Universidad nacional intercultural de la amazonia

Facultad de ingeniería ciencias y ambientales

Informe N 05

Observación morfológica de diversas Bacteria en el microscopio,

diferenciación de bacterias Gram.

DOCENTE : Ing.Darwin.J Estacio Al bornoz

CURSO : Microbiología Agroindustrial

ESTUDIANTE: Lleyns cuja Reátegui

CICLO :V

AÑO : 2021

FECHA DE ENTREGA: 14-02-21

Lima santa clara 14 de febrero de 2021.

 I. Introducción
El presente informe tiene como objetivo conocer la morfología bacteriana a
través del método tinción de Gram o método esporulado, consiste en el uso de
sustancias químicas, lugol, safranina, alcohol, cristal de violeta, que permite
clasificar según las coloraciones que tiñen los cultivos bacterianos, la pared
celular del bacteria es de gran importancia en la clasificación por el contenido
de peptidoglicano, es el responsable de adquirir o retener la coloración cristal
de violeta, según las investigaciones las bacterias de Gram positiva tienden a
dar coloración azul, morado o violeta y las bacterias Gram negativas una
coloración rojo, anaranjado o amarillento. Todas las informaciones y datos son
obtenidos de fuentes bibliográficas, informes, etc. La práctica se realizó
virtualmente y apoyado por videos tutoriales y así mismo el ingeniero de la
práctica dio información el uso de placa petrifilm, de esta manera la práctica se
procedió a concluir
II. Objetivos
II.1. Objetivo general
Observar la morfología de la célula bacteriana, a través del método
tinción Gram, en los diferentes cultivos.
II.2. Objetivos específicos
Identificar las características de las bacterias presentes en los cultivos si
son Gram positivos o Gram negativos.
Diferenciar las bacterias de Gram positiva y Gram negativa de acuerdo a
las coloraciones que adquieren con el colorante cristal de violeta.
Investigar la metodología correcta de tinción Gram y el uso de placas
petrifilm así mismo el recuento de colonias bacterianas en un cultivo.
III. Marco teórico
III.1. Las bacterias
Las bacterias son microorganismos procariotas que presentan un tamaño
de unos pocos micrómetros entre 0,5 y 5 μm de longitud y diversas formas,
incluyendo filamentos, cocos bacilos, vibrios y espirilos. (carbajal, 2015)
III.2. Clasificación por pared celular
a. Gram positivas: Aquellas bacterias que se tiñen de azul oscuro o
violeta por la tinción de Gram. Esta característica química está
íntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular, por lo que
 refleja un tipo natural de organización bacteriana. Está formada en un
90% por peptidoglicano,que permite diferenciarlas con la pared de las
Gram negativas, gracias al grosor que éste le proporciona, que se logra
mantener la coloración del cristal violeta en el interior de la célula al
teñirla con la tinción Gram.Bacillus anthracis,Clostridium, Streptococcus,
Staphylococcus,Enterococcus.
b. Gram negativas: Se refieren a un grupo de células bacterianas que
quedan coloreadas de rojo debido a un colorante de contraste en el test
de coloración de Gram y son caracterizadas por el pequeño contenido
de peptidoglicano en su pared celular y por poseer una membrana
externa. La membrana externa es el elemento estructural saliente.
Contiene numerosas proteínas como el lipopolisacárido,porinas que son
proteínas que forman poros en la membrana y permiten el paso de
sustancias hidrofílicas de bajo peso molecular para el espacio
periplásmico.Escherichiacoli,Klebsiella,Salmonella,Legionella,
Enterobacter (carbajal, 2015)
III.3. Clasificación por forma
a. Bacilos: Son las bacterias que tienen forma alargada, similar a un
bastón. La clasificación que tiene que ver con la cantidad de bacilos
combinados. La estructura que tiene dos bacilos en cadena se conoce
como diplobacilo.Si la estructura tiene varios bacilos conectados se
denomina estreptobacilo. E.coli, siguella, salmonella, yersinia,
enterobacter sakazakii.
b. Cocos: Son aquellas bacterias cuya forma es redondeada. La
clasificación que se hace de los bacilos por la cantidad de individuos en
cada estructura también aplica para los cocos. Si la estructura está
formada por dos cocos, ésta se denomina diplococo. Las estructuras con
formas de cadena son llamadas estreptococos, y aquellas que tienen
forma irregular son conocidas como estafilococos.
c. Helicoidales: Estas bacterias presentan forma de espiral, similar a una
hélice. Cuando son rígidas se les denomina espirilos, y cuando son
flexibles se les llama espiroqueta. Hay un tercer grupo llamado Vibrio,
que se caracteriza por no tener forma de espiral, sino curva.
III.4. Contaminación alimentaria con las bacterias
Las bacterias son más conocidas en la contaminación alimentaria, son los
más habituales y los más estudiados. Las bacterias pueden causar
infección e intoxicación. La infección se produce por la ingesta de alimentos
contaminados con bacterias vivas que entran en el huésped y provocan la
enfermedad. La intoxicación, en cambio aparece cuando se ingieren
alimentos que antes se han contaminado con bacterias que producen
toxinas, y estas últimas son las que causan la enfermedad Salmonella,
Campylobacter, Clostridium, perfringens, Bacilluscereus, Staphylococcus
aereus.Listeria, Monocitogenes, Eschericchiacoli.
III.5. Importancia ecológica y económica de las bacterias
Las bacterias son de importancia en la naturaleza. Algunas de ellas
cuentan con una actividad enzimática intensa que puede aprovecharse en
las industrias de fermentación. Las bacterias son los agentes de las
fermentaciones y putrefacciones que transforman las materias orgánicas en
gases y sustancias inertes aptas para reincorporarse al ciclo vital, además
fijan el gas atmosférico, enriquecen el suelo en nitrógeno y de este modo,
proporcionan a los vegetales algunos alimentos inorgánicos que les son
indispensables para el desarrollo.
III.6. Método tinción de Gram
Lugol: Es una disolución de yodo molecular y yoduro potásico en agua
destilada, Se emplea en microbiología en la tinción de Gram para
retener el colorante cristal violeta.
Cristal de violeta: son mezclas de: N-tetra, N-Penta y N-hexametil p-
rosanilinas.se utiliza como colorante para determinar las morfologías
bacterianas para Gram positivo y Gram negativo.
Safranina: La safranina O es un colorante biológico también conocido
como di metil safranina y rojo básico 2, se utiliza en la Tinción de Gram
para proporcionar un color violeta más intenso a las bacterias Gram+ y
tiñe de rosa a las bacterias G-
Método: Se enciende el mechero bunsen y a continuación se esteriliza
el aza de siembra y Se toma una muestra de la colonia dentro del campo
estéril y se ubica en el portaobjetos, luego se tiñe con cristal de violeta, y
se deja en reposo durante un minuto pasado el tiempo se lava con agua
 y se flamea para después teñir con Lugol, durante un minuto se lava
con alcohol-acetona. A continuación se tiñe por última vez con safranina
por un minuto, y se lava nuevamente con agua, finalmente se flamea y
se observa al microscopio este procedimiento se realiza con todas las
muestras. (Reategui, 2018)
III.7. Placas Petrifilm para Recuento de formadores de colonias
Las Placas Petrifilm para Recuento de Aerobios Totales, son un medio de
cultivo listo para ser empleado, que contiene nutrientes del Agar, se utilizan
para el recuento de la población total existente de bacterias aerobias en
productos, superficies, etc. Imagen1:E.coli
Las Placas Petrifilm EC para el Recuento de
E.coli/Coliformes contienen nutrientes de Bilis
Rojo-Violeta, Cerca del 95% de las E. coli
producen gas, representado por colonias entre
azules y rojo-azules asociadas con el gas
atrapado en la Placa Petrifilm EC.
Fórmula para realizar conteo de colonias.
En un cultivo cuando vemos mayor cantidad de
formadores de colonias, en placa petrifilm se selecciona al azar 3 o 4
cuadrados tal como se observa en imagen 1 y luego se realiza los conteos
de dicho cuadros y es dividido entre los cuadros seleccionados y
multiplicado por la cantidad de cuadros existentes en una placa petrifilm y
las unidades en MNPC (Muy numerosos para contar) (Mora, 2018)

cantidad de colonias de los cuadros seleccionados

FM = xcuadros total de petrifilm(
cantidad de cuadros seleccionados
Mnpc)
III.8. Observación microscópica Tinción Gram positivo y negativo

Muestr imagen Tipos de Gram color forma

a
Cultivo cocos

Gram - -

cultivo bacilos
Violeta
Gram + oscuro

cultivo cocos
Gram - Rojo
oscuro

cultivo Se podían
Gram- Morado -rojizo presentar
cocos,
diplococos y
bacilos.
Hongo Tiene forma de
hifas o
micelios
tubulares
Imagen fuente (UNIA- (Reategui, 2018)
Imagen 1.La imagen es visualizada con microscopio a 1.4x/0.1 RP se
observa la cantidad de cocos pero no se visualiza la coloración es
Gram–
Imagen 2.se visualiza a 1.4x/0.1 RP se observa la coloración violeta
oscuro es de Gram +
Imagen 3.se visualiza una coloración rojiza oscura se observa cocos y
otros más a 10x/1.25 RP OIL es de Gram –
Imagen 4. Se visualiza una coloración morado rojiza se podrían
presentar cocos bacilos diplococos es de Gram –,E.coli
 Imagen 5. Se observa de cultivo de hongo y se observa los filamentos
en forma de micelios o hifas a 100x/1.25 RP OIL
IV. Materiales y métodos
IV.1. Materiales
Para esta práctica no se considera materiales de laboratorio, excepto de
laptop, celular y placas de petrifilm (imágenes).
IV.2. Metodología
El docente de la práctica por aula virtual menciono el uso y el manejo de
placas petrifilm y así mismo el recuento de colonias, y para finalizar la
práctica observamos los videos tutoriales y las informaciones de fuentes
bibliográficas etc.
V. Resultados
Las bacterias que dan coloración violeta o azul oscura, se les llama
bacterias Gram positivas y pueden ser uno de ellos: Bacillus anthracis,
Clostridium, Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus.
Las bacterias que dan coloración roja o rojiza se les llama bacterias Gram
negativas y pueden ser uno de ellos: Escherichiacoli, Klebsiella, Salmonella,
Legionella, Enterobacter.
Las bacterias Gram positivas, tienen la pared celular de grosor conformado
90% de peptidoglicano que retiene el cristal de violeta, en cambio las
bacterias Gram negativas está conformado de membrana externa con
proteínas lipopolisacaridos e interno un pequeño de peptidoglicano.
Las placas petrifilm son cultivo con nutrientes de agar, listos para ser
empleados y las marcas establecidas para recuento de colonias.
El método tinción de Gram utiliza los siguientes sustancias químicas: cristal
de violeta, lugol, alcohol acetona y safranina.
VI. Discusiones
(et.al, 3/3/2016)Dentro de su informe plantea que las bacterias tienden a
clasificarse de acuerdo a su pared celular de peptidoglicano, efectivamente
es cierto pero en comparación con el autor (Lopez Arellano , 2010)las
bacterias para su debido clasificación debe presentar una pared celular
sana, caso contrario si sufre daño de la pared u otra cosa se vuelve
Gramnegativo o Gram positivo. Dos autores tienen toda la razón pero para
clasificar se requiere la coloración de las bacterias.
(carbajal, 2015)El método tinción de Gram no es fiable si los medios de cultivo
son pobres en nutrientes, para salir de las falencias revisamos el fuente del
(Reategui, 2018)El método tinción de Gram o esporulado es fiable siempre
y cuando si los cultivos no son tratados con antibióticos ya que se
degradan los peptidoglicanos de pared celular, realmente dos autores
coinciden de alguna forma pero para asegurar el método tinción
mayormente se requiere un medio de cultivo estéril.
(Reategui, 2018)Todo el cultivo tratado con antibióticos químicos como
penicilina mata la presencia de Gram negativa y positiva. Sin embargo
(carbajal, 2015) especifica que las Gram negativas no son efectos con
penicilina, pero Gram positivas mueren con penicilina. Efectivamente las
negativas no mueren por la presencia de lipopolisacaridos en cambio
positivas muere ya que el antibiótico bloquea la formación de enlaces
peptídicos.
Según (Mora, 2018) Las placas petrifilm son medios de cultivos listos para
realizar la incubación microbiana y el conteo total de colonias propagadas
en el medio. En mi opinión personal estoy de acuerdo que las placas
petrifilm son cultivos ya listos para cultivar microbiana, sin embargo muchas
veces no se llega al conteo total de colonias por la cantidad de
sobrepoblación. Bajo estos problemas según el ingeniero D. Estacio
mencionaba que los microrganismos pobladas en mayor cantidad, muchas
veces no son contables y para ello se aplica una formula Mnpc.
VII. Conclusión

Esta práctica damos por concluido cumpliendo con los objetivos propuestos, en
la página de resultados hemos resaltado las clasificaciones de bacterias según
las coloraciones con el cristal de violeta, así mismo las diferencias de Gram
negativas y positivas por el contenido de peptidoglicanos. Las bacterias
negativas y positivas se mencionan en dicha página, así mismo se ha
investigado las sustancias químicas que se utiliza y por último la manera de
realizar el conteo de las colonias en un cultivo, todas informaciones y los
resultados son obtenidos de los informes experimentales e investigaciones
realizadas como se cita en el marco teórico, de esta manera la practica queda
por concluida.

VIII. Bibliografía

 ANONIMO. (2019). IDENTIFICACION DE BACTERIAS TINCION DE GRAM.

practica, UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA, cuenca.

 carbajal, T. a. (2015). Identificacion de microorganismos con base en

tecnicas Bacteorologicas tincion de gram. INFORME EXPERIMENTAL,
DGETI, mexico .

 Mora, x. (1 de 5 de 2018). vetacunicultura-patologia. Recuperado el 11 de 02

de 2021, de https://seleccionesavicolas.com/pdf-files/2012/2/6536-
diferenciando-bacterias-gram-y-gram.pdf

 Reategui, L. c. (2018). OBSERVACION DE BACTERIAS GRAM POSITIVO

Y GRAM NEGATIVO EN EL LABOARTORIO DE MICROBIOLOGIA.
practica, universidad nacional intercultural de la amzonia, ucayali, pucallpa.