POE Práctica 05 Micro FMH 2022

UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA AMAZONIA PERUANA
FACULTAD DE MEDICINA HUMANA
Pruebas bioquímicas para la diferenciación bacteriana
Laboratorio de Biología Molecular e Inmunología,

Versión: LAB –SL01LA01-LIPNAA-CIRNA-UNAP
LIPNAA
1.0 PT- 005- 2022
001- pág. 1-8
Elaborado por: Dra. Viviana Vanessa Pinedo Cancino, Blga. Katty Madeleine Arista Flores Mgr. S.P. (c)
Aprobado por: M.C. Martín Casapía Morales, Mgr.
PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDARIZADO (POE)
CODIGO: FMH-CBS-SL01LA01-LIPNAA-CIRNA-UNAP-PT-005-2022
NOMBRE DE LA ASIGNATURA MICROBIOLOGÍA
POE-T PLAN DE CÓDIGO DE LA ASIGNATURA DURACIÓN

ESTUDIOS
005 2016 10023 4 horas
Versión Nro. Fecha de Revisión Descripción Modificación
Aprobado por:
REVISIÓN
HISTÓRICA Versión 1.0 11-mar-22 M.C. Martín Casapía 0.0
Morales, Mgr.
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1 ANTECEDENTES
Los microorganismos a diferencia de las plantas no son capaces de crear materia orgánica a partir de
elementos inorgánicos, por ello, han de nutrirse a expensas del medio en que se encuentren, de ahí de
que en el interior de estos ocurran una serie de reacciones de síntesis y de descomposición de
sustancias orgánicas, las cuales reciben el nombre de metabolismo.
A partir de estas características metabólicas se realizan pruebas bioquímicas para la identificación de

microorganismos y productos obtenidos basándose en la relación microrganismo-medio, ya que las
diferencias estructurales con respecto a la forma, el tamaño y la disposición de las bacterias ayudan muy
poco en el proceso de identificación, como en el caso de las bacterias en las que existen muchas
especies con estas características muy similares.
Las bacterias son capaces de modificar el ambiente en que se encuentran tomando sustancias, como
hidratos de carbono, lípidos, aminoácidos, compuestos inorgánicos y liberando productos de desechos para
ellas que modifican el medio y que se puede evidenciar en algunos casos por ejemplo con la utilización de
sustancia como indicadores de pH etc, provocando reacciones tales como la producción de enzimas,
metabolitos intermedios, oxidación, fermentación, entre otras.
Con el pasar de los años se han desarrollado numerosas pruebas metabólicas identificatorias que ya fueron
estandarizadas, las cuales se elaboran a partir de preparados comerciales llamados medios de cultivo, que
contienen el compuesto sobre el cual las enzimas bacterianas actúan complementándose con indicadores
que manifiestan la reacción que se llevó a cabo y gracias a ello, llegar al diagnóstico, para la recomendación
del tratamiento adecuado para combatirlas.
2 OBJETIVOS
 Identificar diferencias metabólicas de enterobacterias mediante el empleo de pruebas bioquímicas

y sus aportes inmediato al área de diagnóstico como de investigación.
 Realizar la correcta interpretación de los resultados de las reacciones en los medios de cultivos
mediante la intervención de enzimas y cambios de pH.
3 RESPONSABILIDADES
 Es responsabilidad del DOCENTE entregar el POE al inicio de cada semestre, con la finalidad
que todos los estudiantes tengan acceso al mismo.
 Al inicio de cada practica el docente socializará cada POE según corresponda, para la cual el
estudiante debe haber leído e investigado referente al tema de práctica.
 Será responsabilidad del ESTUDIANTE, leer con anterioridad el POE que corresponde, para que
se informe sobre el manejo del equipo, reactivos y procedimientos que se utilizarán, con el fin de
realizar correctamente la práctica y evitar accidentes.
 La Universidad, Facultad y Docente no se responsabilizan de posibles accidentes, porque los
estudiantes fueron debidamente informados de los procedimientos de la práctica y de las
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medidas de seguridad.
4 FUNDAMENTO TEÓRICO
Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos, los cuales, nos permiten identificar distintos
microorganismos, mediante su sistema de funcionamiento, generalmente en la determinación de la
actividad de una vía metabólica a partir de un sustrato que se incorpora a un medio de cultivo en la que la
bacteria al crecer se une o no. Así mismo, para la realización de las pruebas bioquímicas se dispone de
múltiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio.
Si bien existen una amplia variedad de pruebas bioquímicas empleadas con fines de identificación, a
continuación, mencionaremos las que se utilizan más frecuentemente, agrupadas según el tipo de
ensayo:
1. Pruebas con enzimas vinculadas con la respiración bacteriana (Oxidasa, catalasa)

2. Pruebas de detección de enzimas y vía metabólica (Rojo de Metilo “RM”- Voges Proskauer “VP”,
gluconato, esculina, hipurato, etc)
3. Pruebas con fuente única de carbono (Citrato, malonato, hipurato para coliformes)
4. Pruebas para la utilización de compuestos nitrogenados (Asimilación y denitrificación)
5. Prueba de descomposición de carbohidratos, aminoácidos y otros (Indol, lisina arginina, urea, etc)
6. Pruebas de ensayos combinados (Triple azúcar hierro- TSI, Agar Hierro Lisina- LIA, bilis esculina)
Algunas de estas pruebas son técnicas rápidas, ya que evalúan la presencia de una enzima preformada y
su lectura varía entre unos segundos hasta unas pocas horas (Prueba de catalasa y oxidasa). Otras
pruebas requieren para su lectura el crecimiento del microorganismo con una incubación previa de 18 a
48 horas; a este grupo pertenecen la mayoría de las pruebas que detectan componentes metabólicos o
aquellas que determinan la sensibilidad de un microorganismo a una sustancia dada tras cultivo en
medios de identificación que contienen el sustrato a metabolizar (Prueba de RM- VP, prueba de TSI,
prueba de LIA, Prueba del citrato, prueba MIO, etc).
5 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
a. Materiales Reactivos Equipos Material

de apoyo
-Equipo de protección -Alcohol Industrial -Autoclave Proyector
personal (mandil manga larga -Alcohol al 70% -Cabina de flujo laminar
y guantes) -Medios de cultivo -Incubadora
-Tubos de ensayo (Caldo RM- VP, Agar
- Rack para tubos TSI, LIA, Agar
-Placas Petri Simmons Citrato,MIO)
-Asas bacteriológicas -Indicador rojo de
-Pipetas transfer metilo.
-Mechero - α Naftol al 5%
-Cultivo de Escheriachia coli, y -KOH al 40%
Klebesiella sp. -Reactivo de Indol
b. Desarrollo de la Práctica
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5.1 Preparación de medios de cultivo

La cátedra pondrá a disposición la batería de pruebas bioquímicas para la identificación diferencial de
enterobacterias (E. coli y Klebsiella sp.) que 24 horas antes de la práctica fueron preparadas.
5.2 Tipos de pruebas bioquímicas para la identificación de enterobacterias.
Escuche con atención la presentación de las tinciones diferenciales y anote la información que crea
necesaria.
a) Prueba de acidez (RM) – Producción de acetil metil carbinol (VP)
Procedimiento:
 Quemar el asa bacteriológica al rojo vivo en la flama del mechero y déjela enfriar en el área
de esterilidad.
 Destapar la placa con el cultivo bacteriano (E. coli o Klebsiella sp en Agar Mac Conkey)
cerca de la flama del mechero y tome con el asa una colonia aislada y sembrarlo en tubos
de caldo MR/VP (4 tubos, 2 por cada especie de bacteria)
 Dejar los tubos incubando de 35 a 37 ºC durante 48 a 72 horas.
 Para leer Rojo de Metilo (RM) agregar 2 a 3 gotas de RM al 1%
 Para leer Voges Poskauer (VP) agregar 0,6 mL de la solución de alfa naftol al 5% en etanol
y 0.2 mL de hidróxido de potasio (KOH) al 40%.
 Luego se agita vigorosamente el tubo, e incubar a temperatura ambiente durante10 a15
minutos.
Interpretación:
Observar el color de la superficie del medio.
 Resultado positivo RM: color rojo.
 Resultado negativo RM: color amarillo.
 Resultado positivo VP: color rojo o rosada, luego de una completa agitación del tubo.
 Resultado negativo VP: ausencia de color rojo.
b) Prueba del Citrato
Procedimiento:
 Quemar el asa en punta al rojo vivo en la flama del mechero y déjela enfriar en el área de
esterilidad.
cerca de la flama del mechero y tome con el asa una colonia aislada y sembrarlo en forma
de estría única en el pico de flauta (agar inclinado) del tubo de agar Simmons Citrato (2
tubos, 1 por cada especie de bacteria).
Interpretación:
 Resultado positivo: crecimiento bacteriano con un color azul en el pico de la flauta.
 Resultado negativo: ausencia de crecimiento y permanencia del color verde del medio de
cultivo.
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c) Prueba Triple azúcar hierro agar (TSI)

Procedimiento:
 Quemar el asa en punta al rojo vivo en la flama del mechero y déjela enfriar en el área de
esterilidad.
cerca de la flama del mechero y tome con el asa una colonia aislada.
 La siembra se realizará por puntura en profundidad, luego de la cual se harán estrías en la
superficie inclinada antes de retirar la punta del asa del medio (2 tubos, 1 por cada especie
de bacteria).
Interpretación:
Observar el color del medio de cultivo y la producción de gas.
 Superficie alcalina/profundidad ácida (K/A) (pico rojo/ profundidad amarilla): el
microorganismo solo fermenta la glucosa.
 Superficie ácida/profundidad ácida (A/A) (pico amarillo/ profundidad amarilla): el
microorganismo solo fermenta la glucosa, lactosa y/o sacarosa.
 Superficie alcalina/profundidad alcalina (K/K) (pico rojo/ profundidad roja): el
microorganismo es no fermentador de azúcares
 La presencia de burbujas o la ruptura del medio indican que el microorganismo produce gas.
 El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico (H2S
+) reducción de sales de hierro.
d) Prueba Lisina hierro agar (LIA)
Procedimiento:
 Quemar el asa en punta al rojo vivo en la flama del mechero y dejarla enfriar en el área de
esterilidad.
 La siembra se realizará por puntura en profundidad (3 picaduras), luego de la cual se harán
estrías en la superficie inclinada antes de retirar la punta del asa del medio (2 tubos, 1 por
cada especie de bacteria).
 Dejar los tubos incubando a 37 ºC durante 24 a 48 horas.
Interpretación:
Observar el color del medio de cultivo.
 Descarboxilación de la Lisina
-Resultado positivo: Superficie alcalina/profundidad alcalina (K/K) (pico violeta/ fondo
violeta).
-Resultado negativo: Superficie alcalina/profundidad ácida (K/A) (pico violeta/ fondo
amarillo).
 Desaminación de la Lisina
-Resultado positivo: Superficie rojo/profundidad ácida (R/A) (pico rojo/ fondo amarillo).
 Producción de ácido sulfhídrico (SH2)

-Resultado positivo: ennegrecimiento del medio de cultivo, especialmente entre la
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superficie y la profundidad.
e) Prueba MIO (Movimiento, Indol, Ornitina)
Procedimiento:
 Quemar el asa en punta al rojo vivo en la flama del mechero y dejarla enfriar en el área de
esterilidad.
 La siembra se realizará por puntura en profundidad.
 Dejar los tubos incubando a 35-37 ºC durante 18 a 24 horas.
Interpretación:
Observar la movilidad y el color del medio de cultivo. Luego realizar la prueba Indol.
 Movilidad
-Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento más allá de la línea de siembra.
-Resultado negativo: presencia solamente en la línea de siembra.
 Ornitina descarboxilasa
-Resultado positivo: color púrpura.
-Resultado negativo: color amarillo, a veces puede desarrollar un color violaceo en la
superficie del medio.
 Indol
-Resultado positivo: color rojo.
-Resultado negativo: color del reactivo revelador permanece incoloro-amarillo.
c. Cálculos y Resultados
 Reportar las observaciones de cambio de coloración de los medios y formación de gases de cada
una de las pruebas bioquímicas por cada especie bacteriana.
 Comparar sus observaciones con las reportadas en la literatura.
d. Limitaciones del procedimiento
Es probable que la prueba RM-VP solo se realice el sembrado en los tubos con el primer grupo de
práctica por el tiempo de incubación para su lectura.
6 INTERPRETACIÓN Y CONCLUSIONES
Comente su experiencia obtenida al hacer las observaciones y las dificultades encontradas, así como las
ventajas y desventajas que notó en las pruebas bioquímicas.
7 ANEXOS
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CUESTIONARIO
1. Hacer los esquemas de lo observado.
Observación:
2. Colocar los resultados obtenidos en la siguiente tabla.
Escherichia coli Klebsiella sp.

Prueba de RM
Prueba de VP
Prueba de Citrato
Prueba de TSI (Superficie y fondo)
Prueba de TSI (Producción de gas)
Prueba de TSI (Producción de SH2)
Prueba de LIA (Superficie y fondo)
Prueba de LIA (Producción de SH2)
Prueba MIO (Movimiento)
Prueba MIO (Ornitina
descarboxilasa)
Prueba MIO (Indol)
3. Responda las siguientes preguntas:

 ¿Qué rol cumplen los medios de cultivos en el diagnóstico bacteriológico?
 ¿Cuál es el fundamento de la Prueba TSI?
 ¿Cuál es el fundamento de la Prueba LIA?
 ¿Cuáles son algunas limitaciones de las pruebas bioquímicas para el diagnóstico
bacteriológico?
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 Crea una tabla comparativa con las pruebas TSI, LIA, MIO para las especies de la
familia Enterobacteriácea: E. coli, Klebsiella sp, Salmonela sp, Shiguella sp, Proteus
sp.
8 MECANISMOS DE EVALUACIÓN
Puntualidad y asistencia 10%

Prueba práctica 30%
Informe 60%
9 MEDIDAS DE SEGURIDAD Y SALUD OCUPACIONAL
Equipo de protección personal: mandil de laboratorio manga larga, guantes, zapatos cerrados, pantalón
largo.
10 DISPOSICIÓN DE DESECHOS QUÍMICOS
Los desechos generados en esta práctica serán tratados de acuerdo a sus características y como se
indica en los protocolos del laboratorio.
11 REFERENCIAS
1. Aquiauhualt Ma de los Angeles. 2012. Manual de Practicas de Microbiología General. Universidad
Autonoma Metropolitana, México. Disponible en:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_general.pdf
2. Bowen C, Mardones M, Velasquez L. Guía de Laboratorio de Microbilogía 2014. 99pp. Pontífica
Universidad Católica del Ecuador, Facultad de Medicina.
3. Campollo EM, Barrientos AE. Manual de Practicas de Microbiología I. 2014. 100pp.Disponible en:
https://microinmuno.files.wordpress.com/2014/01/manual-de-microbiologia-i-medicina-2014.pdf
4. Deoré D, Barbut F. Pett JC. Role of the microbiology laborator in the diagnosis of nosocomial
diarrhea. Pathol Biol (Paris). 200; 48: 733-744.
5. Fung DC, Theriot JA. Immaging techniques in microbiology. Curr Opin Microbiol. 1998; 1:346-351.
6. Gamazo, C, et al. 2005. Manual Práctico de Microbiología. 3ª. Edición. edit. Masson, S.A.
España.
7. Guarner J. Brandt ME. Histopathologic diagnosis of fungal infections in the 21 st century. Clin
Microbiol Rev. 2011; 24:247-280.
8. Olivas E., Alarcon Morales L. 2012. Manual de Prácticas Laboratorio de Microbiología Médica.
Universidad Autónoma de Cuidad de Juarez, México.
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A partir de estas características metabólicas se realizan pruebas bioquímicas para la identificación de

 Identificar diferencias metabólicas de enterobacterias mediante el empleo de pruebas bioquímicas

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1. Pruebas con enzimas vinculadas con la respiración bacteriana (Oxidasa, catalasa)

a. Materiales Reactivos Equipos Material

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5.1 Preparación de medios de cultivo

a) Prueba de acidez (RM) – Producción de acetil metil carbinol (VP)

b) Prueba del Citrato

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d) Prueba Lisina hierro agar (LIA)

 Producción de ácido sulfhídrico (SH2)

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e) Prueba MIO (Movimiento, Indol, Ornitina)

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1. Hacer los esquemas de lo observado.

2. Colocar los resultados obtenidos en la siguiente tabla.

Escherichia coli Klebsiella sp.

3. Responda las siguientes preguntas:

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Puntualidad y asistencia 10%

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