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Aplicación Microbiol Biotechnol (2013) 97:3119–3128 DOI

10.1007/s00253-012-4526-x

FISIOLOGÍA MICROBIANA Y CELULAR APLICADA

Efectividad de hongos micorrízicos arbusculares

(HMA) para inducir la acumulación de carotenoides
mayores, clorofilas y tocoferoles en lechugas de hoja verde y roja
Marouane Baslam & Raquel Esteban & José I.
García-Plazaola & Nieves Goicoechea

Recibido: 21 de mayo de 2012 / Revisado: 16 de octubre de 2012 / Aceptado: 18 de octubre de 2012 / Publicado en línea: 30 de octubre de 2012
# Springer-Verlag Berlín Heidelberg 2012

Resumen Estudios previos demostraron que los hongos micorrízicos Introducción

arbusculares (HMA) pueden inducir la acumulación de carotenoides,
fenoles, antocianinas y algunos nutrientes minerales en hojas de
lechuga (Lactuca sativa L.) mejorando así su calidad nutricional.
Nuestros objetivos fueron saber qué carotenoides se acumulaban más
en las hojas de
lechugas micorrizadas y para evaluar el efecto de los AMF en los
niveles de tocoferoles en hojas de plantas de lechuga. Los AMF
siempre mejoraron el crecimiento y, en la mayoría de los casos,
aumentaron los niveles de todos los principales carotenoides, clorofilas
y tocoferoles en las lechugas de hoja verde y roja. Dado que estas
moléculas también son nutracéuticos importantes, la micorrización
320.000
surge como una técnica confiable para mejorar el valor nutricional de los vegetales
comestibles.
Estos resultados se comparan con otros métodos desarrollados para
mejorar la calidad nutricional.
Palabras clave Hongos micorrízicos arbusculares. ÿ-caroteno.
Lactuca sativa L. . Tocoferoles. Xantofilas
A pesar de los esfuerzos de las organizaciones de salud pública, a
menudo es difícil lograr aumentar el consumo de vegetales en la
sociedad. Por lo tanto, sería interesante mejorar los niveles nutricionales
de las verduras para mejorar la ingesta de nutrientes sin requerir un
aumento en el consumo. La lechuga es una de las hortalizas más
aceptadas en la dieta humana y, junto con la escarola, la verdura más
utilizada para la denominada 'Cuarta Gama' de hortalizas (Borghi
2003). Según FAOSTAT (División de Estadística de la FAO) 2011, la
cantidad de producción de lechuga y achicoria en España, Francia,
Alemania y Grecia fueron, respectivamente, 1.000.000, 430.000,
y 80.000 t en 2009. En 2010, la cantidad total de producción
de lechuga y la achicoria en la Unión Europea alcanzó las 3.023.174 t,
siendo Italia (843.344 t) y España (809.200 t) los principales países
productores.
El Fitomejoramiento Convencional y la Biotecnología son dos
formas de mejorar la calidad nutricional de la lechuga.
Sin embargo, como lo expone Mou (2009), los esfuerzos de
mejoramiento para la nutrición a menudo se ven obstaculizados por la

M. Baslam : N. Goicoechea (*)

Dpto. Biología Vegetal, Sección Biología Vegetal (Unidad
Asociada al CSIC, EEAD, Zaragoza e ICVV, Logroño).
Facultades de Ciencias y Farmacia, Universidad de Navarra, Irunlarrea 1,
31008 Pamplona, Spain e-mail: niegoi@unav.es
R. Esteban : J. I. García-Plazaola Dpto.
Biología Vegetal y Ecología, Universidad
del País Vasco (UPV/EHU), c/Sarriena s/n, Apdo.
644, ES-48080 Bilbao, Spain
falta de capacidades analíticas en la mayoría de los programas de
mejoramiento de cultivos. Este autor también afirma que la
comercialización de la lechuga transgénica dependería del progreso en
la expresión transgénica, la aceptación pública, los desafíos económicos
y de mercadeo, los problemas de propiedad intelectual y la evaluación
de riesgos. Todas estas dificultades inducen a buscar otras alternativas
para mejorar la calidad nutricional de la lechuga. De hecho, algunos
estudios se han centrado en mejorar el crecimiento y el valor nutricional
de diferentes variedades de lechuga mediante la aplicación de luz
suplementaria de longitudes de onda seleccionadas en invernaderos.
Por ejemplo, Li y Kubota (2009) encontraron que el azul, ultravioleta-A suplementario
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3120
(UV-A) o luces rojas pueden inducir, respectivamente, la acumulación
de antocianinas, carotenoides y fenoles en lechugas baby cultivadas
bajo luz blanca. Asimismo, Caldwell y Britz (2006) estudiaron los
efectos de la radiación UV suplementaria sobre los niveles de
carotenoides y clorofilas en varias lechugas de hoja verde y roja
cultivadas en invernadero. Otros autores (Lizarazo et al. 2010)
observaron que la cantidad de ÿ-tocoferol (vitamina E) en hojas de
lechuga aumentaba notablemente durante la ontogenia y, en
consecuencia, sugirieron que el contenido de vitamina E podría
mejorarse fácilmente en este cultivo mediante seleccionando el
momento adecuado de cosecha, lo que permitiría evitar el uso de
plantas modificadas genéticamente.
En este contexto, la aplicación de hongos micorrízicos
arbusculares (HMA) podría ser otra alternativa tanto al
fitomejoramiento convencional como a la lechuga transgénica para
potenciar la cantidad de algunos compuestos de interés nutricional
sin riesgo para la salud humana y respetuosa con el medio ambiente.
Los hongos micorrízicos colonizan las raíces de más del 90 % de las
especies de plantas principalmente para el beneficio mutuo tanto de
la planta huésped como del hongo (Smith y Read 2008), siendo las
micorrizas arbusculares el tipo de simbiosis micorrícica formada por
la mayoría de las plantas de cultivo y hortícolas, incluyendo lechuga.
Investigaciones recientes realizadas por nuestro grupo han
demostrado que la asociación de lechugas cultivadas en invernadero
con HMA puede beneficiar el crecimiento de las plantas e inducir la
acumulación de algunos nutrientes minerales (por ejemplo, Cu y Fe),
carotenoides totales, antocianinas y, en menor medida, solubles.
fenoles en hojas (Baslam y Goicoechea 2012; Baslam et al. 2011a,
b).
Los principales objetivos de este estudio fueron (1) caracterizar
cómo la composición de carotenoides de las plantas de lechuga de
hoja verde y roja responde a los AMF; y (2) evaluar el efecto de AMF
en los niveles de tocoferol en hojas de plantas de lechuga. Estos
resultados se comparan con otros métodos desarrollados para
mejorar la calidad nutricional.
Materiales y métodos
Material biológico y diseño experimental
Three types of lettuces (Lactuca sativa L.), Cogollos de Tudela (CT)
(var. Longifolia), Batavia Rubia Munguía (BRM) (var. Capitata) and
Maravilla de Verano (MV) (var.
capitata), fueron elegidos para este estudio. Las semillas de BRM,
MV y CT se esterilizaron superficialmente con lejía al 10 % durante
10 min y se sembraron (el 22 de junio) en una mezcla de turba y
arena (1:1, v:v). Cuando las plántulas tenían de dos a tres hojas
completamente desarrolladas, se transfirieron (el 13 de julio) a
macetas de 1,5 l (una planta por maceta y 30 macetas por cada tipo
de lechuga) llenas de una mezcla de vermiculita-arena silícea-turba
ligera (2,5 :2.5:1, v:v:v). La turba (Floragard, Vilassar de Mar,
Barcelona, España) tenía un pH de 5,2–6,0, 70–150 mgLÿ1 de
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nitrógeno, 80-180 mgL-1 P2O5 y 140-220 mgL-1 K2O y se esterilizó
previamente a 100 °C durante 1 h en tres días consecutivos. En el
momento del trasplante, se inocularon 10 macetas de cada cultivar
de lechuga con el hongo micorrícico Glomus fasciculatum (Taxter
sensu Gerd.) Gerd. y Trappe, otras 10 macetas fueron inoculadas
con el inóculo comercial AEGIS Endo Gránulo y otras 10 macetas no
fueron inoculadas y se mantuvieron como controles no micorrízicos
(NM). G. fasciculatum provino de un cultivo en maceta con alfalfa
(Medicago sativa L.) como planta huésped y el inóculo (Gf) consistió
en 20,0 g de suelo con fragmentos de raíz de alfalfa, esporas e hifas
por 2,0 L de sustrato total. El inóculo comercial fue una mezcla de
Glomus intraradices (Schenck y Smith) (actualmente Rhizophagus
intraradices (Schenck y Smith) Walker y Schüÿler comb. nov.) y
Glomus mosseae (Nicol. y Gerd.) Gerd. y Trappe (en realidad
Funneliformis mosseae (Nicol. and Gerd.) Walker and Schüÿler comb.
nov.) que contenía alrededor de 100 esporas y otros propágulos
infecciosos por gramo de producto y proporcionado y comercializado
por Atens (Tarragona, España). Se añadió un total de 9,5 g de la
formulación comercial de micorrizas a cada maceta (alrededor de
950 esporas). El inóculo de micorrizas se mezcló en los 10 cm
superiores del sustrato en cada maceta justo antes del trasplante de
las plántulas para facilitar el contacto temprano entre los AMF y las
raíces en crecimiento de las plantas de lechuga jóvenes.
Las plantas de lechuga se cultivaron en un invernadero a 25/15
°C de temperatura día/noche y 40/80 % de humedad relativa día/
noche, y recibieron luz natural complementada con la irradiación de
lámparas fluorescentes (Sylvania DECOR 183, Professional-58 W,
Erlangen , Alemania) que proporcionó un flujo de fotones fotosintéticos
(PPF) mínimo de alrededor de 300–400 ÿmolmÿ2 s durante un
ÿ1
fotoperíodo de 14 h. Todasdescribe
las plantas
por fueron
Baslamfertilizadas como
et al. (2011a) y se
también recibieron 300 ml de agua destilada dos veces por semana.
Las plantas se cosecharon 7 semanas después del trasplante.
Las muestras para las determinaciones analíticas se recolectaron
tanto de hojas internas (zona interna) como externas (zona externa)
de lechugas. Ambas zonas fueron delimitadas visualmente y cada
una tenía una media de aproximadamente 15 hojas. La zona interna
estaba bastante cerca de la punta meristemática del brote e incluía
hojas de color verde claro. Las hojas interiores cosechadas se
colocaron a medio camino entre el centro de la cabeza y la parte
exterior. Las hojas exteriores exhibieron un color más oscuro y un
tamaño más grande que las hojas interiores y no eran compactas en
la cabeza de la lechuga.
Parámetros de crecimiento y análisis de micorrizas
Al momento de la cosecha, se seleccionaron aleatoriamente tres
plantas de cada cultivar de lechuga y tratamiento para determinar la
producción de biomasa tanto de brotes como de raíces. El peso seco
(PD) de hojas y raíces se determinó después de secar el material
vegetal a 80 °C por lo menos durante 2 días (hasta que se obtuvo el peso).
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constante). Se limpiaron y tiñeron muestras de raíces de plantas de
lechuga como describen Phillips y Hayman (1970) y se determinó
la colonización de micorrizas examinando segmentos de raíces de
1 cm (n045 por cada tipo de lechuga y tipo de inóculo de micorrizas)
bajo el microscopio. Los resultados se expresaron como porcentaje
de colonización (Hayman et al. 1976).
métodos analíticos
Se recolectaron muestras de hojas (ÿ40 mg FW), se congelaron en
nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta los análisis de
carotenoides, clorofilas y tocoferoles. La extracción se realizó
mediante molienda en mortero enfriado con 1 ml de acetona (100
%) con 0.5 gLÿ1 de CaCO3, con el fin de evitar trazas ácidas que
pudieran alterar la composición del pigmento. Las muestras se
centrifugaron a 13200 rpm durante 20 min a 4 °C y se filtraron con
jeringa a través de un filtro de PTFE de 0,22 ÿm (Whatman,
Maidstone, Reino Unido). Los extractos se inyectaron (15 ÿL) en un
sistema HPLC de fase inversa Waters (Milford, MA, EE. UU.)
siguiendo el método de García-Plazaola y Becerril (1999) con
algunas modificaciones (García-Plazaola y Esteban 2011; García-
Plazaola y Becerril 2001). El automuestreador 717 plus se equipó
con un termostato que mantiene la temperatura constante a 4 °C
evitando la degradación o alteración del pigmento. Los pigmentos
fotosintéticos se midieron con un detector PDA (Waters modelo
996) en el rango de 250 a 700 nm. Los picos se detectaron e
integraron a 445 nm para el contenido de carotenoide y clorofila.
Los pigmentos se identificaron y cuantificaron según García-
Plazaola y Becerril (1999). Los tiempos de retención y los factores
de conversión de los pigmentos fueron los mismos descritos por
García-Plazaola y Becerril (2001, 1999). Para los tocoferoles, la
detección se llevó a cabo con un detector de fluorescencia (Waters
modelo 474) ajustado a ÿexc0295 nm y ÿem0340 nm y calibrado
con estándares de tocoferoles (Calbiochem, San Diego, CA). Dado
que no pudimos separar ÿ de ÿ-tocoferol en las condiciones
cromatográficas explicadas anteriormente, nos referimos a ellos
solo como ÿ-ÿ-tocoferol en todo el trabajo, en la Fig. 4.
Como la discusión se centra en la calidad nutricional de tres
tipos de lechuga que se consumen como ensaladas, los resultados
se expresaron y discutieron sobre una base fresca.
análisis estadístico
Dentro de cada cultivar de lechuga, los datos se sometieron a un
ANOVA de dos factores (factorial 3×2) (SPSS v. 15.0) para dividir
la varianza en los efectos principales. Se utilizó como primer factor
la inoculación o no con HMA y el tipo de inóculo micorrícico (G.
fasciculatum o inóculo comercial); el tipo de hoja (hoja exterior o
interior) de cada planta de lechuga se incluyó como segundo factor.
Diferencias significativas entre factores
3121
se calcularon al 5 %. Cuando la interacción entre los factores fue
significativa según el análisis ANOVA, las diferencias menos
significativas se evaluaron mediante la prueba post hoc de diferencia
mínima significativa (pÿ0.05).
Resultados
Parámetros de crecimiento y análisis de micorrizas
Las plantas de lechuga no inoculadas con cualquiera de los inóculos
de micorriza nunca mostraron estructuras fúngicas en las raíces
(datos no mostrados). Por tanto, nos referiremos indistintamente a
estas plantas como 'no inoculadas' o 'no micorrizas'. Cuando se
inoculó con G. fasciculatum, los porcentajes de colonización de
raíces alcanzaron valores en torno al 65 %, independientemente del
tipo de lechuga. Cuando se aplicó el inóculo comercial, los
porcentajes de colonización micorrícica oscilaron entre 56 % en MV
y 62 % en CT (Fig. 1).
La simbiosis micorrizal aumentó significativamente el crecimiento
de los brotes en los tres tipos de lechugas (Fig. 2a), siendo la
eficacia de G. fasciculatum similar a la del inóculo comercial para
mejorar la biomasa de los brotes (DW de brotes) en CT y MV. Solo
la aplicación del inóculo comercial a CT benefició significativamente
la biomasa de la raíz (DW de la raíz) (Fig. 2b).
carotenoides
Las cantidades de neoxantina (N), luteína (L) y ÿ-caroteno (ÿ-car)
siempre fueron significativamente más altas tanto en las hojas
externas como internas de las CT micorrizas que en las plantas no
micorrizas, independientemente de la especie de AMF inoculada
(Tabla 1). En comparación con las concentraciones en hojas de
G. fasciculatum
Inóculo Comercial
a
(%)
70 a
a
a
B
sesenta y cinco
B
60
Colonización
micorrizas
de
55
50
45
40
35
30
Connecticut BRM MV
Fig. 1 Porcentaje de colonización micorrízica (%) de raíces
pertenecientes a lechugas Cogollos de Tudela (CT), Batavia Rubia
Munguía (BRM) y Maravilla de Verano (MV) inoculadas con Glomus
fascicu latum (histogramas blancos) o con el inóculo comercial
( histogramas negros). Las mismas letras indican que los valores no
son significativamente diferentes (pÿ0.05)
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3122
a inoculum fue más efectivo que G. fasciculatum para inducir la
20
18
16
14
planta-1)
(g
Dispara
DW
12 Automóvil club británico
10 B B
8 C
6 carotenoides en MV micorrízicos mostraron aumentos que
4
2
0 colonizadas por G. fasciculatum hasta niveles más de ocho
2 veces mayores para Z en hojas externas de plantas que recibieron el inóculo c
4
6
8 niveles de los principales carotenoides sino que también indujo
raíz
DW planta-1)
(g
10 a a
cama y desayuno
12
14
16
18
20 B a
NM Gf C.I. NM Gf C.I.
Connecticut
Fig. 2 Peso seco (PS) (en gramos por planta) de brotes (a) (histogramas
blancos) y raíces (b) (histogramas negros) de lechugas Cogollos de
Tudela (CT), Batavia Rubia Munguía (BRM) y Maravilla de Verano
(MV), no inoculados con hongos micorrízicos (NM), inoculados con
Glomus fasciculatum (Gf) e inoculados con el inóculo comercial (CI).
Los valores son medias (n03) ± SE. Dentro de cada gráfica (a o b) y
tipo de lechuga, las mismas letras indican que los valores no son
significativamente diferentes (pÿ0.05)
sus respectivos controles no micorrícicos (100 %), los aumentos
en los niveles de los carotenoides antes mencionados variaron
desde alrededor del 24 % para N en las hojas externas e
internas de plantas inoculadas con G. fasciculatum hasta más
de tres veces mayor para ÿ-car en hojas exteriores de las plantas
que recibieron el inóculo comercial. Por otro lado, los niveles de
violaxantina (V) aumentaron tanto en las hojas externas como
internas de CT solo después de la aplicación del inóculo
comercial, y G. fasciculatum fue más efectivo que el inóculo
comercial para inducir la acumulación de zeaxantina ( Z) en
ambos tipos de hojas. La simbiosis micorrízica benefició
claramente la acumulación de anteraxantina (A) en las hojas
externas de CT, pero redujo los niveles de este carotenoide en
las hojas internas, siendo más relevante la disminución cuando
las plantas recibieron la formulación comercial de AMF.
En los dos cultivares pertenecientes a la variedad Capitata
(BRM y MV), la inoculación con HMA también indujo la
acumulación de carotenoides en hojas (Cuadro 1). Sin embargo,
los resultados dependieron de la especie de HMA aplicada y/o
la posición de las hojas en la planta. En BRM, la inoculación con
G. fasciculatum resultó en niveles mejorados de N, V, A, Z, L y
ÿ-car tanto en las hojas internas como externas, pero los
aumentos significativos en los niveles de los carotenoides
mencionados se restringieron a las hojas externas. después de
la aplicación del inóculo comercial. Por otro lado, el comercial
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acumulación de N, V, A, Z, L y ÿ-car en MV, aunque esos
a
a aumentos se limitaron a las hojas exteriores.
En comparación con los niveles encontrados en hojas de
a B
controles no micorrícicos (100 %), las concentraciones de
oscilaron entre 29 % para A en hojas internas de plantas
La asociación de lechugas con HMA no solo incrementó los
la acumulación de lactucaxantina (Lx) (Cuadro 1). En
a
comparación con sus respectivos controles no micorrízicos (100
a a %), los incrementos en Lx variaron desde 6.6 % en hojas
a
internas de CT después de la aplicación del inóculo comercial
hasta más de cinco veces mayor en las hojas internas de BRM
que recibieron esta formulación comercial. de AMF.
NM Gf C.I.
BRM MV
clorofilas
El efecto de la simbiosis micorrízica sobre los contenidos de
clorofilas dependió de la variedad o cultivar de lechuga, tipo de
hojas (externas o internas) y especie de HMA (Fig. 3a y b). G.
fasciculatum fue menos eficaz que el inóculo comercial para
mejorar los niveles de chl a (Fig. 3a) y chl b (Fig. 3b) en los tres
tipos de lechugas utilizadas en nuestro estudio.
Las concentraciones de clorofilas en hojas externas e
internas de CT inoculadas con G. fasciculatum fueron
equivalentes, respectivamente, a 118.5 y 135.5 % (chl a) (Fig.
3a) y 112.8 y 128.0 % (chl b) (Fig. 3b) de las concentraciones
medidas en sus controles sin micorrizas. En BRM asociado con
G. fasciculatum, las concentraciones de clorofilas en hojas
externas e internas fueron equivalentes, respectivamente, a
257.5 y 217.5 % (chl a) (Fig. 3a) y 265.0 % y 215.8 % (chl b)
(Fig. 3b) de los niveles cuantificados en sus controles no
micorrízicos. La aplicación de G. fasciculatum a MV incrementó
los contenidos de ambas clorofilas (225.5 %) en las hojas
exteriores (Fig. 3a y b) pero disminuyó las concentraciones de
chl a (53.9 %) (Fig. 3a) y chl b ( 50.1 %) (Fig. 3b) en las hojas
internas en comparación con sus controles no inoculados.
La aplicación del inóculo comercial permitió obtener niveles
de clorofilas en hojas externas de CT y BRM más de dos o tres
veces superiores, respectivamente, a las acumuladas en hojas
equivalentes de sus controles no micorrízicos (Figs. 3a y b).
Las cantidades de clorofilas ayb en las hojas externas de la
lechuga de hoja roja MV tratada con el inóculo comercial fueron
5 veces mayores que las de las hojas externas de sus
respectivos controles sin micorrizas; sin embargo, los niveles de
chl a (Fig. 3a) y chl b (Fig. 3b) en las hojas internas de las
plantas con micorrizas fueron
 FW
peso
fresco,
NM
no
micorrizas,
Gf
plantas
inoculadas
con
Glomus
fasciculatum,
CI
plantas
inoculadas
con
el
inóculo
comercial. Los
principales
carotenoides
en
las
plantas
micorrizas
(hojas
externas
o
internas)
también
se
expresaron
como
porcentajes
(%
C)
de
sus
respectivos
controles
no
inoculados
(100
%). Los
valores
son
medias
de
tres
a
cinco
observaciones.
Dentro
de
cada
columna
ytipo
de
lechuga
los
datos
seguidos
de
la
misma
letra
indican
que
los
valores
no
difirieron
significativamente
(pÿ0.05).
Concentraciones
de MV BRM Connecticut Tabla
1Concentraciones
(ÿggÿ1
FW)
de
carotenoides
mayoritarios
en
hojas
externas
e
internas
de
plantas
lechuga
Cogollos
de
Tudela
(CT),
Batavia
Rubia
Munguía
(BRM)
yMaravilla
de
Verano
(MV)
ALLÍ novia Hojas
exteriores
NM ALLÍ novia Hojas
exteriores
NM ALLÍ novia Hojas
exteriores
NM
hojas
interiores hojas
exteriores hojas
interiores hojas
exteriores hojas
interiores hojas
interiores hojas
exteriores hojas
interiores hojas
exteriores hojas
interiores hojas
interiores hojas
exteriores hojas
interiores hojas
exteriores hojas
interiores
7.20
discos
compactos 23.53
a 8.62
discos
compactos 5,06
días 2.80c 4.72b 2.21c 3.99
aC 9.33b 8.90b 6.72c 7.19c 5.40
días ÿ1
mcg neoxantina
10.61
a.C. 12.39b 12.84
a 11.24
a 12.46
a
FW%C
ÿgg
ÿ1FW%C
58.1 465.0 69.6 209.7 100.0 100.0 126,7
4,92
días 321.8 213.6 281.7 100.0 100.0 129.8 230.7 123.8 124.4 100.0 100.0
37.08
a 8.08c 20.86
a 8.29c 3,79
días 6.00
discos
compactos 20.37
a 9.15
discos
compactos 9.95c 7,64
días violaxantina
12.61
a.C. 12.86
a.C. 15.84b 15.93b 17.06b 14.64b 14.25b
79.2 458.9
2.80a 80.7 347.7 218,7
0,46c 284.3 266.6
196,0
0,56
aC 100.0 100.0 129.8 100,0
0,22
días 100,0
0,77c 147.1 143,2
0,90c 119.8 100.0 100,0
0,39
días
0,55
aC 0.41c 0,28
días 0,53
días µgg
ÿ1FW%
C
µgg
ÿ1FW%
C
µgg
ÿ1FW%
C
µgg
ÿ1FW%
C
µgg
ÿ1FW%
C anteraxantina
1.35b 1.05
aC 1.28
a 1.10b 1.34b 1.72
a 1,72
días
52.4 682.9 128.6 136.6 100.0 100.0 127.3 166.2 209.1 142.9 100.0 100.0 30.8 343.6 52.3 441.0 100.0 100.0
0.73b 3.73
a 0,67b 0.99b 0.44b 0.34
de 0.50
discos
compactos 0.19
y 0,69c 0.78c 0,61c 0.51c Zeaxantina
1.16b 1.75
a 1.28b 1.54
a 1.21b 1.82
a
73.7 847.7 67.7 263.6 253.6
20.37a 263.2
6.18c 302.0 356.9
100.0 100.0 178.9 185.8 100.0 100.0 127.9 198.4 100.0 100.0
9.34
a.C. 37.00
a 9.21
aC 5.82c 3.80
discos
compactos 2,68
días 5.59c 9.51c 7.03
días luteína
13.97b 14.98b 13.85b 14.11b 17.73
a 16.13
en
adelante 10.16c
62.4 635.7
16.18a 61.5 240,0
12,10
millones 364,4
4,87
en
adelante 230,6
2,59c 247.8 252.2
8.63a
100.0 100.0 141.8 100.0 100.0 148.4 169.6 144.5 100.0 100.0
9.22
discos
compactos 5.06
un 3.01
aC 2.21
discos
compactos 4.64c 4.31c lactucaxantina
11.42b 9.33c 8.41
días 1,01
días 3.87c 6.88b 3.63c
135.8 175.5
46.79a 110.9 131.2 100,0
23,76
millones 100.0 501.0 220.4 256.4 136,2
24,14b 100.0 100.0 106,6
21,75b
200.2 127.8
22.07b 159.6 100.0 100.0
9.08
días 6.89
de 31.76
a 5.23
y 9.11
discos
compactos 31.46
a ÿ-
caroteno
17.03
discos
compactos 17,52
bcd 18.63
aC 11.34c 13.92c 14.88c 10.20
d
71.7 515.3 73.7 205.2 100.0 100.0 131.7 348.6 216.8 265.0 100.0 100.0 146.2 308.4 148.3 136.5 100.0 100.0
3123 Aplicación Microbiol Biotechnol (2013) 97:3119 –3128
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3124 Appl Microbiol Biotechnol (2013) 97:3119–3128

Fig. 3 Concentraciones de
clorofila a (chl a) (mggÿ1 FW) a hojas exteriores
(a) y clorofila b (chl b) (en hojas interiores
miligramos por gramo FW) (b) en 0.9 a
hojas exteriores (histogramas
blancos) e interiores (histogramas
0.8
negros) de lechugas Cogollos de 0.7
Tudela (CT), Batavia Rubia
Munguía (BRM) y Maravilla de 0.6 a
a
B
Verano (MV), no inoculadas con 0.5
hongos micorrízicos (NM), B
B
inoculadas con Glomus fasciculatum 0.4 B
c
(Gf) e inoculadas con el inóculo C cd cd
0.3 D
comercial (CI). Los valores son Y
C
medias (n07) ± SE. Dentro de cada 0.2 discos compactos

de D
gráfica (a o b) y tipo de lechuga, Y
0.1
las mismas letras indican que los
valores no son significativamente 0
diferentes (pÿ0.05). Las
concentraciones de chl a o chl b B
(hojas exteriores u hojas interiores) 0.35
en plantas micorrizas también se a

han expresado como porcentajes 0.30

de sus respectivos controles no
inoculados (C0100 %) y los valores 0.25
aparecen en la parte superior de
los histogramas correspondientes. 0.20 a
a B
Peso fresco FW
0.15 B
B B antes de Cristo

C
0.10 D
D discos compactos
discos compactos

discos compactos C D
0.05
discos compactos

0
NM Gf C.I. NM Gf C.I. NM Gf C.I.

Connecticut BRM MV

reducido al 50 % de los encontrados en las hojas internas de sus Discusión

controles no micorrícicos.
tocoferoles
En plantas sin micorrizas, los niveles más bajos de ÿ-ÿ tocoferol se
midieron tanto en las hojas internas como externas de BRM.
(Figura 4a). Sin embargo, la cantidad de ÿ-ÿ tocoferol aumentó
significativamente en BRM cuando las plantas se asociaron con AMF
y también lo hizo en micorrizas MV, independientemente del tipo de
inóculo de micorrizas aplicado. Sin embargo, con la excepción de
BRM colonizado por G. fasciculatum, los aumentos en las
concentraciones de ÿ-ÿ tocoferol se restringieron a las hojas exteriores.
En CT, solo la aplicación del inóculo comercial indujo una acumulación
significativa de ÿ-ÿ tocoferol en las hojas externas. Por el contrario, G.
fasciculatum aumentó los niveles de ÿ-tocoferol en las hojas internas
de CT y BRM (Fig. 4b). Sin embargo, las mayores mejoras en las
cantidades de ÿ-Tocoferol se observaron en las hojas externas de los
tres tipos de lechugas después de aplicar el inóculo comercial.
La aplicación de G. fasciculatum o del inóculo comercial benefició el
crecimiento de las lechugas. Es bien sabido que la simbiosis de
micorrizas puede beneficiar el crecimiento de las plantas debido
principalmente a la absorción de nutrientes con baja movilidad por las
hifas externas (Jakobsen et al. 1994). Además, la asociación de
micorrizas también puede inducir la acumulación de mayores
cantidades de agua de las plantas hospederas, especialmente cuando
el suministro de agua está restringido (Goicoechea et al. 2004), lo
que también permite mejorar el crecimiento de las plantas. Este mayor
contenido de agua en la parte aérea, sin embargo, no se observó en L. sativa cv.
Tafalla inoculada con G. intraradices o G. mosseae y cultivada bajo
diferentes niveles de riego (Kohler et al.
2008). En nuestro estudio, la absorción de nutrientes en CT
micorrízicos también podría haberse visto favorecida por el mayor
desarrollo de raíces (en términos de PS) después de aplicar la
formulación comercial de AMF. La plasticidad de la raíz está
influenciada por AMF, siendo el efecto más común el aumento de la
ramificación de la raíz (Berta et al. 1993). Otros posibles efectos de
AMF en el sistema de raíces del huésped son el DW de raíz mejorado y la longitud d
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Appl Microbiol Biotechnol (2013) 97:3119–3128 3125

Fig. 4 Concentraciones de
(ÿ+ÿ)-Tocoferol (ÿggÿ1 FW) (a) y hojas exteriores
a 412,8
%

ÿ-Tocoferol (ÿggÿ1 FW) (b) en 14 hojas interiores

hojas exteriores (histogramas
blancos) e interiores (histogramas a
12
178,0
%

negros) de lechugas Cogollos de 266,1

%

Tudela (CT), Batavia Rubia 10

600,9
%

Munguía (BRM) y Maravilla de 117,8

%
104,5
% a
Verano (MV), no inoculadas con 8 369,3
%
100,0
%
B
100,0
%
a
hongos micorrízicos (NM),
85,4
%

100,0
%

inoculadas con Glomus FW)

g-1
(µg
ÿ
6 bb _
192,5
%

C B
50,9
%

C
(Tocoferol
+ )-

fasciculatum (Gf) e inoculadas B B 101,4

%

con el inóculo comercial (CI). Los

19,2
%

4 100,0
100
%
0 .
D
B Y
valores son medias (n07)±SE.
C
Dentro de cada gráfica (a o b) y 2 CC F
tipo de lechuga, las mismas letras
indican que los valores no son 0
significativamente diferentes B 326,3
%

(pÿ0.05). Las concentraciones de

3.0
(ÿ+ÿ)-tocoferol o ÿ-tocoferol (hojas
externas o internas) en plantas a
micorrícicas también se han 2.5
228,3
%

expresado como porcentajes de 536,0

% 181,5
%

sus respectivos controles no 2.0

a
inoculados (C0100 %) y los
valores aparecen en la parte
113,4
%

-Tocoferol
PF)
g-1
(µg
a B
ÿ 1.5 194,4
%
100,0
%

superior de los correspondientes

histogramas. Peso fresco FW. ND 100,0
%

C
107,6
%

1.0
100,0
%
B
no detectado 100,0
% B 19,4
%
B B
15,38
%

C D D
0.5 C DAKOTA
NORTE
DEL
DAKOTA
NORTE
DEL

D C Y
0
NM Gf C.I. NM Gf C.I. NM Gf C.I.

Connecticut BRM MV

observado por Berta et al. (1995) en Prunus cerasifera asociado
con HMA. Estos últimos autores concluyeron que los AMF pueden
afectar los procesos en el sistema radicular en diferentes niveles y
no todos los efectos se deben a una mejor nutrición con fósforo o
una mayor edad fisiológica. El crecimiento mejorado en lechugas
inoculadas con AMF contrasta con la inhibición de la acumulación de biomasa
ción en lechugas suplementada con ultravioleta (UV) quizás debido
al alto costo metabólico de los compuestos fenólicos para la
protección UV (Tsormpatsidis et al. 2010).
Se ha informado ampliamente que las plantas asociadas con
AMF pueden tener mayores niveles y/o actividades de enzimas
involucradas en la eliminación de especies de oxígeno activado, y
dichas mejoras se ven beneficiadas por una mayor absorción y
acumulación de Fe, Cu, Zn y Mn en los brotes. de plantas micorrizas.
Sin embargo, el papel de los AMF en el estado de los antioxidantes
no enzimáticos que también pueden eliminar las especies de oxígeno
activado (es decir, carotenoides, glutatión, tocoferoles y ácido
ascórbico) en los tejidos de las plantas hospedantes necesita más
investigación (Evelin et al. 2009). Estudios de investigación previos
realizados por nuestro grupo de trabajo demostraron que la
asociación de plantas de lechuga con HMA facilitaba la absorción de
los mencionados micronutrientes, aunque la
la tasa de absorción del suelo y la acumulación adicional en las
hojas dependía de la variedad o cultivo de lechuga (Baslam et al.
2011a), la especie de HMA utilizada (Baslam et al. 2011a) y la
fuente de P aplicada a las plantas (Baslam et al. 2011a). otros 2011b).
La simbiosis de micorrizas también aumentó los niveles de
carotenoides totales (Baslam et al. 2011a), y las mejoras fueron más
pronunciadas cuando las plantas de lechuga se cultivaron con un
suministro de agua restringido (Baslam y Goicoechea 2012). Por el
contrario, el efecto de los AMF sobre los niveles de ascorbato total
no fue muy claro (Baslam et al. 2011a).
El presente estudio muestra que no solo se mejoró el crecimiento
por la micorrización, sino que también se asignaron más recursos a
la maquinaria fotosintética, como lo demuestra el mayor contenido
de clorofila y/o carotenoides, especialmente en las hojas que están
más expuestas a claro (hojas exteriores). De acuerdo con nuestros
resultados, Ulrichs et al. (2008) encontraron mayor contenido de
licopeno y ÿ-caroteno en frutos de plantas de tomate inoculadas con
Glomus sp. puede ser una consecuencia del rendimiento fotosintético
mejorado en las plantas micorrícicas. Más recientemente, Giovannetti
et al. (2012) encontraron que G. intraradices puede mejorar el valor
nutricional y nutracéutico de los frutos de tomate a través de
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3126
modificaciones del metabolismo secundario de la planta y sin
producción de compuestos mutagénicos; además, los frutos
producidos por plantas de tomate micorrizadas mostraron una
mayor actividad antiestrogénica que los producidos por plantas no
micorrizadas. Las concentraciones de N, L y ÿ-car en CT sin
micorrizas fueron bastante similares a las medidas en las lechugas
de hoja verde Simpson Elite, Black-Seeded Simpson y Concept
(Caldwell y Britz 2006).
Sin embargo, CT micorrizal acumuló niveles mejorados de estos
carotenoides, con tales aumentos (especialmente aquellos
obtenidos en hojas exteriores después de aplicar la formulación
comercial de AMF) siendo significativamente más altos que los
aumentos obtenidos por Caldwell y Britz (2006) al aplicar radiación
ultravioleta suplementaria en el invernadero a los tipos de lechugas
verdes antes mencionados. Mou (2005) encontró que las
concentraciones de ÿ-car y L en lechuga están altamente
correlacionadas y sugirió que este hallazgo es relevante para los
mejoradores de lechuga interesados en mejorar la calidad nutricional
de este cultivo. De hecho, se ha demostrado que ÿ-car está
inversamente relacionado con el riesgo de enfermedades
cardiovasculares y ciertos tipos de cáncer, mientras que L con los
trastornos relacionados con los ojos (Calvo 2005). Como se expone
en la sección de “Resultados”, la aplicación de AMF mejoró la
acumulación de V y Z en la lechuga verde CT. Numerosos estudios
muestran la necesidad de aumentar el consumo de V debido a que
su deficiencia provoca el desarrollo de ciertas enfermedades como
la degeneración macular que conduce a la pérdida irreversible de
la visión (Ma y Lin 2010). Z protege a través de su capacidad para
absorber eficientemente la luz azul, reduciendo la cantidad de luz
que induce el daño oxidativo y extinguiendo las especies reactivas
de oxígeno (Demmig-Adams y Adams 2002).
La inoculación con AMF también mejoró las cantidades de
carotenoides en las hojas externas de BRM y MV, los dos
cultivares pertenecientes a la variedad Capitata, y G. fasciculatum
también beneficiaron la acumulación de carotenoides en las hojas internas.
hojas de BRM. En términos generales, los aumentos en las
concentraciones de N, L y ÿ-car inducidos por AMF en la lechuga
de hoja verde BRM fueron claramente más altos que los logrados
mediante la aplicación de radiación UV suplementaria a otras
lechugas de hoja verde (Caldwell y Britz 2006). Además, estos
autores encontraron que, en el caso de las lechugas de hoja roja,
el uso de radiación UV suplementaria en el invernadero produjo
disminuciones en los niveles de N, L y ÿ-car. Por el contrario, la
inoculación de la lechuga de hoja roja MV con HMA aumentó
significativamente las cantidades de estos y otros carotenoides en
las hojas externas.
Como explicaron Demmig-Adams y Adams (1996), mientras
que V, A, Z, L, N y ÿ-car son ubicuos entre las especies de plantas
superiores, Lx está restringida a unos pocos taxones y ocurre en
varios géneros en la tribu Cichoriae de las Asteraceae.
Este pigmento se ha caracterizado particularmente en la lechuga,
donde está presente en todos los complejos captadores de luz
principales y secundarios del fotosistema II. Demmig-Adams y Adams fueron especialmente elevados en Suillus luteus (L.:
Appl Microbiol Biotechnol (2013) 97:3119–3128
(1996) observaron que Lx disminuía en las hojas de Euonymus
kiautschovicus al aumentar V+A+Z. Por el contrario, los niveles de
Lx fueron mayores en las hojas de todas las plantas de lechuga
con micorrizas en comparación con sus respectivos controles sin
micorrizas y estos aumentos ocurrieron junto con mejoras de V, A
y Z (con la excepción de A en CT suministrado con el inóculo
comercial) .
Los aumentos en los niveles totales de clorofilas (chl a y chl b)
pueden ser interesantes para la salud humana debido a la hipotética
actividad antiinflamatoria de estos pigmentos (Mulabagal et al.
2010). Las mejoras en las concentraciones de clorofilas observadas
en las lechugas verdes CT y BRM asociadas con AMF son
comparables a las obtenidas al irradiar algunos tipos de lechugas
de hoja verde (Crisp and Green, Marin y Simpson Elite) con UV-A
suplementario (320 –400 nm) más UV-B (290–320 nm)
(Caldwell y Britz 2006). Sin embargo, estos autores encontraron
que la aplicación de radiación ultravioleta suplementaria a varios
tipos de lechugas de hoja roja siempre provocaba disminuciones
en los niveles tanto de chl a como de chl b, lo que contrasta con el
aumento de los niveles de clorofilas en las hojas externas de MV
asociado con AMF. . La simbiosis micorrizal puede modificar la
duración del ciclo de vida al acortar el período vegetativo de las
plantas hospederas (Garmendia et al. 2004). Las plantas responden
al envejecimiento de las hojas con un aumento inicial en el
contenido de pigmento (Pantin et al. 2012). En conjunto, estos dos
hallazgos podrían explicar, al menos parcialmente, por qué las
hojas exteriores de las lechugas con micorrizas acumularon más
clorofilas y carotenoides que las hojas equivalentes de sus controles
sin micorrizas. Los niveles de pigmentos en las hojas internas
podrían explicarse por las diferencias en el microambiente de luz
causado tanto por el tamaño y número de hojas externas como por
el tipo de cogollo producido por cada tipo de lechuga. Cuanto más
grandes y numerosas sean las hojas exteriores y más redondeada
y densa la cabeza de la lechuga, más sombreadas estarán las
hojas interiores. Este es el tipo de cogollo que forman las lechugas
de la variedad Capitata (BRM y MV en nuestro estudio) al final de su crecimiento v
Además, las plantas micorrízicas alcanzaron un tamaño mayor que
sus respectivos controles no micorrízicos, siendo este hallazgo
especialmente relevante en MV tras la aplicación del inóculo
comercial. Por lo tanto, la menor cantidad de clorofilas y/o
carotenoides que presentan las hojas internas de las MV
micorrízicas en comparación con las encontradas en las hojas
internas de sus controles no micorrícicos puede deberse a un
patrón de aclimatación (Valladares et al. 2012) a la menor incidencia
de luz sobre las hojas internas de micorrizas MV, especialmente
después de la aplicación del inóculo comercial.
Existen algunos estudios (ver Reis et al. 2011 como ejemplo)
enfocados en la evaluación del potencial antioxidante y composición
química de hongos ectomicorrízicos con raíces de varios arbustos
y árboles. Entre los metabolitos determinados en hongos
micorrízicos silvestres aparecieron los tocoferoles, cuyos niveles
Machine Translated by Google
Appl Microbiol Biotechnol (2013) 97:3119–3128
Papas fritas) Gris. Sin embargo, hasta donde sabemos, el
presente estudio proporciona los primeros datos sobre el efecto
de la simbiosis de micorrizas arbusculares sobre la acumulación
de tocoferoles en tejidos de plantas incluidas en la dieta humana.
Solo unos pocos estudios (Ginebra et al. 2010a, b) aportan
información sobre el efecto del hongo micorrícico G. intraradices
sobre el contenido de vitamina E en plantas con propiedades
medicinales (Salvia officinalis L. y Sideritis scardica Griseb). En
estos últimos estudios, la simbiosis micorrícica mejoró levemente
o no modificó los niveles de vitamina E en las plantas hospederas.
Concentraciones de ÿ-ÿ tocoferol y ÿ-tocoferol en plantas de
lechuga no micorrizadas var. Longifolia (CT) y var. Capitata (BRM
y MV) fueron inferiores a los encontrados por Lizarazo et al.
(2010) en L. sativa L. var. Romaine d'Hiver. Curiosamente,
independientemente del tipo de lechuga y de la especie de
micorriza, las hojas exteriores de las lechugas con micorriza
contenían más tocoferoles que las de control. Aparentemente,
este resultado representa una paradoja, ya que este antioxidante
es una molécula típica que responde al estrés (Munné-Bosch
2005) y las lechugas micorrizadas mostraron un rendimiento y un
Esto es de gran interés ya que los tocoferoles son constituyentes
de la vitamina E, la cual es esencial para la salud humana
(Bramley et al. 2000). Los tocoferoles (principalmente ÿ-tocoferol)
muestran una potente actividad antioxidante en los sistemas
biológicos y, recientemente, Lira et al. (2011) sugirieron que la
suplementación con vitamina E podría ser efectiva para evitar la
obesidad. Sin embargo, los aumentos de tocoferoles observados
en las lechugas con micorrizas se restringieron a las hojas
exteriores, que se quitan durante la cosecha. Los mayores niveles
de tocoferoles en las hojas externas (y, en consecuencia, más
viejas) concuerdan con los hallazgos de Lizarazo et al. (2010).
Estos autores concluyeron que la acumulación de tocoferol con
el envejecimiento de las hojas representa un rasgo general en las
plantas, incluida la lechuga. En hojas de plantas superiores, los
tocoferoles son más abundantes en tilacoides y plastoglóbulos,
siendo estos últimos más numerosos y alcanzando mayor
diámetro en hojas senescentes (Munné Bosch y Alegre 2004). La
hipótesis de que los HMA pueden haber acortado el ciclo de vida
de las lechugas (con la consiguiente diferencia en el estado
fenológico de las plantas micorrízicas y no micorrízicas) también
podría explicar por qué las hojas externas de las lechugas
micorrícicas acumularon mayor cantidad de tocoferol que las
hojas externas de las no micorrícicas. -controles de micorrizas.
Cualesquiera que sean las razones de tal acumulación, los
presentes resultados destacan que la micorrización no solo
mejora el crecimiento de la lechuga, sino también el contenido de
En conclusión, nuestro estudio ha demostrado que la
asociación de lechugas de hoja verde y roja con HMA constituye
una alternativa factible tanto a la ingeniería genética como a la
aplicación de radiación ultravioleta suplementaria para mejorar la
calidad nutricional de este cultivo. Además, el hecho de que se
produjeran niveles elevados de carotenoides, clorofilas y
tocoferoles en las lechugas micorrizadas a pesar de la dilución
3127
El efecto debido al aumento de tamaño de las plantas asociado
a los HMA indica que la simbiosis micorrícica permitiría potenciar
la ingesta de compuestos con propiedades antioxidantes sin
incrementar el consumo de lechuga en la dieta.
Agradecimientos Marouane Baslam ha recibido una beca de la Asociación de
Amigos de la Universidad de Navarra (ADA). Raquel Esteban recibió un contrato
de médico especialista de la Universidad del País Vasco. Este estudio ha sido
financiado en parte por los proyectos de investigación UPV/EHU-GV IT-299-07
del Gobierno Vasco y BFU2010-15021 del Ministerio de Educación y Ciencia de
España.
Los autores están muy agradecidos a Adriana Hernández, de Atens, Tarragona,
España, por proporcionar amablemente el inóculo comercial.
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