UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRES

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACEUTICAS Y BIOQUIMICAS

CARRERA DE BIOQUIMICA

CATEDRA: BIOTECNOLOGÍA
TEMA: CULTIVO CELULAR
DR: …Teresa Alvarez………………….

DEFINICION: ………………………………………………………

Soporte
Tenemos el microscopio de fluorescencia que a
EL LABORATORIO DE CULTIVO CELULAR
la larga en realidad ha sido reemplazado por el
La ingeniería de tejidos en general como para
microscopio de fluorescencia con focal y
poder entender por qué es fundamental esta
últimamente tenemos el de escaneo por láser y
ingeniería o esta metodología de cultivo celular
fluorescencia, entonces la observación ha
y las diversas aplicaciones que tiene en cuanto
mejorado en el sentido de que podemos tener
por ejemplo a la producción de anticuerpos al
imágenes tridimensionales y no tan planas como
cultivo de virus y en general también para ver la
estamos viendo ahora sino que además
fisiología y el metabolismo celular.
podemos ver un poco la conformación de tejidos
Entonces estábamos por empezar a describir un
en este caso es muy importante para ese
poco las herramientas de laboratorios
estudio.
necesarias si quieren para establecer un cultivo
celular, y ahí es donde les había dicho que no
era cosa del otro mundo, que evidentemente se
requieren algunos equipos sofisticados pero que
fundamentalmente se necesita de un ambiente
mejor (por ej. si tiene una presión negativa, ¿qué
quiere decir esto?, que esté provisto de filtros
hepa de los filtros que se utilizan en las cabinas
de flujo laminar para evitar justamente que haya
contaminaciones internas y en lo posible
también tratar de entrar lo más protegidos más
que todo para no contaminar las muestras)
entonces es una condición que el laboratorio del Campana de flujo laminar
cultivo celular guarde las restricciones de un Un nivel de seguridad 2, es ideal salvo que
laboratorio tipo 2 o tipo 3 de niveles de seguridad estemos trabajando con cultivos de virus y de
para justamente asegurar la calidad del trabajo. virus patógenos entonces ahí es donde se exige
Las imágenes fluorescentes refrigerantes nos que la cabina de flujo laminar sea de nivel de
permiten identificar si quieren el borde de cada seguridad 3 y lo mismo el ambiente donde se va
una de las células, además uniones celulares. atrabajar en el que tener sí o sí presión negativa
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y además tienen que entrar disfrazados líquido y obviamente los van conservando,
prácticamente como astronautas con doble traje preservando etc.
de seguridad más de traje externo la máscara
con las dotación de oxígeno específica etcétera
entonces en ese caso ya se manejan entre los
niveles 3 y 4 ese tipo de ropa o ese tipo de
indumentaria.

Las canastillas donde se pueden introducir las

Espacios fríos
En todo como en todo el laboratorio de
preservación si quieren donde incluso los
microorganismos nosotros guardamos a -20, -
40, -80 grados, pero en el cultivo celular es
indispensable el nitrógeno líquido que
habíamos dicho que puede preservar a -196
grados entonces estos son tanques de nitrógeno
líquido y les ha mostrado alguna vez cómo eran
estos donde se insertan pajuelas o se insertan
tubos de preservación que van en unas
canastillas y se saca como cucharón (es
prácticamente de la del termo de de nitrógeno
líquido)
En los laboratorios que por ejemplo con el
nitrógeno líquido hacen preservación de
gametas con reservación de embriones se hay
preservación de semen y preservación de
óvulos y también preservación de embriones
entonces allí dos o tres laboratorios de células
madre que se encargan justamente de este tipo
de preservación y también las clínicas que
realizan la fertilización in vitro sí o sí tienen una
área un laboratorio de manipulación de en
óvulos y espermatozoides no porque hacen la
fertilización in vitro con microscopios con
manipulación manual sin por inyección entonces
todos estos tienen estos termos de nitrógeno
tachuelas y cada canastilla tiene un agarrado de
diferente color como para que puedan identificar
qué tipo de muestras están en ese mismo
Estos termos parecen lecheras y son bastante
prácticos
FACTORES CRÍTICOS
No biológicos
Primero el orden, la limpieza crucial incluso la
limpieza de paredes de techos, y la vestimenta
estricta.
Biológicos
Los principales agentes contaminantes entre
bacterias hongos y levaduras y los
micoplasmas, porque como mi coplas los
micoplasmas tienen vida intracelular
prácticamente no se los ve cuando uno está
cultivando estas líneas celulares y después de
un tiempo empiezan los problemas no cuando
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cambian la fisiología o el comportamiento de las
líneas celulares varía o el ph del medio cambia
porque ha habido un estrés celular etc.
En hongos y levaduras por lo general son
debidas a nosotros aparece cándida, muchas
veces en los medios eso ya es demasiada
negligencia.
Habíamos hablado que cambia el metabolismo
celular por ende nos damos cuenta cuando ha
cambiado el ph del medio por lo general porque
hay un sufrimiento. El rendimiento si quieren lo
que estábamos buscando si estábamos
produciendo anticuerpos.
Generalmente lo primero que tenemos que
hacer es obviamente que verificar si el estudio
que se va a conducir en las células tumorales
tiene el mismo comportamiento in vitro e in vivo
crucial el no puedo asumir que las
características que estoy viendo in vitro pueden
ser extrapolables quizás en vivo o viceversa
porque hay condiciones muy específicas en los
dos tipos de cultivo no en el comportamiento
celular sin embargo lo que se trata es que el
comportamiento in vitro imite en un 100%. El
comportamiento individuo con lo cual ya les he
dicho no esimportante ver las características del
medio del ph de la temperatura del más que
todos los requerimientos nutricionales son los
que van a determinar este comportamiento
similar al in vivo. Y la otra es que el hecho que
vayamos a estudiar por ejemplo drogas
anticancerígenas veamos de hacer reemplazos
genéticos tienen que ser hechos si quieren en
estas líneas celulares tumorales.
Cuando vamos a estudiar células cancerígenas,
tenemos que pensar primero en qué podemos
tener un exceso de células porque muchas
veces ustedes saben bien hay una división
anormal no de estas células y puede haber una
proliferación exacerbada, por lo tanto hay una
limitación de física. Es donde empiezan los
problemas porque ya no hay una suficiente
superficie de desarrollo y empiezan a
autolimitarse
La otra característica es que debemos contar
con que el fenómeno de la metástasis va a hacer
que posiblemente nuestra primera línea el
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celular obtenida, por razones de la división

exacerbada puedo incluso cambiar mutar
mucho más y tener una diferente fisiología y
morfología a la que inicialmente habíamos visto,
entonces siempre hay que tomar en cuenta que
la metástasis predomina si quiero determinar y
una influencia crucial en las células tumorales.

APLICACIONES EN OTROS CAMPOS

Por ejemplo si nosotros vemos las células
normales versus las células tumorales en
cultivos, las células normales generalmente
forman la mono capa muy muy prolija al
microscopio electrónico se pueden ver que
guardan la continuidad de turgencia, es decir se
ven células bastante o fisiológicamente sanas y
las células tumorales por el contrario, se
observan células polinucleadas, células que
tienen diferentes morfología así que cuando
crecen en el cultivo celular por lo general sobre
la mono capa que se haya establecido de
células normales, puede empezar a observarse
el crecimiento de como un clan o una
protuberancia, lo que es debido a la alta
proliferación celular.
La aplicación en otros campos del cultivo celular,
hemos visto que es importante para la biología.
Virología: Necesitamos aislar y multiplicar virus
muchas veces para la producción de vacunas o
para estudios de antivirales, vemos también si
vamos a poder describir nuevos virus y
principalmente también porque queremos ver la
actividad de algunos virus oncogénicos.
Para ver de desarrollar transplantes o
injertos: les había hablado que el inicio de todo
esto ha sido el cultivo de piel ya sea sea el
cultivado epitelio y ha sido posible el reemplazo
de las mismas células de una persona que por
ejemplo ha sufrido quemaduras se puede ser
una proliferación in vitro de sus células formando
un tejido de reemplazo un injerto. También se ha
tenido bastante éxito como hemos visto el cultivo
de las células madre y esto es el boom si quieren
hoy en día y se está viendo ya en nuestro medio
hay muchos colegas principalmente en santa
cruz que trabajan con células madre,
principalmente en la criopreservación de estas.
Luego tenemos la generación de los islotes
pancreáticos y de hepatocitos, también a través
del cultivo celular, pero en nuestro medio

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todavía no hay este desarrollo, el único
desarrollo de nuestro medio es el cultivo de
células pluripotenciales las células.
Fertilización in vitro: por parte de la
criopreservación y luego obviamente la
manipulación de estas células para hacer la
fertilización y luego la inserción sería ideal.
Producción de transgénicos: que ya es algo
en todo lugar tiene sus pros y sus contras pero
pensamos más de los pros porque podríamos
tener por ejemplo mejoramiento del ganado a
través justamente de la producción de
transgénicos un ganado con mayor cantidad de
musculatura de carne, en ganados que ven una
buena calidad de leche o mayor cantidad de
leche, lo mismo en los cultivos vegetales del
mejoramiento ya te tenemos soya transgénica y
el arroz transgénico. La producción de los
transgénicos en ingeniería genética es
fundamental para el desarrollo del de un país y
fundamental para la para responder a la política
del desarrollo sostenible a no más hambre
Terapia génica: los anticuerpos monoclonales
cómo es que se producen qué son cómo
funciona sin dejar de lado y hablar un poco de
quienes en su momento han logrado producir in
vitro este tipo de anticuerpos a través de que
otra vez de la técnica de hibridación somática,
es decir, han unido dos tipos de células una
cancerígeno y otra no y han hecho que
obviamente estás este híbrido me produzca una
gran cantidad de anticuerpos, porque al ser un
híbrido mantener parte de una célula
cancerígena hace que haya una proliferación
exacerbada
Los anticuerpos monoclonales son aquellos
que se van a producir por células que vienen de
un solo clon de una sola célula si quieren a partir
a partir la división de las células hijas y esa
primera línea es un primer clon de esa célula son
todas iguales en estructura y en función y
entonces producen estos anticuerpos a través
de que han sido reconocidos por un antígeno
para qué todos todos los anticuerpos que se
generen tengan la misma afinidad para ese.
Primero si yo tengo este antígeno y ustedes
tienen digamos que es una bacteria ya tienen
determinantes antigénicos y tienen lugares
super antigénicos que son los epitopes o
epítopos y tienen supónganse cuatro tipos de
determinantes antigénicos, entonces inyectan el
antígeno esta bacteria o una suspensión
bacteriana a un animalito y esperan que
obviamente haya una generación la respuesta
inmune del animal frente y sencilla. lo que se
hace luego es recuperar las células del vaso y
ustedes van a tener una la presencia de
plasmáticas luego van a unir estas células
recuperadas con células de mieloma, entonces
lo que se hace es inducir a la formación de
híbridomas (las células que tienen o sea se han
unido hibridación entre una célula plasmática y
una célula de mieloma), esto es híbrido más
luego pueden ser si quieren seleccionados de
acuerdo a que hayan desarrollado. Lla afinidad
por un determinado epítope del antígeno van a
haber híbrido más que han desarrollado
anticuerpos contra el epitope 1, anticuerpos que
hayan desarrollado contra el epitope 2 y así
sucesivamente.
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Entonces podemos seleccionar cada uno de
estos híbridomas y lo que se hace es una la
liberación y producción de anticuerpos que sean
específicos para cada uno de estos epítopes.
Entonces toda esta línea celular se vuelve
monoclonal, porque ha generado solamente un
anticuerpo para un epitope o anticuerpos para
un tipo de epitope de este antígeno que puede
tener cuatro.
Anticuerpos policlonales o suero policlonal:
si el monoclonal venía de un solo clon y era
específico para un solo epitope, el policlonal
será una colección de una acumulación de
anticuerpos que pueden ser específicos para
diferentes epitopes. Está la mezcla entonces si
el ratoncito ha sido inoculado con los con el
antígeno con los cuatro, ha desarrollado su
respuesta inmune, se aísla el suero del ratoncito
y lo que tenemos es un suero policlonal, este
suero policlonal justamente tiene la colección de
todos los anticuerpos anti todos estos epítopes
y entonces yo puedo usar este suero anti anti
suero policlonal para si quieren para inmunizar
o para otro tipo de estudios.
Ventajas y deventajas de anticuerpos
monoclonales y policlonales
Si yo tengo los anticuerpos monoclonales la
ventaja es que son altamente específicos,
puedo esperar que haya una reacción cruzada
entonces con lo cual es una unión tradicional.
La desventaja es que es compleja la producción
tiene muchos pasos y hoy en día estos pasos
pueden ser muy caros como habíamos visto
dependiendo de cuántos sistema estado que
general y obviamente ahí es donde viene el
cuello de botella son excelentes, altamente
específicos, son reproducibles.
Los anticuerpos monoclonales, como hay la
mezcla de diferentes anticuerpos a veces no se
puede reproducir lo mismo que quien le dice que
en un momento dado puede tener en esta
mezcla la abundancia de anticuerpos contra el
epitope 1 a diferencia de los otros o en algunos
casos el anticuerpo 3 a diferencia de los otros
entonces es muy variable con lo cual no puedo
asegurar un mayor productividad en la
producción ya y las cantidades que se producen
son limitadas porque limitadas porque
obviamente dependen de cuántos animales de
experimentación en inoculado para recuperar la
cantidad de suero policlonal.
PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS
MONOCLONALES
Depende de la inmunización de los animales
que tiene que ver un plan de inmunización
inyecta del antígeno una sola vez sino que hay
que darle como nosotros una segunda dosis una
tercera dosis hasta que genere una respuesta
ideal. Luego como habíamos visto extraer el
vaso recuperar los plenocitos y luego hacer los
híbridomas conjuntamente con las células de
mieloma, luego hay selecciones por medios
específicos y se hace un aislamiento clonado
esto se hacía por proliferación celular.
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El aislamiento lo que habíamos visto de separar
en cada uno de estos hibridomas como clones
para la producción de cada uno de estos
anticuerpos, entonces esa separación se la va
viendo por ejemplo por fluorescencia al ver tal
célula que se está uniendo a tal.
Luego tenemos la amplificación específica de
esta línea celular y por último podemos congelar
toda esa línea celular para mantenimiento la
criopreservación y esto ya tenemos las líneas
luego solamente proliferar las y esperar que
produzcan los anticuerpos monoclonales
específicos y esa recuperación luego se hace
por la obtención del quieren del del caldo de
cultivo del medio de cultivo que alimentan las
células donde estaban presentes los
anticuerpos, siempre y cuando se haya
generado y han estado al nivel extracelular o
bien en algunos casos hay que hacer un análisis
de una monocapa celular para poder recuperar
los anticuerpos.
El paso más crítico es la purificación, tanto la
inmunización o la generación, purificación de
esas proteínas de anticuerpo específico que eso
puede encarecer los costos como en algún
momento hemos visto no porque tienen hay que
separarlos quizás por cromatografía de
intercambio iónico o por cromatografía de peso
molecular o llamadas filtración en gel o inmuno
cromatografía si no que son específicas
Es interesante pensar que tengo que recuperar
principalmente cuando se recuperan las células
del bazo, tengo que asesorarme de que haya
una buena población de linfocitos B porque son
esos los linfocitos que van a producir
anticuerpos.
Fusión-hibridación: para formar el híbridoma,
entonces teníamos los plenocitos
fundamentalmente que sean linfocitos b,
tenemos a las células de mieloma y lo que se
hace es una fusión química o física. Cuando va
a ser una fusión química se hace un tratamiento
de ambas líneas celulares con polietileno y coll,
puede infectarse con un virus como el virus
sendai que es que facilita si quieren también la
apertura de membranas y la liso destina también
es otra herramienta para poder hacer esta
apertura, sin embargo existe una herramienta
mucho más fácil que es la el extrafusión o
electroporación, entonces primero se abren
pequeños poros de las membranas y luego
justamente por pulsos eléctricos es qué se abre
las membranas hay una solución de continuidad
al reconocimiento de membrana membrana y es
que se empiezan por un lado a fusionar entre
ellos no entre ellos mismos pero también
tenemos por otro lado la fusión de los
esplenocitos con los centros de mieloma. Y
como observarán ustedes es como que si
hubiesen perdido su capa y luego qué ocurre
hay una integración una fusión de núcleos para
dar lugar a una sola.
La selección más específica es en un medio
hat, se llama hat porque tiene hipoxantina,
aminopterina y timina. En realidad es muy
interesante los pasos que siguen para
justamente poder seleccionar las células.
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Cuando se hace el clonado por ejemplo les
decía para ello determinar dónde están las
células que por ejemplo producen los
anticuerpos anti antígeno.
Tengo que hacer un screening en una micro
placa y poder ver no es cierto entonces ahí es
donde tengo que serlo por alguna característica
típica de la célula o por fluorescencia en la que
pueda discernir cuál de éstas es la qué la que
tiene la fluorescencia específica y es mi célula
clave y luego puedo, si quieren hacer una
segunda o tercera screening para cerciorarme a
través lo que está expresado en anticuerpo le
colocó el antígeno y luego puedo reconocer
dónde establecer un específicamente por un anti
anticuerpo lo ha hecho por ELISA y ya puedo
tener como un sándwichito entre los anticuerpos
producidos por estos linfocitos, el antígeno o el
epitopo que reconocía en específico y luego un
anticuerpo que se va a unir al sándwich es lo va
a formar el sándwich entonces ya puedo
identificar dónde está específicamente mi
células de interés y la voy a proliferar, la voy a
congelar.
AMPLIFICACIÓN
sí ahora cuando tengo que hacer un estudio
mayor les decía yo ya puedo descongelar si
quieren me creo tubo y voy a hacer la
producción primero a pequeña escala donde
puedo utilizar estas botellas y un medio
específico, entonces ahí la idea es que
justamente lo que les decía que el anticuerpo
que se ha producido se encuentra en el
sobrenadante del cultivo con lo cual solamente
recuperó el sobrenadante lo purifica a partir de
ello como ya es solamente una proteína
específica quizás los vasos de purificación son -
y ya puedo tener mi monográfico y listo y a gran
escala les decías utilizar los reactores
específicos donde ya puede recuperar gracias a
concentraciones de miligramos e mililitros y
grandes volúmenes de medio, entonces como
tendrían que ser los rectores para este fin
Los biorectores utilizados para el cultivo celular
a mayor escala esta son las botellas roller
Aunque son parecen frascos normales comunes
y corrientes pero pueden tener fíjense como en
este caso este tipo de láminas donde
conjugaciones que aumentan la superficie de
producción porque en cada una de estos
corrugados es que se va a establecer la línea
celular y ahí puedo sembrar las células. Lo
importante es que estas botellas ya tienen que
estar en un séiquer de este tipo que permite que
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vayan rodando sobre su propio eje y de esa
manera el medio de cultivo alimente toda la
superficie celular que estamos buscando que
produzca los anticuerpos. En toda esta
superficie y toda la superficie interna están
creciendo las células monoclonales y
produciendo por ejemplo el anticuerpo
monoclonal
Otro reactor importante son el fermentador
común y corriente que ustedes han utilizado o
han visto alguna vez les hemos explicado las
partes, sólo que aquí la idea de estos reactores
es para cultivar células en suspensión, por
ejemplo las células madre en suspensión en las
células madre totipotenciales no guardan una
solución de continuidad como las otras que
forman tejidos verdaderos no ven eso
acuérdense entonces para este caso es también
utilizar este tipo de reactores, sin embargo para
cultivo de tejidos vamos a poner aquí tenemos
solamente los reactores nuevos cultivos celular
La caracterización de los anticuerpos se hacía
a través de Elisa, podía purificarse por
inmunoprecipitación en gel también hemos visto
y puedo reconocer si quieren el epítope
específico con otros métodos como elisa
Westernblot.
APLICACIONES DE LOS BIOLÓGICOS están
en las terapias y en las aplicaciones terapéuticas
en las terapias oncológicas, en la terapia anti
rechazo de transplantes por ejemplo y en las
enfermedades autoinmunes entonces y ahí hoy
en día también están antivirales específicos lo
cual su aplicación es amplia fíjense en donde es
súper necesario y las otras aplicaciones
diagnósticas están dirigidas poder terminar
digamos antígenos específicos o principalmente
poder determinar marcadores moleculares para
determinar cánceres o alguna tendencia a
enfermedades infecciosas o marcadores
involucrados en enfermedades autoinmunes
entonces hasta ahí es donde las aplicaciones
también son amplias y generar este tipo de
herramientas diagnósticas en nuestro medio
La importancia de considerar cuando uno tiene
un inmunoterapia qué tipo de origen han tenido
estimulo terápicos si es marino quimérico
humanizado o humano para justamente ver su
efectividad sus acuérdense solamente por ver la
terminación de la del nombre del inmunoterapia
para saber de qué tipo es los vayan practicando
por ejemplo aquí nos daba el reduce a rituximab
las tres bastante famosos nuestro medio para el
tratamiento del cáncer justamente y el por
ejemplo de los las leucemias y linfomas.
Otro conocido adentro de este ejemplo el
infliximab el palivizumab, se utiliza si quieren
como una profilaxis para algunos virus
respiratorios especialmente en pacientes
alérgicos. La terminación zumab nos da la idea
directa de que es un anticuerpo humanizado y
así ustedes pueden practicar con estos nombres
y muchos otros en la web para justamente
acordarse de cuál es el origen.
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