Machine Translated by Google

SOLUCIÓN DE PROBLEMAS DE LC

¿Por qué Peaks Tail?

John W. Dolan, Laboratorio BASi del Noroeste, McMinnville, Oregón, EE. UU.

Los picos verdaderamente simétricos son raros.

Si observa detenidamente, verá que casi todos Los trabajadores de la industria farmacéutica utilizan el de picos con varios factores de asimetría.
los picos cromatográficos tienen colas hasta cierto factor de cola (Tf ) de la Farmacopea de EE . UU . (USP ): Cuando una columna es nueva, la
punto. Aunque muchas de las columnas de cromatografía mayoría de los fabricantes permitirán que pase
abdominales

líquida (LC) actuales son menos problemáticas desde T.f.

este punto de vista que sus antepasadas, el problema
no se ha eliminado. El “LC” de este mes
Solución de problemas” analiza las causas de las
colas máximas, cómo medirlas, algunos pasos
preventivos que puede tomar y por qué los tipos de
columnas más nuevos son menos propensos a las colas.
¿Qué es la cola máxima?
Un pico se etiqueta como cola o asimétrico cuando se
desvía de la forma simétrica ideal de un pico gaussiano.
La Figura 1 muestra un ejemplo de un pico de
cola. La última mitad del pico eluida es más ancha
que la mitad delantera, y el ensanchamiento parece
enfatizarse cerca de la línea de base. Aunque los picos
frontales pueden ocurrir en la cromatografía, son raros
en comparación con los picos de cola. Debido a que las
colas de los picos pueden influir en la calidad de una
separación, es una buena idea cuantificar la cantidad
de colas que tiene un pico. Existen dos medidas
ampliamente utilizadas de picos de colas.
Figura 1: Medición de la cola máxima.
Ver texto para más detalles.
[1]
2a
donde a y b son los semianchos delantero y
trasero al 5 % de la altura máxima, como se muestra
en la Figura 1. La mayoría de los demás trabajadores
utilizan el factor de asimetría (As)
B mal con la separación y el problema debe abordarse.
[2]
Como
a
donde a y b se miden al 10% de
la altura del pico. Si ab, ambas medidas
arrojan un valor de 1,0, el valor de un pico sin cola.
Para valores de menos de aproximadamente 2,
los valores de As y Tf son aproximadamente los
mismos, como se muestra en la Tabla 1. Realmente no
importa qué medida de relave se use, a menos que lo
dicte una regulación de la industria, siempre que el La
misma técnica se usa consistentemente para que se
puedan rastrear los cambios en las colas de los picos.
¿Qué es aceptable?
Cierto grado de cola máxima es
inevitable, pero ¿cuánto se puede tolerar? La
Figura 2 muestra algunos ejemplos
Tabla 1: Mediciones del factor de
asimetría de pico y el factor de cola de
USP para el mismo pico.
Pico en la figura 2 Medido
los criterios de aceptación si As está entre 0,9
(ligero frente) y 1,2 (ligera cola).
La mayoría de los trabajadores prácticos que usan
muestras reales luchan por factores de asimetría de
no más de 1,5, pero se conformarán con menos de
2,0 si es necesario. Generalmente, cuando los
factores de asimetría son mayores que 2.0, algo anda
Problemas potenciales
Una mirada a los picos en la Figura 2 proporcionará
alguna indicación de los problemas potenciales
creados por los picos de cola. Compare el pico con
un factor de asimetría de 1,0 con el pico que tiene
un factor de asimetría de 4,0.
Las diferencias son dramáticas. Por ejemplo, aunque
las áreas de los picos son las mismas, hay una
diferencia triple en la altura de los picos. Cuando se
utiliza un método para el análisis de trazas, la altura
del pico se convierte en un factor crítico para determinar
el límite inferior de cuantificación y el pico de cola es
claramente inferior.
Otro problema potencial es el rendimiento
del sistema de datos. Los algoritmos de detección
de picos determinan el inicio y el final de un pico al
detectar un cambio en la pendiente de la línea de base.
Para todos los picos que se muestran, el inicio del pico
es el mismo y es fácil para el sistema de datos
determinar cuándo comienza el pico. Cuanto mayor sea
la cola de los picos, más gradual será el regreso a la

Como T.f.
línea de base. Además, el final del pico es difícil de
determinar, especialmente si la línea de base no es
1.0 1.0 1.0
uniforme. Si el sistema de datos utiliza marcas para
1.2 1.3 1.2 indicar el inicio y el final del pico, es probable que el
1.5 1.7 1.4 final del pico se muestre en diferentes lugares para
2.0 2.5 1.9 múltiples inyecciones del mismo pico de cola. Esto da
como resultado un error en la medición del área.
abdominales 3.0 3.8 2.9
10% altura
5% altura 4.0 5.5 3.5

2 LC•GC Europa Septiembre 2003

Machine Translated by Google
Solución de problemas de LC
Los picos de cola también son problemáticos si
se producen picos menores en la misma muestra que
los principales; por ejemplo, durante un ensayo indicador
de estabilidad o una medición de metabolitos o impurezas.
Con los ensayos indicadores de estabilidad, las directrices
del Comité Internacional de Armonización de Requisitos
Técnicos para el Registro de Productos Farmacéuticos
para Uso Humano (ICH) exigen que se notifiquen picos
del 0,1 % del pico principal o mayores. Es fácil ver que un
pico menor podría ocultarse debajo de la cola del pico y
que los requisitos de ICH para picos menores podrían no
cumplirse si ocurriera una cola de pico severa.
Los métodos de LC utilizados para el análisis de
rutina generalmente deben proporcionar una resolución
de referencia de todos los picos y tiempos de ejecución
lo más breves posible. La Figura 2 muestra que la
resolución de la línea de base de los picos de colas
requerirá tiempos de ejecución más largos que los de
los picos que no tienen colas o que solo tienen colas
menores.
Por lo tanto, los picos de cola no solo reducen la
calidad del cromatograma, sino que también reducen
la capacidad de cuantificar los componentes de la
muestra. Además, debido a las dudas sobre la pureza de
los picos y la cuantificación adecuada, la confianza de
los analistas en sus resultados se debilita cuando las
separaciones contienen picos con muchas colas.
Figura 2: Ejemplos de picos asimétricos.
Bien
Como 1.0 1.2 1.5
Figura 3: La superficie de sílice. (Reimpreso de la referencia 1 con permiso).
OH HO OH
Si Si
silanol libre silanoles geminales
METRO
Superficie metálica
3 LC•GC Europa Septiembre 2003
¿Qué causa la cola máxima?
Picos cola porque más de una retención
mecanismo está presente en una separación, y uno de
esos mecanismos está sobrecargado.
Los químicos tienden a pensar en una separación de fase
inversa, por ejemplo, con una columna C18, como un
mecanismo de retención hidrofóbico puro. Podría ser cierto
si la fase estacionaria fuera solo grupos C18.
Sin embargo, aproximadamente la mitad de la
superficie de sílice no está unida, lo que deja grupos
de silanol (Si–OH) expuestos que pueden interactuar
con la muestra.
Las partículas de sílice que forman el soporte
sólido están hechas de un polímero de silicio y oxígeno.
Al igual que el carbono, el silicio es tetravalente, por lo que
la estructura interna del sílice consta de cuatro átomos de
oxígeno unidos a cada átomo de silicio en un polímero
tridimensional. En la superficie, el polímero termina en
grupos silanol.
La figura 3 muestra las diferentes configuraciones
posibles de silanol. Los cromatógrafos comúnmente
dibujan la superficie como silanoles libres, pero también
están presentes átomos de silicio con dos grupos
hidroxilo en una configuración geminal. Si los grupos
silanol se colocan uno al lado del otro, un grupo silanol
asociado puede compartir un protón con un grupo
adyacente. Los grupos silanol libres son más ácidos que
los grupos geminales y asociados, e interactúan más
fuertemente.
Marginal Inaceptable
2.0 3.0 4.0
OH OH
Si Si
Silanoles asociados
OH
METRO Si
Metal interno (silanol activado)
con solutos básicos. El resultado es una cola de pico
comúnmente asociada con la separación de bases. Para
complicar aún más las cosas, pueden estar presentes
trazas de metales (p. ej., hierro y aluminio) en la matriz
de sílice. Estos metales traza pueden actuar como sitios
de intercambio de iones o, cuando están adyacentes a
los silanoles libres, pueden retirar electrones, lo que hace
que los silanoles sean aún más ácidos.
En el pasado, los rellenos de columna designados
ya que la sílice de tipo A tendía a tener todas las
formas de silanoles que se muestran en la Figura 3.
Estos materiales de tipo A generalmente producían picos
de cola para compuestos básicos. En los últimos 10 años,
los fabricantes de columnas han aprendido a fabricar
sílice de alta pureza o sílice tipo B. Estos productos se
fabrican cuidadosamente en entornos libres de metales
para que los niveles de metales traza sean extremadamente
bajos. Las tecnologías patentadas han permitido a los
fabricantes reducir simultáneamente el contenido de
silanol libre y aumentar el número y la distribución espacial
de los silanoles geminales y asociados.
El resultado es una superficie de sílice mucho menos ácida.
Además, las columnas de sílice de tipo B tienen menos
tendencia a generar colas de pico severas con compuestos
básicos.
¿Qué hacer con el seguimiento?
Con las columnas de tipo A, la reducción de colas en los
picos generalmente significaba modificar la fase móvil para
incluir un compuesto supresor de colas.
La trietilamina era un aditivo de fase móvil popular para
reducir los picos de cola. Usada en concentraciones de
20 mM o más en la fase móvil, la trietilamina podría
reducir significativamente la cola de pico con columnas
Tipo A. En mi laboratorio, mis compañeros de trabajo y
yo realizamos servicios de separación por contrato para
la industria farmacéutica. Cuando dependíamos de las
columnas de tipo A, la trietilamina estaba presente en la
mayoría de las fases móviles.
Hoy en día, con la disponibilidad de sílices tipo
B, la cola de picos para compuestos básicos es un
problema mucho menor. En mi laboratorio ahora usamos
columnas Tipo B casi exclusivamente; muy pocas veces
añadimos trietilamina a la fase móvil. Como regla general,
las fases móviles de bajo pH (pH 3) también actúan para
suprimir la ionización del silanol, lo que reduce aún más
los problemas de colas.
Hoy en día, la confiabilidad añadida de las columnas y la
simplicidad de las fases móviles hacen que los métodos
de LC sean más confiables y robustos. No veo ninguna
razón para desarrollar una nueva separación en una
columna Tipo A; solo está preguntando por problemas que
podrían evitarse fácilmente usando un material de relleno
Tipo B.
El pico de relaves es principalmente un problema
con los materiales de empaque a base de sílice. Fases
estacionarias de fase inversa unidas a polímeros orgánicos,
zirconia u otros soportes que no sean sílice
Machine Translated by Google
están disponibles como alternativas a los a base de sílice
columnas Estas columnas especiales podrían resolver
su problema de separación y producir picos con poca o
ninguna cola de pico.
¿Qué pasa con los degradados?
En general, los analistas están más preocupados por
la cola de picos con picos generados por separaciones
isocráticas porque los gradientes tienen dos características
que minimizan
cola La primera característica es más una ilusión que una
diferencia real. Todos los picos en una separación de
gradiente tienen aproximadamente el mismo ancho,
mientras que una separación isocrática genera picos que
aumentan de ancho con la retención. La cola a menudo es
más obvia visualmente con picos más amplios, como los
picos eluidos más tarde en una separación isocrática.
Debido a que los picos de gradiente tienden a ser más
angostos, las colas son menos obvias.
La segunda característica que minimiza
el problema de las colas de picos con gradientes es la
compresión de picos, un proceso que actúa sobre todos
los picos de gradientes. Piense en un gradiente a escala
microscópica: la concentración de disolvente orgánico
aumenta gradualmente con el tiempo en un gradiente de
fase inversa. En cualquier punto de una columna, las
moléculas de soluto que la atraviesan experimentan una
fase móvil más débil que las que la atraviesan más tarde.
Para un pico dado, este fenómeno significa que las
moléculas en el frente del pico viajan en un solvente más
débil que aquellas en el borde posterior del pico.
Un solvente más fuerte (más orgánico) eluye las
moléculas a través de una columna más rápido que un
solvente más débil. Por lo tanto, en condiciones de
gradiente, las moléculas en el borde posterior de un pico
siempre viajan más rápido que aquellas en el borde frontal
del pico.
En otras palabras, la cola se empuja constantemente
hacia el pico principal y se reduce la cola del pico. Por esta
razón, la formación de colas en los picos en las
separaciones de gradiente es un problema menor que la
formación de colas para el mismo compuesto en
condiciones isocráticas y con la misma columna y
componentes de fase móvil.
Conclusiones
La cola máxima es un problema real e
inevitable con la mayoría de las separaciones LC.
Los fabricantes han hecho grandes avances en el
desarrollo de materiales de soporte de sílice tipo B y,
aunque estos materiales reducen significativamente los
picos de cola, rara vez los eliminan. Los picos de colas
pueden causar problemas cualitativos y cuantitativos con
los métodos de LC, por lo que es importante monitorear
los picos de colas para que no comprometan los resultados
analíticos. Mida la cola de los picos utilizando el factor de
cola de la USP o el
www.lcgceurope.com
Solución de problemas de LC
factor de asimetría. Con los materiales de empaque
Tipo B de hoy en día, generalmente no es necesario
agregar reactivos para suprimir la cola de pico. Sin
embargo, los solutos fuertemente básicos aún
pueden requerir el uso de trietilamina u otro reactivo
para reducir la formación de colas en los picos. Otra
alternativa es explorar el uso de un material de empaque
que no sea a base de sílice.
El uso de materiales de empaque a base de sílice puede
ser una relación de amor y odio. Recuerdo cuando se
introdujeron los soportes a base de polímeros orgánicos a
mediados de la década de 1970.
Muchos trabajadores pensaron que serían la sentencia
de muerte para la sílice porque no tenían los problemas
de relaves asociados con la sílice. Pero luego se dieron
cuenta de que los efectos del silanol de la fase estacionaria
jugaban un papel muy importante en la selectividad de la
separación cromatográfica. Aunque las columnas basadas
en polímeros podían generar picos simétricos, no eran tan
útiles como las columnas basadas en sílice para separar
mezclas complejas. Aún no se ha inventado la columna LC
perfecta.
Referencia
1. LR Snyder, JJ Kirkland y JL Glajch,
Practical HPLC Method Development (John
Wiley & Sons, Nueva York, 2.ª ed.), pág.
180 (1997).
El editor de "Solución de problemas de LC" John W.
Dolan es vicepresidente de BASi Northwest Laboratory
de McMinnville, Oregón, EE. UU.; consultor de capacitación
para Rheodyne LLC, el Grupo de Capacitación de Recursos
de LC, de Walnut Creek, California, EE. UU.; y miembro
del Consejo Asesor Editorial de LC•GC Europe.
Correspondencia directa sobre esta columna a “LC
Troubleshooting”, LC•GC Europe, Advanstar House, Park
West, Sealand Road, Chester CH1 4RN, Reino Unido.
Los lectores también pueden dirigir sus preguntas al
Foro de cromatografía en línea en http://
www.chromforum.com
4