico, como

osteoblastos, condroblastos y adipoblastos, es otra de las características que define a
las MSCs como entidades clonales y de multipotencia in vitro.

Osteogénesis.

El hueso es un tejido conectivo especializado que provee soporte a los órganos del
cuerpo. Existen dos maneras de formación de hueso durante el desarrollo embrionario:

i) intramembranosa y ii) formación endocondral de hueso.

La osificación intramembranosa forma los huesos planos que incluyen el cráneo y
clavículas medias; mientras que la formación endocondral forma los huesos largos que
comprenden el esqueleto apendicular, huesos faciales y clavículas laterales.
La formación intramembranosa se produce gracias a una condensación de las MSCs
comprometidas hacia el linaje osteogénico las cuales se encuentran en contacto por
medio de largas prolongaciones. Algunas MSCs se diferencian en osteoblastos que al
poco tiempo comienzan a secretar matriz ósea orgánica sin calcificar, la cual se
denomina osteoide y consta de proteoglucanos, fibras de colágeno y sustancia
fundamental. Los osteoblastos que están embebidos dentro del osteoide se comunican
entre si por medio de finas prolongaciones y al momento de la calcificación por fosfatos
de calcio, quedan atrapados formándose un pequeño espacio propio del hueso que se
denomina canalículo; al mismo tiempo, el osteoblasto de la zona de calcificación pierde
su capacidad de metabolizar matriz ósea y se convierte en osteocito. Este osteoblasto
es rápidamente reemplazado por otro, el cual se encuentra encima del nuevo osteocito
dán- dole de esta manera la estructura laminar (por capas) al hueso y haciendo que
aumente su grosor.
La osificación endocondral se diferencia de la intramembranosa en la manera en que
este proceso involucra un paso intermedio donde el cartílago es quien regula el
crecimiento y desarrollo del hueso. La formación dentro del embrión

l48
comienza con el desarrollo de un modelo de cartílago el cual crece por yuxtaposición y

de manera intersticial; seguidamente los condrocitos de este cartílago se hipertrofian

dando como resultado el crecimiento de lagunas y reducción de los tabiques de matriz
cartilaginosa intercalados que se calcifican. El pericondrio se vasculariza haciendo que
las células condrogénicas pasen a ser osteoprogenitoras formando los osteoblastos, los
cuales elaboran matriz ósea sobre la superficie del cartílago calcificado. Esta matriz se
calcifica formando un complejo de cartílago y hueso calcificado.

La matriz ósea aparece al final de la formación del hueso, posee componentes orgánicos
e inorgánicos. Los componentes orgánicos se refiere a los tipos de colágenos que la
componen, estas fibras proveen el microambiente necesario para favorecer los depósitos
de apatita. En el hueso existen varios tipos de colágeno aunque el que pre- domina es
el colágeno tipo I seguido de colágeno tipo III y X, y los tipos de colágeno V, VI, XIII y
XIV se encuentran en la matriz ósea en menores cantidades.
En la matriz ósea existen también proteínas no colágenas que también intervienen en la
estructura y proceso de mineralización del hueso. Estas proteínas se dividen en tres
grupos que corresponden a las glicoproteínas, proteínas gamma-ácido glutámico
carboxy (Gla) y proteoglicanos. El grupo de las glicoproteínas incluye la ostenectina,
osteopontina, proteína siálica del hueso, fosfatasa alcalina, fibronectina, vitronectina y
trombospondina. El grupo de proteínas Gla incluye la osteocalcina que se fija a la
hidroxiapatita y proteína S, estas son proteínas que parecen restringirse solamente al
hueso; mientras que las proteínas fibromodulina, biglican y modulina pertenecen al
grupo de los proteoglicanos.
El componente inorgánico de la matriz ósea, constituye cerca del 65 % de hueso, está
compuesta por calcio y fósforo principalmente y en menos cantidades de bicarbonato,
citrato, magnesio, sodio y potasio. El calcio y el fósforo forman los llamados cristales de
hidroxiapatita los cuales se encuentran ordenados a lo largo de las fibras de colágeno,

l49
poseen 40nm de longitud y 25nm de ancho. Estos cristales relacionados con las fibras

de colágeno son los que proveen la dureza y resistencia al hueso.

Las células osteoprogenitoras son derivadas de las MSCs, las cuales sufren divisiones
mitóticas y poseen el potencial de diferenciarse en osteoblastos. Su morfología es
fusiforme con núcleo oval, poseen citoplasma escaso al igual que retículo
endoplasmático rugoso y aparato de Golgi, mientras que contienen abundantes
ribosomas libres.
Los osteoblastos son células óseas inmaduras, derivadas de las células

osteoprogenitoras, encargadas de sintetizar los componentes orgánicos de la matriz

ósea como el colágeno, proteoglicanos y las glicoproteínas. Expresan marcadores como
la fosfatasa alcalina y receptores para hormonas como dihidroxivitamina D, estrógenos
y gluco- corticoides los cuales se encuentran involucrados en la diferenciación
osteoblástica. En su citoplasma poseen abundante retículo endoplasmático rugoso,
aparato de Golgi bien desarrollado y un gran número de vesículas de secreción. Estas
células emiten seudópodos que entran en contacto con otros osteoblastos formando
uniones comunicantes.
Los osteocitos son células óseas maduras que se encuentran depositadas dentro de la
matriz ósea en cúmulos llamados lagunas. De aquí emiten prolongaciones que hacen
contacto con otros osteocitos a través de las cuales pueden intercambiar iones y
moléculas pequeñas. Estas células se encuentran en mayor cantidad en el hueso
estimándose que de cada un osteoblasto existen 10 osteocitos. Su citoplasma es pobre
en organelos y su núcleo aplanado y aunque parecen ser células inactivas, secretan
sustancias que conservan el hueso.
Los osteoclastos son células derivadas de células madre hematopoyéticas, encargadas
de la resorción del hueso. Poseen un tamaño grande, son multinucleadas (poseen hasta
50 núcleos), móviles y miden 150nm de diámetro aproximadamente.

l50
La diferenciación osteogénica in vitro de MSCs obtenidas de MO adulta, se caracteriza

por la formación de depósitos de calcio y aumento de la expresión de fosfatasa alcalina

después de la exposición de las células a dexametasona, ascorbato y SFB.

Dexametasona

La dexametasona es un adrenocorticoide sintético que posee propiedades antiin

flamatorias, inmunosupresivas y reguladoras del calcio sanguíneo, produce efectos in-
hibitorios en la formación del hueso a altas concentraciones mientras que a concentra-

ciones fisiológicas (10nM) promueve la diferenciación osteoblástica de MSCs in vitro.

Durante la osteogenesis, mediante la vía MKP-1 (Mitogen-activated protein kinase- 1), la
dexametasona regula la fosforilación de un residuo de serina (Ser 125) de la proteína
Runx2, la cual es un regulador esencial en la transcripción. Runx2 dirige la diferenciación
osteogénica uniéndose a un elemento específico de osteoblastos llamado OSE2, en la
región del promotor de los genes diana regulando la expresión y activación de genes
de osteocalcina y sialoproteína ósea, y aumentando la actividad de la fosfatasa alcalina
y acumulación de mineral en las células produciendo la diferenciación osteoblástica de
las mismas.

B -glicerofosfato
El B -GP es un fosfato orgánico, utilizado como suplemento del medio para la dife-
renciación osteogénica de MSCs gracias a su capacidad para estimular la calcificación
de las células in vitro, induciendo la formación de calcio. El -GP es un sustrato de la
fosfatasa alcalina ósea, en cuya reacción enzimática se produce un incremento de
fosfatos inorgánicos en el medio.
La fosfatasa alcalina es una enzima localizada en las vesículas de la matriz extracelular
como una proteína fijada a un glicolípido de fosfatidilinositol, inicia la mineralización en
la superficie de estas vesículas y es utilizada como uno de los principales marcadores
bioquímicos para demostrar la actividad osteoblástica de las células, su

l51
función es hidrolizar fosfatos orgánicos para liberar fosfatos inorgánicos al sitio de

mineralización de dichas células. Este fosfato será luego convertido en cristales de

hidroxiapatita que produce la calcificación de las células y por tanto su resistencia.

Acido Ascórbico

El ácido ascórbico (vitamina C reducida) es otro suplemento esencial para la

diferenciación de MSCs a osteoblastos. Estudios in vivo han demostrado que cuando se
inyecta vitamina C radiomarcada, esta se acumula en los sitios en donde existe forma-

ción activa de hueso. Para realizar este proceso los osteoblastos contienen un sistema
de transporte de ácido ascórbico dependiente de sodio, esencial para la acumulación
de vitamina C.
En cultivos de MSCs, el ácido ascórbico estimula la hidroxilación de aminoácidos y
procesamiento del procolágeno. La síntesis normal de colágeno depende de la
hidroxilación de los residuos de prolina y lisina en el retículo endoplásmico de la célula,
para formar hidroxiprolina e hidroxilisina, respectivamente. Las enzimas hidroxilasas,
que catalizan esta hidroxilación, requieren ácido ascórbico para funcionar
correctamente. Sin ácido ascórbico, las enzimas no pueden hidroxilar la prolina y la
lisina; esta hidroxilación es indispensable para la formación en triple hélice de las fibras
de colágeno que permiten mantener la estructura de los tejidos.

Adipogénesis

El tejido adiposo es un órgano difuso con gran actividad metabólica, puesto que sus
lípidos están capacitados para almacenar energía. En el humano se encuentran dos tipos
de tejido adiposo, el tejido adiposo blanco, amarillo o unilocular que representa la
mayor parte del tejido adiposo del organismo, y el tejido adiposo marrón o multilocular,
es más escaso y es llamado así porque las células contienen muchas gotas pequeñas de
lípidos.

l52
El tejido adiposo blanco o unilocular, posee células adiposas grandes (hasta 100 m de

diámetro) y esféricas, que pueden llegar a deformarse cuando están formando grupos
tomando una morfología poliédrica. Cada célula contiene una gota grande de lípidos
en el centro, principalmente triglicéridos, y un citoplasma reducido al borde de ella, con
escasos organelos, el núcleo se encuentra desplazado hacia la periferia del citoplasma,
es oval, con cromatina fina y no contiene nucleolos. El tejido adiposo blanco se encuentra
ampliamente distribuido como grasa subcutánea, en el mesenterio y en la zona
retroperitoneal.

El tejido adiposo marrón o multilocular, consta de células grandes y poligonales; con un

citoplasma más abundante y granuloso que las células del tejido adiposo blanco, que
contiene pequeñas gotas de grasa de distintos tamaños. El núcleo es redondo con
gránulos de cromatina un poco gruesos. Con la edad el tejido adiposo marrón pasa a
parecerse al tejido adiposo blanco, por lo que es indistinguible en adultos.
Todas las células adiposas se originan por diferenciación de las MSCs, aunque el
proceso de desarrollo para los dos tipos de tejido adiposo es diferente. El tejido adiposo
blanco se desarrolla en los islotes grasos en fetos con 5 meses de vida
aproximadamente; en el citoplasma de las MSCs aparecen gradualmente gotas grasas
y las células se van haciendo más redondeadas mientras que las gotas de lípidos se
hacen más grandes para luego fusionarse y formar una sola vacuola, y por esto el núcleo
cada vez está más excéntrico; en esta etapa la célula ya es llamada adipocito. El tejido
adiposo marrón también se desarrolla a partir de MSCs en el embrión, las cuales se
vuelven semejantes a las células epiteliales y el tejido se hace lobulado; aquí comienzan
a aparecer las primeras gotas de lípidos haciendo que las células se vuelvan
multiloculares y maduras convirtiéndose en adipocitos.
Los inductores que mejor actúan en la diferenciación adipogénica in vitro de MSCs
obtenidas de MO son la dexametasona, isobutilmetilxantina, la insulina y la indometaci-
na.

l53
Isobutilmetilxantina

La IBMX actúa sobre la MSCs regulando el compromiso de esta hacia el linaje

adipogénico, ya que este es un inductor del cAMP el cual inicia la adipogénesis mediante
la activación temprana de CREB (proteína de unión a un elemento de respuesta a cAMP)
el cual participa en la inducción de la expresión de C/EBP .

Insulina

La insulina es un inductor de la adipogénesis que origina la diferenciación de MSCs

únicamente a concentraciones mayores a las fisiológicas, su función la realiza uniéndose
al receptor del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1); el cual está presente
en un gran número en el progenitor comprometido del adipocito, mientras que el
receptor de la insulina se encuentra en muy poca cantidad y aumenta hasta veinte veces
durante la diferenciación del adipocito, por lo que se vuelve sensible a ella. El IGF-1 es
igual estructuralmente a la insulina, por lo que esta sustituye casi todas sus acciones entre
ellas la de inductor fisiológico de la adipogénesis uniéndose con baja afinidad al
receptor. La insulina también estimula la captación de glucosa por parte de las células
adiposas, dentro de las cuales ocurre la glucólisis en donde se forman grandes
cantidades de -glicerofosfato, que se acopla con ácidos grasos libres sinteti- zando
triglicéridos dentro de la célula.

Indometacina

La indometacina es otro inductor incluido en la mezcla de compuestos usados para

promover la diferenciación adipogénica de MSCs; su función está dada como un ac-
tivador del factor transcripcional PPAR el cual es expresado ampliamente en la dife-
renciación adipogénica de CMM. Al unirse la indometacina al PPAR se produce una
activación del factor transcripcional PPAR interviniendo de esta manera en la cascada
de la diferenciación adipogénica.

l54
 Sistema de Separación para Cultivo Celular. SVF - BMAC

Muestras de tejido adiposo

La obtención de la muestra de tejido puede ser a partir de lipoaspirados estéticos,

abdominoplastías o una intervención quirúrgica, de donde se puede obtener 5g de tejido
adiposo aproximadamente, que son suficientes para iniciar un proceso de cultivo celular
primario, con fines de investigación. La muestra debe colocarse inmediatamente en un
frasco estéril con medio de cultivo o buffer fosfato salino (PBS) con antibióticos y
transportado al laboratorio en un ambiente de 4-8 °C dentro de las 24 h siguientes.

Obtención de la fracción estromal vascular (SVF)

La muestra de tejido adiposo se procede a incubar con colagenasa tipo I al 0,1% a 37

°C en constante agitación por 60 min en falcon de 50 ml. Luego se procede a realizar
dos o tres lavados respectivos con el medio, centrifugando a 2400 rpm x 5, obteniéndose
al final un pellet celular conocido como SVF que es rico en MSC. El pellet celular es
resuspendido en 1 mL de medio completo (D-MEM + 1%P/S + 15% PRP). El PRP se
utiliza como sustituto del suero bovino fetal (SBF) y es preparado de acuerdo a

l55
protocolos ya establecidos mundialmente. Actualmente hay una gran tendencia a la
utilización de lisados plaquetarios y preparados de xenofree.

Cultivo y expansión de las MSC

La SVF es cultivada en flasks de 25 cm2 con medio D-MEM completo e incubado a 37

°C en 5% CO2 por 72 h, apreciándose pocas células de aspecto fibroblástico adheridas
al flask, junto a otras células no adheridas (Figura 3). Luego se cambia el medio con la

finalidad de retirar las células no adherentes. Se cambia el medio cada 2 a 3 días hasta
alcanzar confluencia de 70-80% de las células adherentes (Figura 4). Luego se procede
a realizar la tripsinización (tripsina EDTA 0,25%) y se vuelve a subcultivar las células
en flask de 75 cm2 en razón de 5000–10000 células por cm2. En el pasaje 3 se obtienen
las células para su identificación, criopreservación y experimentación. Para aplicación
terapéutica se recomienda usar células en el cuarto pasaje como máximo.

l56
Identificación fenotípica

La ISCT (Sociedad Internacional de Terapia Celular) estableció en el 2006 los criterios

de identidad mínima para las MSC. En función a ello, las MSC, después de un proceso
de cultivo deben de identificarse a través de marcadores de membrana usando para tal
fin la citometría de flujo. Deben ser positivos en más o igual al 98% para CD73, CD90,
CD105 y negativos en menos o igual al 2% para CD45, CD34, HLA-DR, CD14 o CD11b,
CD79 o CD19 (Figura 5).

Identificación funcional

Está basado en la capacidad de diferenciación que tienen las MSC hacia condrocitos,
adipocitos y osteoblastos que fueron establecidos por el consenso de la ISCT. En el
pasaje 3 del cultivo se subcultivan las células en placas de 12 pozos con el medio de

l57
diferenciación específico para cada linaje. Luego de un tiempo de cultivo las células

muestran morfologías diferentes a la inicial las que se confirmarán con coloraciones

específicas, siendo las más usadas el oil red para adipogénesis, alcian blue para
condrogénesis y fosfatasa alcalina para osteogénesis.

Muestras de Médula ósea.

La médula ósea humana (MD) se obtiene en la mayoría de los casos de la cresta ilíaca
de pacientes después de haber obtenido su consentimiento por escrito. La MD se recoge
asépticamente y se traspasa a un tubo K2EDTA. La capa leucocitaria se aisla por

centrifugación (BMAC) (450 x g, 10 min), se suspende en 1,5 ml de PBS y se usa para

el cultivo celular en un flask.

Otra forma, es obtener la capa lustrosa sobre un volumen igual de Ficoll Paque (GE
health care) respecto a la Medula Ósea, y se centrifuga (400 x g, 30 min). Las células
en la interfaz se retiran y se lavan dos veces en PBS estéril.

l58
Cultivo de células madre mesenquimales

Se cultivan las células progenitoras de médula ósea humanas en placas de cultivo

tratadas con tejido en medio DMEM suplementado con FBS al 10% y penicilina /
estreptomicina (50 U / mL y 50 mg / mL, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, EE. UU.,
Respectivamente). Las placas se mantienen a 37 ° C en una atmósfera humidificada que
debe contener un 5% de CO2 durante 48 h. Para intercambiar el medio, las placas se
lavan con PBS para eliminar las células no adheridas y se reemplaza el medio. Los
cultivos se mantienen durante una semana adicional con un intercambio de medio.

Para caracterizar las células adherentes, se induce la diferenciación osteoblástica

mediante el cultivo de MSC humanas confluentes durante 3 semanas en medios de
diferenciación osteoblástica y después de tres semanas, las células se tiñen con Alizarina.
Para inducir la diferenciación de adipocitos, se cultivarán MSC confluentes de 1 a 3
semanas en medio de diferenciación, y la tinción de gotitas de lípidos se lleva a cabo
mediante S Red Oil.

Análisis de citometría de flujo.

La citometría de flujo se utiliza para evaluar el perfil inmune de las MSC, utilizando el

estándar para MSC descrito por la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT).
Las células (P2-3) se recogen, se sedimentan y se resuspenden en albúmina sérica bovina
al 1%. (BSA en PBS).

l59
Aislamiento y cultura del MSC humano.

El aislamiento de MSC humano se logra mediante centrifugación en gradiente de Ficoll-

Paque. (VER PROTOCOLO GE HEALTHCARE) La población de MSC forma una sola
capa, lo que permite una extracción de MSC más efectiva. Las células recogidas se
cultivan en placas de cultivo tratadas con tejido; por lo tanto, solo las hMSC se adhieren
y se mantienen en los medios. Después de 8 a 12 días, la mayoría de las células no

adherentes se eliminarán durante los intercambios de medio. Las células restantes

tendrán n una apariencia heterogénea de tipo fibroblástico y mostrarán una formación
de colonias distinta. Los cultivos de hMSC mostrarán una proliferación aumentada, lo
que resulta que gradualmente en el mantenimiento de una morfología fibroblástica
homogénea. Las hMSC tienen principalmente un aspecto en forma de huso con extensión
en direcciones opuestas a un cuerpo de células pequeñas.

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