Universidad de Buenos Aires

Facultad de Farmacia y Bioquímica

Departamento de Química Analítica y Fisicoquímica
Cátedra de Fisicoquímica

Tesis de Doctorado

“Metabolismo de óxido nítrico, anión superóxido

y peroxinitrito en mitocondrias de corazón.
Participación del complejo I y de la mtNOS en
mecanismos de disfunción mitocondrial”

Silvina Sonia Bombicino

Directora
Dra. Laura Beatriz Valdez

2015
"A veces sentimos que lo que hacemos es tan solo una gota en el mar,
pero el mar sería menos si le faltara una gota"

Madre Teresa de Calcuta

A la Memoria de mis abuelos Lina y Arturo
A mis padres Ana y Horacio
A Santi
Agradecimientos

AGRADECIMIENTOS

A mi directora de Tesis, la Dra. Laura Beatriz Valdez, quien me acompañó y me enseñó

durante todo este camino. Por el tiempo dedicado, por guiarme y ayudarme en mi
formación profesional. Por permitirme ser libre en el trabajo diario en el laboratorio. Por
su enorme generosidad y por las oportunidades que me dio durante mi Tesis, permitiendo
mi desarrollo profesional y personal. Por los momentos compartidos diariamente en el
laboratorio y en los Congresos científicos a los que tuvimos la oportunidad de asistir.

A mi hermano de laboratorio y de Tesis, Darío Iglesias, a quien considero una persona

excepcional, una mente brillante y sobre todo un gran amigo. Con quien he compartido
muchas horas de experimentos, interesantes debates y discusiones de resultados, y viajes
a Congresos llenos de anécdotas. Por su ayuda constante en estos años, no solo a nivel
científico sino también personal, por su escucha y por los incontables momentos vividos.

A la Dra. Tamara Zaobornyj por acompañarme en mis inicios en el Doctorado, y

enseñarme la técnica de aislamiento de mitocondrias. Por su siempre útil aporte a la hora
de escribir publicaciones en inglés. Por cada día compartido en el Laboratorio 3 y en los
Congresos.

Al Dr. Alberto Boveris, por su gran sabiduría, por sus opiniones y por la oportunidad de
aprender. Recuerdo sus teóricos de Fisicoquímica, en los que siempre había alguna
anécdota divertida y algo de historia que los hacía más interesantes, y gracias a quién
ingresé como ayudante en la cátedra de Fisicoquímica.

A la Facultad de Farmacia y Bioquímica, por la formación que me brindó como estudiante

de grado y posgrado, y por proporcionarme un lugar de trabajo.

A la Universidad de Buenos Aires y al CONICET, por las becas que me han otorgado para
el desarrollo de esta Tesis de Doctorado, y por el financiamiento de los proyectos que
conformaron el presente trabajo.

Al grupo de trabajo del Dr. Gelpi; Verónica D’Annunzio, Martín Donato y Bruno Bochholz,
por llevar a cabo el modelo de atontamiento miocárdico, que forma parte de los
resultados del capítulo II de esta Tesis, y por las mediciones de la función cardíaca en ratas
que conforman parte de los resultados del capítulo III.

Al Dr. Cesar Fraga y la Dra. Susana Puntarulo por brindarme el espacio físico dentro de
Fisicoquímica para realizar mi Trabajo de tesis.

i
Agradecimientos

A todo el plantel de la Cátedra de Fisicoquímica: Silvia, Mónica, Vir, Silvia Lores, Anita,
Analía, Juanita, Andre, Eli, Gabriela, Paula, Nati, Barbie, Vale, Cori, Julián, Paulita, Tami V.,
Laurita, Ana, Gaby y Nico. Con los que compartí muchos años de docencia, con algunos
desde que entré a la cátedra como ayudante de segunda, aún antes de empezar mi Tesis
de Doctorado. Por tantas horas compartidas diariamente, por las charlas y debates de los
almuerzos y por el esfuerzo que pone cada uno para hacer que sigamos adelante con la
docencia.

A mis compañeras de Bioquímica y a partir de ahí, amigas de la vida: Mori, Clau, Agus,
Vani, Meli y Agus. Por ser fundamentales en mi vida. La carrera de Bioquímica hizo que
nos conozcamos, y allí nos dimos cuenta cuán parecidas somos. Con quienes además de
compartir el amor por la ciencia y la investigación, compartimos momentos inolvidables e
importantes en nuestras vidas, vacaciones, fines de semana en el club Bertres, juntadas
llenas de comida, películas y risas.

Al "eje del bien": Virginia Vanasco, Darío Iglesias, Timoteo Marchini, Natalia Magnani,
Mariana Garcés, Romina Lasagni Vitar y Luciano Guerra. A pesar de pertenecer a distintas
cátedras y laboratorios, fueron mis compañeros de Tesis. Por su ayuda, por las discusiones
de resultados e intercambio de técnicas que han enriquecido mi conocimiento. Por los
momentos compartidos, por las tardes de charlas y meriendas, y por su amistad.

A Ceci Cimolai, una gran amiga, con quién cursé la carrera de Bioquímica, empezamos
como ayudantes en Fisicoquímica y luego el Doctorado. Porque a pesar de la distancia y
que el tiempo pase y no nos veamos tanto, seguimos compartiendo muchas cosas. Por
tantos mates y charlas, por abrirme las puertas de su casa. Por su amistad.

A mis hermanos, Analía y Mariano, a quienes quiero con todo mi corazón y admiro.
Quienes me apoyaron y me acompañaron siempre. A mis cuñados, Any y Ale, quienes
estuvieron desde mis inicios en la carrera de Bioquímica. Y a los cuatro, por traer al mundo
a mis sobrinos, Fran, Bruni, Nachi y Felipe, unas personitas hermosas, inquietas,
divertidas, que son el sol de mi vida y por quienes vuelvo a ser niña cada vez que juego
con ellos.

Un agradecimiento especial a mi hermano Mariano por haberme ayudado con el diseño

de las carátulas.

A mis abuelos Lina y Arturo, quienes este año se fueron "hasta siempre". Porque se cuán
orgullosos hubiesen estado de ver el final de mi Tesis. A pesar de que no entendían bien lo
que hacía durante el Doctorado y en el laboratorio, sabían que me seguía formando, y eso
los hacía felices. Por ser unos abuelos maravillosos e inolvidables.

ii
Agradecimientos

A mis padres, Ana y Horacio, a quienes amo. Quienes siempre fueron un pilar importante
en mi vida, que me criaron con mucho amor, me enseñaron, me guiaron, me formaron
como persona y me dieron la libertad de elegir mi camino. Por todos los esfuerzos que
han hecho y siguen haciendo por mis hermanos y por mí. Por brindarme su apoyo, por
acompañarme siempre y alegrarse por mis logros.

A Santi, mi amor, el compañero de mi vida, con quien tengo muchos proyectos por
delante. Por apoyarme incondicionalmente en mis decisiones y en esta carrera. Por darme
fuerzas para seguir adelante y hacerme ver los aspectos buenos de la vida. Por estar
siempre, en los buenos momentos y en los momentos difíciles que nos han tocado vivir.
Por su confianza en mí y su admiración. Por compartir cada uno de nuestros días.

Silvina Bombicino

iii
Publicaciones

PUBLICACIONES

Los resultados presentados en esta Tesis se hallan parcialmente incluidos en los

siguientes trabajos científicos:

1. Complex I syndrome in myocardial stunning and the effect of adenosine

Valdez LB, Zaobornyj T, Bombicino S, Iglesias D, Boveris A, Donnato M,
D’Annunzio V, Buchholz B, Gelpi R. Free Radical Biology and Medicine. 51: 1203-
1212, 2011.
2. Mitochondrial dysfunction in the diabetic heart
Bombicino SS, Iglesias DE, Rukavina Mikusic IA, Boveris A, Valdez LB. Biocell.
Enviado, Septiembre 2015.
3. Regulation of heart mitochondrial nitric oxide synthase (mtNOS) by oxygen
Valdez LB, Zaobornyj T, Bombicino SS, Iglesias DE, Boveris A. En “Mitochondrial
Pathophysiology” (Ed. Cadenas S, Palau F), Transworld Research Network, Kerala,
India. Pp 29-42, 2010.

Además, durante el período de ejecución de mi Doctorado, participé en los

siguientes trabajos de investigación y revisiones:

4. Nitric oxide interacts with mitochondrial complex III producing antimycin-like

effects
Iglesias DE, Bombicino SS, Valdez LB, Boveris A. Free Radical Biology and
Medicine, 89: 602-613, 2015.

5. Thioredoxin-1 attenuates ventricular and mitochondrial post-ischemic

dysfunction in the stunned myocardium of transgenic mice
Perez V, D´Annunzio V, ValdezLB, Zaobornyj T, Bombicino SS, Mazo T, Sadoshima
J, Longo Carbajosa N, Gironacci MM, Boveris A, Gelpi RJ. Antioxidants and Redox
Signaling. En revisión, Noviembre2015.

6. Superoxide and hydrogenperoxideproductionsby NO-inhibitedcomplex III

Iglesias DE, Bombicino SS, Boveris A, Valdez LB. Biocell. Biocell. Enviado,
Septiembre 2015.

7. Nitric oxide metabolism in heart mitochondria

Zaobornyj T, Iglesias DE, Bombicino SS, Boveris A, Valdez LB. Biocell. Enviado,
Septiembre 2015.

iv
Abreviaturas

ABREVIATURAS

HO• radical hidroxilo

ADP difosfato de adenosina
ATP trifosfato de adenosina
BH4 tetrahidrobiopterina
BHT butihidroxibutileno
BSA seroalbúmina bovina
CaM calmodulina
CN- cianuro
CO monóxido de carbono
CoQ1 coenzima Q1
CuZn-SOD cobre,zinc superóxido dismutasa
DiOC6 ioduro de 3,3’-dihexiloxacarbocianina
DNP 2,4-dinitrofenol
DNPH 2,4-dinitrofenilhidrazina
+dP/dtmáx máxima velocidad de ascenso de la presión intraventricular
DTT ditiotreitol
E escopoletina oxidada
Eº´ potencial de reducción estándar
EDTA ácido etilén-diaminotetracético
EGTA ácido etilen glicol-bis(-amino-etileter)-N,N,N´,N´-tetracético
EH2 escopoletina reducida
eNOS óxido nítrico sintasa endotelial
ETPH Partículas submitocondriales fosforilates (del inglés electron transfer
phosphorilating particles - Mg2+)
FAD(H2) flavina adenina dinucleótido (reducida)
F-CCCP carbonilcianuro-p-trifluoremetoxi-hidrazona
FMN(H2) flavina mononucleótido (reducida)
FMNH• semiquinona de la flavina mononucleótido
GCs guanilato ciclasa soluble
GMPc guanosina 3´,5´-monofosfato cíclico
GLUT-4 transportador de glucosa tipo 4
GPx glutatión peroxidasa
GR glutatión reductasa
GSH glutatión reducido
GSSG glutatión oxidado
H+ protón
H2O2 peróxido de hidrógeno
HbO2 oxihemoglobina
HEPES ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N´-etanosulfónico
HO- anión hidroxilo
HRP peroxidasa de rábano rusticano
iNOS óxido nítrico sintasa inducible

v
Abreviaturas

L-NAME Nw-nitro-L-arginina metil éster

L-NIO N-iminoetil-L-ornitina
L-NMMA Lw-monometil-L-arginina
L-NNA Nw-nitro-L-arginina
mCCCP carbonilcianuro-m-clorofenilhidrazona
MDA malondialdehído
metaHb metahemoglobina
Mn-SOD manganeso superóxido dismutasa
MSHP Solución amortiguadora conteniendo: manitol 0.2 M, sacarosa 0.07 M,
Hepes 0.55 mM y KH2PO4 / K2HPO4 100 mM, pH 7.40
MST Solución amortiguadora conteniendo: manitol 0.23 M- sacarosa 0.07 mM-
Tris-HCl 30 mM, pH 7.50
MSTE Solución amortiguadora conteniendo: manitol 0.23 M - sacarosa 0.07 M -
Tris-HCl 10 mM- EDTA 1 mM
mtADN ADN mitocondrial
mtNOS óxido nítrico sintasa mitocondrial
mtTFA factor de transcripción mitocondrial A
nNOS óxido nítrico sintasa neuronal
NAD(P)+ nicotinamida adenina dinucleótido (fosfato) forma oxidada
NAD(P)H nicotinamida adenina dinucleótido (fosfato) forma reducida
Na número de mitocondrias por m2
NaN3 azida sódica
NAO naranja de nonil-acridina
Nmi densidad numérica mitocondrial
NO óxido nítrico
NOS óxido nítrico sintasa
NRF-1 factor respiratorio nuclear 1
NRF-2 factor respiratorio nuclear 2
O2- anión superóxido
ONOO- anión peroxinitrito
PBS Solución amortiguadora compuesta por KH2PO4 15mM, Na2HPO4 0.08 M,
NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM pH 7.40
PDVI presión desarrollada por el ventrículo izquierdo
PDFVI presión de fin de diástole del ventrículo izquierdo
PGC-1α coactivador 1α del receptor activador γ de la proliferación peroxisomal
Pi fosfato inorgánico
PPC presión de perfusión coronaria
Prx peroxirredoxina
RET flujo reverso de electrones
ROO• radical peroxilo
ROOH hidroperóxidos de alquilo
SDS dodecil sulfato de sodio
SMP Partículas submitocondriales fosforilates (del inglés submitochondrial
phosphorilating particles)
SPM fracción post-mitocondrial

vi
Abreviaturas

STE Solución amortiguadores compuesta por: sacarosa 0.25 mM, Tris-HCl

5 mM y EGTA 2 mM, pH 7.40
STE2 Solución amortiguadores STE adicionada con BSA 0.5% (p/v), MgCl2 5
mM, ATP 1 mM y 2.5 U. ml-1 de proteasa bacteriana tipo XXIV, pH 7.50
STH Solución amortiguadora conteniendo: sacarosa 0.67 M - Tris-HCl 50 mM-
Histidina 1 mM, pH 8.00
STZ estreptozotocina
TCA ácido tricloroacético
TEMED N, N, N, N´-tetra-metil-etilendiamina
Trx tiorredoxina
TTC cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio
UQ ubiquinona o Coenzima Q
UQH• ubisemiquinona, semiquinona de la ubiquinona
UQH2 ubiquinol
VDAC canal de aniones dependiente de voltaje
Vmi densidad volumétrica mitocondrial
XO xantina oxidasa

Δp fuerza protón-motriz o potencial electroquímico

ΔpH gradiente de pH
Δ potencial eléctrico
ΔG energía libre de Gibbs
ΔG°’ energía libre de Gibbs estándar
SDS-PAGE electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes
Km constante de Michaelis-Menten
k´ constante cinética
rpm revoluciones por minuto

Unidades de Concentración
M molar
mM milimolar (10-3 M)
M micromolar (10-6 M)
nM nanomolar (10-9 M)
pM picomolar (10-12 M)

Unidades de Tiempo
h hora
min minuto
s segundo
ms milisegundo
s microsegundo

vii
Indice
Indice

INDICE

Introducción Página

1. Estructura y función mitocondrial 1

1.1. Estructura mitocondrial 1

1.2. Cadena respiratoria mitocondrial 2

1.3. Reacciones catalizadas por los complejos multienzimáticos 5

mitocondriales

1.4. Supercomplejos o respirasomas 9

1.5. Teoría quimiosmótica y Fosforilación oxidativa 10

1.5.1. Eficiencia de la transferencia de electrones 11

1.5.2. Eficiencia del proceso de fosforilación 12

1.6. Estados metabólicos mitocondriales y Control respiratorio 13

1.6.1. Agentes que inhiben la transferencia de electrones y/o 15

desacoplan la fosforilación oxidativa

1.7. Preparaciones mitocondriales 16

2. Metabolismo mitocondrial de especies reactivas del oxígeno 17

2.1. Producción mitocondrial de anión superóxido y peróxido de hidrógeno 17

2.2. Defensas antioxidantes en la mitocondria 19

3. Metabolismo mitocondrial de especies reactivas del nitrógeno 23

3.1. Óxido nítrico 23

3.1.1. Síntesis de óxido nítrico en sistemas biológicos. Óxido 24

nítrico sintasas

3.1.2. Oxido nítrico sintasa mitocondrial (mtNOS) 27

3.1.3. Inhibidores de las óxido nítrico sintasas 29

3.2. Peroxinitrito 29

4. Efectos del NO en sistemas biológicos 31

4.1. Papel regulador del NO en la mitocondria 32

viii
Indice

4.1.1. Efecto del NO sobre la transferencia de electrones 32

4.1.2. Actividad funcional de la mtNOS 34

5. Biogénesis mitocondrial 36

6. El corazón: órgano dependiente de O2 y ATP 37

6.1. Isquemia/reperfusión cardíaca: Atontamiento miocárdico 38

6.1.1. Efecto de la Adenosina sobre la función cardíaca 41

6.2. Diabetes Mellitus 42

Objetivos

1. Objetivo General e Hipótesis de trabajo 44

2. Objetivos específicos 44

2.1. Interacción funcional entre el complejo I y la mtNOS en corazón 44

2.2. Funcionalidad mitocondrial y papel del complejo I y de la mtNOS 45

en situaciones fisiopatológicas

2.2.1. Funcionalidad mitocondrial en atontamiento miocárdico. 45

Efecto de la adenosina.

2.2.2. Funcionalidad y biogénesis mitocondrial cardiaca en diabetes 45

inducida por estreptozotocina

Materiales y Métodos

1. Modelos experimentales y material biológico 47

1.1. Modelo de atontamiento miocárdico 47

1.2. Modelo de Diabetes 48

1.3. Corazón de vaca 49

2. Preparación de las muestras 49

2.1. Corazón de vaca 49

2.1.1. Aislamiento de mitocondrias de corazón de vaca 49

2.1.2. Obtención de partículas fosforilantes ETPH 49

ix
Indice

2.1.3. Aislamiento de los complejos de la cadena respiratoria: 50

Obtención de la fracción enriquecida en complejo I

2.2. Corazón de conejo y de rata 51

2.2.1. Obtención de cortes de tejido 51

2.2.2. Obtención de mitocondrias de corazón de conejo 52

2.2.3. Aislamiento de mitocondrias de corazón de rata 53

2.2.4. Obtención de membranas mitocondriales 55

3. Función cardíaca 55

3.1. Determinación de parámetros de función ventricular cardíaca 55

estudiados en corazón de conejo o de rata

3.2. Determinación del área infartada en corazón de conejo 56

4. Determinaciones realizadas en preparaciones mitocondriales 57

4.1. Determinación del consumo de O2 57

4.1.1. Consumo de O2 de cortes de tejido 57

4.1.2. Consumo de O2 mitocondrial 58

4.1.3. Consumo de O2 en partículas ETPH y cálculo del 59

porcentaje de partículas invertidas

4.2. Actividades enzimáticas determinadas en preparaciones mitocondriales 60

4.2.1. Determinación de la actividad succinato-NAD+ reductasa 60

en ETPH

4.2.2. Determinación de la actividad de NADH-citocromo c 61

reductasa (complejos I-III)

4.2.3. Determinación de la actividad de NADH-ubiquinona 61

reductasa (complejo I)

4.2.4. Determinación de la actividad de succinato-citocromo c 62

reductasa (Complejos II-III)

4.2.5. Determinación de la actividad citocromo oxidasa (Complejo IV) 62

4.3. Determinación del contenido de citocromos 64

x
Indice

4.4. Determinación del potencial de membrana mitocondrial por 64

citometría de flujo

4.5. Determinación de la producción de ATP 66

5. Determinación de la producción de peróxido de hidrógeno y 68

óxido nítrico en preparaciones mitocondriales

5.1. Producción mitocondrial de peróxido de hidrógeno (H2O2) 68

5.2. Determinación de la producción de óxido nítrico (NO) 70

5.2.1. Producción de NO por membranas mitocondriales 72

5.2.2. Producción de NO por partículas ETPH y por la fracción 72

enriquecida en complejo I

5.2.3. Producción de NO por la enzima nNOS recombinante 73

6. Determinación de la actividad de superóxido dismutasa (SOD) 73

en membranas mitocondriales

7. Determinación de daño oxidativo a macromoléculas 76

7.1. Determinación del contenido de sustancias reactivas al 76

ácido tiobarbitúrico (TBARS)

7.2. Determinación del contenido de grupos carbonilos 77

asociados a proteínas

8. Análisis de la expresión de proteínas por Western Blot 78

8.1. Electroforesis 78

8.2. Transferencia a la membrana de nitrocelulosa 79

8.3. Cuantificación 81

9. Análisis morfológico mitocondrial 81

9.1. Microscopía electrónica de transmisión 81

9.2. Planimetría 82

xi
Indice

10. Determinación de la concentración de proteínas 83

11. Análisis estadístico de los datos 83

12. Reactivos y anticuerpos utilizados 84

Resultados

I. Capítulo I INTERACCIÓN FUNCIONAL ENTRE EL COMPLEJO I Y LA ÓXIDO NÍTRICO

SINTASA MITOCONDRIAL EN CORAZÓN

1. Caracterización de las partículas ETPH de corazón bovino 85

1.1. Consumo de O2 por partículas ETPH 85

1.2. Actividad de los complejos de la cadena respiratoria y 86

contenido de citocromos

1.3. Estimación del grado de inversión de las partículas ETPH 87

2. Actividad NAD+ reductasa 88

2.1. Efecto de la temperatura sobre la actividad NAD+ reductasa 88

2.2. Elección del medio de conservación de las partículas ETPH 89

2.3. Efecto de rotenona, oligomicina y m-CCCP sobre la actividad 90

NAD+ reductasa

2.4. Efecto de la concentración de MgCl2 y KCN sobre la actividad 92

NAD+ reductasa

2.4.1. Efecto del MgCl2 92

2.4.2. Efecto del KCN 93

3 Producción de óxido nítrico por las partículas ETPH 94

3.1. Producción de NO usando NADPH como dador de electrones 94

3.2 Producción de NO por las partículas ETPH a expensas del flujo 96

reverso de electrones de la cadena respiratoria

3.2.1. Efecto de la concentración de MgCl2 sobre la producción de NO 98

3.2.2. Efecto de rotenona, oligomicina y m-CCCP sobre la producción 99

de NO

xii
Indice

3.3 Producción de NO por la enzima nNOS recombinante 100

3.4 Producción de NO por la fracción mitocondrial enriquecida 101

en complejo I

4. Expresión de NOS en mitocondrias de corazón bovino, partículas ETPH 103

y en la fracción mitocondrial enriquecida en complejo I

II. Capítulo II FUNCIONALIDAD MITOCONDRIAL EN ATONTAMIENTO MIOCÁRDICO.

EFECTO DE LA ADENOSINA.

1. Función ventricular 104

2. Tamaño de infarto 106

3. Consumo de oxígeno en cortes de tejido 107

4. Funcionalidad mitocondrial 110

4.1. Consumo de O2 en mitocondrias de ventrículo izquierdo 110

4.2. Actividad de los complejos mitocondriales 112

4.3. Producción mitocondrial de NO 113

4.3.1. Actividad bioquímica de mtNOS 113

4.3.2. Actividad funcional de mtNOS 115

4.4. Expresión de mtNOS 116

4.5. Producción mitocondrial de H2O2 117

4.6. Actividad y concentración de Mn-SOD 119

5. Modificaciones oxidativas y/o nitrosativas a lípidos y proteínas 120

5.1. Daño oxidativo a lípidos y proteínas 120

5.2. Nitración de tirosinas 120

6. Efecto de la Adenosina 121

6.1. Efecto de la adenosina sobre la función ventricular 122

6.2. Efecto de la adenosina sobre la funcionalidad mitocondrial 124

6.3. Efecto de la adenosina sobre el daño oxidativo y nitrosativo 126

xiii
Indice

III. Capítulo III FUNCIONALIDAD Y BIOGÉNESIS MITOCONDRIAL CARDÍACA EN

DIABETES INDUCIDA POR ESTREPTOZOTOCINA

1. Caracterización de los animales diabéticos: glucemia, peso de los 129

animales y peso del corazón

2. Función ventricular 132

3. Consumo de O2 tisular 135

4. Funcionalidad mitocondrial 136

4.1. Consumo de O2 mitocondrial y eficiencia de la 136

fosforilación oxidativa

4.2. Actividades de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial 138

4.3. Potencial de membrana mitocondrial estimado por citometría de flujo 138

4.4. Producción mitocondrial de ATP 142

4.5. Producción mitocondrial de H2O2 143

4.6. Actividad y concentración de Mn-SOD 144

4.7. Actividad y expresión de la enzima mtNOS 145

5. Nitración de tirosinas 146

6. Biogénesis mitocondrial 147

6.1. Masa mitocondrial estimada a partir de la actividad de 147

citocromo oxidasa

6.2. Estudios microscópicos de tejido cardíaco 148

6.2.1. Microscopía electrónica de corazón 148

6.2.2. Análisis estereológico de mitocondrias de corazón 152

6.3. Expresión de PGC-1α como marcador de biogénesis mitocondrial 153

Discusión

1. Interacción funcional entre el complejo I y la mtNOS en corazón 155

1.1. Asociación funcional entre el complejo I y la mtNOS en corazón 155

xiv
Indice

1.1.1. Caracterización funcional de las partículas invertidas 155

1.1.2. Actividad de NAD+ reductasa sostenida por el flujo reverso 157

de electrones

1.1.3. Producción de NO por las partículas ETPH 161

1.2. Interacción entre el complejo I mitocondrial y la mtNOS 164

2. Funcionalidad mitocondrial en atontamiento miocárdico 167

Efecto de la adenosina

2.1. Atontamiento miocárdico 167

2.2. Función ventricular en atontamiento miocárdico 168

2.3. Funcionalidad mitocondrial en atontamiento miocárdico 170

2.3.1. Estimación de las concentraciones de O2- y de NO en estado 147

estacionario, y de la velocidad de generación de ONOO-

2.4. Síndrome del complejo I 179

2.5. Efecto de la adenosina 180

2.5.1. Función ventricular 180

2.5.2. Funcionalidad mitocondrial 182

3. Funcionalidad y biogénesis mitocondrial cardíaca en Diabetes 184

inducida por estreptozotocina

3.1. Función ventricular en Diabetes 184

3.2. Función mitocondrial en Diabetes 187

3.2.1. Estimación de las concentraciones de O2- y de NO en estado 190

estacionario, y de la velocidad de generación de ONOO-

3.3. Biogénesis mitocondrial 192

3.3.1. Participación del NO mitocondrial en el proceso 195

de biogénesis

4. Relevancia de la asociación entre el complejo I y la mtNOS en fisiología 196

y patología. Papel del NO mitocondrial y su relación con O2- y ONOO -

xv
Indice

Concusiones

202

Bibliografía

205

Resumen

224

xvi
Introducción
Introducción

INTRODUCCIÓN

1. Estructura y función mitocondrial

Las mitocondrias son las organelas subcelulares, presentes en las células

eucariotas, responsables de la producción de energía a través de la síntesis de
adenosina trifosfato (ATP) por fosforilación oxidativa. Aproximadamente, el 95% del ATP
necesario para las funciones celulares es sintetizado en las mitocondrias. El ATP es
utilizado en los procesos celulares endergónicos (G>0), es decir, aquellos que requieran
aporte de energía para que se lleven a cabo.

A su vez, las mitocondrias son los sitios subcelulares más activos en cuanto a la
producción de especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno.

1.1. Estructura mitocondrial

La estructura general de la mitocondria es de forma alargada y su tamaño varía

entre 0.5 µm2 y 2 µm2. Sin embargo, la forma de las mitocondrias puede variar
significativamente de acuerdo con las funciones específicas de los diferentes tipos
celulares. Estructuralmente, las mitocondrias poseen dos membranas fosfolipídicas, una
membrana externa, lisa y elástica y una membrana interna, con pliegues internos o
invaginaciones denominados crestas (Figura 1). Las crestas permiten aumentar el área
superficial de la membrana interna, en relación con el volumen mitocondrial; su número
varía según el tipo celular.

Membrana externa
Matriz mitocondrial
Espacio intermembranas

Crestas
Membrana interna

100 nm

Figura 1. Morfología mitocondrial. Fotografía de una microscopía electrónica de una

mitocondria (Aumento: 85 000X).

1
Introducción

Ambas membranas se encuentran separadas por un compartimento denominado

espacio intermembranas (Sjostrand, 1955; Palade, 1956) y el espacio delimitado por la
membrana interna se denomina matriz mitocondrial.

La membrana externa, es permeable a pequeñas moléculas e iones de un peso

molecular menor a 5000 Da, las cuales se mueven libremente a través de canales
transmembrana, compuestos por una familia de proteínas integrales de membrana
llamadas porinas. Los canales aniónicos dependientes del voltaje (VDAC) son porinas
sensibles al potencial de membrana que regulan el intercambio de metabolitos entre la
mitocondria y el citoplasma.

La membrana interna, es impermeable a la mayoría de las moléculas pequeñas e

iones, incluido el protón (H+); las únicas especies capaces de atravesar la membrana
interna son aquellas para las que existen transportadores específicos (ej: ácidos
carboxílicos, ADP, aminoácidos, Ca2+). Esta propiedad provee la base fisicoquímica para
la transducción de energía en la mitocondria. La membrana interna contiene como
proteínas constitutivas a los componentes de la cadena respiratoria y a la enzima ATP
sintasa (FoF1-ATPasa) encargada de la síntesis de ATP. Adicionalmente, en la membrana
interna se encuentran las enzimas piridin nucleótido transhidrogenasa, β-hidroxibutarato
deshidrogenasa y las enzimas de los sistemas de transporte de iones, sustratos y
nucleótidos.

La matriz mitocondrial, es una fase gelatinosa compuesta por un 50% de proteínas,

que experimenta grandes cambios de volumen y organización durante la actividad
respiratoria. Contiene el complejo de la piruvato deshidrogenasa y las enzimas del ciclo
del ácido cítrico, de la ruta de la β-oxidación de los ácidos grasos y de las rutas de
oxidación de los aminoácidos, es decir, todas las rutas de oxidación de combustibles
excepto de la glucólisis que tiene lugar en el citosol.

1.2. Cadena respiratoria mitocondrial

La cadena respiratoria mitocondrial, o cadena de transferencia de electrones,

consta de una serie de transportadores electrónicos que actúan secuencialmente, la
mayoría de los cuales son proteínas integrales de membrana con grupos prostéticos
capaces de aceptar o ceder uno o dos electrones.

Los transportadores que se encuentran dentro de la cadena respiratoria incluyen a

las (a) flavoproteinas, que contienen flavina adenina dinucleótido (FAD) o flavina
mononucleótido (FMN) como grupos prostéticos fuertemente unidos; (b) citocromos,
proteínas con el grupo hemo conteniendo hierro, (c) las hierro-sulfo (Fe-S) proteínas,

2
Introducción

donde el hierro está presente en asociación con atomos de azufre inorgánico o azufre de
residuos cisteína (Cys); y (d) la ubiquinona (UQ, coenzima Q), cofactor liposoluble capaz
de moverse libremente dentro de la membrana interna.

Los transportadores funcionan en orden de potenciales de reducción crecientes, de

forma que los electrones fluyen espontáneamente desde los transportadores con
potenciales de reducción estándar (Eº´) más bajo hacia los que poseen un Eº´ más
elevado (Tabla 1).

Tabla 1. Potenciales de reducción estándar (E°’) de los transportadores de la cadena

respiratoria mitocondrial

Hemi-reacción E°’ (mV)

NAD+ + 2H+ + 2 e-  NADH + H+ - 320

FMN + 2H+ + 2 e-  FMNH2 - 290

Fe3+-S-proteína (Complejo I) + 1 e-  Fe2+-S-proteína - 270

Fumarato + 2H+ + 2 e-  Succinato - 31

FAD + 2H+ + 2 e-  FADH2 - 10

Fe3+-S-proteína (Complejo II) + 1 e-  Fe2+-S-proteína 20

Ubiquinona (UQ) + 2H+ + 2 e-  Ubiquinol (UQH2) 50

Citocromo bk (Fe3+) + 1 e-  Citocromo bk (Fe2+) 77

Citocromo bT (Fe3+) + 1 e-  Citocromo bT (Fe2+) 190

Citocromo c1 (Fe3+) + 1 e-  Citocromo c1 (Fe2+) 220

Citocromo c (Fe3+) + 1 e-  Citocromo c (Fe2+) 254

Citocromo a (Fe3+) + 1 e-  Citocromo a (Fe2+) 290

Citocromo a3 (Fe3+) + 1 e-  Citocromo a3 (Fe2+) 550

½ O2 + 2H+ + 2 e-  H2O 816

Así, cada componente de la cadena respiratoria acepta electrones del

transportador precedente y se los transfiere al siguiente, en una secuencia específica,

3
Introducción

desde el par redox NAD+/NADH (E°’NAD+/NADH = -320 mV) hasta el par redox O2/2H2O
(E°’O2 / 2H2O= +816 mV).

Los transportadores de electrones mitocondriales funcionan dentro de los complejos

proteicos multienzimáticos, ordenados en serie, localizados en la membrana interna
mitocondrial (Figura 2): complejo I (NADH deshidrogenasa), complejo II (succinato
deshidrogenasa), complejo III (ubiquinol-citocromo c reductasa) y complejo IV (citocromo
oxidasa).

Espacio intermembranas
(Lado P)
pH = 7.0
4H+ 4H+ 2H+ H+

Cit c
IV
I Q III
2 e-
II 2e-

2e-
V
½ O2 + 2H+ H2O
Succinato Fumarato
NADH NAD+ + H+
ADP + Pi ATP
Matriz mitocondrial
(Lado N)
pH = 7.8

Figura 2. Esquema de la cadena de transferencia de electrones dentro de la

membrana interna mitocondrial. Se muestran los complejos I a IV y la ATP sintasa o
FoF1-ATPasa (complejo V). Q: ubiquinona. Citc: citocromo c.

Los complejos I y II catalizan la transferencia de electrones hacia la ubiquinona

(UQ) a partir de dos dadores de electrones: NADH (complejo I) o succinato (complejo II).
El complejo III transfiere electrones desde la ubiquinona reducida (ubiquinol, UQH2) al
citocromo c, y el complejo IV completa la secuencia transfiriendo electrones desde el
citocromo c hacia el O2.

La energía que proviene del flujo espontáneo de electrones a través de los

complejos de la cadena respiratoria, es suficiente para realizar simultáneamente el
bombeo de protones (H+) desde la matriz hacia el espacio intermembranas, de manera
vectorial a través de los complejos I, III y IV. De esta manera, se genera un gradiente de
H+ que polariza la membrana interna, siendo el espacio intermembranas el lado positivo
(P) y la matriz mitocondrial el lado negativo (N).

4
Introducción

1.3. Reacciones catalizadas por los complejos multienzimáticos

mitocondriales

La mayoría de los componentes de la cadena de transferencia de electrones son

reversibles. Para catalizar tanto las reacciones directas como las inversas es necesario
que dichos componentes redox puedan operar en condiciones en las cuales, las formas
oxidadas y reducidas, existan en concentraciones apreciables.

El complejo I, NADH deshidrogenasa o NADH-ubiquinona oxidorreductasa está

compuesto por 45 cadenas polipeptídicas diferentes de una masa molecular aproximada
de 1 MDa, incluyendo una FMN-flavoproteína y 8 centros ferrosulfurados (Fe-S) (Hirst y
col., 2003 ; Carroll y col., 2006; Balsa y col., 2012). Mediante microscopía electrónica de
alta resolución, se determinó que el complejo I posee una estructura en forma de “L”, con
un brazo largo que constituye la región hidrofóbica integral de la membrana interna, y un
dominio hidrofílico (o periférico) más corto, que se extiende hacia la matriz y contiene el
aceptor primario de electrones (FMN), los centros redox Fe-S y el sitio activo para el
NADH (Sazanov y Walker, 2000). La estructura del complejo I se mantiene a través de
uniones hidrofóbicas no covalentes. Bajas concentraciones de detergentes, esteroides
sintéticos y naturales (Boveris y Stoppani, 1970) o pesticidas hidrofóbicos, como la
rotenona (Chance y col., 1963) y el piribaden (Gomez y col., 2007), son capaces de
romper las uniones polipeptídicas y de inhibir la transferencia de electrones en dicho
complejo, afectando su función.

El complejo I es la vía principal que relaciona el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, el

NADH y la cadena respiratoria. Cataliza dos procesos simultáneos acoplados: (1) la
transferencia de un ión hidruro desde el NADH hacia la FMN, a partir del cual dos
electrones pasan a través de una serie de centros Fe-S hasta la UQ, y (2) la
translocación exergónica de cuatro H+ desde la matriz hacia el espacio intermembranas
(Walker, 1992; Walkery col., 1992) (Figura 3). El flujo protónico genera un potencial
electroquímico a través de la membrana mitocondrial interna, inherente a la diferencia de
concentración de H+ y a la separación de cargas, que conserva parte de la energía
liberada por las reacciones de transferencia electrónica, contribuyendo con la fuerza
protón-motriz (Δp).

La reacción global catalizada por el complejo I es:

NADH + 5H+N + UQ  NAD+ + UQH2 + 4H+P

Eo’ = + 420 mV Go’ = -81 kJ.mol-1

5
Introducción

La oxidación de NADH ocurre a 250-500 nmol NADH. min-1. mg proteína-1, mientras

que la velocidad de oxidación de succinato en el complejo II es de 100-225 nmol. min-1.
mg proteína-1 (Poderoso y col.1996, Vanasco y col., 2008; Iglesias y col., 2015).

4H+
Espacio intermembranas
(Lado P)
Q
N2 QH2
Fe-S

FMN
2e- 2H+
Matriz mitocondrial
(Lado N)

NADH NAD+ + H+

Figura 3. Esquema del complejo I mitocondrial. Tomado de Nelson y Cox, 2005.

Adicionalmente, el complejo I es capaz de reducir NAD+ en presencia de succinato

y a expensas de ATP (Chance y Hollunger, 1961; Heldt y col., 1965). La reducción de
NAD+ por el complejo I es determinada como consecuencia de la oxidación de succinato
y por el Δp que permite superar la diferencia de potenciales redox entre el UQH2 y el
NAD+. Este proceso se denomina flujo reverso de electrones (RET, por sus siglas en
inglés). La actividad de NAD+ reductasa es posible debido a que el complejo I es
termodinámicamente reversible (Vinogradov, 1998; Wilson y col., 1974) y es capaz de
alternar rápidamente entre las reacciones directa y reversa que allí ocurren, a través de
un punto de equilibrio en donde la energía libre de la reacción redox es igual y opuesta a
la de la transferencia de electrones (Pryde y Hirst, 2011).

El complejo II, succinato deshidrogenasa o succinato-ubiquinona reductasa, es el

componente del ciclo del ácido cítrico unido a membrana, que también funciona como un
componente de la cadena respiratoria mitocondrial. Es una proteína integral de la
membrana interna compuesta por cuatro subunidades, una de ellas posee FAD unido
covalentemente en el sitio activo y otra subunidad contiene tres centros Fe-S necesarios
para la transferencia de electrones. Los electrones son aceptados por el FAD y a través
de los centros Fe-S pasan a la UQ (Cecchini, 2003). La quinona recibe 2 H+ desde el lado
N de la membrana (matriz), balanceando de este modo los H+ liberados hacia la matriz
luego de la oxidación del FADH2. Por lo tanto, la reducción de la UQ por el succinato no

6
Introducción

está asociada a la translocación de H+ a través de la membrana interna (Nicholls y

Ferguson, 2002). La siguiente reacción muestra la transferencia de electrones que ocurre
en el complejo II:

FADH2 + UQ  FAD + UQH2

Eo’ = + 15 mV Go’ = -2.9 kJ.mol-1

El complejo III, complejo bc1 o ubiquinol-citocromo c oxidorreductasa es un dímero

de monómeros idénticos. Cada monómero está constituído por 11 subunidades
diferentes, 3 de las cuales se encuentran asociados a centros redox: los grupos hemo
b562, b566, y c1; y un centro [2Fe-2S] (Hatefi, 1985). Además, existen dos sitios de unión a
ubiquinonas, el sitio QN y el QP, dispuestos hacia la matriz (QN) y al espacio
intermembranas (QP) (Crofts, 2004). Este complejo cataliza la transferencia de electrones
desde el ubiquinol al citocromo c, según:

UQH2 + 2 Fe3+ (cit c) + 2 H+N  UQ + 2 Fe2+ (citc) + 4 H+p

Eo’ = + 150 mV Go’ = -30 kJ.mol-1

Dicha transferencia ocurre a través del denominado ciclo Q (Mitchel, 1975), el cual
involucra ubisemiquinonas intermediarias y permite el transporte neto de 2 H+ hacia el
espacio intermembranas. La translocación neta de 2 H+/2 e- es lograda por la captación y
liberación de H+ en sitios topológicamente separados de oxidación del UQH2 y de
reducción de la ubiquinona (UQ), situados en lados opuestos de la membrana, y por la
transferencia vectorial de 2 electrones a través del centro [2Fe-2S] de la proteína de
Rieske y el citocromo c1 hacia el citocromo c, y de otros 2 electrones a través de los
citocromos b hacia el lado negativo de la membrana, donde reducen a la UQ.

El citocromo c es una proteína periférica ubicada en el lado P de la membrana

interna mitocondrial, dirigida hacia el espacio intermembranas. El citocromo c posee un
grupo hemo, el cual acepta un electron del complejo III y se desplaza por la membrana
interna hacia el complejo IV para ceder dicho electron a un centro de cobre (CuA)
binuclear. En suma, el citocromo c transfiere 4 electrones, de a uno por vez, hacia el
complejo IV.

El complejo IV, citocromo oxidasa o citocromo c óxidorreductasa, es el catalizador

terminal de la cadena respiratoria. Está compuesto por 13 subunidades de las cuales 10
son codificadas en el núcleo y 3 son codificadas en la mitocondria (Tsukihara y col.,

7
Introducción

1996). Las subunidades I y II cumplen funciones catalíticas relevantes. La subunidad II

contiene 2 iones Cu que forman complejos con los grupos tioles (-SH) de dos residuos
cisteína (Cys) en un centro binuclear (CuA), cuya función es la de aceptar electrones, de a
uno por vez, desde el citocromo c. La subunidad I contiene 2 grupos hemo, designados
como a y a3, y otro ión cobre (CuB). El hemo a3 y el CuB forman un centro binuclear que
acepta electrones del hemo a y los transfiere al O2 unido al hemo a3. Este complejo
transfiere 4 electrones desde el citocromo c reducido hacia el O2 molecular, reduciéndolo
a 2 moléculas de H2O. Simultáneamente, en este proceso, se bombean 2 H+ desde la
matriz hacia el espacio intermembranas. Los H+ necesarios para la reducción del O2
provienen del lado N de la membrana, mientras que los electrones responsables de la
oxidación del ferrocitocromo c provienen del lado P. Como consecuencia, en la reducción
del O2 a H2O se genera una diferencia de potencial (p) de membrana. La reacción global
catalizada por el complejo IV es:

2cit. c2+ + 4 H+N + 1/2 O2  2 cit. c3+ + 2 H+P + H2O

Eo’ = + 815 mV Go’ = -109 kJ.mol-1

La FoF1-ATPasa mitocondrial, o complejo V es un complejo multienzimático de la

membrana interna, formado por dos componentes: una proteína periférica de membrana
cuya función es la síntesis de ATP (F1) y una proteína integral de membrana (Fo) sensible
a la inhibición por oligomicina, que actúa como poro protónico a través del cual entran los
H+ a la matriz mitocondrial (Pullman y col., 1958; Walker y col., 1995; Boyer, 1998). El
componente F1 está formado por 9 subunidades (3, 3, ,  y ), estando los sitios
catalíticos en las subunidades β. El componente Fo esta formado una serie de
subunidades hidrofóbicas (1a, 2b, entre 10 y 12c). La síntesis de ATP se basa en un
mecanismo de catálisis rotacional (Boyer, 1998) en el cual las tres subunidades β, se
alternan a través de cambios conformacionales, para la síntesis de ATP. Dichos cambios
conformacionales están impulsados por el pasaje de H+ desde el lado P al lado N de la
membrana interna, a favor de su gradiente electroquímico, a través del poro del
componente Fo. El flujo de H+ es un proceso exergónico que está acoplado al proceso
endergónico de síntesis de ATP catalizada por la subunidad F1, a partir de ADP y fosfato
inorgánico (Pi).

ADP + Pi + 2H+P ATP + H2O + 2H+N

ΔG°´= 30.9 kJ. mol de ATP-1

8
Introducción

1.4. Supercomplejos o respirasomas

La mayoría de los trabajos previos al año 2000, relativos a la organización

estructural de la cadena respiratoria, avalaban el “Modelo de difusión aleatoria de
transferencia de electrones” postulado por Hackenbrock y col. (1986). Según este
modelo, la distribución de los complejos en la membrana interna es aleatoria, con
capacidad de moverse libremente por difusión lateral, encontrándose funcionalmente
conectados a través de la difusión de pequeñas moléculas, tales como la coenzima Q y el
citocromo c (Lenaz y Genova, 2007).

Sin embargo, trabajos posteriores realizados por Schägger y Pfeiffer (2000) hallaron
evidencias estructurales de una interacción permanente entre los complejos
mitocondriales, encontrándose ensamblados en estructuras supramoleculares,
describiendo el “Modelo de los Respirasomas” (Shägger y Pfeiffer, 2000). Este modelo se
comprobó a través de análisis cinéticos (Rich, 1984; Boumans y col., 1998), de la
presencia de una asociación estequiométrica entre los complejos mitocondriales I y III
(Fowler y Richardson, 1963; Ragan y Heron, 1978), del aislamiento de NADH-citocromo c
reductasa (complejos I+III) (Hatefi y Rieske, 1967) y de la interacción de los complejos II y
III en levaduras (Bruel y col., 1996). Posteriormente, se ha mostrado la presencia de
supercomplejos tanto en mitocondrias de bacterias (Stroh y col., 2004), de hongos
(Krause y col., 2004a) y de plantas superiores (Eubel y col., 2004; Krause y col., 2004b),
como en mitocondrias de rata (Reifschneider y col., 2006), de corazón bovino y de células
humanas (Shägger y col., 2004).

De esta forma, los complejos I, III y IV de la cadena respiratoria están ensamblados

formando supercomplejos (Figura 4), los cuales poseen una estequiometría definida
según el organismo (Schäfer y col., 2006; Genova y Lenaz, 2014). El primer aislamiento,
por cromatografía, de un respirasoma completo se realizó a partir de membranas de
P. denitrificans presentando una estequiometría I1:III4:IV4 (Stroh y col., 2004). Asimismo,
Schäfer y col. (2006) caracterizaron dos supercomplejos, I1:III2 y I1:III2:IV1, presentes en
mitocondrias de corazón bovino.

9
Introducción

2H+
Espacio intermembranas 4H+ 4H+

Cit c

I
Q
III IV
2 e-
Matriz

2e-
½ O2 + 2H+ H2O

NADH NAD+ + H+

Figura 4. Representación esquemática de la interacción de los complejos I, III y IV en

un supercomplejo, en la membrana interna mitocondrial.

La formación de estas estructuras presenta una serie de ventajas (Fersht, 1999;

Shägger y Pfeiffer, 2000), tales como (a) una mejora en la eficiencia catalítica de la
cadena de transferencia de electrones debido a un confinamiento de los sustratos, (b) un
menor tiempo para la difusión de los intermediarios entre los complejos, y (c) una menor
perdida de electrones que “escapan” de la cadena respiratoria, atenuando la producción
de anión superóxido (O2-).

Asimismo, se ha mostrado que la formación de supercomplejos es esencial para el

ensamblaje y estabilidad del complejo I, el sitio principal de entrada de los sustratos a la
cadena respiratoria, debido a que el aislamiento de dicho complejo en cepas mutantes de
P. denitrificans carentes de complejos III y IV resultaron en una disociación completa del
mismo (Stroh y col., 2004).

1.5. Teoría quimiosmótica y Fosforilación oxidativa

La fosforilación oxidativa constituye la etapa final del proceso de transducción de

energía en los organismos aeróbicos y se refiere al proceso endergónico (G>0) de
síntesis química de ATP impulsado por el proceso exergónico (G<0) de transferencia de
electrones desde el NADH o succinato hacia el O2. Así, la energía química liberada por
las reacciones de oxidación que tienen lugar en la cadena de transferencia de electrones
mitocondrial, es utilizada para la síntesis de ATP. Este proceso acoplado, depende
críticamente de la integridad e impermeabilidad de la membrana interna mitocondrial.

10
Introducción

En el año 1961, Peter Mitchell propuso la teoría quimiosmótica para describir

reacciones enzimáticas en las que intervienen simultáneamente, una reacción química de
síntesis de ATP y un proceso de transferencia de electrones (Mitchell, 1961). Esta teoría
incluye 3 postulados:

(1) La membrana interna mitocondrial posee baja conductividad y es impermeable a

especies iónicas, incluyendo H+ y HO-.

(2) Los componentes de la cadena de transferencia de electrones están organizados en

la membrana interna mitocondrial, de manera que durante los procesos de
óxido-reducción, los H+ son transferidos hacia el espacio intermembranas en un
proceso acoplado a la transferencia de electrones, a través de los sitios de
conservación de energía. Como consecuencia, se genera un gradiente de pH (pH) y
una diferencia de carga () entre ambos lados de la membrana interna.

(3) El complejo V o ATPasa (FoF1-ATPasa) de la membrana interna mitocondrial es

responsable de la translocación de H+. Este complejo puede generar la fuerza
protón-motriz (p) hidrolizando ATP, o alternativamente, usar la energía del gradiente
electroquímico para sintetizar ATP. La estequiometría de la reacción es de 2 H+ por
cada fosfato incorporado (o liberado) del ATP. Se sintetiza ATP, cuando los H+ pasan
a favor de su gradiente electroquímico desde el espacio intermembranas hacia la
matriz mitocondrial; se hidroliza ATP, cuando los H+ se liberan desde la matriz
mitocondral hacia el espacio intermembranas.

P. Mitchell propuso que las concentraciones de H+ en las dos fases acuosas, es

decir, la matriz mitocondrial y el espacio intermembranas, separadas por la membrana
interna, constituye la fuerza molecular responsable de la formación de ATP a partir de
ADP y de Pi, por la acción de la F1-ATPasa de la membrana mitocondrial. Es decir, el
gradiente electroquímico inherente a la diferencia de concentración de H+ (pH) y a la
separación de cargas () a través de la membrana mitocondrial interna, es la fuerza
protón-motriz (p) que impulsa la síntesis de ATP, como consecuencia del flujo pasivo y
espontáneo de H+ hacia la matriz mitocondrial, a través de un poro de H+ (Fo) asociado a
la FoF1-ATPasa.

1.5.1. Eficiencia de la transferencia de electrones

La transferencia de electrones desde el NADH o succinato hacia el O2 molecular va

acompañada de un cambio de energía libre (Go’) de -220 kJ. mol NADH-1 o -150 kJ. mol

11
Introducción

succinato-1. Parte de dicha energía es utilizada para realizar un proceso endergónico

acoplado, el pasaje vectorial de H+ desde la matriz hacia el espacio intermembranas. Por
cada electrón transferido al O2, 4 H+ se bombean por el complejo I, 4 H+ por el complejo
III y 2 H+ por el complejo IV, desde la matriz hacia el espacio intermembranas. La
reacción global catalizada desde el complejo I hacia el O2 es:

NADH + 11 H+N + ½ O2  H2O + NAD+ + 10 H+P

La fuerza protón-motriz, expresada en mV (p = m – 60 pH, a 298 K) se refiere

al potencial electroquímico, normalmente 220-230 mV, el cual multiplicado por el número
de cargas transferidas a través de la membrana indica el trabajo eléctrico realizado, que
será utilizado en la síntesis de ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico (Pi). Así, en la
primera parte del proceso el potencial químico generado en la oxidación del NADH o
succinato se convierte en potencial electroquímico (p), y en la segunda parte del
proceso ese p es utilizado por la ATPasa para realizar la síntesis endergónica de ATP.

Lado P Lado N
(Espacio intermembranas) (matriz)
[H+p] = C2 [H+N] = C1

H+ OH-
H+ OH-
H+ 4H+ OH-
H+ OH-
H+ OH-
H+ OH-
H+ OH-
H+ OH-

Figura 5. Generación de la fuerza protón-motriz en el complejo I. El bombeo de H+ desde

la matriz mitocondrial hacia el espacio intermembranas, genera una diferencia de
concentración química (pH) y de distribución de cargas (). El efecto neto es la fuerza
protón-motriz (p).

1.5.2. Eficiencia del proceso de fosforilación

La eficiencia del proceso de fosforilación llevado a cabo en la mitocondria se evalúa

a través de la relación P/O o ADP/O, que es la relación entre la cantidad de fosfato
inorgánico (Pi) incorporado al ATP y el oxígeno consumido para oxidar al sustrato.

12
Introducción

Durante muchos años se consideró que la relación P/O debía ser un número entero y se
postuló el valor 3 para la oxidación del NADH y 2 para la oxidación del succinato. Sin
embargo, según la Teoría Quimiosmótica este valor no debe ser necesariamente un
número entero. Actualmente, se sostiene que 10 H+ ó 6 H+ son bombeados hacia el
espacio intermembranas, por cada par de electrones, cuando el sustrato es NADH o
succinato, respectivamente. A su vez, se determinó experimentalmente que 4 H+ son
necesarios para la síntesis de ATP. Por lo tanto, se considera que se sintetizan 2.5
moléculas de ATP por cada molécula de NADH oxidada y 1.5 moleculas de ATP por cada
succinato utilizado como dador de electrones.

1.6. Estados metabólicos mitocondriales y Control respiratorio

La velocidad de respiración mitocondrial depende no sólo de la concentración de O2

sino también de la disponibilidad de ADP a la FoF1-ATPasa. Los gradientes de ADP y
ATP a través de la membrana interna se equilibran a través de una adenina nucleótido
translocasa que funciona para proveer ADP a la matriz y ATP al citosol para procesos
dependientes de energía. En condiciones fisiológicas, la matriz mitocondrial contiene una
alta concentración de Pi, de manera que la concentración de ADP es la reguladora de la
actividad del sistema de transferencia de electrones y, por lo tanto, de la respiración
mitocondrial. La velocidad de respiración y de síntesis de ATP está determinada por la
demanda energética celular. Esta última se puede expresar como concentración
citosólica de ADP o potencial de fosforilación ([ATP]/[ADP][Pi]) donde la parte operacional
es la relación [ATP]/[ADP].

Cabe mencionar que actualmente se considera que la respiración celular no sólo es

regulada por las concentraciones de O2 y ADP, sino también por la concentración de
óxido nítrico (NO) mitocondrial, ya que éste ultimo inhibe la actividad de citocromo
oxidasa competitivamente con el oxígeno (Boveris, y col., 1999a).

En el año 1956, Chance y Williams (Chance y Williams, 1956) describieron las

condiciones generales que afectan la velocidad de respiración en mitocondrias intactas y
el estado de óxido-reducción de los componentes de la cadena respiratoria, conocido
como estados metabólicos mitocondriales (Tabla 2). Así, la velocidad de consumo de O2
depende de dichos estados mitocondriales.

13
Introducción

Tabla 2. Estados metabólicos de la mitocondria (Tomada de Lehninger, 1965)

Estado Oxígeno ADP Sustrato Consumo de O2 Factor limitante

1 disponible bajo bajo lento ADP

2 disponible alto muy bajo lento sustrato

3 disponible alto alto rápido cadena respiratoria

4 disponible bajo alto lento ADP

5 no disponible* alto alto 0 oxígeno

 condición anaeróbica

Al estado metabólico caracterizado por la presencia de sustratos oxidables en

ausencia de ADP se lo denomina “estado controlado o estado 4”, dado que el consumo
de O2 es lento. La adición de ADP establece la máxima velocidad fisiológica de consumo
de O2 y producción de ATP, y se lo denomina “estado activo o estado 3”. Este último
estado metabólico es considerado como el que representa el consumo de O2 fisiológico
que genera energía para la correcta función celular (Boveris y Poderoso, 2000a).

La respiración mitocondrial puede ser evaluada experimentalmente en los estados 3

y 4. El cociente de velocidades de consumo de O2 en estado 3/estado 4 se denomina
control respiratorio, y es un indicador muy sensible de la integridad mitocondrial, que
indica el grado de acoplamiento entre las reacciones de óxido-reducción y la síntesis de
ATP que ocurren en la mitocondria. A su vez, el control respiratorio da cuenta del control
que ejerce el ADP sobre la transferencia de electrones (Stoppani y Boveris, 1983a;
1983b).

En condiciones fisiológicas, se estima que las mitocondrias de mamíferos se hallan

mayoritariamente (60-70%) respirando en estado 4, mientras que el resto se encuentra
en estado 3. Esta observación indica que en condiciones normales sólo se utiliza en un
30-40% la capacidad máxima de producir ATP (Boveris y col., 1999a; Boveris y Boveris,
2007).

14
Introducción

1.6.1. Agentes que inhiben la transferencia de electrones y/o desacoplan la

fosforilación oxidativa

Entre las sustancias capaces de inhibir la fosforilación oxidativa se encuentran los

inhibidores de la transferencia de electrones, los inhibidores de la FoF1-ATPasa y los
desacoplantes, cuyos sitios de acción se esquematizan en la Figura 6.

Dentro de los compuestos que inhiben la transferencia de electrones cabe

mencionar a la rotenona, inhibidor específico del complejo I, el cual bloquea la
transferencia de electrones desde el centro Fe-S (N2) a la ubiquinona (Chance y col.,
1963); y a la antimicina A, que inhibe la transferencia de electrones entre los citocromos b
y c1. Asimismo, diversos compuestos interfieren en la transferencia de electrones por la
citocromo oxidasa, tales como el cianuro (CN-), la azida, el monóxido de carbono (CO) y
el óxido nítrico (NO), actuando sobre el hemo a3 e impidiendo su interacción con el O2.

La oligomicina, un inhibidor del componente Fo de la ATPasa, interfiere con el

transporte de H+ a través de la membrana, afectando simultáneamente la respiración y la
fosforilación. El agregado de oligomicina a mitocondrias respirando en estado 3 provoca
el retorno al consumo de oxígeno en estado 4, no modificando la transferencia de
electrones en mitocondrias desacopladas.

NO, CO,
Espacio intermembranas
Azida, CN- Oligomicina
(Lado P) Mixotiazol
pH = 7.0
H+ m-CCCP
4H+ Rotenona 4H+ 2H+
F-CCCP

H+
Cit c
IV H+
I Q III
2 e-
II 2e-

2e- H+
V H+
Malonato H+
½ O2 + 2H+ H2O
Succinato Fumarato Antimicina A H+
NADH NAD+ + H+
ADP + Pi ATP
Matriz mitocondrial
(Lado N)
pH = 7.8

Figura 6. Esquema de la cadena respiratoria mostrando los sitios de acción de

compuestos que inhiben la transferencia de electrones y/o desacoplan la fosforilación
oxidativa.

Los desacoplantes son compuestos lipofilicos con propiedades de ácido débiles.

Este grupo incluye a los fenoles sustituídos, fenilhidrazonas de cianuro de carbonilo como

15
Introducción

el carbonilcianuro-m-clorofenilhidrazona (m-CCCP) y el 2,4 dinitrofenol (DNP), así como

algunos antibióticos como la valinomicina. Se caracterizan por disipar el potencial
electroquímico de H+ en forma de calor, de modo que liberan la respiración en estado 4
en ausencia de un aceptor de fosfato, siendo la velocidad de consumo de O2 semejante a
la obtenida en estado 3.

1.7. Preparaciones mitocondriales

Las mitocondrias se aíslan como estructuras intactas, con sus dos membranas, la
membrana externa y la membrana interna, definiendo espacios cerrados o
compartimentalizados. Esta compartimentalización es esencial para establecer, mediante
las reacciones de óxido-reducción de la cadena respiratoria, una diferencia de potencial
electroquímico a ambos lados de la membrana interna, y para que el movimiento de H+
dirigido por la fuerza protón-motriz, a través de la F1-ATPasa, se utilice para la síntesis de
ATP.

La complejidad estructural y bioquímica de la mitocondria ha llevado a la obtención

de diferentes preparaciones mitocondriales (Tzagoloff, 1982). De esta forma es posible
obtener preparaciones mitocondriales de complejidad decreciente: (a) mitocondrias, (b)
mitoplastos, (c) vesículas submitocondriales (inside-out particles), (d) membranas
reconstituidas a partir de complejos respiratorios y ATPasa y (e) membranas
mitocondriales.

Las mitocondrias se aíslan como estructuras intactas, con sus membranas externa
e interna, definiendo espacios compartimentalizados. Se obtenien en realizando
sucesivos cortes del tejido y homogeneización utilizando un homogeneizador de teflon.
En el caso de tratarse de órganos musculares, el tejido puede ser tratado previamente
para facilitar la disgregación, utilizando un homogeneizador de cuchillas o mediante
tratamiento con proteasas. Posteriomente y con el fin de obtener la fracción mitocondrial,
se realizan centrifugaciones diferenciales de dicha suspensión.

Los mitoplastos son membranas internas cerradas, obtenidas por tratamiento con
digitonina o con sacarosa hipotónica/sacarosa hipertónica, las cuales son capaces de
tener control respiratorio.

Las partículas o vesículas submitocondriales o inside-out particles son obtenidas

por disrupción ultrasónica. Estas partículas carecen de todos los componentes
mitocondriales solubles y consisten predominantemente en vesículas de membrana
interna selladas, que exponen los componentes de la membrana interna hacia el exterior.
La membrana mitocondrial interna presenta una orientación inversa, exponiendo todos

16
Introducción

los componentes de la cadena respiratoria así como también la ATP sintasa hacia el
medio de reacción (Figura 7). Esta característica las hace útiles para el estudio de los
componentes de la cadena respiratoria y de los mecanismos de traducción de energía.
Estas partículas exhiben una alta actividad ATPasa y son deficientes en funciones de
transporte. Sin embargo, poseen potencial de membrana y capacidad fosforilante.

0.1 m

Figura 7. Imagen de una microscopía electrónica de partículas submitocondriales

invertidas de corazón de vaca. Tomado del libro Mitochondria de Alexander Tzagolloff,
1982.

Las membranas mitocondriales, son fragmentos de membrana interna mitocondrial,

obtenidos por ciclos de congelamiento y descongelamiento de mitocondrias y pasadas
posteriormente a través de una jeringa provista de una aguja calibre 15/10 (Boveris y col.,
2002a), o por tratamiento de los tejidos con cuchillas que giran a alta velocidad
(Ultraturrax).

2. Metabolismo mitocondrial de especies reactivas del oxígeno

2.1. Producción mitocondrial de anión superóxido y de peróxido de hidrógeno

El oxígeno molecular es un birradical, de acuerdo a su configuración electrónica, ya

que tiene dos electrones desapareados ubicados cada uno en un orbital π antiligante
(Pauling, 1940). Es un agente oxidante, capaz de oxidar a otros átomos y moléculas,
aceptando electrones de éstos, lo que hace que el O2 se reduzca. El O2, por su carácter
de birradical, se puede reducir a través de cuatro pasos sucesivos de transferencia de un

17
Introducción

electrón (Michaelis, 1946). Durante este proceso, denominado reducción univalente del
oxígeno, se generan intermediarios reactivos (Figura 8).

e- e- e- e-
O2 O2- H2O2 HO• H2O
2H+ H+ H+

Figura 8. Reducción univalente del oxígeno.

A los intermediarios de esta reacción, anión superóxido (O2-), peróxido de hirdógeno

(H2O2) y radical hidroxilo (HO), se los incluye dentro de las denominadas especies
reactivas del oxígeno (Pryor, 1976; Boveris, 1998). El O2- y el HO tienen las
características de ser radicales libres ya que poseen un electrón no apareado en su órbita
externa, pero no así el H2O2. Esta última, es una de las especies reactivas del oxígeno
que tiene capacidad de difundir a través de las membranas lipídicas y actuar como
molécula señalizadora, cumpliendo un papel fundamental en la señalización
mitocondria-citosol.

Los organismos superiores están organizados para extraer O2 de la atmósfera,

distribuirlo a sus células, y reducirlo a H2O dentro de las mitocondrias. En células
aeróbicas y en condiciones fisiológicas, un 90-95% del O2 consumido es reducido a H2O
por la citocromo oxidasa en la cadena de transferencia de electrones mitocondrial. Cabe
mencionar que dicha enzima, no permite el escape de electrones durante la respiración
celular, evitando de esa forma la generación de intermediarios reactivos. Sin embargo, en
1973, Boveris y Chance muestran que mitocondrias aisladas de hígado y corazón son
fuentes activas de H2O2. Posteriormente, el O2- fue reconocido como el precursor
estequiométrico del H2O2 mitocondrial (Boveris y Cadenas, 1975; Dionisi y col., 1975;
Cadenas, y col., 1977). Debido al moderado potencial redox de la cupla O2-/O2
(E1/2 = -160 mV), la reacción de reducción del O2 por un electrón es termodinámicamente
favorable (Turrens, 2003). Un 1-2 % del O2 consumido es parcialmente reducido en la
mitocondria y convertido a O2- (Chance y col., 1979), el cual se forma a través de dos
reacciones principales: (a) la auto-oxidación de la ubisemiquinona (UQH•) del par redox
ubiquinol/ubiquinona (complejo III) y (b) la auto-oxidación de la flavina semiquinona
(FMNH•) de la coenzima FMNH/FMN de la NADH deshidrogenasa (complejo I) (Boveris y

18
Introducción

Cadenas, 1975; Boveris y col., 1976; Chance y col., 1979; Turrens y Boveris, 1980). Las
semiquinonas colisionan con el O2 y se oxidan no enzimáticamente formando O2-, según:

UQH• + O2  UQ + H+ + O2- k = 8 x 103 M-1 s-1

FMNH• + O2  FMN + H+ + O2-

La mayor parte del O2- generado en las mitocondrias (70-80%) es liberado

vectorialmente hacia la matriz, y solo un 20-30% es liberado hacia el espacio
intermembranas (Han y col., 2001). Dentro de la matriz, el O2- dismuta a H2O2 y O2
(McCord y Fridovich, 1969) a través de la reacción catalizada por la enzima
Mn-superóxido dismutasa (Mn-SOD) y en el espacio intermembranas por acción de la
isoforma CuZn-SOD, según:

2 O2- + 2 H+  H2O2 + O2 k = 1.8-2.4 x 109 M-1 s-1

En presencia de succinato y antimicina, las membranas mitocondriales muestran

valores cercanos a 2 para la relación estequiométrica entre la producción de O2- y H2O2
(Boveris y Cadenas, 1982; Iglesias y col., 2015).

Boveris y Chance (1973) han mostrado que la producción de H2O2 en estado 3

(0.05-0.15 nmol H2O2. min-1. mg proteína-1) es menor que la generación de H2O2 en
estado 4 (0.30-0.80 nmol H2O2. min-1. mg proteína-1). Al pasar de un estado de
respiración activa (estado 3) a la respiración en reposo (estado 4), el se incrementa
llevando a un aumento en el estado estacionario del componente auto-oxidable (UQH•), y
por lo tanto, a un aumento en la producción de H2O2. En corazón e hígado de rata, la
producción mitocondrial de H2O2 da cuenta de alrededor del 0.5-1.0% del O2 consumido
fisiológicamente al usar como sustratos succinato o malato-glutamato (Boveris y
Cadenas, 2000b).

2.2. Defensas antioxidantes en la mitocondria

Dado que la generación mitocondrial de especies reactivas del oxígeno es un

proceso continuo, las mitocondrias poseen múltiples niveles de defensas antioxidantes,
enzimáticas y no enzimáticas. La Figura 9 esquematiza los sistemas antioxidantes
presentes en la mitocondria.

19
Introducción

Sistemas antioxidantes en la mitocondria

Enzimáticos No enzimáticos

SOD (Mn-SOD y
Hidrosolubles Liposolubles
CuZn-SOD)

Catalasa (Cat)
Ácido Ascórbico α-Tocoferol
(Vitamina C) (Vitamina E)

Sistema Glutatión Glutatión (GSH) Ubiquinol (Q10)

peroxidasa (GPx) /
Glutatión reductasa (GR)

Ácido Úrico Carotenoides

Peroxirredoxinas
(Prx3 y Prx5)

Figura 9. Defensas antioxidantes presentes en la mitocondria.

Dentro de los antioxidantes enzimáticos mitocondriales, se pueden mencionar a las

enzimas superóxido dismutasa (SOD), catalasa, peroxirredoxinas (Prx) y el sistema
glutatión peroxidasa/glutatión reductasa (GPx/GR).

Superóxido dismutasa (SOD; EC 1.15.1.1): Esta enzima cataliza la dismutación de

anión superóxido (O2-) a H2O2 y O2 (McCord y Fridovich, 1969), según la siguiente
ecuación:

2 O2- + 2 H+  H2O2 + O2 k = 1.8 - 2.4 x 109 M-1 s-1

Las familias de enzimas SOD son metaloenzimas, formadas por dos o cuatro
subunidades proteicas y distribuidas en forma ubicua en diferentes organismos y tejidos.
Presentan un comportamiento no michaeliano, no saturable por sustrato. Esto se debe a
que reacciona secuencialmente en su forma reducida y oxidada con dos moléculas del
mismo sustrato. No requieren de la presencia de cofactores, por lo tanto su eficiencia solo
depende de la cantidad de enzima presente.

SOD-Mn3+ + O2-  SOD-Mn2+ + O2 k1 = 1.5 x 109 M-1 s-1

20
Introducción

SOD-Mn2+ + O2- + 2 H+  SOD-Mn3+ + H2O2 k2 = 1.1 x 109 M-1 s-1

La constante de velocidad para la reacción bimolecular del O2- catalizada por la SOD es
de 1.8-2.4 x 109 M-1 s-1 (según la isoenzima). Este valor se encuentra cercano al límite
difusional, es decir la velocidad de reacción depende de la velocidad de difusión del
sustrato hasta la enzima (Chance y col., 1979), y establece una sección eficaz de la
enzima reaccionante con el O2- de aproximadamente el 20% (18-24%).

Las dos isoenzimas halladas en mitocondrias de células animales son la Mn-SOD y

la CuZn-SOD (Fridovich 1975; Fridovich, 1995). La Mn-SOD se localiza en la matriz
mitocondrial, es un homotetrámero con un peso molecular de 80 - 89 kDa (Weisiger y
Fridovich, 1973; Crapo y McCord, 1976) contiene manganeso en su sitio activo y es
fácilmente inducible. La misma representa un 10% de la actividad celular total de SOD.
En el espacio intermembranas, la concentración de O2- es controlada por la isoenzima
CuZn-SOD (Okado-Matsumoto y Fridovich, 2001). La CuZn-SOD es de localización
principalmente citosólica, posee 2 subunidades con un peso molecular de 32 kDa,
contiene cobre y zinc en su sitio activo y representa el 90% de la actividad celular total de
la enzima. La CuZn-SOD se encuentra en gran proporción en eritrocitos, hígado, glándula
adrenal y bazo (Chance y col., 1979). Esta enzima es sensible a altas concentraciones de
KCN (McCord y Fridovich, 1969; Salin y col., 1978), mientras que la Mn-SOD es
insensible a la acción de dicho inhibidor.

Catalasa (EC 1.11.1.6): Esta enzima detoxifica parte del H2O2 generado a partir de
la reacción de dismutación del O2-, por acción de la SOD, convirtiéndolo en H2O y O2.

2 H2O2  2 H2O + O2

Es una hemoproteína de peso molecular 240 kDa con actividad de peroxidasa

específica para el H2O2 (Aebi, 1984). Posee 4 subunidades proteicas, cada una de las
cuales contiene un grupo hemo (Fe3+-protoporfirina) en el sitio activo. Mayormente se
encuentra asociada a los peroxisomas en hígado, pero también está presente en riñones,
pulmones, corazón y cerebro. En el tejido cardíaco, solamente se encuentra en las
mitocondrias, contribuyendo con el 0.025% del total de las proteínas mitocondriales (Radi
y col. 1991).

Glutation peroxidasa (GPx, EC 1.11.1.9): Es la principal enzima mitocondrial

encargada de reducir H2O2 y peróxidos orgánicos (ROOH) a H2O, utilizando glutatión

21
Introducción

(GSH) como dador de hidrógeno (Flohe y Brand, 1969; Flohe y Gunzler, 1984) según la
siguiente ecuación:

H2O2 + 2 GSH  GSSG + 2 H2O

La GPx actúa fisiológicamente acoplada a la Glutatión reductasa (GR), enzima que

se encuentra localizada en la matriz mitocondrial y mantiene la dupla GSH/GSSG
(glutatión reducido/glutatión oxidado) en un estado altamente reducido (Chance y col.,
1979)

GSSG + NAD(P)H + H+  2 GSH + NAD(P)+

El sistema Glutatión Peroxidasa/Glutatión Reductasa es una familia de

selenoenzimas, de localización ubicua en tejidos, presente tanto en la matriz mitocondrial
como en el espacio intermembranas.

Peroxiredoxinas (Prxs, EC 1.11.1.15): constituyen una familia de enzimas capaces

de reducir directamente hidroperóxidos como H2O2 e hidroperóxidos de alquilo (ROOH).
En las mitocondrias de células de mamíferos existen al menos dos miembros de la
familia, Prx3 y Prx5. La isoenzima Prx3 utiliza la Tiorredoxina-2 mitocondrial como dador
de electrones para su actividad peroxidásica (Watabe y col., 1997). La Tiorredoxina
oxidada es nuevamente reducida por la acción de la Tiorredoxina reductasa. La Prx3 se
induce por oxidantes y juega un papel en el sistema de defensa antioxidante y en la
homeostasis mitocondrial (Araki y col., 1999).

H2O2 + 2 Prx-SH  2 H2O + PrxS-SPrx

Trx2red + PrxS-SPrx  Trx2ox + RSH

TR
Trxox + NADPH  Trxred + NADP+

Por otro lado, los antioxidantes no enzimáticos pueden clasificarse en hidrosolubles,

tales como el ácido ascórbico, GSH, ácido úrico y N-acetil-cisteína; y en liposolubles,
como el α-tocofero, β-caroteno y ubiquinoles (Figura 9).

El glutatión (GSH) corresponde al tripéptido (-glutamil-cisteinil-glicina). El GSH no

sólo actúa como dador de hidrógeno para la familia de enzimas GPx, sino que tiene
funciones antioxidantes por sí mismo. El mecanismo molecular de prevención no sólo se
debe a la reacción directa del tiol con radicales libres, sino también a la regeneración del

22
Introducción

-tocoferol a partir de sus formas radicales (Di Mascio y col., 1991). El GSH se encuentra
en concentraciones 0.5 a 5 mM en células animales (Al-Turk y col., 1987), siendo de esta
forma, el tiol intracelular más abundante.

La ubiquinona (UQ) o coenzima Q es un compuesto liposoluble constituído por un

núcleo quinoide con capacidad redox y una cadena lateral hidrofóbica, que contiene un
número de unidades trans-isopreno (n) monoinsaturadas (Ernster y Dallner, 1995). La
principal función de la ubiquinona en sistemas biológicos es actuar como componente
redox de la cadena respiratoria mitocondrial. El ubiquinol (UQH2) es la forma reducida de
la ubiquinona (UQ) (Ernster y col., 1995). Las formas detectadas en hígado de animales y
humanos son los ubiquinoles-9 y 10, que contienen 9 y 10 unidades isoprenoide en la
cadena lateral, respectivamente. En roedores la forma predominante es el ubiquinol-9,
mientras que en humanos, un 97% del ubiquinol total corresponde a ubiquinol-10 (Åberg
y col., 1992).

3. Metabolismo mitocondrial de especies reactivas del nitrógeno

3.1. Óxido nítrico

El óxido nítrico (NO) es una de las moléculas más simples, pequeña y ubicua que
se ha encontrado en las especies animales. Es un radical libre diatómico, que se genera
a partir de la combinación de un átomo de nitrógeno (N), con 3 electrones no apareados,
con un átomo de oxígeno (O) con 2 electrones no apareados. Por lo tanto, la molécula de
NO posee un electrón desapareado en su órbita externa, lo que le confiere la propiedad
de ser un radical libre centrado en nitrógeno (Figura 10). A pesar de ello, el NO es una
especie relativamente estable con una vida media de entre 1 y 60 s (Knowles y Moncada,
1993).

23
Introducción

N NO O

σ*z
π*2p

2p
σz 2p

π2p

σ*s
2s 2s
σs

σ*s
1s
1s
σs

Figura 10. Diagrama de orbitales moleculares del óxido nítrico.

El NO es un gas incoloro a temperatura ambiente y a 1 atm de presión. Su

solubilidad máxima en agua es aproximadamente 2 mM, la cual es 2 veces superior a la
del O2 (Fukuto y col., 2000) y el coeficiente de difusión en solución acuosa es de
3.3 x 10-5 cm2. s-1. Debido a que es una molécula con carácter lipofílico y presenta
partición en medios hidrofóbicos, es capaz de difundir a través de las membranas
biológicas. Posee entre 6 y 8 veces mayor solubilidad en solventes no polares y
membranas lipídicas, que en agua. Por tal motivo, la velocidad de reacción del NO en
ambientes hidrofóbicos puede incrementarse notablemente sobre las determinadas en
agua (Liu y col., 1998).

3.1.1. Síntesis de óxido nítrico en sistemas biológicos. Oxido nítrico sintasas

El óxido nítrico es sintetizado en células de mamíferos por acción de una familia de

oxidorreductasas, las óxido nítrico sintasas (NOS), que catalizan la conversión de
L-arginina a L-citrulina, en presencia de O2 y NADPH, para producir NO y L-citrulina
(Knowles y Moncada, 1994). Por cada mol de NO formado, se consumen 2 moles de O2 y
1.5 moles de NADPH (Stuehr y Griggith, 1992).

1.5 NADPH + L-arginina + 2 O2  1.5 NADP + 2 H2O + L-ctrulina + NO

24
Introducción

La oxidación de L-arginina se produce a través de dos reacciones de

mono-oxidación sucesivas: el primer paso es la conversión de L-arginina a
N-hidroxil-L-arginina, un intermediario de reacción, que se genera como consecuencia
de la utilización de un mol de NADPH como dador de electrones; el segundo paso es la
conversión de dicho intermediario a L-citrulina, mediante la utilización de medio mol de
NADPH, resultando en la producción de NO (Alderton y col., 2001), según las siguientes
ecuaciones:

L-arg + NADPH + H+ + O2 → N-hidroxil-L-arg + NADP+ + H2

N-hidroxil-L-arg + 0.5 NADPH + 0.5 H+ + O2  L-citrulina + 0.5 NADP+ + H2O + NO

Para que la síntesis de NO ocurra, las NOS requieren de calmodulina (CaM), Ca2+ y
cofactores: (6R)-5,6,7,8-tetrahidrobiopterina (BH4), flavina adenina dinucleótido (FAD) y
flavina adenina mononucleótido (FMN) (Palmer y col., 1988; Moncada y col., 1991).

CaM
Ca2+

Reductasa

Oxigenasa

BH4 L-arginina + O2
Fe
L-citrullina + NO
NADPH FAD FMN

NADP+
CaM
Ca2+

NADPH FADH• FMNH2 Fe3+

NADP+ FADH2 FMNH• Fe2+

E´° -320 mV -280 mV -274 mV -248 mV

Figura 11.A. Esquema del dímero de la NOS que incluye la secuencia en el flujo de
electrones entre el NADPH y el hierro del dominio oxigenasa. B. Potenciales de
reducción estándar de las cuplas redox que participan en las óxido-reducciones dentro
de las NOS. Tomado de Alderton y col. (2001) y modificado.

25
Introducción

Las NOS son proteínas homodiméricas (Figura 11), compuestas por dos dominios,
un dominio reductasa y un dominio oxigenasa (Alderton y col., 2001). El dominio
reductasa contiene sitios de unión para FAD, FMN y NADPH, y un segmento que
reconoce a la CaM. El dominio oxigenasa contiene sitios de unión para el hemo
(Fe-protoporfirina IX), BH4 y L-arginina (Ghosh y Stuehr, 1995; McMillan y Masters, 1995).
Cada monómero, homodimeriza en una configuración que le permite al dominio
reductasa de un monómero estar en contacto con el dominio oxigenasa del monómero
opuesto. Dentro del dímero, los electrones aportados por el NADPH son transportados
por el FAD y la FMN en el dominio reductasa, hacia el grupo hemo del dominio oxigenasa
del otro monómero, ubicado en el extremo amino terminal. Allí es donde se encuentra
unido el O2, el cual es utilizado para sintetizar NO y L-citrulina (Griffith y Stuehr, 1995). El
pasaje de electrones está de acuerdo con los potenciales estándar de las diferentes
cuplas redox (Noble y col., 1999).

Se han identificado 3 isoformas de NOS, con pesos moleculares de 130-160 kDa

(por monomero), cada una producto de diferentes genes: la NOS neuronal (nNOS), la
NOS endotelial (eNOS) y la NOS inducible (iNOS).

Tabla 3. Propiedades estructurales y enzimáticas de las distintas isoformas de NOS

Parámetros enzimáticos Enzima

y estructurales
nNOS (NOS-I) iNOS (NOS-II) eNOS (NOS-III)

Peso molecular 160 kDa 125 - 130 kDa 133 kDa

Expresión Constitutiva Inducible Constitutiva

-9
 30 x 10 M  30 x 10 M
-9 -9
Unión a CaM >> 30 x 10 M

Cofactores NADPH, L-arginina; O2 NADPH, L-arginina; O2 NADPH, L-arginina; O2

Variantes proteicas Isoformas , ,  y  - -

Modificaciones Sitios de fosforrilación Sitios de fosforrilación Sitios de miristoilación,

postraslacionales específicos específicos palmitoilación y

fosforrilación específicos

Principales funciones Neurotransmisión Citotoxicidad Vasodilatación y tono

biológicas vascular

Enfermedades Infarto de miocardio, Shock tóxico, Disfunción endotelial,

relacionadas distrofia muscular, inflamación, hipertensión,

injuria por enfermedades hipercolesterolemia
isquemia/reperfusión autoinmunes
Tomada de Masters, 2000.

26
Introducción

Las mismas poseen diferente localización celular, regulación y propiedades

catalíticas, así como también diferente sensibilidad frente a inhibidores (Tabla 3). Según
el patrón de expresión, las NOS se clasificaron en constitutivas (nNOS y eNOS) e
inducible (iNOS). Las NOS constitutivas se expresan en niveles constantes dentro de la
célula y producen concentraciones fisiológicas de NO, el cual cumple funciones de
señalización intra e intercelular. Dichas isoformas son inactivas en su estado nativo y
requieren de la presencia de Ca2+ unido a la CaM para generar NO (Schmidt y col., 1991;
Bredt y Snyder, 1994). La isoforma inducible, se expresa ante estímulos inmunológicos y
es controlada a nivel transcripcional y traduccional. Posee una velocidad de producción
de NO más alta que las NOS constitutivas.

3.1.2. Oxido nítrico sintasa mitocondrial (mtNOS)

Dos grupos de investigación independientes, Ghafourifar y Richter (1997) y Giulivi y

col. (1998) mostraron simultáneamente que preparaciones mitocondriales purificadas de
hígado de rata generan NO, postulando la presencia de una cuarta isoforma de NOS, la
NOS mitocondrial o mtNOS. Kanai y col. (2001) aportaron evidencias importantes sobre
la existencia de la mtNOS, a través de la determinación electroquímica de la liberación de
NO, inducida por calcio, por una única mitocondria de corazón de ratón. Concluyeron que
existía una similitud entre la mtNOS y la nNOS debido a la ausencia de producción de NO
en ratones knock out para nNOS (nNOS-/-). La mtNOS fue aislada y secuenciada por el
grupo de Giulivi (Elfering y col., 2002), identificándola como la variante  de la nNOS
genómica con modificaciones post-traduccionales: (a) acilación con ácido mirístico en el
extremo N-terminal, lo que permitiría su traslado y anclaje en membrana interna luego de
su síntesis citosólica, y (b) fosforilación de la Ser-1412 del extremo C-terminal,
relacionada con la regulación de la actividad enzimática (Traaseth y col., 2004).

La mtNOS se localiza en la membrana interna mitocondrial, y, al igual que las otras

isoformas de la enzima, cataliza la reacción de oxidación de L-arginina en presencia de
NADPH y O2 para producir L-citrulina y NO (Figura 12). Esta enzima es de expresión
constitutiva y regulada por variaciones en las concentraciones de calcio (Ghafourifar y
Richter, 1997; Giulivi y col., 1998; Tatoyan y Giulivi, 1998; Traaseth y col., 2004).

La producción de NO por mitocondrias de corazón ha sido determinada utilizando

técnicas inmunohistoquímicas (goldimmunolabelling, Bates y col., 1995, 1996),
espectroscópicas (Costa y col., 2002; Boveris y col., 2003a; Valdez y col., 2004;
Zaobornyj y col., 2005), electroquímicas (Kanai y col., 2001) y fluorescentes (Zenebe y
col., 2007; Dedkova y Blatter, 2009).

27
Introducción

2H +
4H + 4H +

Cit c

Q III IV
I
II 2 e-
2e-
H+
2e- Succinato Fumarato
½ O2 + 2H + H 2O

O2 -
NADH NAD+ + H + V
ADP + Pi
ONOO-
L-citrulina + NO ATP
Matriz L-arginina
+ O2
mtNOS

Espacio intermembranas NO

Figura 12. Esquema mostrando los componentes de la cadena de transferencia de

electrones y la mtNOS en la membrana interna mitocondrial. Tomado de Ghafourifar y
Cadenas (2005) y modificado.

La actividad y/o expresión de la enzima mtNOS es regulada en situaciones

fisiológicas, patológicas y farmacológicas. Resultados de nuestro laboratorio muestran
que los estados metabólicos mitocondriales y el potencial de membrana mitocondrial
modifican la producción de NO a partir de la regulación de la mtNOS (Valdez y col., 2006;
Boveris y col., 2006). Asimismo, la actividad y/o expresión mtNOS es modificada por
importantes efectores fisiológicos, entre ellos, la presión parcial de O2 en el aire inspirado
(González y col., 2005; Zaobornyj y col., 2005), la regulación autonómica simpática (Fellet
y col., 2006), las hormonas tiroideas (Carreras y col., 2001), la insulina (Finnochietto y
col., 2008) y la angiotensina II (Costa y col., 2002). Se ha mostrado que la mtNOS es
regulada positivamente en procesos inflamatorios (Alvarez y Boveris, 2004; Vanasco y
col., 2012) y modulada positiva o negativamente por tratamientos farmacológicos con
haloperidol, clorpromazina y enalapril (Lores Arnaiz y col., 1999, 2004; Boveris y col.,
2003b), entre otros. Asimismo, cambios de actividad de la mtNOS en el ciclo ovárico en
ratas coinciden con un papel del NO en la regulación positiva de la biogénesis
mitocondrial (Navarro y col., 2005).

28
Introducción

3.1.3. Inhibidores de las óxido nítrico sintasas

La identificación de inhibidores de las enzimas NOS ha facilitado el estudio de la

síntesis de NO en sistemas biologicos. Dichos inhibidores pueden clasificarse en función
de su mecanismo de acción, del sitio al que se unen, del tiempo necesario para inhibir la
actividad enzimática, así como también de la dependencia respecto del sustrato (Tabla 4)
(Alderton y col., 2001).

Los más utilizados como herramientas experimentales son los inhibidores del grupo
de los análogos de sustrato, la L-arginina: L-monometil-L-arginina (L-NMMA), N-nitro-L-
arginina (L-NNA) y su metil éster (L-NAME), a pesar de que no presentan especificidad
por ninguna de las isoformas de la enzima, y la N-iminoetil-L-ornitina (L-NIO) que es
parcialmente selectiva para la isoforma iNOS (Knowles y Moncada, 1994).

Tabla 4. Clasificación de Inhibidores de las NOS

Inhibidores de las NOS

Modo de acción / sitio al que se unen Compuesto

Competitivos por el sitio de unión de la L-arg S-etilisotiourea; L-NIL

Análogos de sustrato L-NAME, L-NMMA, L-NNA

Inhibidores de la síntesis de BH4 4-amino-BH4, BH2, metotrexato

Antagonistas de la CaM Trifluorperazina (Inhiben la eNOS y

nNOS)

Inhibidores del grupo hemo Imidazoles (7-nitrindazol, selectivo

para nNOS)

Competitivo con el NADPH y las flavoproteínas Difenileneiodonio (DFI)

3.2. Peroxinitrito

Debido a que el O2- posee un electrón desapareado ocupando un orbital

antienlazante *, éste es capaz de reaccionar con el NO, en una clásica reacción de
terminación de radicales libres, para dar lugar a la formación de oxoperoxonitrato(1-) o
peroxinitrito (ONOO-).

NO + O2- ONOO- k ~1.9 x 1010 M-1 s-1

29
Introducción

Esta reacción está cinéticamente controlada por difusión, y su constante de

velocidad es 0.67-1.9 x 1010 M-1 s-1 (Huie y Padmaja, 1993; Goldstein y Czapski, 1995;
Kissner y col., 1997). Si bien la velocidad de formación de ONOO - depende
exclusivamente de las concentraciones de O2- y de NO, se puede reconocer, para
sistemas biológicos, dos determinantes principales de la formación de ONOO-: (a) las
cantidades relativas de NO y O2-, y (b) las reacciones de estos dos radicales libres con
otros componentes biológicos, los que limitan la concentración local de ambos.

La concentración de O2- en condiciones fisiológicas es del orden nM o pM,

usualmente 0.1 nM en la matriz mitocondrial y 10 pM en el citosol (Chance y col., 1979).
Esto se debe a su corta vida media (50-100 s), debido a la reacción de dismutación no
catalizada o catalizada por la enzima SOD, y a las reacciones redox con diversas
moléculas biológicas.

O2- + O2- + 2H+  H2O2 + O2 k ~2.0 x 109 M-1 s-1

En estas condiciones, el NO producido, en concentraciones de 50 a 150 nM, estaría en

gran exceso. Debido a que la concentración de O2- es significativamente menor a la de
NO, esta última determina la velocidad de reacción entre estos dos radicales, la cual
transforma en una reacción de pseudo primer orden respecto del O2-. Por otro lado, la
concentración de O2- determina la cantidad total de ONOO- formado en un tiempo
determinado. Así, bajo condiciones celulares normales, las concentraciones de ONOO-
son relativamente bajas ( 2-5 nM en la matriz mitocondrial; Valdez y col., 2000). Si se
considera que la constante de velocidad de la reacción de formación de ONOO- (k  1010
M-1 s-1) es aproximadamente 5 veces superior a la constante de velocidad de la reacción
de dismutación del O2- catalizada por la enzima SOD (k  2 x 109 M-1 s-1),
concentraciones fisiológicas de SOD (M) pueden competir efectivamente con el NO
por el O2-. Se ha estimado que a concentraciones fisiológicas de SOD, una concentración
de NO de aproximadamente 100 nM, reaccionaría con el 26% del O2- formado,
produciendo ONOO-, mientras que el 74% del O2- remanente dismutaría a H2O2 (Boveris
y col., 2010).

Sin embargo, mientras que la concentración de NO en estado estacionario como

mensajero celular está en el rango nM, en regiones inflamatorias, el NO podría alcanzar
concentraciones del orden ~0.3-0.5 M (Moncada y col., 1991; Poderoso y col., 1998),
reaccionando con el 50% del O2- disponible, haciendo cinéticamente importante la
formación de ONOO- (Radi y col., 2000). Es interesante recalcar que por cada 10 veces
que se incrementen las concentraciones de NO y O2-, la velocidad de formación de

30
Introducción

ONOO- aumenta 100 veces (Beckman, 1996). Asimismo, si la concentración de SOD

disminuyera por debajo del rango M, la química del ONOO- podría alcanzar fundamental
importancia. Por otro lado, así como la SOD reduce la concentración de O 2-, las
hemoproteínas, principalmente la HbO2, reducen la concentración de NO. Otro factor que
determina la concentración de NO, es su difusión a partir del sitio de formación. Todos
estos factores limitan la formación de ONOO- a regiones cercanas a la localización de las
fuentes de NO, y más importante, de O2-.

Así, en la matriz mitocondrial, los metabolismos del NO y del O 2- son

interdependientes y están ligados por la reacción de formación de ONOO- (Valdez y col.,
2000). Valdez y col. (2000) has estimado que en mitocondrias de hígado de rata, y sin
considerar el aporte citosólico de NO, la reacción de formación de ONOO- contribuye con
0.38 M ONOO-. s-1 en la matriz mitocondrial.

El ONOO- es un poderoso oxidante y nitrante que, como especie cargada, tiene

una difusibilidad limitada a través de membranas. En las mitocondrias, el ONOO- tiene
una vida media menor que en otras organelas (t½ ~ 3 a 5 ms) debido a que el entorno
mitocondrial es especialmente rico en metaloproteínas, grupos tioles y CO2. Por tal
motivo, un aumento en el estado estacionario mitocondrial de ONOO- lleva a nitración de
proteínas y/o nitrosilación de grupos tioles, ocasionando disfunción mitocondrial y/o daño
celular (Radi y col., 2002; Pacher y col., 2007).

4. Efectos del NO en sistemas biológicos

Dadas sus propiedades químicas, el NO actúa como un mensajero intra e

intercelular, lo cual le permite actuar en forma rápida y de manera local. Posee una vida
media corta porque reacciona fácilmente con O2-, O2 y hemoproteínas (Furchgott y
Vanhoutte, 1989). Por lo tanto, considerando una constante de difusión de 4 x 106 cm2. s-1
la distancia de difusión es limitada (100 - 130 m), confiriendole especificidad y eficiencia
como señal biológica (Wise y Hounghton, 1968; Beckman, 1996).

Así, el NO participa en numerosas funciones reguladoras, desde su acción como

relajante vascular y como modulador de la función neuronal (Ignarro, 1989; Moncada y
col., 1991), hasta la regulación de la respiración mitocondrial y celular (Poderoso y col.,
1996; Boveris y col., 1999a; Boveris y col., 2000a). Por este motivo, alteraciones en el
metabolismo del NO podrían conducir a estados patológicos tales como: aterosclerosis,
enfermedades coronarias, accidentes cerebrovasculares (ACV), hipertensión,
complicaciones vasculares de la Diabetes Mellitus, asma, enfermedades
neurodegenerativas, sepsis, entre otros (Wink y Mitchell, 1998).

31
Introducción

Los efectos del NO pueden clasificarse como efectos directos, por la reacción del
NO con metales o reacciones de terminación de radicales libres, y efectos indirectos que
son mediados por la formación de especies reactivas del nitrógeno (Figura 13).

Hemoglobina / Mioglobina
Guanilato ciclasa
Reacción con Citocromo Oxidasa
metales
Citocromo P450
Fe unido a proteínas

Directos
Reacciones de Radicales centrados en C
terminación con Radicales lipídicos
Efectos del radicales libres y NO2
NO
Oxidación
Especies reactivas
Reacciones del nitrógeno:
Indirectos con O2- o O2
Nitración
NO2, N2O3, N2O4,
ONOO-
Nitrosación

Figura 13. Efectos del óxido nítrico y de las especies reactivas del nitrógeno.

4.1. Papel regulador del NO en la mitocondria

4.1.1. Efecto del NO sobre la transferencia de electrones

El NO participa en reacciones de terminación de radicales libres y en reacciones

redox que ocurren en la matriz mitocondrial, en un proceso regulador de la concentración
en estado estacionario intramitocondrial del propio NO y de otras especies reactivas
(Poderoso y col., 1996; Poderoso y col., 1998; Poderoso y col., 1999; Boveris y col.,
1999a).

La velocidad de producción mitocondrial de NO es 0.9-1.4 nmol NO. min-1. mg

proteína-1 la cual lleva a una concentración en estado estacionario en la matriz
mitocondrial del orden de 100-400 nM (Knowles y col., 1990; Poderoso y col., 1998;
Boveris y col., 2006). Valdez y Boveris han mostrado que la producción de NO por
mitocondrias aisladas de corazón, hígado, riñón y cerebro de rata en estado 3 es 40-50%
menor que en estado 4 (Valdez y col., 2006; Boveris y col., 2006; Valdez y Boveris,
2007), indicando que el estado metabólico mitocondrial es un regulador de la generación
de NO. La producción y liberación de NO depende exponencialmente del potencial de

32
Introducción

membrana mitocondrial (Δ), de la misma forma que la producción mitocondrial de H2O2

(Korshunov y col., 1997; Boveris, 1977; Cadenas y Boveris,1980). La dependencia con el
potencial de membrana es más importante en el rango fisiológico de Δ (150-180 mV),
en donde pequeños cambios en el potencial ocasionan grandes variaciones en la
generación de NO por la mtNOS.

A su vez, el NO es un efectivo modulador del metabolismo energético mitocondrial

ya que ejerce múltiples efectos sobre la cadena respiratoria.

(a) El NO inhibe la actividad de citocromo oxidasa (complejo IV), en forma

reversible y competitiva con el O2 de tal manera que aumenta dramáticamente la KM de la
citocromo oxidasa, desde 1.4 M O2 en ausencia de NO hasta 3.4 M O2 en presencia de
0.2 M NO (Cleeter y col., 1994; Brown y Cooper, 1994; Takehara y col., 1996). La
inhibición de la respiración mitocondrial por el NO depende de las concentraciones de O2
y de NO, de la competencia del NO con el O2 por el sitio de unión a la enzima en el centro
activo, siendo importante la relación O2/NO, y del efecto diferencial de la inhibición del NO
según el estado metabólico mitocondrial, donde el estado de respiración activa o estado 3
es más sensible a la inhibición que el estado 4 (Antunes y col., 2004; 2007). La
concentración de NO que produce el 50% de inhibición de la actividad del complejo IV
(80-200 nM) (Boveris y col., 2010) se encuentra dentro del rango de concentraciones
fisiológicas del NO presente en los tejidos (100-360 nM) (Boveris y col., 2006; Poderoso y
col., 1998). Este hecho indica que el NO producido endógenamente es un modulador
negativo de la respiración (Shen y col., 1995; Poderoso y col., 1998; Clementi y col.,
1999).

(b) El NO inhibe la transferencia de electrones entre los citocromos b y c en el

complejo III, aumentando la producción mitocondrial de O2- (Poderoso y col., 1996) y
consecuentemente de H2O2 (Poderoso y col., 1996; Poderoso y col., 1998; Poderoso y
col., 1999; Boveris y Poderoso, 2000a; Boveris y Cadenas, 2000b; Iglesias y col., 2015).
El efecto que ejerce el NO sobre la transferencia de electrones sobre el área
ubiquinol-citocromo c reductasa (complejo III) es similar a la producida por la antimicina.
Sin embargo, poco se sabe sobre el mecanismo inhibitorio.

La sensibilidad de ambos sitios al NO se encuentra dentro de los rangos de

concentraciones fisiológicas en estado estacionario de dicho radical libre (Cadenas y col.,
2000), siendo éstas las principales acciones moduladoras del NO sobre la cadena
respiratoria mitocondrial. La importancia de ésta radica en la capacidad de disminuir el
consumo de O2 mitocondrial, cuando éste disminuye su concentración (o cuando aumenta
la concentración de NO), disminuyendo el gradiente de pO2 existente entre las

33
Introducción

mitocondrias y la sangre, permitiendo así una mejor distribución de O 2 hacia células en

condiciones desfavorables como en situaciones hipóxicas breves (Poderoso y col., 1998;
Boveris y col., 2010). Este mecanismo sensor de los niveles de O2 celulares, permitiría la
adaptación del metabolismo celular ante condiciones de hipoxia (Budinger y col., 1996).

Adicionalmente, se ha descrito que el NO o especies reactivas derivadas del NO,

inhiben la respiración mitocondrial a nivel del complejo I (NADH-deshidrogenasa). Dicho
complejo es uno de los primeros en inhibirse en forma persistente en células expuestas a
elevadas concentraciones de NO (1M) por un período prolongado, simultáneamente con
una disminución en el contenido celular de GSH (Riobó y col., 2001). Existen
controversias acerca del mecanismo inhibitorio y de la(s) especie(s) responsable(s) de
dicha inhibición. Borutaite y colaboradores (2000) han propuesto, como mecanismo de
inhibición reversible, la S-nitrosación o Fe-nitrosilación producidas, principalmente, como
consecuencia de la acción del ONOO- (Borutaite, y col. 2000), el cual es un potente
oxidante capaz de inhibir enzimas de la cadena respiratoria, dañar el ADN, los lípidos y
proteínas mitocondriales.

4.1.2. Actividad funcional de la mtNOS

La habilidad de la mtNOS de modular, a través de su producto NO, el consumo de

O2 y la producción de H2O2 es denominada actividad funcional de la mtNOS (Boveris y
col., 2003a; Boveris y col., 2003b; Valdez y col., 2005), y se considera como el principal
papel del NO como regulador intracelular en situaciones fisiológicas, patológicas y
farmacológicas.

La actividad funcional de la mtNOS se determina experimentalmente en

mitocondrias acopladas en dos condiciones, de máxima y de mínima producción de NO, y
se evalúa a través de la determinación de la velocidad de consumo de O2 o de
producción de H2O2. La máxima producción de NO se alcanza adicionando L-arginina y
SOD al medio de reacción, y la mínima por adición de HbO2 y de un inhibidor de la NOS
(Valdez y col., 2008; Valdez y col., 2005) (Figura 14).

El efecto sobre el consumo de O2 se ensaya en mitocondrias respirando en estado

3. La diferencia en el consumo de O2 en estado 3 determinada en situaciones de máxima
y minima producción mitocondrial de NO, indica la actividad funcional de la mtNOS en la
inhibición de la actividad de citocromo oxidasa.

34
Introducción

Cit c

II
Q - IV
III
2 e-
I
O2 H2 O
O2-.
-
SOD

NO + L-citrulina
H 2 O2
mtNOS
L-arginina
ONOO- + O2

H2O2
NO

Cit c

II
Q IV
III
2 e-
I

O2- H2O
O2
SOD

NO + L-citrulina
H2O2
HbO2 L-NAME - mtNOS
L-arginina
ONOO- + O2
NO3-

H2O2
NO

Figura 14. Actividad funcional de la mtNOS en la inhibición del consumo de O2 y en el

incremento de la producción de H2O2. A. En presencia de L-arginina y SOD (máxima
producción y estado estacionario de NO) y B. En presencia de L-NAME y HbO2 (mínima
producción y estado estacionario de NO).

35
Introducción

La actividad regulatoria de la mtNOS sobre la generación mitocondrial de H2O2 se

determina en mitocondrias respirando en estado 4. En este caso, los efectos son
explicados como consecuencia de la inhibición la actividad ubiquinol-citocromo c
reductasa por el NO, lo que lleva a un aumento en la generación de H2O2.

La regulabilidad de la actividad de la mtNOS puede interpretarse como una

evidencia de la importancia del NO mitocondrial como molécula moduladora del
metabolismo energético y de la señalización mitocondria-citosol en situaciones
fisiológicas, fisiopatológicas y farmacológicas.

5. Biogénesis Mitocondrial

Las mitocondrias son organelas que forman parte del complejo mecanismo de
señalización involucrado en el nacimiento, diferenciación, crecimiento, envejecimiento y
muerte celular. En las últimas décadas se ha mostrado que las mitocondrias no son
organelas estáticas, sino que están en constante movimiento y recambio: los procesos de
fusión y/o fisión mitocondrial van acompañados de variaciones del tamaño, número y
masa mitocondrial. Las mismas presentan un alto grado de plasticidad, en un complejo
proceso que puede ser desencadenado por diversos estímulos fisiológicos o procesos de
diferenciación celular (Nisoli y col., 2004). De acuerdo a las evidencias experimentales,
las mitocondrias pueden crecer y dividirse a partir de mitocondrias pre-existentes.

Durante la mitosis celular, las mitocondrias se dividen dejando, a cada célula hija,
una cantidad equivalente de mitocondrias. Mas de 1000 genes y aproximadamente un
20% de las proteínas celulares están involucradas y regulan la biogénesis mitocondrial,
entendida como la formación de mitocondrias durante el ciclo de vida de una célula y la
filogénesis y ontogénesis de las mitocondrias (Nisoli y Carruba, 2006). La biogénesis
mitocondrial es un proceso complejo que requiere de la coordinación controlada de genes
nucleares y mitocondriales, que codifican para proteínas mitocondriales. El ADN
mitocondrial (mtADN; existen entre 2 y 10 copias de mtADN por mitocondria) codifica
solamente 13 proteínas mitocondriales, mientras que el resto de las proteínas son
codificadas en el ADN nuclear. Dentro de los factores involucrados en la regulación y
coordinación de la expresión de genes mitocondriales se encuentran:

a) El co-activador 1α del receptor activador γ de la proliferación peroxisomal

(PGC-1α). Esta proteína es uno de los factores de transcripción centrales durante la
biogénesis, ya que regula coordinadamente la activación de otros factores de

36
Introducción

transcripción tales como el factor de transcripción mitocondrial A (mtTFA) y los factores

respitatorios nucleares (NRF-1 y NRF-2), entre otros (Puigserver y Spiegelman, 2003).

b) El factor de transcripción mitocondrial A (mtTFA), codificado en el núcleo, el

cual regula la interacción entre núcleo-mitocondria y cumple un papel importante en la
replicación del mtADN y su transcripción durante la biogénesis.

c) Los factores respiratorios nucleares 1 y 2 (NRF-1 y NRF-2), los cuales son

factores de transcripción codificados en el núcleo, que inducen y regulan la expresión
nuclear de genes que codifican proteínas de la cadena respiratoria mitocondrial.

Resultados recientes muestran que variaciones en los niveles intracelulares de NO

y de especies reactivas del oxígeno estarían asociados a cambios en el número de
mitocondrias, en el número de copias de mtADN, y a la expresión de genes involucrados
en la síntesis de proteínas de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial
(Gadaleta y col., 1992; Lee y col., 2000). Nisoli (Nisoli y col., 2003; Clemente y Nisoli,
2005) postula que el NO forma parte de la via de señalización que culmina en la
formación de nuevas mitocondrias.

6. El corazón: órgano dependiente de O2 y ATP

El corazón, órgano central del sistema cardiovascular, actúa bombeando sangre a

través de todo el sistema circulatorio, variando la velocidad y fuerza de contracción.

Es un tejido altamente dependiente del suministro continuo de O2, ya que más del
90% del metabolismo cardíaco es aeróbico. La tasa de utilización de O2 estimada en
cardiomiocitos humanos es de aproximadamente 60-150 mmol O2. min-1 (Sun y col.,
1998). Las funciones normales del corazón se acompañan de un aporte energético
continuo por parte de la mitocondrias, las cuales producen el 95% del ATP necesario
para las funciones cardíacas. Dicha energía es generada a través de los procesos de
β-oxidación de los ácidos grasos, de la cadena de transferencia de electrones y,
principalmente, de la fosforilación oxidativa (Marín-García y Goldenthal, 2002; Zaobornyj
y Ghafourifar, 2012).

Adicionalmente, el corazón necesita mantener un balance redox para poder

desarrollar la fuerza de contracción, particularmente en condiciones de trabajo cardíaco
incrementado. El entorno redox celular se define a partir de la contribución de las cuplas
redox presentes en el citoplasma, la matriz y el espacio intermembranas mitocondrial,
NADH/NAD+; NADPH/NADP+; GSH/GSSG y Trx(SH)2/TrxSS, en función de sus
potenciales de reducción (ΔE°´NAD(P)H/NAD(P)+ = -320 mV; ΔE°´GSH/GSSG = -240 mM y

37
Introducción

ΔE°´Trx(SH)2/TrxSS = -292 mV ) y de la concentración de las especies en su forma reducida.

(Kembro y col., 2013; Roede y col., 2012).

El corazón es un órgano insulino-dependiente, debido a que necesita de la insulina

para controlar el ingreso de glucosa al tejido, lo cual le permite regular los sustratos
presentes en la célula, para la síntesis de ATP en la mitocondria (Giacco y Brownlee,
2010).

Debido a la elevada demanda energética del tejido cardíaco, los cardiomiocitos

poseen una gran cantidad de mitocondrias (~7.2 x 109 mitocondrias por miligramo de
proteína mitocondrial, (Loud, 1968), en comparación con otros tipos celulares. Las
mitocondrias ocupan aproximadamente un 30-40% del volumen celular (Murphy y
Steenbergen, 2007; Duncan, 2011) y generan entre un 80-90% del ATP necesario para la
contractilidad y funciones cardíacas.

Modificaciones en el metabolismo energético del miocardio juegan un papel clave

en las enfermedades cardiovasculares: cada vez con mayor frecuencia se encuentran
enfermedades asociadas a anomalías en la función y estructura de las mitocondrias, tales
como la miocardiopatía dilatada e hipertrófica, defectos en la conducción cardíaca y
muerte súbita, miocardiopatía isquémica y alcohólica, miocarditis e insuficiencia cardíaca.
Deficiencias en la producción de ATP podrían resultar en una disfunción bioenergética y
falla cardíaca.

6.1. Isquemia/reperfusión cardíaca: Atontamiento miocárdico

La viabilidad de un tejido depende del aporte permanente de O2 y nutrientes, los

cuales son transportados a través de la sangre. La isquemia es una forma de hipoxia en
la que la disponibilidad de O2 está disminuida.

Los síndromes isquémicos cardíacos incluyen un grupo de entidades clasificadas

de acuerdo al tiempo de duración de la isquemia y a su fisiopatología. Abarcan desde
episodios de isquemia transitoria (menores a 20 min) sin alteraciones funcionales (Bolli y
col., 1988), hasta isquemias prolongadas posteriores a un infarto de miocardio, con
muerte y necrosis celular, que tienen como consecuencia un remodelamiento ventricular
(Olivetti y col., 1991). Cuando la isquemia es sostenida durante más de 20 min, se
produce infarto de miocardio con muerte celular y necrosis, mientras que una isquemia
transitoria, menor a 20 min, produce una disfunción ventricular post-isquémica reversible
conocida como miocardio atontado (Bolli, 1988; Heyndrickx y col. 1978).

38
Introducción

En el atontamiento cardíaco, no se observa una injuria irreversible (necrosis) y la

reserva contráctil se encuentra conservada, sin embargo se modifica la función
ventricular (Opie, 1996), caracterizada por la presencia de alteraciones mecánicas
sistólicas y diastólicas (Donato y Gelpi, 2003). La particularidad de este síndrome
isquémico es que, sin importar la duración o severidad de la disfunción post-isquémica
generada, la misma es totalmente reversible, recuperando la función ventricular normal
luego de un período de horas o días. El atontamiento miocárdico es una injuria
relativamente moderada y sub-letal, que debe diferenciarse del infarto de miocardio. Por
lo tanto, el diagnóstico del atontamiento miocárdico debe hacerse una vez que se haya
comprobado que el tejido en cuestión es totalmente viable (Bolli, 1990).

En los últimos años se han descripto nuevos síndromes isquémicos, que pueden
presentarse en pacientes sometidos a cirugías de revascularización miocárdica, terapias
con drogas trombolíticas, angioplastias, trasplantes cardíacos, pacientes con angina
estable/inestable e isquemia inducida por el ejercicio (Bolli, 1990). El estudio del
atontamiento miocárdico se incrementó en la década del '90 fundamentalmente debido a
la aparición de las terapias de reperfusión para el tratamiento de pacientes con
cardiopatía isquémica y por el crecimiento del número de pacientes que experimentan
una reperfusión espontánea como consecuencia de la lisis de un trombo mural coronario
o posterior a un espasmo coronario (Donato y Gelpi, 2003; D'Annunzio y col., 2005;
Donato y col., 2007).

Cuando el suministro de O2 al tejido es limitante como en una condición de

isquemia, disminuye el flujo en la cadena de transferencia de electrones mitocondrial y
concomitantemente, la eficiencia de la fosforilación oxidativa. Adicionalmente, se observa
una depleción en los niveles de creatina fosfato, disminución de la oxidación de ácidos
grasos y piruvato y alteraciones en la producción de ATP. En este escenario, se utiliza
como fuente de energía el ATP generado por la vía glucolítica anaeróbica, generando
acumulación de lactato, disminución del pH intracelular y acidosis, lo cual se relaciona en
forma directa con una inhibición de la función contráctil (Marín-García y Goldenthal,
2002).

De acuerdo con esto, se torna evidente que la disfunción post-isquémica es parte

de la evolución natural de la cardiopatía isquémica. Existe consenso que las especies
reactivas del oxígeno y del nitrógeno formarían parte del mecanismo fisiopatológico de
dicha disfunción, así como también modificaciones en el metabolismo y/o distribución del
calcio intracelular.

39
Introducción

El tratamiento más efectivo frente a una situación isquémica o hipóxica es la

reperfusión temprana del tejido. Sin embargo, la re-oxigenación se acompaña de un
aumento en la producción de especies reactivas del oxígeno, principalmente O2- y H2O2.

El estrés oxidativo, es un concepto que fue definido inicialmente como un

desbalance reversible entre las concentraciones de oxidantes y antioxidantes, con un
exceso de oxidantes y/o disminución de antioxidantes (Sies, 1985). Actualmente se ha
ampliado dicha definición haciendo foco en las respuestas biológicas desencadenadas,
que tienen como consecuencia una disrupción de la señalización y del control redox
generando de ese modo daño molecular (Sies y Jones, 2007). Se ha postulado que el
estrés oxidativo constituye el principal mecanismo responsable de las alteraciones
celulares observadas durante la reperfusión. Los tejidos reperfundidos, luego de un
período de isquemia, manifiestan alteraciones funcionales conocidas como “lesiones de
reperfusión” (Engelman y col., 1972; Jones, 1985). Estas lesiones se caracterizan por
disfunción mitocondrial, disrupción de la membrana plasmática, daño a estructuras
mitocondriales, daño del retículo endoplasmático, aumento de la permeabilidad vascular
y, en el caso del miocardio, aparición de arritmias ventriculares (Bernier y Hearse, 1988).

La hipótesis más aceptada sostiene que el sitio principal de generación de O2-

durante la reperfusión es la mitocondria. Durante la isquemia, la distribución de O2 al
miocardio se encuentra limitada, siendo insuficiente para que se realice el proceso de
oxidación de sustratos en la mitocondria con el fin de proveer de energía a las células
durante el período fisiológico de hipoxia (Chen y Zweier, 2014). La ausencia de O2
determina que los componentes de la cadena respiratoria mitocondrial pasen a un estado
de máxima reducción. Cuando el tejido es re-oxigenado, el escape de electrones de la
cadena respiratoria es mayor debido al aumento en la velocidad de auto-oxidación de los
principales sitios de producción de O2- (la UQH• en el complejo III y la FMNH• en el
complejo I), incrementándose la generación de O2- y de H2O2 (Gonzalez-Flecha y col.,
1993) (Figura 15).

40
Introducción

Cadena respiratoria
mitocondrial
(FMN, UQ)
Isquemia

Inhibición de la HO
transferencia de electrones

Cadena respiratoria en
estado de máxima O2- H2O2
reducción (FMNH , UQH)

O2 H2O2

Reperfusión

Figura 15. Esquema propuesto para el mecanismo responsable del aumento de la

generación de O2- y H2O2 asociados a la isquemia/reperfusión. Durante la isquemia se
produce la reducción de los componentes de la cadena respiratoria, y en la
reperfusión se incrementa la generación de H2O2. UQ y UQH, forma oxidada y
reducida de la ubiquinona; FMN y FMNH, forma oxidada y reducida de la flavina
mononucleótido del complejo I. Tomado de Gonzalez Flecha y col. (1993) y
modificado.

Existe una hipótesis alternativa que postula a la enzima xantino oxidasa (XO) como
responsable del aumento en la velocidad de generación de O2- durante la re-oxigenación.
Sin embargo, se ha observado grandes variaciones de actividad de xantino
deshidrogenada (forma nativa de la enzima XO) entre tejidos y entre especies, no
habiéndose detectado cantidades apreciables de la misma en miocardio de conejo y
humanos. Dado el marcado daño mitocondrial observado en el miocardio humano
durante procesos de isquemia/reperfusión (Godín y Shabir, 1987; Ferreira y col., 1988), la
hipótesis mitocondrial es la aceptada para tejidos con baja actividad de xantino
deshidrogenasa (Eddy y col., 1986).

6.1.1. Efecto de la Adenosina sobre la función cardíaca

Se ha observado, tanto en modelos in vivo como in vitro, que la adenosina tiene un

papel protector sobre la injuria causada por isquemia/reperfusión. La administración de

41
Introducción

adenosina exógena, o agonistas de los receptores de adenosina, previos a la isquemia

reducen el tamaño del infarto (Liu y col., 1991), mejora la recuperación de la función
ventricular durante la reperfusión (atenuando el atontamiento miocárdico) (Ogawa y col.,
1996) y prolonga el período de la contracción isquémica (Cave, 1995). Donato y Gelpi
(2003) demostraron que la administración de adenosina desde el inicio de la reperfusión,
atenúa las alteraciones tanto sistólicas como diastólicas (rigidez miocárdica) en el
miocardio atontado. Este efecto positivo es mediado por los receptores A1 de la
adenosina, sin modificación del tamaño de infarto.

6.2. Diabetes Mellitus

La Diabetes es un desorden metabólico que resulta de un incremento crónico en los

niveles de glucosa en sangre (hiperglucemia). El desbalance en los niveles de glucemia
puede ocurrir como consecuencia de un defecto en la secreción de insulina por las
células β del páncreas, Diabetes Tipo I, o por un pérdida de sensibilidad a la acción de
dicha hormona en los órganos blancos, aún con secreciones normales de insulina,
Diabetes Tipo II.

En los pacientes diabéticos, la hiperglucemia prolongada y no controlada es un

factor de riesgo para el desarrollo de enfermedades cardiovasculares, siendo una de las
principales causas de muerte. Aproximadamente, un 80% de los pacientes diabéticos
muere por falla cardíaca. La disfunción cardiovascular puede acompañarse del desarrollo
de retinopatía, nefropatía y neuropatía diabéticas. La disfunción ventricular en pacientes
diabéticos, en ausencia de hipertensión o enfermedades coronarias arteriales se
denomina cardiomiopatía diabética. Este término fue introducido en la década del ´70 por
Rubler y col. (1972) y se presenta en el 75% de los pacientes diabéticos asintomáticos,
donde la disfunción diastólica es la primera manifestación de la alteración contráctil, con
leves disminuciones en los niveles de ATP. La cardiomiopatía diabética se caracteriza por
cambios bioquímicos, mecánicos, estructurales y eléctricos del corazón, previos al
desarrollo de la disfunción diastólica (Pacher y Szabó, 2006).

La etiopatogenia de la cardiomiopatía diabética puede estar asociada tanto a la

presencia de hiperglucemia, como a cambios en el metabolismo cardíaco, lo cual puede
deberse a una disfunción mitocondrial. Durante la diabetes, el balance redox se
encuentra alterado, contribuyendo a la disfunción diastólica observada en la
cardiomiopatía diabética (Aon y col, 2015). Las alteraciones en el metabolismo
energético, el aumento del flujo de sustratos y la producción incrementada de especies

42
Introducción

reactivas del nitrógeno y del oxígeno, principalmente O2-, estarían implicados en el

desarrollo de las complicaciones cardíacas.

Dado que el corazón es un organo insulino-dependiente, que necesita de la insulina

para controlar el ingreso de glucosa al tejido, y que es un tejido altamente dependiente de
las concentraciones de O2, dependiendo de la fosforilacion oxidativa para el suministro de
energía (ATP), alteraciones en el suministro de sustratos, la acción de la insulina y a las
mal-adaptaciones metabólicas del corazón que ocurren en la diabetes tienen una gran
influencia sobre el metabolismo cardíaco. Así, las fallas cardíacas observadas en la
diabetes podrían estar asociadas a alteraciones en el metabolismo energético,
principalmente, el deterioro progresivo en la funcionalidad mitocondrial, junto con una
disminución en la producción de ATP, siendo los causantes de la progresión hacia la falla
cardíaca (Rolo y Palmeira, 2006).

43
Objetivos
Objetivos

OBJETIVOS

1. Objetivo general e Hipótesis de trabajo

El objetivo general de este trabajo de Tesis fue estudiar la relación funcional entre el
complejo I de la cadena de transferencia de electrones y la óxido nítrico sintasa
mitocondrial (mtNOS), en situaciones fisiológicas y patológicas, desde un aspecto
bioenergético y haciendo hincapié en el metabolismo de especies reactivas del oxígeno y
del nitrógeno, en mitocondrias de corazón. Se ha elegido éste órgano, ya que el corazón,
para mantener su función contráctil normal, depende significativamente de la energía
generada por fosforilación oxidativa en las mitocondrias.

La hipótesis del trabajo sostiene que la mtNOS interaccionaría física y

funcionalmente con subunidades del complejo I mitocondrial. Dicha asociación podría
constituir otro de los mecanismos reguladores del óxido nítrico (NO) sobre la cadena
respiratoria, en situaciones fisiológicas; y explicaría la disfunción del complejo I asociada
a cambios en la producción mitocondrial de NO, observada en enfermedades
neurodegenerativas, síndrome metabólico, sepsis, entre otras (Boveris y col., 2010). Cabe
mencionar que aunque se ha descripto la inactivación del complejo I y la disfuncionalidad
en la producción mitocondrial de NO, junto a modificaciones oxidativas y nitrosativas de
proteínas y lípidos en mitocondrias de cerebro en procesos neurodegenerativos, poco se
sabe respecto a este tipo de disfunción en corazón.

La verificación de la hipótesis planteada se realizó abordando el estudio (a) desde

un punto de vista fisiológico y (b) a través de dos modelos experimentales, que simulan
situaciones fisiopatológicas, en los cuales la actividad y/o expresión de la enzima
generadora del NO en la mitocondria, la mtNOS, así como la actividad del complejo I
mitocondrial, estarían modificados: atontamiento miocárdico y diabetes.

2. Objetivos específicos

2.1. Interacción funcional entre el complejo I y la mtNOS en corazón

El objetivo incluye caracterizar bioenergética y funcionalmente mitocondrias de

corazón en condiciones fisiológicas, haciendo énfasis en el estudio funcional existente

44
Objetivos

entre el complejo I de la cadena respiratoria y la mtNOS. Para ello, se utilizaron partículas

fosforilantes submitocondriales (ETPH) obtenidas a partir de corazón bovino, las cuales
consisten en vesículas de membrana interna selladas, que exponen los componentes de
la membrana interna hacia el exterior y carecen de todos los componentes mitocondriales
solubles de la matriz. Ésta preparación permite el estudio de la producción de NO, y su
modulación por el flujo de electrones de la cadena respiratoria.

2.2. Funcionalidad mitocondrial y papel del complejo I y de la mtNOS en

situaciones fisiopatológicas

2.2.1. Funcionalidad mitocondrial en atontamiento miocárdico. Efecto de la

adenosina.

Dado que el atontamiento miocárdico es una situación patológica en la cual la

disfunción ventricular revierte y no lleva a necrosis tisular, se utilizó como modelo de
isquemia-reperfusión moderada. Se estudió la función mitocondrial en corazón de conejo
sometido a una isquemia/reperfusión ex vivo, utilizando un sistema de perfusión para
órgano aislado. Cabe mencionar que se utilizó corazón de conejo debido a que, en esta
especie, la actividad de xantina oxidasa es baja y comparable con la actividad detectada
en corazón humano (de Jong y col., 1990).

Se hizo énfasis en el estudio del consumo de oxígeno tisular y mitocondrial, de la

actividad de los complejos de la cadena respiratoria, del potencial de membrana y del
metabolismo de especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno, tratando de correlacionar
los hallazgos funcionales mitocondriales con la función ventricular cardíaca. Asimismo, se
evaluó el efecto protector de la adenosina frente a las modificaciones ocasionadas por la
isquemia/reperfusión, tanto en la función ventricular como en la disfunción mitocondrial.

2.2.2. Funcionalidad y biogénesis mitocondrial cardíaca en Diabetes inducida

por estreptozotocina

Debido a que existe una predisposición no relacionada a enfermedad coronaria,

hipertensión, alcoholismo, enfermedad valvular o congénita, que hace a los pacientes
diabéticos más susceptibles al desarrollo de insuficiencia cardíaca, y que poco se sabe
sobre el papel de las especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno y la funcionalidad

45
Objetivos

mitocondrial cardíaca en dicha situación, se pretendió estudiar el papel del NO y de la

mtNOS en la función mitocondrial de corazón, utilizando el modelo de diabetes
experimental inducida por inyección de estreptozotocina en ratas Wistar macho.

Se abordó el estudio funcional mitocondrial en cuanto al consumo de oxígeno, la

actividad de los complejos de la cadena respiratoria, el potencial de membrana y el
metabolismo de especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno, pretendiendo
correlacionar los hallazgos funcionales tisulares con la función mitocondrial, así como con
la participación del NO y la ocurrencia de biogénesis mitocondrial.

46
Materiales y
Métodos
Materiales y Métodos

MATERIALES Y MÉTODOS

1. Modelos experimentales y material biológico

1.1. Modelo de atontamiento miocárdico

Se utilizaron conejos New Zeland de 1.8 - 2.0 kg de peso. Los mismos fueron
anestesiados por vía subcutánea con ketamina (75 mg. kg-1) y xilazina (0.75 mg. kg-1).
Luego, fueron eutanasiados con tiopental sódico 35 mg. kg-1). Posteriormente se les
realizó una toracotomía lateral izquierda y se les extrajo el corazón, el cual fue perfundido
con solución de Krebs-Henseleit (NaCl 118.5 mM, KCl 4.7 mM, NaHCO3 24.8 mM,
KH2PO4 1.2 mM, MgSO4 1.2 mM, CaCl2 1.25 mM y dextrosa 10 mM) en un sistema de
perfusión para órgano aislado según la técnica de Langendorff, el cual se termostatizó a
37 ºC y se equilibró con una mezcla de 95% O2 + 5% CO2 para obtener un valor de pH
entre 7.35 y 7.45. Luego de 15 min de perfusión, necesarios para alcanzar condiciones
de estabilización, se realizó una isquemia global de 15 min seguido de un período de
reperfusión de 30 min. Durante el período isquémico, los corazones se mantuvieron a una
temperatura constante por inmersión en una cámara termostatizada conteniendo agua.
Los grupos experimentales fueron divididos en función del tiempo de isquemia y
tiempo de reperfusión (Figura 16): antes de la isquemia (0/0), al finalizar los 15 min de
isquemia (15/0), luego de 15 min de isquemia y 5 min de reperfusión (15/5) y luego de 15
min de isquemia y 30 min de reperfusión (15/30).
Este protocolo experimental fue realizado en ausencia o presencia de adenosina
(0.03 µg. kg de peso-1. min-1) en el medio de perfusión (solución Krebs-Henseleit). La
adenosina se adicionó a la solución Krebs-Henseleit, durante todo el período de
estabilización (15 min), de isquemia y de reperfusión. Luego de cada tiempo de
isquemia/reperfusión, se separaron los ventrículos izquierdos (VI) de cada corazón para
realizar las determinaciones funcionales mitocondriales.

Tiempo (min) 0 15 30 60
Perf usión Isquemia Reperf usión

Tiempo I / R (min) 0/0 15/0 15/5 15/30

Figura 16. Esquema que muestra el protocolo de isquemia/reperfusión realizado,

utilizando un baño de órgano aislado según la técnica de Langendorff. El órgano fue
perfundido con una solución de Krebs-Henseleit, en ausencia o presencia de adenosina
(0.03 μg. kg-1. min -1).

47
Materiales y Métodos

1.2. Modelo de Diabetes

Se utilizaron ratas Wistar machos de 200 - 220 g de peso, provenientes del Bioterio
Central de la Facultad de Farmacia y Bioquímica, de la Universidad de Buenos Aires.
Hasta el momento de su empleo y durante todo el tratamiento, los animales fueron
mantenidos bajo condiciones de temperatura y humedad controladas, en ciclos de luz-
oscuridad de 12 horas, teniendo acceso a alimento balanceado y agua ad libitum.
La diabetes fue inducida por administración intraperitoneal de Estreptozotocina en
una única dosis de 60 mg. kg-1 de peso del animal al inicio del tratamiento (día cero). La
Estreptozotocina (STZ, Sigma - S0130) fue disuelta en una solución amortiguadora de
citrato de sodio (C6H8O7/Na3C6H5O7) 20 mM pH 4.50 en una concentración de
60 mg. ml-1. Los animales pertenecientes al grupo control fueron inyectados con vehículo,
formado por solución amortiguadora C6H8O7/Na3C6H5O7 20 mM, pH 4.50, en un volumen
de 1 ml. kg de peso-1.
Los niveles de glucemia fueron medidos 72 h post-inyección con el kit comercial
One Touch Ultra (Johnson y Johnson, Medical) y se consideraron diabéticos aquellos
animales que presentaron valores de glucemia mayores a 200 mg. dl-1.
Cuatro semanas posteriores a la inyección, las ratas fueron anestesiadas en una
atmósfera controlada de CO2 e inmediatamente se les extrajo el corazón, lo cual provocó
la muerte de los animales. Los corazones fueron utilizados para efectuar pruebas de
contractilidad cardíaca, microscopías electrónicas de tejido o para el aislamiento de
mitocondrias. En la Figura 17 se esquematiza el protocolo realizado.

Día 0 7 14 21 28

Dosaje de Control de Control de Control de Control de peso -

Glucemia peso peso peso Dosaje Glucemia
Inyección
STZ/vehículo

Sacrificio de los
animales

Figura 17. Esquema que muestra el protocolo de Diabetes inducida por STZ

48
Materiales y Métodos

1.3. Corazón de vaca

Para la obtención de inside-out particles o partículas ETPH (electron transfer

phosphorylating particles - Mg2+) y de la fracción enriquecida en complejo I, se partió de
mitocondrias aisladas de corazón bovino. Los corazones de vaca fueron provistos por un
frigorífico y transportados en forma refrigerada hasta el laboratorio.

2. Preparación de las muestras

2.1. Corazón de vaca

2.1.1. Aislamiento de mitocondrias de corazón de vaca

La obtención de mitocondrias de corazón bovino se realizó de acuerdo a la técnica

descripta por Blair (Blair, 1967) y modificada por Cadenas (Cadenas y col., 1977). El
ventrículo izquierdo del corazón fue cortado en pequeños trozos con un cuchillo y
triturado utilizando una picadora de carne (Moulinex) por 15 s. Aproximadamente 100 g
de ventrículo izquierdo de corazón fueron colocados en 200 ml de un medio de
homogeneización conteniendo manitol 0.23 M, sacarosa 0.07 M, EDTA 1 mM, Tris-HCl
10 mM (MSTE), llevado a pH 7.80. En estas condiciones el tejido se trituró utilizando una
máquina de picar manual (Braun, Minipimer MR 400) a máxima velocidad por 30 s (6
veces de 5 s cada uno). El pH fue controlado continuamente, llevándolo a pH 7.50
mediante el agregado de Trisma base 1.0 M. Los homogeneizados se centrifugaron en
una centrífuga refrigerada (Sorvall-Instruments-Du Pont, RC5S) a 1200g (2720 rpm)
durante 15 min para descartar núcleos y restos celulares. El sobrenadante conteniendo
las mitocondrias, se pasó a través de una gasa doble. El pellet se descartó y el
sobrenadante se centrifugó a 16 000g (9920 rpm) durante 15 min. El pellet obtenido se
resuspendió en solución amortiguadora MSTE en una proporción 1:4, se homogeneizó
con un homogeneizador de teflón y se centrifugó nuevamente a 16 000g (9920 rpm)
durante 20 min. Este pellet, conteniendo la fracción mitocondrial, se resuspendió en
manitol 0.23 M, sacarosa 0.07 M, Tris-HCl 30 mM, pH 7.50 (MST), adicionado con
ATP 1 mM y MgCl2 15 mM, en una proporción 1:4. Esta suspensión se congeló y
almacenó a -20 ºC hasta el día siguiente. Todos los procedimientos fueron realizados a
0-4 ºC (Boveris y col., 1976; Hatefi y Rieske, 1967).

2.1.2. Obtención de partículas fosforilantes ETPH

La fracción mitocondrial de corazón de vaca almacenada a -20 ºC se descongeló y

se diluyó en solución amortiguadora MST pH 7.5 adicionada con MgCl2 15 mM y ATP
1 mM, a fin de lograr una concentración de 20 mg proteína. ml-1. La suspensión

49
Materiales y Métodos

mitocondrial diluida se sonicó utilizando un sonicador (Branson sonifier 450), realizando

12 pulsos de 10 s cada uno con intervalos de 30 s. Durante la sonicación, la suspensión
se sumergió en un baño de hielo, agua y NaCl, con el fin de mantenerla a 0 ºC. La
suspensión sonicada se centrifugó a 15 000g (11 210 rpm), durante 10 min, para separar
las mitocondrias no desintegradas. El sobrenadante obtenido se centrifugó a 140 000g
(40 000 rpm) durante 40 min (Turrens y Boveris, 1980) utilizando una ultracentrífuga
(Beckman Optima XL-90, Beckman, USA). El pellet resultante, conteniendo las partículas
ETPH se resuspendió en MST pH 7.50 o en MST adicionado con MgCl2 5 mM y ATP
2 mM o con GSH 2 mM y succinato 4 mM. Las partículas se conservaron a -80 ºC hasta
su utilización.

2.1.3. Aislamiento de los complejos de la cadena respiratoria: Obtención de

la fracción enriquecida en complejo I

El complejo I de la cadena respiratoria fue aislado siguiendo la técnica descripta por

Hatefi y Rieske (1967) con algunas modificaciones (Cadenas y col., 1977). De acuerdo
con dichas técnicas, el complejo I fue aislado en cuatro etapas:
1) Lavado de la fracción mitocondrial. La fracción mitocondrial en una concentración
de 30 mg. ml-1, previamente obtenida como se detalla en la sección 2.1.1., fue
centrifugada en una centrífuga refrigerada (Sorvall-Instruments-Du Pont, RC5S) a
26 900g (15 000 rpm) durante 30 min. El pellet obtenido se resuspendió en una solución
amortiguadora conteniendo sacarosa 0.67 M, Tris-HCl 50 mM, histidina 1 mM, pH 8.00
(STH). Posteriormente se determinó la concentración de proteínas siguiendo la técnica de
Lowry detallada en la sección 10.
2) Separación de la fracción correspondiente a la citocromo oxidasa (complejo IV).
La fracción mitocondrial lavada se diluyó hasta una concentración de 23 mg proteína. ml-1
en solución amortiguadora STH. A dicha solución se le agregó desoxicolato de potasio
(C24H39O4K) (0.3 mg. mg proteína-1) y KCl (72 g. l-1) y se la sometió a agitación durante
30 min a 0 ºC. Posteriormente, la solución se ultracentrifugó (Beckman Optima XL-90,
Beckman, USA) a 140 000g (40 000 rpm) durante 30 min. El pellet, conteniendo la
enzima citocromo oxidasa, fue descartado. Se midió el volumen del sobrenadante rojizo,
al cual se le adicionaron 0.25 volúmenes de H2OmilliQ fría. Se volvió a realizar una
centrifugación en las mismas condiciones que en el paso anterior. De este procedimiento
se conservó el sobrenadante para ser utilizado en el paso siguiente.
3) Diálisis. Con el fin de remover el exceso de C24H39O4K y KCl, se dializó el
sobrenadante frente a 8 volúmenes de Tris-HCl 10 mM, pH 8.00, a 0 ºC, con agitación
constante durante 3 h. El dializado obtenido se centrifugó a 140 000g (40 000 rpm)

50
Materiales y Métodos

durante 75 min. El sobrenadante fue descartado y el pellet rojo (S1) se resuspendió en un

pequeño volumen de STH y se determinó la concentración de proteínas. Esta fracción se
congeló a -20 ºC durante toda la noche.
4) Fraccionamiento con C24H39O4K y acetato de amonio (CH3COONH4). La fracción
S1 se descongeló y se diluyó con STH hasta alcanzar una concentración de 10 mg
proteína. ml-1. Dicha fracción fue adicionada con desoxicolato de potasio (0.5 mg. ml-1 de
fracción S1) y CH3COONH4, preparado al 50% de saturación (16.5 ml. 100 ml-1 de
fracción S1), y se la sometió a agitación durante 15 min a 0 ºC. Posteriormente se
centrifugó a 140 000g (40 000 rpm) durante 30 min. Se obtuvo un residuo marrón claro
que se descartó y el sobrenadante resultante fue adicionado con CH3COONH4 en una
proporción de 6.4 ml por cada 100 ml de solución. La solución fue sometida a agitación
durante 15 min a 0 ºC y se centrifugó en las mismas condiciones que en el paso anterior.
Al sobrenadante resultante se le agregó CH3COONH4 (3.2 ml por cada 100 ml de
sobrenadante) con agitación constante durante 15 min a 0 ºC. Se realizó una
centrifugación final, en iguales condiciones que las detalladas previamente. Se obtuvo un
residuo marrón-rojizo conteniendo el complejo I el cual se resuspendió en STH y se
almacenó a -80 ºC. Esta fracción mitocondrial conteniendo el complejo I de la cadena de
transferencia de electrones será denominada, de acá en adelante, “fracción enriquecida
en complejo I”. La misma fue utilizada para la realización de Western Blot y para la
determinación de actividades enzimáticas. Todas las determinaciones fueron realizadas a
0-4 ºC.

2.2. Corazón de conejo y de rata

2.2.1. Obtención de cortes de tejido

Para los experimentos realizados en cortes de tejido, se emplearon corazón de

ratas macho de la cepa Wistar o ventrículo izquierdo de conejos New Zeland. Un vez
extraídos, los órganos fueron sumergidos en solución amortiguadora de Krebs compuesta
por NaCl 117.5 mM, KCl 4.7 mM, KH2PO4 1.2 mM, MgSO4 1.18 mM, CaCl2 2.5 mM,
NaHCO3 25 mM y glucosa 5.5 mM, pH 7.40 mantenida a 4 ºC, limpiados y pesados.
Posteriormente, se obtuvieron cubos de tejido de 1 mm3, seccionándolos con un bisturí
mientras permanecían sumergidos en solución de Krebs a 2-4 ºC (Navarro y col., 2005).
El peso promedio de los mismos, cuando se utilizó corazón de conejo fue de 2.1 mg, y en
el caso de los corazón de rata fue de 1.0 mg.

51
Materiales y Métodos

2.2.2. Obtención de mitocondrias de corazón de conejo

Los ventrículos izquierdos provenientes de corazones de conejo fueron pesados y

sumergidos en una solución amortiguadora compuesta por manitol 0.23 M, sacarosa
0.07 M, Tris-HCl 10 mM y EDTA 1 mM (MSTE), pH 7.40. El tejido fue cortado con una
tijera de cirugía y lavado con la misma solución amortiguadora repetidas veces hasta
obtener una preparación límpida con trozos finamente cortados. Posteriormente, el medio
se descartó y se reemplazó por MSTE fresco, en una proporción de 9 ml por cada 1 g de
tejido. Seguidamente, el tejido fue homogeneizado mediante el uso de un
homogeneizador Potter-Elvejhem con vástago de teflón. Durante el procesamiento del
tejido, la temperatura fue mantenida a 2-4 ºC.
La fracción mitocondrial se aisló mediante centrifugación diferencial de los
homogeneizados de ventrículo izquierdo de corazón, en una centrífuga refrigerada
(Sorvall-Instruments-Du Pont, RC5S) a 2-4 ºC. Se realizó una primera centrifugación a
600g (2250 rpm) durante 10 min, para descartar núcleos y restos celulares. El
sobrenadante de esta centrifugación, denominado homogeneizado total, se volvió a
centrifugar a 8000g (8200 rpm) durante 10 min. El sobrenadante resultante, corresponde
a la fracción post-mitocondrial (SPM). El pellet obtenido, correspondiente a la fracción
mitocondrial, se resuspendió en el mismo medio de aislamiento, en un volumen suficiente
para obtener una concentración final de 10 mg proteina. ml-1, y se homogeneizó
manualmente (Boveris y col., 1972; Boveris y Chance, 1973) (Figura 18).

Órgano Homogeneización

Centrif ugación 600g 10 min

SN

Pellet (se descarta)

Centrif ugación a 8000g 10 min

SN
Pellet mitocondrial

Figura 18. Esquema experimental que muestra el aislamiento de la fracción mitocondrial

a partir de ventrículo izquierdo de corazón de conejo.

52
Materiales y Métodos

2.2.3. Aislamiento de mitocondrias de corazón de rata

Las mitocondrias de corazón de ratas Wistar, utilizadas en el modelo de diabetes

experimental, fueron obtenidas por centrifugación diferencial en una centrífuga
refrigerada (Sorvall-Instruments-Du Pont, RC5S).
Los animales fueron anestesiados en una atmósfera controlada de CO2 e
inmediatamente se les extrajo el corazón, lo cual provocó la muerte de los animales. El
órgano fue sumergido en una solución amortiguadora compuesta por sacarosa 0.25 mM,
EGTA 2 mM, Tris-HCl 5 mM, pH 7.40 (STE). Los corazones fueron lavados, pesados, y
cortados utilizando una tijera de cirugía. Luego de sucesivos lavados, los cortes se
dividieron en dos partes iguales (Figura 19). En una de ellas, el tejido fue sometido a la
acción de una proteasa. Para ello, se reemplazó la solución amortiguadora STE por una
solución STE adicionada con BSA 0.5% (p/v), MgCl2 5 mM, ATP 1 mM y 2.5 U. ml-1 de
proteasa bacteriana tipo XXIV (STE-2). En la otra porción, la solución amortiguadora fue
reemplazada por STE fresco. Se incubaron ambas fracciones durante 4 min a 4 ºC y
luego de adicionar 2.5 ml de STE a cada fracción, se homogeneizaron mediante el uso de
un homogeneizador Potter-Elvejhem con vástago de teflón y se centrifugaron a 8600g
(8500 rpm) durante 10 min a 2-4 ºC. Los pellets obtenidos se resuspendieron en STE y se
volvieron a centrifugar a 800g (2600 rpm) durante 10 min. Luego, se unificaron los
sobrenadantes de ambas fracciones y se realizó una centrifugación a 8600g (8500 rpm)
durante 10 min. El pellet mitocondrial resultante se resuspendió en 4 ml de STE y se
centrifugó a 8600g (8500 rpm) durante 10 min. Este pellet, conteniendo la fracción
mitocondrial lavada, se resuspendió en un volumen aproximado de 500 µl de STE. Todos
los procedimientos fueron realizados a 0-4 ºC (Mela y Seitz, 1979) (Figura 19).

53
Materiales y Métodos

Corazón Cortes de tejido en

Sol. amortiguadora STE

STE STE-2

Incubación - 4 min a 4 ºC

Homogeneización

Centrifugación a 8600g 10 min

SN (se descarta) SN (se descarta)

Pellets
resuspensión en STE

Centrifugación a 800g 10 min

Pellet (se descarta) Se juntan los SN Pellet (se descarta)

Centrifugación a 8600g 10 min

Pellet mitocondrial
+ STE

Centrifugación a 8600g 10 min

Mitocondrias lavadas

Figura 19. Esquema experimental que muestra el aislamiento de la fracción mitocondrial

de corazón de rata.

54
Materiales y Métodos

2.2.4. Obtención de membranas mitocondriales

Para obtener membranas mitocondriales, las suspensiones mitocondriales de rata o

conejo, obtenidas previamente, fueron sometidas a tres ciclos de congelamiento-
descongelamiento y pasadas a través de una jeringa provista de una aguja calibre 15/10
(Boveris y col., 2002a).

3. Función cardíaca

3.1. Determinación de parámetros de función ventricular cardíaca estudiados

en corazón de conejo o de rata

Se realizaron pruebas funcionales cardíacas en corazón de conejo y en corazón de

rata. Los corazones fueron extraídos y colocados en un sistema de perfusión de órgano
aislado de acuerdo a la técnica de Langendorff. El medio de perfusión consistió de NaCl
118.5 mM, KCl 4.7 mM, NaHCO3 24.8 mM, KH2PO4 1.2 mM, MgSO4 1.2 mM, CaCl2
2.5 mM, y glucosa 10 mM, pH 7.20 - 7.40, equilibrado con 95% O2 / 5% CO2 a 37 ºC. Para
estimular al corazón y mantener la frecuencia cardíaca constante (conejos: 180 - 200
latidos. min-1 y ratas: 250 – 300 latidos. min-1) se utilizó un marcapaso durante todo el
experimento.
En el ventrículo izquierdo (VI) se colocó un balón de látex ligado a uno de los
extremos de un tubo rígido de polietileno, pasándolo por el anillo mitral a través de un ojal
realizado en la orejuela izquierda. El otro extremo del tubo se conectó a un transductor de
presión (Deltram II; Utah Medical System), el cual permite medir la presión en el interior
del ventrículo izquierdo y su primera derivada (+dP/dtmáx) en tiempo real. El balón de látex
se llenó con agua destilada hasta alcanzar una presión de fin de diástole del ventrículo
izquierdo (PDFVI) de 8-10 mmHg. Dicho volumen se mantuvo constante durante todo el
experimento. Se registró la presión de perfusión coronaria (PPC), a través de un
transductor de presión conectado a la línea de perfusión en un punto inmediatamente
anterior a la cánula aórtica. Todos los corazones fueron perfundidos con un flujo
constante. El flujo coronario fue controlado con una bomba peristáltica (conejos:
22 ml. min-1; ratas: 13 ml. min-1,) para conseguir una PPC inicial de 70.5 ± 4.2 mmHg,
tanto en corazón de conejo como en corazón de rata, para luego mantenerlo constante.
En un corazón perfundido a flujo constante, la PPC indica la resistencia vascular
coronaria. La presión del ventrículo izquierdo y la PPC fueron registradas en tiempo real
usando un programa de adquisición de datos (Utah Medical System, UT, USA). Se
calculó la presión desarrollada por el ventrículo izquierdo (PDVI), la cual se obtiene

55
Materiales y Métodos

restando la PDFVI a la presión sistólica pico, y se midió la +dP/dtmax, que indica la

máxima velocidad de ascenso de la presión intraventricular (contractilidad miocárdica).
En el estudio de la función diastólica se consideraron sus dos componentes: la
relajación isovolúmica (componente activo - lusitropismo) y la rigidez miocárdica
(componente pasivo). El lusitropismo se analizó evaluando el índice de relajación
isovolúmica (t50) o velocidad de relajación (Vittone y col., 1974; Marchini y col., 2013) es
decir, el tiempo necesario para que la presión intraventricular descienda hasta el 50% de
su máximo valor. Así, una mayor velocidad de relajación, se correlaciona con un menor
tiempo para que la presión intraventricular descienda al 50%, t50. La adición de agonistas
β, como el isoproterenol, generan un aumento en la velocidad de relajación, es decir, un
valor de t50 menor.
La rigidez miocárdica se expresó a través de la PDFVI. La rigidez depende de la
relación dP/dV. En un corazón isovolúmico, como es el modelo experimental utilizado, al
ser el volumen constante en la relación dP/dV, la rigidez depende de la presión, por lo
tanto la PDFVI se utiliza como índice de la rigidez miocárdica (Gonzalez y col., 2003).
Para el caso particular de los corazones de conejo, se determinaron las funciones
cardíacas basales y posteriores a los diferentes tiempos de isquemia/reperfusión, tanto
en ausencia como en presencia de adenosina en el medio de perfusión. Por otro lado, en
los corazones de ratas diabéticas, se determinó la función ventricular basal y posterior al
estímulo β-adrenérgico inducido como consecuencia de la perfusión con isoproterenol
(1 µM).

3.2. Determinación del área infartada en corazón de conejo

Luego de 120 min de reperfusión, tiempo suficiente para permitir la liberación de

deshidrogenasas y cofactores desde los tejidos necrosados, los corazones fueron
congelados. Posteriormente, se realizaron cortes transversales de 3 mm desde el ápice
hacia la base del órgano. Los cortes se incubaron con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio
1% (TTC) en una solución isotónica de KH2PO4/K2HPO4, pH 7.80 a 37 ºC durante 20 min
(Fishbein, y col. 1981). El TTC reacciona con dadores de electrones, como el NADH, en
presencia de deshidrogenasas, haciendo que las células viables se tiñan de un color rojo
intenso. Por lo tanto, el tejido viable teñido de color rojo, es fácilmente diferenciable del
tejido necrosado, que queda de color grisáceo o blanco. Luego, los cortes fueron fijados
en una solución de formalina al 10%. Las secciones fueron calcadas en hojas de acetato;
y las áreas infartadas se midieron utilizando planimetría computarizada (Analizador de
imágenes: Image Pro Plus, versión 4.5).

56
Materiales y Métodos

Cabe mencionar que en el corazón aislado, sometido a isquemia global, no es

necesario estimar la incidencia de flujo colateral, ni definir el área de riesgo con partículas
fluorescentes, ya que la misma corresponde al tejido miocárdico total.

4. Determinaciones realizadas en preparaciones mitocondriales

4.1. Determinación del consumo de O2

La determinación del consumo de O2 en cortes de tejido, mitocondrias o partículas

ETPH se llevó a cabo mediante una técnica polarográfica, utilizando oxígrafos
desarrollados para respirometría de alta resolución.
El consumo de O2 en cortes de tejido se realizó en un oxígrafo Oroboros (Oroboros
Oxygraph Paar KG, Graz, Austria). Para el consumo de O2 en mitocondrias o partículas
submitocondriales se utilizó un oxígrafo Hansatech (Hansatech Oxygraph, Hansatech
Instruments Ltd, Norfolk, Inglaterra).
Ambos oxígrafos constan de un electrodo tipo Clark. En el oxígrafo Hansatech
(modelo S1) los electrodos en están ubicados dentro de un disco de resina epoxi con un
cátodo de platino en el centro, rodeado por un surco que contiene al ánodo de plata,
estando ambos electrodos conectados por un puente electrolítico. El oxígrafo Oroboros
consta de un electrodo tipo Clark con cátodo de oro (Orbisphere, modelo 2120) con un
área de 2 mm de diámetro, que incrementa la sensibilidad y la estabilidad de la señal.
Ambos electrodos se ubican en una cámara termostatizada de volumen regulable entre
0.5 y 3.0 ml (Poderoso y col., 1994; Boveris y col., 1999b).

Previo a su utilización, los equipos fueron calibrados, según:

1. Se colocó H2O destilada en la cámara de medida, se seleccionó la
temperatura y la velocidad de agitación (350 rpm para cortes de tejido,
450 rpm para suspensiones mitocondriales) y se fijó la señal obtenida como el
100% de saturación de O2
2. Se agregó una solución concentrada de ditionito de sodio (Na2S2O4), y se fijó
la señal obtenida como el 0% de saturación de O2
3. Se lavó cuidadosamente la cámara con abundante agua destilada

4.1.1. Consumo de O2 en cortes de tejido

El consumo de O2 tisular fue determinado en cubos de tejido de 1 mm3, obtenidos

de ventrículo izquierdo de corazón de conejo o de corazón de rata. Los cortes fueron
mantenidos en una solución amortiguadora de Krebs formada por NaCl 118 mM, KCl 4.7

57
Materiales y Métodos

mM, KH2PO4 1.2 mM, MgSO4 1.2 mM, CaCl2 2.5 mM, NaHCO3 25 mM y glucosa 5.5 mM,
pH 7.40.
Para las determinaciones se utilizaron entre 2 y 4 cubos de tejido, los cuales fueron
introducidos en la cámara de medida termostatizada a 30 ºC, en 1.0 ml de solución
amortiguadora de Krebs. Se cerró la cámara de medida y se determinó el consumo de O2
durante 3 a 10 min, con agitación a 350 rpm.
Se evaluó el efecto del agregado de KCN 2 mM para diferenciar entre el consumo
de O2 mitocondrial y el proveniente de otros pasos metabólicos, como por ejemplo, el
consumo de O2 por la NADPH oxidasa, reacción que lleva a la producción de anión
superóxido (O2-).
En las condiciones de medida, a 30 ºC, la concentración de O2 disuelta es de
aproximadamente 220 M. Los resultados fueron expresados en μmol O2. min-1. g tejido-1.

4.1.2. Consumo de O2 mitocondrial

Mitocondrias de ventrículo izquierdo de corazón de conejo

Para determinar el consumo de O2 por mitocondrias de ventrículo izquierdo de

conejo, el medio de respiración consistió en manitol 0.23 M, sacarosa 0.07 M, Tris-HCl
20 mM, EDTA 1 mM, solución amortiguadora KH2PO4/K2HPO4 5 mM, MgCl2 2 mM,
pH 7.40, termostatizada a 30 ºC y con agitación a 450 rpm. En las condiciones de medida
y a 30 ºC, la concentración de O2 disuelto en el medio fue aproximadamente 220 M. Las
suspensiones mitocondriales se utilizaron en una concentración de 0.30-0.50 mg
proteína. ml-1.
La actividad respiratoria mitocondrial en estado 4, o respiración controlada, se
determinó en presencia de malato 6 mM y glutamato 6 mM, como sustratos del
complejo I, o succinato 7 mM, como sustrato del complejo II. Se estableció la respiración
activa o estado 3, utilizando los mismos sustratos más el agregado de ADP 0.5 mM.

El control respiratorio fue calculado como la relación existente entre la velocidad de

consumo de O2 en estado 3 sobre la velocidad de consumo de O2 en estado 4. Esta
relación indica el grado de integridad de las preparaciones mitocondriales, mostrando el
acoplamiento entre la transferencia de electrones y la fosforilación oxidativa.

Se determinó la actividad funcional de la mtNOS en la inhibición del consumo de

O2, en mitocondrias de ventrículo izquierdo de corazón de conejo respirando en estado 3.
Por ello, con el fin de registrar el consumo de O2 en condiciones de máxima velocidad de
producción de NO mitocondrial, se adicionó L-arginina 1 mM y CuZn-SOD 1 M a la
cámara de medida. Por el contrario, para determinar el consumo de O2 en condiciones de

58
Materiales y Métodos

una menor producción de NO mitocondrial, se realizaron la determinaciones en presencia

de L-NAME 2 mM y de oxihemoglobina (HbO2) 20 M (Valdez y col., 2005).

Mitocondrias de corazón de rata

En el caso de la determinación del consumo de O2 por mitocondrias de corazón de

ratas, el medio de respiración consistió en KCl 120 mM, KH2PO4 5 mM, EGTA 1 mM,
HEPES 3 mM, BSA 1 mg. ml-1, solución amortiguadora adicionada con malato 2 mM y
glutamato 5 mM, y llevada a pH 7.20. Cuando se utilizó succinato como sustrato, se
utilizó el medio de respiración, llevado a pH 7.20 sin el agregado de malato-glutamato. La
adición de succinato 7 mM se realizó en la cámara de medida en cada determinación.
Las medidas fueron realizadas a 30 ºC y con agitación a 450 rpm. El estado de
respiración activa o estado 3 se estableció luego de adicionar ADP 0.5 mM al medio de
reacción.
El control respiratorio fue calculado como la relación existente entre la velocidad de
consumo de O2 en estado 3 sobre la velocidad de consumo de O2 en estado 4.
La eficiencia de la fosforilación oxidativa, o moles equivalentes de fosfato
esterificado por oxígeno consumido (ADP/O) se determinó adicionando, a la cámara de
medida, una cantidad limitante de ADP (0.20 mM). El agregado de 0.20 mM de ADP
permite lograr el consumo total de dicho reactivo en el tiempo de medida, permitiendo a
las mitocondrias establecer nuevamente el estado de respiración pasiva o estado 4. La
relación ADP/O fue calculada teniendo en cuenta la cantidad de O2 consumido durante el
estado 3 y la concentración de ADP utilizada (Estabrook, 1967). Teniendo en cuenta una
relación 1:1 para la formación de ATP por cada ADP consumido, es posible determinar
los nmoles de ATP producido por ng-átomo de oxígeno consumido.

En todos los casos, el consumo de O2 fue expresado como

-1 -1
ng-át O. min . mg proteína .

4.1.3. Consumo de O2 en partículas ETPH y cálculo del porcentaje de

partículas invertidas

El consumo de O2 por las partículas ETPH se determinó utilizando el mismo medio

de respiración que el utilizado para la medición del consumo de O2 en mitocondrias de
ventrículo izquierdo de corazón de conejo, termostatizado a 30 ºC y con agitación a
450 rpm. Las suspensiones de partículas ETPH se utilizaron en una concentración de
0.20-0.40 mg proteína. ml-1. En las condiciones de medida y a 30 ºC, la concentración de
O2 disuelto en el medio fue aproximadamente 220 M.

59
Materiales y Métodos

La actividad respiratoria en estado 4 se determinó en presencia de malato 6 mM y

glutamato 6 mM, NADH 0.4 mM o succinato 7 mM. A fin de lograr el desacoplamiento de
las partículas se adicionó m-CCCP 1M. El control respiratorio (CR’) se calculó como la
relación entre el consumo de O2 por las partículas ETPH desacopladas sobre el consumo
de O2 en estado 4.
Con el fin de determinar el porcentaje de partículas con orientación inversa en la
suspensión, se estudió el efecto de la adición de citocromo c3+ 20 M sobre la velocidad
de respiración de las partículas ETPH, utilizando NADH como sustrato. Las partículas
invertidas y correctamente selladas, no poseen la capacidad de utilizar al citocromo c
exógeno como aceptor de los electrones provenientes de la oxidación del NADH y
cederlos a la citocromo oxidasa. Esto se debe a que el sitio de interacción fisiológico del
citocromo c se encuentra en el lado P de la membrana interna mitocondrial, es decir el
orientado hacia el espacio intermembranas. Así, en las vesículas invertidas, dicho sitio se
halla orientado hacia el lado interno (Harmon y col. 1974; Nicholls P, 1974). Por lo tanto,
un aumento en la velocidad de consumo de O2 luego de la adición de citocromo c al
medio de reacción, da cuenta de la proporción de partículas no invertidas o de la
presencia de fragmentos de membrana mitocondrial, donde el sitio de unión del citocromo
es accesible. La velocidad de consumo de O2 determinada en presencia de citocromo c3+
es considerada la máxima actividad respiratoria por la preparación (100%). Solo la
fracción que no puede utilizar el citocromo c exógeno, corresponde a las partículas
correctamente selladas. El porcentaje de partículas invertidas se calcula como la
velocidad de consumo de O2 en ausencia de citocromo c3+ sobre la actividad luego de la
adición de citocromo c3+.

4.2. Actividades enzimáticas determinadas en preparaciones mitocondriales

Las actividades enzimáticas fueron determinadas espectrofotométricamente

utilizando un espectrofotómetro termostatizado Beckman DU 7400 con arreglo de diodos.

4.2.1. Determinación de la actividad succinato-NAD+ reductasa en ETPH

Se determinó espectrofotométricamente a 340 nm ( = 6.2 mM-1 cm-1), a 30 ºC o a

37 ºC, midiendo la reducción del NAD+ por electrones provenientes de la oxidación del
succinato a fumarato, en condiciones de flujo invertido de electrones (Turrens y Boveris,
1980). La energía para que esta reacción ocurra proviene de la hidrólisis del ATP. Las
partículas ETPH (0.3 mg proteína. ml-1) se pre-incubaron por 3 min a 30 ºC ó a 37 ºC en
un medio que consistió en manitol 0.23 M, sacarosa 0.07 M, Tris-HCl 30 mM, pH 7.50
(MST) y en presencia de succinato 11 mM. El medio de reacción fue adicionado con

60
Materiales y Métodos

MgCl2 0.5 o 3.0 mM, KCN 0.3 o 0.6 mM y NAD+ 1.25 mM iniciándose la reacción por el
agregado de ATP 1.5 mM (Turrens y Boveris, 1980; Ernster y Lee, 1967). Con el fin de
determinar las concentraciones mínimas de MgCl2 y de KCN que permitieran una
actividad NAD+ reductasa sin diferencias significativas respecto de las concentraciones
óptimas descriptas (3.0 mM MgCl2, 0.6 mM KCN), se realizaron curvas en función de la
concentración de ambos reactivos: MgCl2 entre 0.25 y 3.0 mM, y KCN entre 0.05 y
0.6 mM.
Se determinó el efecto del inhibidor de la cadena de transporte de electrones
mitocondrial rotenona (1 M), del inhibidor de la F0F1-ATPasa oligomicina (0.25 M) y del
desacoplante m-CCCP (1 M) sobre la actividad NAD+ reductasa.
Los resultados se expresaron como nmol NADH. min-1. mg proteína-1.

4.2.2. Determinación de la actividad de NADH-citocromo c reductasa

(complejos I-III)

La actividad de NADH:citocromo c reductasa o complejos I-III, fue determinada

siguiendo la oxidación de NADH por el citocromo c3+ a 550 nm ( = 19 mM-1 cm-1), según
la siguiente reacción:

NADH + citocromo c 3+ NAD+ + citocromo c 2+

La mezcla de reacción consistió en solución amortiguadora KH2PO4/K2HPO4

100 mM, pH 7.40, membranas mitocondriales (0.25 mg proteína. ml-1), NADH 0.2 mM,
KCN 0.5 mM, y citocromo c3+ 25 M. La presencia de KCN en el medio, inhibe la
re-oxidación del citocromo c2+ generado.
Las medidas se realizaron a 30 ºC. Los resultados se expresaron como
nmoles citocromo c2+. min-1. mg proteína-1.

4.2.3. Determinación de la actividad de NADH-ubiquinona reductasa

(complejo I)

La actividad de NADH:coenzima Q oxidorreductasa o complejo I fue determinada

siguiendo la oxidación de NADH por la coenzima Q1 a 340-380 nm ( = 5.5 mM-1 cm-1)
(Estornell y col. 1993). La reacción estudiada fue:

NADH + H+ + coenzima Q1  NAD+ + (coenzima Q)H2

61
Materiales y Métodos

La actividad del complejo I fue determinada en partículas ETPH, mitocondrias

ventrículo izquierdo de corazón bovino y en la fracción enriquecida en complejo I, en un
medio de reacción consistente en Tris-HCl 10 mM, KCl 50 mM, EDTA 1 mM, pH 7.40,
KCN 2 mM, CoQ1 50 M, antimicina 1 M, NADH 75 M. La concentración de proteínas
en el medio de reacción fue de 7.5 - 20 µg. ml-1 (dependiendo de la preparación
mitocondrial). Se consideró como actividad específica del complejo I aquella que fue
sensible a la inhibición por rotenona 1 M. Las medidas fueron realizadas a 30 ºC. Los
resultados se expresaron como nmol de NADH oxidado. min-1. mg proteína-1.

4.2.4. Determinación de la actividad de succinato-citocromo c reductasa

(complejos II-III)

La determinación de la actividad de la succinato-citocromo c reductasa o

complejosII-III, fue determinada siguiendo la oxidación de succinato por el citocromo c3+ a
550 nm (= 19 mM-1 cm-1), según la siguiente reacción:

succinato + citocromo c 3+  fumarato + citocromo c 2+

La mezcla de reacción consistió en solución amortiguadora KH2PO4/K2HPO4

100 mM, pH 7.40, membranas mitocondriales (0.25 mg. ml-1), succinato 5 mM, KCN
0.5 mM y citocromo c3+ 25 M. Las medidas se realizaron a 30 ºC. Los resultados se
expresaron como nmoles citocromo c reducido. min-1. mg proteína-1.

4.2.5. Determinación de la actividad de citocromo oxidasa (complejo IV)

La actividad de la citocromo oxidasa (complejo IV) se evaluó a través de una

técnica espectrofotométrica (Yonetani y Ray, 1965), la cual se fundamenta en la
determinación de la velocidad de oxidación de citocromo c2+, según la siguiente reacción:

2 citocromo c2+ + O2 + 4 H+  2 citocromo c3+ + 2 H2O

Dicha reacción corresponde a una cinética de pseudo-primer orden con respecto a

la concentración de citocromo c2+. Por tal motivo, la actividad de citocromo oxidasa se
expresa en función de la constante cinética (k´), la cual se determina a partir de la
pendiente de la curva del gráfico del logaritmo natural de la absorbancia en función del
tiempo (Figura 20). Asimismo, dicha actividad puede expresarse como nmoles de
citocromo c oxidado, considerando que 20 µM de citocromo c2+ son oxidados por minuto

62
Materiales y Métodos

por miligramo de proteína. Este dato está de acuerdo con las velocidades fisiológicas de
transferencia de electrones descriptas (Antunes y col., 2004; Navarro y Boveris. 2007).

-0,5
0,55

0,50

Absorbancia 550nm
-0,6
0,45

0,40
Ln Absorbancia 550nm

-0,7
0,35

0,00
0 10 20 30 40 50 60
-0,8 tiempo (s)

-0,9

-1,0

-1,1
0 10 20 30 40 50 60

tiempo (s)

Figura 20. Determinación de la actividad de citocromo oxidasa. Rectificación del gráfico

inserto, aplicando logaritmo natural a los valores de absorbancia, para calcular la
constante k’. Inserto: trazado que muestra la variación de absorbancia a 550 nm en
función del tiempo.

La actividad enzimática se estudió siguiendo la disminución de la absorbancia del

citocromo c2+ a 550 nm ( = 19 mM-1 cm-1). El medio de reacción consistió en solución
amortiguadora KH2PO4/K2HPO4 100 mM, pH 7.40 y citocromo c2+ 50 M en presencia de
membranas mitocondriales (0.02 mg proteína. ml-1) (Navarro y Boveris, 2004). Las
medidas se realizaron a 30 ºC. La actividad de citocromo oxidasa, velocidad de oxidación
del citocromo c2+, se expresó en función de la constante de pseudo-primer orden de la
reacción k´ en min-1 mg proteína-1 y como nmol citocromo c3+. min-1. mg proteína-1
(Antunes y col., 2004; Navarro y Boveris, 2007).

Preparación del citocromo c2+: El citocromo c2+ se preparó mediante reducción de

citocromo c3+ (6.5%, p/v) en presencia de exceso de Na2S2O4. Posteriormente, se separó
el citocromo c2+ del agente reductor mediante una cromatografía de exclusión, utilizando
una columna de Sephadex-G25. La solución así preparada se fraccionó en alícuotas y se
conservó a -20 ºC. El reactivo se utilizó solamente cuando la relación entre las lecturas de
absorbancia del mismo a 550 nm y 565 nm fuera mayor o igual a 6.

63
Materiales y Métodos

4.3. Determinación del contenido de citocromos

El contenido de citocromos de las partículas ETPH se determinó utilizando un

espectrofotómetro Beckman DU 7400 con arreglo de Diodos. Se realizaron barridos
espectrales de las muestras, entre 500 y 650 nm, en presencia de Na2S2O4, para lograr la
reducción de los citocromos, o en ausencia del mismo (forma oxidada de los citocromos).
El contenido de citocromos se determinó a través de la diferencia entre los espectros en
presencia de Na2S2O4 menos en ausencia del mismo, es decir el que corresponde a la
determinación de los citocromos en estado reducido menos al correspondiente en estado
oxidado.
Los contenido de cada uno de los citocromos fue determinado utilizando los
siguientes pares de longitudes de onda y sus respectivos coeficientes de extinción molar:
citocromos c + c1, 550-540 nm y 19 mM-1 cm-1; citocromos b, 562-575 nm y 22 mM-1 cm-1;
citocromos a + a3, 605-630 nm y 21 mM-1 cm-1.
El contenido de citocromos se expresó como nmol. mg proteína-1 (Boveris y col.,
1971).

4.4. Determinación del potencial de membrana mitocondrial por citometría de

flujo

La citometría de flujo es una herramienta de análisis que permite discriminar

células, organelas subcelulares o partículas de diferente tamaño y complejidad, de
manera de poder cuantificar propiedades bioquímicas y/o moleculares de las mismas. Por
esta técnica se pueden analizar las características físicas tales como el tamaño, medido
por la luz con desviación frontal (Forward Scatter, FSC), y la complejidad, determinada
por la luz con desviación lateral (Side Scatter, SSC).
A partir del análisis de estas propiedades se seleccionó la población de
mitocondrias a analizar (entre 30 000 y 50 000 eventos), excluyendo restos celulares y
mitocondrias dañadas. Para seleccionar la población mitocondrial se utilizó naranja de
nonilacridina (NAO) 100 nM, una sonda con capacidad de unirse selectivamente a la
cardiolipina, fosfolípido que se encuentra en alta proporción en la membrana interna
mitocondrial (Petit y col., 1992).
La utilización de sondas potenciométricas permiten detectar cambios en el potencial
de membrana mitocondrial. Se utilizó una sonda catiónica lipofílica, ioduro de
3,3’-dihexiloxacarbocianina (DiOC6; Figura 21), la cual es selectiva para mitocondrias.
Debido a su naturaleza catiónica, dicha sonda es capaz de ingresar y acumularse en la
matriz mitocondrial emitiendo flourescencia verde (Vasileios Fotopoulos, 2012). La

64
Materiales y Métodos

despolarización de la membrana, permite la salida de la sonda al exterior de la

mitocondria, por lo que la señal registrada disminuye.

Figura 21. Estructura de la sonda potenciométrica catiónica ioduro de

3,3’-dihexiloxacarbocianina (DiOC6).

El potencial de membrana mitocondrial se determinó, en mitocondrias de corazón

de ratas, por citometría de flujo utilizando un citómetro Partec PAS-III (PartecGmbH,
Münster, Alemania) equipado con un láser de argón de 488 nm (Bustamante y col.,
2004).
Las mitocondrias aisladas se diluyeron a una concentración de 0.5 mg proteína. ml-1
en una solución amortiguadora conteniendo manitol 0.20 M, sacarosa 0.07 M, Hepes
0.55 mM y KH2PO4/K2HPO4100 mM, pH 7.40 (MSHP).
Para seleccionar la población mitocondrial, 5 l de la suspensión diluida en MSHP
se incubó con la sonda NAO en una concentración 7.5 µM, durante 20 min en oscuridad y
a 37 ºC. Las mitocondrias fueron seleccionadas de acuerdo a las propiedades de
dispersión de la luz (light scattering properties) para descartar restos celulares y
mitocondrias pequeñas. Se seleccionaron 30 000 eventos por muestra dentro de la
ventana R1.
Por otro lado, otra alícuota de 5 l de la suspensión mitocondrial diluida en MSHP
se incubó con la sonda potenciométrica DiOC6, durante 20 min en oscuridad y a 37 ºC. La
señal de DiOC6 se analizó en el canal FL-1 con el Programa Cyflogic (CyFlo Ltd., Turku,
Finlandia). La auto-fluorescencia mitocondrial se evaluó incubando la muestra en las
mismas condiciones, pero en ausencia de la sonda DiOC6. Los cambios en el potencial
de membrana se realizaron estableciendo el estado 4, utilizando malato 2 mM y
glutamato 5 mM o succinato 8 mM como sustratos, y en estado 3, tras la adición de ADP
1 mM al medio de reacción. La despolarización total inducida con 40 µM de m-CCCP se
utilizó como un control positivo (Czerniczyniec y col., 2011; Marchini y col., 2013)

65
Materiales y Métodos

4.5. Determinación de la producción de ATP

La cinética de producción de ATP se determinó utilizando el sistema luciferina-

luciferasa (Leach y Webster, 1986), donde la luminiscencia generada es directamente
proporcional a la concentración de ATP (Drew y Leeuwenburg, 2003). El ATP generado
reacciona con la luciferasa para formar luciferil-adenilato y fosfato inorgánico (Pi), en la
superficie de la enzima luciferasa. Mientras el luciferil-adenilato se encuentra unido a la
enzima, se combina con O2 para formar oxiluciferina y AMP a través de una serie de
reacciones enzimáticas. Cuando la oxiluciferina y el AMP son liberados de la superficie
de la enzima, se produce conjuntamente un cuanto de luz proporcional a la cantidad de
ATP producido. Dicha emisión de luz (h) puede ser detectada utilizando un luminómetro.
El mecanismo propuesto para dichas reacciones es el siguiente:

luciferasa + luciferina + ATP  luciferasa-luciferil-AMP + Pi

luciferasa-luciferil-AMP + O2  luciferasa + oxiluciferina + AMP + CO2 + h

Figura 22. Estructura de la D-luciferina, sustrato de la enzima luciferasa utilizada en la

medición de la producción de ATP.

La producción de ATP se determinó en mitocondrias aisladas (0.15-0.50 mg

proteína. ml-1) en un medio de reacción compuesto por KCl 120 mM, Tris-HCl 20 mM,
EDTA 1.6 mM, BSA 0.08%, solución amortiguadora K2HPO4/ KH2PO4 8 mM, MgCl2
0.08 mM, pH 7.40 (solución amortiguadora A) y Tris-acetato 0.50 M, D-luciferina
0.80 mM, luciferasa 20 µg. ml-1, pH 7.75 (solución amortiguadora B). La producción de
ATP se inició con el agregado de malato 3 mM y glutamato 1.25 mM ó succinato 8 mM y
ADP 0.1 mM al medio de reacción. Como línea de base, se utilizó la señal detectada en
presencia de oligomicina 2 M, la cual inhibe al componente Fo de la ATPasa. Dado que
el ATP se forma no solo a través de la fosforilación oxidativa mitocondrial, sino también
por otras vías metabólicas, se agregó al medio de reacción un inhibidor de la actividad de
adenilato quinasa, di(adenosina) pentafosfato 150 µM (Vives-Bauza y col., 2007).

66
Materiales y Métodos

Procedimiento

Adición de Solución amortiguadora A + Solución amortiguadora B

Medición de la Quimioluminiscencia basal

Adición de la muestra

Medición del contenido de ATP inicial

Adición de Sustratos + ADP

Medición de la Quimioluminiscencia durante 3 min cada 15 s

Las mediciones de la quimioluminiscencia emitida en función del tiempo se

realizaron en un contador de centelleo LabSystem Luminoskan EL microplate reader
(LabSystem, MN, US) determinando la quimioluminiscencia cada 15 s durante 3.5 min.
Las determinaciones fueron realizadas a 30 ºC.
Se realizó una curva de calibración utilizando concentraciones crecientes de ATP
como estándar (0 -100 nmoles; Figura 23) (Leach y Webster; 1986; Wibom y col., 2002;
Drew y Leeuwenburgh, 2003; Vives-Bauza y col., 2007). Los resultados de la producción
de ATP se expresaron como nmoles de ATP. min-1. mg proteína-1.

67
Materiales y Métodos

Unidades arbitrarias
3

1
-1
m = UA. nmol ATP

0
0 20 40 60 80 100 120

[ATP] (nmol)

Figura 23. Curva de calibración para la determinación de ATP.

5. Determinación de la producción de peróxido de hidrógeno y óxido nítrico en

preparaciones mitocondriales

5.1. Producción mitocondrial de peróxido de hidrógeno (H2O2)

La velocidad de producción mitocondrial de H2O2 fue evaluada en mitocondrias

intactas a través de la técnica fluorométrica que utiliza peroxidasa de rábano rusticano
(HRP) en presencia de escopoletina (6-metoxi-7-hidroxi-1, 2 benzopirano). La
escopoletina es un compuesto fluorescente en su forma reducida (EH2) y no fluorescente
en su forma oxidada (E) (Boveris, 1984). La Figura 24 ilustra la reacción entre el H2O2 y la
escopoletina, catalizada por la enzima HRP.

Figura 24. Reacción entre el H2O2 y la escopoletina, catalizada por la enzima HRP.

68
Materiales y Métodos

Las siguientes ecuaciones muestran el mecanismo de la reacción. El H2O2 forma el

complejo enzima-sustrato con la peroxidasa. La escopoletina (EH2) reacciona con el
complejo HRP(H2O2), dando lugar a la formación de escopoletina oxidada (E) (Boveris y
Chance, 1973; Boveris, 1984).

HRP + H2O2 → HRP(H2O2)

HRP(H2O2) + EH2 → HRP(•OH) + EH• + H2O

HRP(•OH) + EH• → HRP + H2O + E

Las determinaciones se llevaron a cabo a 30 ºC durante 2 min y la intensidad de

fluorescencia de la escopoletina se detectó mediante el uso de un espectrofluorómetro
Hitachi F-3010, empleando 365 nm y 450 nm como longitudes de onda de excitación y de
emisión, respectivamente (Boveris y col., 2002b). El medio de reacción consistió en
manitol 0.23 M, sacarosa 0.07 M, Tris-HCl 20 mM, pH 7.40, HRP 1 M, escopoletina
1 M y Cu,Zn-SOD 0.5 M. El H2O2 intramitocondrial es producto de la dismutación del
O2-, sin embargo parte de este O2- puede pasar al citosol antes de transformarse en H2O2.
El agregado de SOD al medio de reacción convierte estequiométricamente el O2- en
H2O2, permitiendo determinar la producción de H2O2 intramitocondrial total.
La velocidad de producción de H2O2 se determinó en mitocondrias de ventrículo
izquierdo de conejo o en mitocondrias de ratas en estado 4, utilizando malato 6 mM y
glutamato 6 mM ó succinato 8 mM, como sustratos. La suspensión mitocondrial fue
utilizada en una concentración de 0.1 a 0.3 mg proteína. ml-1.
Para determinar la producción máxima de H2O2 proveniente del O2- generado por el
complejo I, se agregó rotenona 1 µM al medio de reacción. Con el fin de determinar la
producción de O2- máxima proveniente del complejo I y del complejo III, las
determinaciones se realizaron en presencia de antimicina 1 M.
Los valores de producción de H2O2 se calcularon en base a una curva de
calibración que permitió relacionar los valores de fluorescencia con la concentración de
H2O2. La misma se realizó con concentraciones de H2O2 crecientes, desde 0.05 a
0.35 M utilizando soluciones de H2O2 previamente tituladas espectrofotométricamente a
240 nm ( = 43.6 M-1. cm-1).
La producción de H2O2 se expresó como nmol H2O2. min-1. mg proteína-1.

69
Materiales y Métodos

5.2. Determinación de la producción de óxido nítrico (NO)

La producción de NO se determinó siguiendo la velocidad de oxidación de

oxihemoglobina (HbO2, forma ferrosa) a metahemoglobina (metaHb, forma férrica) a
37 ºC, en el medio de reacción correspondiente, saturado con aire ([O2] = 185 M). La
técnica se basa en la reacción directa entre el NO y la forma oxigenada de la HbO2,
dando lugar a la formación de metaHb y NO3-. La reacción involucra la oxidación de un
Fe2+ de un grupo hemo de la HbO2 a Fe3+, producida por una molécula de NO, según la
siguiente ecuación:

Hemoglobina (Fe2+-O2) + NO  Hemoglobina (Fe3+) + NO3-

Originalmente, esta técnica fue descripta para modelos experimentales utilizando

cultivos celulares y órganos perfundidos (Ignarro y col., 1987; Murphy y Noack, 1994), en
la cual se utilizaba la banda  de la HbO2 para seguir la producción de NO.
Posteriormente, fue modificada para su uso en modelos celulares y mitocondriales;
adaptada para su realización en cubetas de espectrofotómetro y utilizada teniendo en
cuenta los cambios de absorbancia en la banda  de la HbO2 (Carreras y col., 1996;
Boveris y col., 2002b; Valdez y Boveris, 2001). En la Figura 25 se observa un espectro
característico de la banda  de la HbO2.

545 nm
581 nm
Absorbancia

530 nm
591 nm

Longitud de onda (nm)

Figura 25. Espectro de absorción de la HbO2 con picos máximos a 545 y 581 nm, y
puntos isosbésticos a 530 y 591 nm. Cambios espectrales cada 30 s debidos a la
oxidación producida por el agregado de GSNO 200 M en presencia de DTT 40 M.
Adaptado de Boveris y col., 2002b.

70
Materiales y Métodos

Dado que el O2- y el H2O2 pueden reaccionan con la HbO2 o con la metaHb, debe
agregarse SOD y catalasa al medio de reacción en el que se determina la producción de
NO. La catalasa contiene un grupo hemo y, por consiguiente, presenta absorción en la
zona de la banda  de la HbO2. Sin embargo, dicha enzima no absorbe en el rango de
longitudes de onda de 550 a 600 nm (banda ). Además, la banda  permite la utilización
de una concentración de grupo hemo entre 20 y 40 M, la cual no sólo puede atrapar
efectivamente al NO sino que es más adecuada en condiciones de gran turbidez de la
muestra, tal como es el caso de suspensiones celulares o mitocondriales. Esto se debe a
que las longitudes de onda de medida (577 nm) y de referencia (punto isosbéstico, 591
nm) se encuentran muy próximas en la región roja del espectro.
En la Figura 25 se puede ver que la HbO2 posee máximos de absorción a 545 y 581
nm, y dos puntos isosbésticos a 530 y 591 nm.
La determinación de la velocidad de oxidación de HbO2 se efectuó registrando la
diferencia entre la absorbancia en la longitud de onda de medida (577 nm) y la
absorbancia en la longitud de onda de referencia en uno de los puntos isosbésticos de la
HbO2 (591 nm) (Boveris y col., 2002b). Se realizaron lecturas cada 2 s durante un período
de 2 a 3 min.
Para considerar solamente la oxidación de HbO2 debida a la formación de NO, en
todos los casos se realizaron controles adicionando inhibidores de las NOS tales como
L-Nω-monometil-L-arginina (L-NMMA) o L-NG-Nitroarginina metil ester (L-NAME) 2 mM.
Para calcular la producción de NO, solo se consideró la oxidación de HbO2 sensible a los
inhibidores.
Los cambios de absorbancia se expresaron como nmol NO. min-1. mg proteína-1.

Titulación de la solución de oxihemoglobina: La HbO2 es una molécula tetramérica

de peso molecular 68 kDa, que contiene un grupo hemo por monómero. Se preparó una
solución 200 M de HbO2 (800 M, expresada por grupo hemo) disolviendo 13.6 mg de
HbO2 en 1 ml de solución amortiguadora HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N´-
etanosulfónico) pH 7.40. La concentración de HbO2, expresada en M, se calculó
teniendo en cuenta el peso molecular del monómero (17 kDa), y la determinación de la
absorbancia de la solución a 577 nm y a 630 nm. Debido a que la HbO2 posee un pico
máximo de absorción a 577 nm, y la metaHb a 630 nm, la ecuación utilizada para calcular
la concentración de HbO2 fue:

[HbO2] = (66 x Abs577 nm) - (80 x Abs630 nm)

71
Materiales y Métodos

5.2.1. Producción de NO por membranas mitocondriales

La determinación de la producción de NO se realizó en membranas mitocondriales

de ventrículo izquierdo de conejos o de corazón de ratas en un medio conteniendo
KH2PO4/K2HPO4 50 mM, pH 7.40 en presencia de CaCl2 1 mM, L-arginina 1 mM, NADPH
100 M, ditiotreitol (DTT) 10 M, CuZn-SOD ~4 M, catalasa ~0.1 M, L-arginina 1 mM y
HbO2 20 M (expresada por grupo hemo), a 37 ºC. La concentración de proteínas
utilizada fue entre 0.15 - 0.25 mg de proteína. ml-1 (Boveris y col., 2002b).

5.2.2. Producción de NO por partículas ETPH y por la fracción enriquecida

en complejo I

Utilizando NADPH como dador de electrones

Se determinó la producción de NO sostenida por la actividad de la enzima mtNOS

en partículas ETPH (0.2 - 0.4 mg proteína. ml-1) y en la fracción mitocondrial enriquecida
en complejo I (0.05 - 0.10 mg proteína. ml-1), en un medio conteniendo solución
amortiguadora MST, pH 7.50, CaCl2 1 mM, NADPH 100 M, DTT 10 M, CuZn-SOD
~4 M, catalasa ~0.1 M, L-arginina 1 mM y HbO2 20 M.

Utilizando la cadena respiratoria mitocondrial como fuente de electrones

Con el fin de estudiar la producción de NO sostenida por los electrones

provenientes del flujo reverso de la cadena respiratoria, se determinó la producción de
NO en partículas ETPH en presencia de los sustratos y cofactores de la enzima y en
presencia de los reactivos necesarios para establecer el flujo reverso. Las partículas
ETPH (0.2 - 0.4 mg proteína. ml-1) fueron pre-incubadas por 3 min a 37 ºC en solución
amortiguadora MST, pH 7.50 y en presencia de succinato 11 mM. En el medio de
reacción se agregaron CaCl2 1 mM, MgCl2 0.5 mM, DTT 10 M, CuZn-SOD ~4 M,
catalasa ~0.1 M, KCN 0.3 mM, L-arginina, 1 mM, HbO2 20 M y ATP 1.5 mM.
Con el fin de correlacionar la producción de NO sostenida por el flujo reverso de
electrones con los cambios en la transferencia de electrones mitocondrial y cambios del
potencial de membrana, se analizó el efecto del inhibidor de la transferencia de
electrones mitocondrial rotenona (1 µM), del inhibidor de la F 0F1-ATPasa oligomicina
(0.25 µM) y del desacoplante m-CCCP (1 µM).

72
Materiales y Métodos

5.2.3. Producción de NO por la enzima nNOS recombinante

La producción de NO por la enzima nNOS recombinante (N3033, de cerebro de rata

Sigma Chemical Co.) se determinó en un medio de reacción formado por HEPES 50 mM,
pH 7.40, CaCl2 1 mM, NADPH 100 µM, DTT 170 µM, tetrahidrobiopterina (BH4) 12 µM,
calmodulina (CaM) 1 µM, HbO2 5 µM y 0.2 - 0.7 l de nNOS (0.05 a 0.18 U nNOS)
(Figura 26). Los experimentos fueron realizados en ausencia o presencia del cofactor
calmodulina (1 µM) y del inhibidor rotenona (1 µM).
Los cambios de absorbancia fueron expresados como nmol NO. min-1. Ue-1.

0.20

0.16
Producción de NO
(nmol NO.min-1)

0.12

0.08

0.04

0.00
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8

Volumen nNOS (ul)

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20

Unidades enzimáticas (U nNOS)

Figura 26. Producción de NO por la enzima recombinante nNOS en función del

volumen de la enzima y de las unidades enzimáticas en cubeta.

6. Determinación de la actividad de superóxido dismutasa (SOD) en

membranas mitocondriales

La actividad de la enzima SOD se determinó utilizando un espectrofotómetro

Beckman DU 7400 siguiendo la velocidad de reducción de citocromo c3+ parcialmente
acetilado a citocromo c2+ (550 - 540 nm; ε = 19 mM-1 cm-1) a través de la reacción no
enzimática con el O2-. Se utilizó el sistema xantina-xantina oxidasa como fuente
generadora de O2- (McCord y Fridovich, 1969; Flohé y Gunzler, 1984).

73
Materiales y Métodos

xantina + xantina oxidasa  O2- + hipoxantina

La enzima SOD compite por el O2-, disminuyendo la velocidad de reducción del

citocromo c3+ parcialmente acetilado, como se muestra en las siguientes reacciones:

citocromo c3+ + O2-  citocromo c2+ + O2

SOD
O2- + 2 H+  H2O2 + O2

Se utilizó citocromo c parcialmente acetilado debido a que las muestras en estudio

contenían actividad de citocromo oxidasa y de citocromo reductasa, pudiendo ocurrir
reacciones de reducción del citocromo c3+ independientes de la reacción con el O2-. El
citocromo c3+ parcialmente acetilado es reducido por la cadena respiratoria y oxidado por
la citocromo oxidasa a una velocidad menor que la correspondiente al citocromo c3+
nativo (10.5 nmol. min-1. mg proteína-1 vs. 178 nmol. min-1. mg proteína-1, respectivamente
- 94% de reducción), pero conserva la capacidad de ser reducido por el O2- a una
velocidad similar a la de éste último. Se considera que la reducción de citocromo c
sensible al agregado de SOD o de la muestra, es atribuible al O2-.
La actividad de la enzima Mn-SOD se determinó en una mezcla de reacción
conteniendo KH2PO4/K2HPO4 50 mM, EDTA 0.1 mM pH 7.80, citocromo c3+ parcialmente
acetilado 10 M, xantina 50 M y xantina oxidasa (XO ~5 nM) en cantidad suficiente para
producir una variación de absorbancia por minuto de 0.025 a 25 ºC. La reacción se inició
por el agregado de XO y se monitoreó la variación de la absorbancia durante 2 min, en
ausencia o presencia de membranas mitocondriales (0.3 – 1.0 mg proteína. ml-1).

Dado que la isoforma CuZn-SOD es sensible a la inhibición por KCN, se realizaron

experimentos en presencia de KCN 0.50 mM. De esta forma, la actividad de SOD
detectada en presencia de KCN corresponde a la actividad de la isoforma Mn-SOD. En
las condiciones experimentales ensayadas, en las que se utilizó citocromo c3+
parcialmente acetilado, el agregado de KCN al medio de reacción no modificó la
velocidad de reducción del citocromo c (Figura 27), indicando que la actividad medida en
la fracción mitocondrial corresponde casi exclusivamente a la Mn-SOD.

74
Materiales y Métodos

Volumen de muestra (l)

0 5 10 15 20 25
0.00

-0.15
Log (B/A)

-0.30

-0.45

Figura 27. Determinación de la actividad de SOD utilizando citocromo c3+ parcialmente

acetilado. En la figura se representa el logaritmo de B/A en función del volumen de
muestra (en este caso, fracción mitocondrial de ventrículo izquierdo de corazón de
conejo). El log B/A es la relación entre el ΔAbs/min debido al agregado de muestra (B) y
el ΔAbs/min generado solamente por el sistema xantina - XO (A) para cada volumen de
muestra. Dicha relación indica la fracción remanente de la producción de O2- en
presencia de muestra (enzima). Las mediciones fueron realizadas en ausencia (círculos
negros; m = 0.019) o en presencia de KCN (círculo blancos; m = 0.018)

Una unidad de SOD se define como la cantidad de enzima que inhibe la reducción
del citocromo c3+ en un 50% y equivale a 4 pmoles de Mn-SOD. Los resultados fueron
expresados como actividad de Mn-SOD (U. mg proteína-1) y como concentración de
Mn-SOD en la matriz mitocondrial (µM).

Cálculo del contenido de SOD: Para poder realizar la conversión de actividad de

Mn-SOD (U SOD. mg proteína-1) a contenido dentro de la matriz mitocondrial, fue
necesario tener en cuenta: la concentración de proteínas de la muestra, la equivalencia
entre las U SOD y pmoles de SOD comercial (1U SOD comercial / 4 pmoles SOD), la
inhibición del 50% (I50) de la muestra (expresada en µl) y el peso molecular de la Mn-SOD
(80-89 kDa). Con estos datos se obtuvieron los nmoles SOD. mg proteína mitocondrial-1.
Para expresarlos en concentración (µM), se consideró el volumen de la matriz
mitocondrial de corazón que fue obtenido a través de cálculos (7.2 µl matriz. mg proteína
mitocondrial-1) (Costa y col., 1988). Finalmente, los resultados se expresaron como
concentración de SOD (µM) por centro activo o por enzima.

75
Materiales y Métodos

7. Determinación de daño oxidativo a macromoléculas

7.1. Determinación del contenido de sustancias reactivas al ácido

tiobarbitútico (TBARS)

Durante las reacciones en cadena que llevan a la oxidación de lípidos se forman

hidroperóxidos, los que a su vez se descomponen en varios productos secundarios como
aldehídos y cetonas. La oxidación de lípidos fue estimada a partir de la detección
espectrofluorométrica de las sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS). El
ensayo de las TBARS consiste en la reacción del ácido tiobarbitúrico (Figura 28) con
varios productos de la peroxidación lipídica, principalmente el malondialdehído (MDA),
para formar un aducto (MDA-TBA) que puede ser cuantificado fluorométricamente (Yagi,
1976).

Figura 28. Esquema que ejemplifica la formación del aducto MDA - TBA

Las mitocondrias fueron obtenidas por centrifugación diferencial como se detalla en

la sección 2.2.2 de Materiales y Métodos, reemplazando la solución amortiguadora MSTE
por una solución conteniendo K2HPO4/KH2PO4 30 mM y KCl 120 mM, pH 7.40 debido a
que la presencia de azúcares, tales como sacarosa y manitol, interfieren con el método
de detección. Luego de obtenidas las membranas mitocondriales se agregó
butihidroxibutileno (BHT) 4% en etanol hasta una concentración final de 0.1% y se
guardaron a -20 ºC hasta su análisis. El BHT es un antioxidante que evita la oxidación y
peroxidación de lípidos que ocurre espontáneamente durante el manejo de las muestras.
La mezcla de reacción se realizó en un tubo de ensayo, donde se agregó una alícuota de
la fracción mitocondrial ( 100 µl) a un medio conteniendo 2 ml de HCl 0.1 N, 0.3 ml de
ácido fosfotúngstico 10% (p/v) y 1 ml de ácido 2-tiobarbitúrico 0.7% (p/v). Los tubos se
taparon con papel aluminio y se colocaron en un baño de agua a 100 ºC durante 1 h.
Posteriormente, las TBARS fueron extraídas en 3 ml de n-butanol y se realizó una
centrifugación de 10 min a 1000g (2900 rpm) para separar la fase butanólica de la fase

76
Materiales y Métodos

acuosa. Se midió la fluorescencia de la fase butanólica en un espectrofluorómetro Hitachi

F-3010 (λexitación= 515 nm - λemisión= 553 nm). Se realizó una curva de calibración
utilizando malondialdehído (MDA) como estándar en concentraciones 0.06 - 0.60 M para
poder transformar las intensidades de fluorescencia en moles de TBARS y expresarlo
como moles de TBARS. mg proteína-1 (Fraga y col., 1988; Navarro y Boveris, 2007).

7.2. Determinación del contenido de grupos carbonilos asociados a

proteínas

La presencia de grupos carbonilo asociados a proteínas, se utilizan como

marcadores de la modificación oxidativa de las mismas. La determinación se basa en la
reacción entre 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) y los grupos carbonilos oxidados de las
proteínas mitocondriales (Figura 29). El producto obtenido, la 2,4-dinitrofenilhidrazona, se
cuantifica espectrofotométricamente a 360 nm (Levine y col., 1994; Oliver y col., 1987;
Navarro y Boveris, 2007).

Carbonilo proteico DNPH 2,4-dinitrofenilhidrazona

Figura 29. Esquema que ejemplifica la formación de la 2,4-dinitrofenilhidrazona

Se utilizaron alícuotas de 200 µl de suspensiones de membranas mitocondriales

(10 mg proteína. ml-1), las cuales fueron suplementadas con 4 ml de DNPH 10 mM e
incubadas por 1 h en oscuridad, con agitación cada 15 min. Luego, se adicionaron 5 ml
de ácido tricloroacético (TCA) 20% y se volvió a incubar durante 10 min a 0 ºC, para
lograr la precipitación de las proteínas. Se realizó una centrifugación a 10 000g
(9150 rpm) durante 5 min para obtener las proteínas en el pellet. El sobrenadante se
descartó y las proteínas fueron resuspendidas en 4 ml de TCA 10%, incubando en las
mismas condiciones que en el paso anterior. Se realizó una centrifugación final a 10 000g
(9150 rpm) durante 3 min. El pellet obtenido se lavó 3 veces con una mezcla de
CH3COOH2-CH3/CH3CH2OH (acetato de etilo:etanol) en una proporción 1:1, con el fin de

77
Materiales y Métodos

remover el DNPH en exceso, centrifugando durante 3 min entre cada lavado a 10 000g
(9150 rpm). El precipitado se disolvió con 2 ml de hidrocloruro de guanidina 6 mM pH
2.50 y se incubó a 37 ºC durante 10 min.
El contenido de carbonilos proteicos fue determinado utilizando un
espectrofotómetro de arreglo de diodos Beckman DU 7400, considerando el pico máximo
de absorbancia de la 2,4-dinitrofenilhidrazona a 360 nm (ε = 22 mM-1 cm-1). Los
resultados fueron expresados como nmol carbonilos proteicos. mg proteína-1.

8. Análisis de la expresión de proteínas por Western blot

La detección de la expresión de proteínas se llevó a cabo en membranas

mitocondriales de ventrículo izquierdo de corazón de conejos o corazón de ratas,
sobrenadante post-mitocondrial, partículas ETPH o en la fracción enriquecida en
complejo I, según corresponda. Las preparaciones subcelulares se sometieron a una
agitación vigorosa y se diluyeron 1/3 con solución amortiguadora de carga (solución de
Laemmli) la cual está compuesta por Tris 62.5 M, glicerol 25%, azul de bromofenol 0.01%
(p/v), dodecil sulfato de sodio (SDS) 2% (p/v), -mercaptoetanol 2% (p/v), pH 6.80.
Posteriormente, las muestras fueron sometidas a 100 ºC durante 1 min para facilitar la
desnaturalización de las proteínas presentes.

8.1. Electroforesis

Para realizar la electroforesis en gel de poliacrilamida y las transferencias, se

utilizaron mini cubas (Mini-PROTEAN II Cell y Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer
Cell, BioRad Laboratories, Richmond, CA, USA). Cantidades equivalentes de proteínas
(entre 60 - 100 g) de las muestras se separaron por electroforesis, utilizando geles de
poliacrilamida de 7.5%, 10% o 12%, según la proteína a identificar, en condiciones
desnaturalizantes (SDS-PAGE). El gel concentrador fue preparado en solución
amortiguadora Tris 125 mM pH 6.80, conteniendo SDS 0.1%, acrilamida:bisacrilamida
(30:1) 4%, (NH4)2S2O8 0.05% y TEMED (N, N, N, N´-tetra-metil-etilendiamina) 0.1%. El
gel de corrida fue preparado en solución amortiguadora Tris 375 mM pH 8.80, SDS 0.1%,
acrilamida:bisacrilamida (30:1) 7.5, 10 o 12%, (NH4)2S2O8 0.05% y TEMED 0.1%. Se
sembraron entre 60 y 80 µg de proteína mitocondrial por calle del gel. La solución
amortiguadora de corrida utilizada fue Tris 25 mM, glicina 190 mM, SDS 0.1% (p/v),
pH 8.30. Se comenzó la electroforesis aplicando un voltaje de 100 V hasta concentrar las
muestras y obtener bandas delgadas. El resto de la corrida electroforética se realizó a

78
Materiales y Métodos

temperatura ambiente y a 130 V hasta que el colorante azul de bromofenol llegara al

extremo inferior del gel.

8.2. Transferencia a la membrana de nitrocelulosa

Luego de la migración de las proteínas hacia el cátodo, se realizó la transferencia

de las mismas a una membrana de nitrocelulosa en solución amortiguadora de
transferencia compuesta por Tris 25 mM, glicina 190 mM, metanol 20% (v/v), pH 8.30.
Dicho proceso se efectuó a 100 V durante 2 horas en un baño de hielo, utilizando el
dispositivo Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer Cell (BioRad, CA). Luego, para
disminuir la unión inespecífica de los anticuerpos primarios, las membranas se
bloquearon con una preparación de leche en polvo descremada "Molico" al 5% (p/v),
NaN3 0.1% (v/v) en solución amortiguadora compuesta por KH2PO4 15 mM, Na2HPO4
0.08 M, NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, pH 7.40 (PBS), incubando 1 h a temperatura
ambiente con agitación. Posteriormente, las membranas fueron lavadas con solución
PBS e incubadas durante toda la noche, a temperatura ambiente y con agitación
continua, con los anticuerpos primarios correspondientes (Tabla 5) preparados en una
dilución 1:500 o 1:100 en PBS adicionado con seroalbúmina bovina (BSA) 1% (p/v) y
azida sódica (NaN3) 0.1% (v/v). Una vez finalizada la incubación, se realizaron tres
lavados sucesivos con agitación: un lavado con PBS durante 10 min, un lavado con PBS-
Tween 20% (v/v) durante 15 min y nuevamente con PBS por 10 min. Finalmente, las
membranas fueron incubadas durante 1 h a temperatura ambiente con el anticuerpo
secundario correspondiente (Tabla 5) conjugado con HRP, preparados en diluciones
1:5000 o 1:7500 en PBS + leche en polvo 2.5% (p/v). Posteriormente, se repitieron los
lavados descriptos anteriormente. La detección de las proteínas inmunoreactivas se
realizó por quimioluminiscencia utilizando el reactivo ECL (Bustamante y col., 2002). La
señal fue capturada sobre una película radiográfica High performance
TM
chemiluminescence film (Amersham Hyoerfilm ECL, GE Healthcare Limited, Japan).

79
Materiales y Métodos

Tabla 5. Anticuerpos primarios y secundarios utilizados para cada determinación

Proteína a Anticuerpo primario Anticuerpo Secundario

determinar
nNOS Ac. Policlonal de conejo, anti
NOS1 (H299): cs-8309 Santa Cruz
Biotechnology. Dilución 1:500
iNOS Ac. Policlonal de conejo, anti
NOS2 (C-19): cs-649 Santa Cruz
Biotechnology. Dilución 1:500
VDAC-1 Ac. Policlonal de cabra, anti VDAC-
1 (D-16): sc-32063, Santa Cruz
Biotechnology.
Dilución 1:500
Nitrotirosina Ac. Monoclonal de ratón, anti
nitrotirosina: clone 1 A6Millipore.
Dilución 1:4000
(conjugado con HRP)
Ac. de cabra anti IgG de conejo,
(GAR):170-5046; Bio-Rad, CA)
Dilución 1:7500
Ac. de cabra anti IgG de conejo,
(GAR):170-5046; Bio-Rad, CA)
Dilución 1:7500
Ac. de ratón anti IgG de cabra, sc:
2354, Santa Cruz Biotechnology.
Dilución 1:5000
Ac. de cabra anti IgG de ratón. sc-
2005, Santa Cruz Biotechnology.
Dilución 1:7500

Ac. Monoclonal de ratón anti- Ac. de conejo anti-IgG de ratón

nitrotirosina (HM.11, sc-32731
Santa Cruz Biotechnology, Santa
Cruz, CA). Dilución 1:100
PGC1-α Ac Policlonal de cabra, anti-PGC1-
α (K 15): sc-5816, Santa Cruz
Biotechnology.
Dilución 1:500
β-actina Ac. Monoclonal de ratón, anti-β-
actina (C4): sc-47778; Santa Cruz
Biotechnology.
Dilución 1:500
((315-035-048) Jackson
InmunoResearch, Baltimore Pike,
USA) 1:5000
Ac. de ratón anti IgG de cabra,
Santa Cruz Biotechnology.
Dilución 1:5000
Ac. de conejo anti-IgG de ratón
((315-035-048) Jackson
InmunoResearch, Baltimore Pike,
USA) 1:5000

En el caso de los análisis de Western Blot para detectar nitración de proteínas

(nitrotirosinas) se sembró un control positivo, de manera de corroborar que las bandas
detectadas en las muestras correspondían a proteínas nitradas. Para ello se nitró un
volumen de muestra control con ONOO- (sintetizado en el laboratorio) y luego se procesó
la muestra como se describió anteriormente.

80
Materiales y Métodos

Preparación de la solución de peroxinitrito: El método utilizado se basa en la

reacción rápida de una solución acidificada de peróxido de hidrógeno (H2O2) con una
solución de nitrito de sodio, seguida por la estabilización del producto formado, el ácido
peroxinitroso, con una base fuerte (Hughes y Nicklin, 1968; Beckman y col., 1994;
Koppenol y col., 1996; Uppu y col., 1996; White y col., 1998; Valdez y col., 2000):

HONO + H2O2  HOONO + H2O

HOONO + HO-  ONOO- + H2O

La solución de peroxinitrito se preparó haciendo reaccionar H2O2 2.1 M, preparado

en HNO3 1.85 M, con una solución de nitrito de sodio 2 M. El producto de la reacción se
estabilizó con NaOH 4.2 M. La reacción se llevó a cabo a 4 ºC y bajo campana con el fin
de extraer el gas liberado (mayoritariamente, dióxido de nitrógeno). Para eliminar el
exceso de H2O2, la solución de ONOO- se trató durante 10 min con dióxido de
manganeso sólido (MnO2) y la suspensión resultante se centrifugó a 4000g durante
5 min. La concentración de la solución de ONOO- se determinó espectrofotométricamente
a 302 nm (= 1.67 mM-1 cm-1). El rendimiento teórico máximo es de 690 mM, pero
usualmente se obtienen concentraciones de ONOO- entre 250 y 350 mM. Se dividieron
las muestras en alícuotas de 1 ml y se conservaron a –70 ºC, siendo estable durante, al
menos, 3 semanas.

8.3. Cuantificación
Con el fin semicuantificar la expresión de las proteínas analizadas, las placas
radiográficas fueron digitalizadas y las imágenes fueron analizadas por medio del
programa ImageJ 1.45s (Wayne Rasband, National Institute of Health, USA).

9. Análisis morfológico mitocondrial

9.1. Microscopía electrónica de transmisión

Para realizar el estudio ultraestructural por microscopía electrónica de transmisión

(MET), se realizaron cortes, de 1 mm de espesor, de corazón de ratas control y
diabéticas. Las muestras fueron fijadas con glutaraldehído 2.5% en una solución
amortiguadora compuesta por K2HPO4/KH2PO4 100 mM, pH 7.40 a 0 ºC durante 1 h.
Luego se realizaron dos lavados con la misma solución amortiguadora y las muestras
fueron fijadas con tetróxido de osmio 1% (v/v) durante 90 min a 0 ºC. A continuación se
realizaron dos lavados de 15 min con H2O destilada y se incubaron con acetato de uranilo
5% (v/v) durante 2 h a 0 ºC. Luego de un lavado de 15 min con H2O destilada se procedió

81
Materiales y Métodos

a la deshidratación de la muestra por pasajes sucesivos en soluciones de concentración

creciente de etanol y finalmente fueron incubadas en óxido de propileno durante 15 min.
Las muestras fueron incluidas en resinas Durcupan (Fluka AG, ChemischeFabrik, Buchs
SG, Suiza), la cual se polimerizó a 60 ºC durante 72 h. Una vez polimerizada la resina, se
realizaron cortes ultrafinos de 50 nm de espesor por medio de un ultramicrótomo
(Reichert Jung Utracut E.). Finalmente los cortes se montaron en grillas de cobre y se
observaron en un microscopio electrónico de transmisión Ziess EM 109 (Oberkochen,
Alemania).
Las muestras fueron procesadas y observadas al microscopio electrónico en el
Laboratorio Nacional de Análisis y Servicios en Microscopía Electrónica (LANAIS-MIE)
dependiente del Instituto de Biología Celular y Neurociencias "Prof. Eduardo De Robertis"
(Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires).

9.2. Planimetría

Para los estudios planimétricos en corazón se estudiaron 3 animales control y 4

animales diabéticos. En ambos casos se estudiaron entre 2 y 4 tacos, obteniéndose entre
12 y 25 fotografías de cada muestra. Las microfotografías obtenidas fueron registradas
con una magnitud de 12 000, 20 000, 30 000 y 85 000 X.
Se cuantificó el número de mitocondrias por campo, las áreas de cada mitocondria
y la densidad de volumen mitocondrial utilizando el programa Image Pro-plus 6.0 (Media
Cybernetics, Inc.Rockville, USA).
A partir de los parámetros obtenidos se realizó un análisis estereológico de las
mitocondrias, es decir, la interpretación espacial de secciones planas de tejidos.
Se analizaron 40 áreas en microfotografías correspondientes a tejido de 3 animales
control y 60 áreas en microfotografías de corazón de 4 animales diabéticos. Se determinó
la densidad volumétrica (Vmi), la densidad numérica (Nmi) y el área promedio de cada
mitocondria en el tejido cardíaco, de acuerdo a las formulas desarrolladas por Weibel y
col. (1969).
La densidad volumétrica mitocondrial (Vmi) representa el volumen de citosol
ocupado por mitocondrias. El método utilizado para determinar la Vmi fue el de "conteo de
puntos en grilla" o "point counting grids" (Medeiros, 2008). El método se basa en contar el
número de intersecciones ocupadas por mitocondrias, en una grilla de aproximadamente
450 intersecciones, utilizando imágenes en un aumento de 12 000 X. La densidad
volumétrica mitocondrial se expresó en porcentaje.

82
Materiales y Métodos

La densidad numérica mitocondrial (Nmi) expresa el número de mitocondrias por

unidad de volumen. Para ello se contabilizó el número de mitocondrias en un área de
112 m2, en un aumento de 12 000X. Luego se calculó la Nmi según la expresión:

1 Na3/2
Nmi = x x K
β Vmi 1/2

donde Na es el número de mitocondrias por m2, Vmi es la densidad volumétrica

mitocondrial, β es un coeficiente que depende de la forma de la organela, que en el caso
de las mitocondrias toma un valor de 2.25 y K, un factor dependiente de la distribución de
tamaño, la cual se asume que es igual a la unidad. La Nmi se expresó como porcentaje.

10. Determinación de la concentración de proteínas

La concentración de proteínas se determinó según el método espectrofotométrico

de Lowry y col. (1951) determinando el desarrollo de color a 625 nm, por reacción de las
proteínas de las muestras con Cu2+ en medio alcalino y en presencia del reactivo
fosfomolídbico-fosfotúngstico (Folin). Se agregaron 5 a 10 µl de la muestra a determinar a
2.8 ml de un medio conteniendo Na2CO3 1.4%, NaOH 0.07 N, SO4Cu5H2O 0.007% y
tartrato de Na y K 0.014%. Se mezcló durante 5 s y se incubó por 10 min a temperatura
ambiente. Se agregaron 0.2 ml de reactivo de Folin y se dejó actuar durante 30 min. Una
vez desarrollado el color se determinó la absorbancia a 625 nm en un espectrofotómetro
con arreglo de diodos Beckman DU 7400. Para realizar la curva de calibración, se utilizó
BSA (1 mg. ml-1) como proteína estándar. Los resultados se expresaron como mg
proteína. ml-1.

11. Análisis estadístico de los datos

Los valores se expresaron en tablas y figuras como la media  error estándar de la

media (X  ESM). Los resultados presentes en la tesis, fueron analizados utilizando dos
estadísticos diferentes:
1) Modelo de Diabetes: las diferencias significativas entre los valores medios entre
el grupo de animales control y el grupo de animales diabético fueron analizadas
utilizando el estadístico t de Student no apareado.
2) Modelo de isquemia/reperfusión y en partículas ETPH: se realizó un análisis de
las varianzas utilizando el test del ANOVA de un factor seguido por un test de

83
Materiales y Métodos

Dunnett cuando se quiso comparar a todos los grupos frente al grupo control y
ANOVA seguido de un test de Tukey cuando se quiso comparar a todos los
grupos entre sí.
Se consideró estadísticamente significativa una diferencia con p < 0.05. Los análisis
estadísticos fueron realizados utilizando el software GraphPad Instat4 (GraphPad
Software, La Jolla, CA, USA).

12. Reactivos y anticuerpos utilizados

Los reactivos ADP, antimicina, L-arginina, butanol, CaCl2, catalasa (C40, de hígado
bovino), m-CCCP, citocromo c3+, citocromo c3+ parcialmente acetilado, Cu-Zn superóxido
dismutasa (Cu,Zn-SOD: S7571, de eritrocitos bovinos), desoxicolato de sodio, dodecil
sulfato de sodio (SDS), ditiotreitol (DTT), EDTA, escopoletina, estreptozotocina (S0130),
etanol, FeSO4, glicina, glucosa, glutamato, glutatión (GSH), hemoglobina A0-ferrosa,
Hepes, H2O2, KCl, KCN, KH2PO4, K2HPO4, KOH, L-Nω-monometil-L-arginina (L-NMMA),
L-NG-Nitroarginina metil ester (L-NAME), malato, manitol, metanol, MgCl2, MgSO4, NaCl,
NAD(P)H, NaH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaN3, NaNO2, NaOH, Na2S2O4, nNOS
recombinante (N3033, de cerebro de rata), oligomicina, rotenona, sacarosa, seroalbúmina
bovina (BSA), succinato, Trisma base, Tween 20, fueron adquiridos en Sigma-Aldrich (St.
Louis, MO, USA).
Los reactivos acrilamida, bis-acrilamida, Immun-Star HRP chemiluminescent kit,
Laemmli buffer, -mercaptoetanol, estándar de proteínas para geles, S2O8(NH4)2,
tetrametiletilendiamina (TEMED), fueron adquiridos en Bio-Rad Laboratories Inc.,
Research Foundation (Oklahoma, USA)
Todos los otros reactivos utilizados fueron de grado analítico. Los solventes
utilizados (HCl, etanol, éter, metanol, etc.) fueron de calidad HPLC (cromatografía líquida
de alta presión).
Se utilizaron anticuerpos adquiridos en Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz,
CA, USA): Pab anti-iNOS (NOS-2 (C-19): sc-649); Pab anti-nNOS (NOS-1 (H299):
sc-8309), Pab anti-PGC1-α (K 15: sc-5816), Mab anti-nitrotirosina (HM.11, sc-32731),
Pab anti-VDAC-1 (D-16: sc-32063) y Mab anti- β-actina (C4: sc-47778); y anticuerpos
adquiridos en Millipore (Billerica, Massachusetts, USA): Mab anti-nitrotirosina clone 1 A6.
Los anticuerpos monoclonales secundarios HRP anti-ratón o anti-cabra utilizados fueron
de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), y los anticuerpos secundarios HRP
anti-conejo fueron adquiridos en Bio-Rad, Oklahoma, USA).

84
Resultados
Resultados I

CAPÍTULO I
INTERACCIÓN FUNCIONAL ENTRE EL COMPLEJO I Y LA

ÓXIDO NÍTRICO SINTASA MITOCONDRIAL EN CORAZÓN

1. Caracterización de las partículas ETPH de corazón bovino

Las suspensiones de partículas ETPH, obtenidas a partir de corazón bovino, fueron

caracterizadas en cuanto al porcentaje de partículas invertidas en la preparación,
consumo de oxígeno, control respiratorio, contenido de citocromos y actividades de los
complejos de la cadena respiratoria I-III, II-III y IV.

1.1. Consumo de O2 por partículas ETPH

El consumo de O2 fue determinado utilizando malato-glutamato y NADH como

sustratos del complejo I o succinato como sustrato del complejo II. Cuando los sustratos
utilizados fueron malato y glutamato, las partículas ETPH consumieron 34  1 ng-át O.
min-1. mg proteína-1, una velocidad de consumo de O2 similar al valor obtenido para
mitocondrias de corazón de vaca recién aisladas (35  2 ng-át O. min-1. mg proteína-1).
Estos valores fueron comparables al consumo de O2 en estado 4, publicado para
mitocondrias de corazón de rata, el cual fue de 35-45 ng-át O. min-1. mg proteína-1
(Valdez y col., 2006, Valdez y col., 2011). Asimismo, las partículas ETPH tuvieron la
capacidad de consumir O2 cuando se las suplementó con NADH y succinato (Tabla 6).
Estos sustratos fueron oxidados a altas velocidades por los complejos correspondientes,
indicando un correcto funcionamiento de la cadena de transferencia de electrones
mitocondrial. Adicionalmente, cuando el potencial de membrana fue colapsado por la
adición del desacoplante m-CCCP, el consumo de O2 se incrementó entre un 63% y un
68%, según el sustrato utilizado, mostrando que las partículas obtenidas poseen
potencial de membrana.

El control respiratorio, determinado en este caso como el consumo de O2 en

presencia del m-CCCP relativo al consumo de O2 en ausencia de m-CCCP, fue
aproximadamente de 1.6-1.7 usando tanto sustratos del complejo I como del complejo II.
Este valor es comparable con valores informados previamente para este tipo de
preparaciones (Pryde y Hirst, 2011).

85
Resultados I

Tabla 6. Consumo de O2 por partículas ETPH

Consumo de O2
(ng-át O. min-1. mg proteína-1)

Condición NADH Succinato

Acopladas (+Δp) 228  20 176  13

Desacopladas (Δp = 0)* 385  31 288  16
CR# 1.69  0.06 1.64  0.02

* El potencial de membrana (Δp) fue colapsado utilizando m-CCCP 1 µM.

# #
El control respiratorio (CR ) se calculó como la relación entre el consumo de O2 de las partículas
ETPH desacopladas sobre el consumo de las partículas acopladas.

1.2. Actividad de los complejos de la cadena respiratoria y contenido de

citocromos

Se determinó la actividad de los complejos I-III (NADH-citocromo c reductasa), II-III

(succinato-citocromo c reductasa) y IV (citocromo oxidasa). Los valores obtenidos e
incluidos en la Tabla 7 estuvieron de acuerdo con las actividades publicadas para este
tipo de muestras (Poderoso y col.,1996) y para preparaciones mitocondriales de otras
especies, tales como rata y conejo (Boveris y col., 2002a; Zaobornyj y col., 2007,
Vanasco y col., 2008). La actividad del complejo IV se calculó como la constante de
reacción de pseudo-primer orden k´ (33 ± 2 min-1. mg proteína-1) y se expresó como nmol
de citocromo c oxidado, considerando que 20 µM de citocromo c son oxidados por minuto
por miligramo de proteína. Esto muestra que las partículas ETPH son capaces de oxidar
los sustratos adicionados al medio de reacción, indicando que presentan una integridad
de los componentes de la cadena de transferencia de electrones.

Tabla 7. Actividad de los complejos mitocondriales en partículas ETPH

Complejo Actividad
(nmol. min-1. mg proteína-1)

NADH-citocromo c reductasa 349  6

Succinato-citocromo c reductasa 222  4
Citocromo oxidasa 660  40

86
Resultados I

Por otro lado, se determinó el contenido de citocromos c, b y aa3 en las partículas

ETPH. Los citocromos a y b forman parte de los complejos IV y III, respectivamente y el
citocromo c es una proteína soluble del espacio intermembranas que se asocia a la
superficie externa de la membrana interna mitocondrial, a través de interacciones
electrostáticas. Los valores obtenidos y mostrados en la Tabla 8, son similares a los
previamente publicados (Boveris y col, 2003b). La presencia de los citocromos a, b y c en
las preparaciones de partículas ETPH, son esenciales en el proceso de transferencia de
electrones.

Tabla 8. Contenido de citocromos en las partículas ETPH

Citocromos Contenido
(nmol. mg proteína-1)
Citocromos c + c1 0.42  0.06
Citocromos b 0.49  0.07
Citocromos a + a3 0.54  0.05

Estos resultados aportan un fuerte indicio de la integridad de los componentes de la

cadena respiratoria mitocondrial en las partículas obtenidas.

1.3. Estimación del grado de inversión de las partículas ETPH

El porcentaje de inside-out particles o partículas con orientación inversa se estimó

midiendo el consumo de O2 utilizando NADH como sustrato y a través de la
determinación espectrofotométrica de la actividad de NADH:O2-oxidorreductasa, ambas
en ausencia o presencia de citocromo c3+ en el medio de reacción. Las partículas ETPH
invertidas y correctamente selladas, no poseen la capacidad de utilizar al citocromo c
exógeno como aceptor de los electrones provenientes de la oxidación del NADH en el
complejo I y cederlos a la citocromo oxidasa. Esto se debe a que el sitio de interacción
fisiológico del citocromo c se encuentra en el lado P, hacia el espacio intermembranas, de
la membrana interna mitocondrial (Harmon y col., 1974; Nicholls, 1974), y en estas
partículas queda ubicado hacia el interior.

En presencia de citocromo c, el consumo de O2 y la actividad de NADH:O2

oxidorreductasa se incrementaron 65% y 67%, respectivamente. Este aumento en la
actividad respiratoria a través del complejo I se debe a fragmentos de membrana interna

87
Resultados I

no selladas con capacidad de transferir electrones al citocromo c del medio y éste a la

citocromo oxidasa. De esta forma, esta actividad medida se considera la máxima
actividad respiratoria por dicha preparación. Solo la fracción que no puede utilizar el
citocromo c exógeno, corresponde a las partículas correctamente selladas. En nuestras
condiciones experimentales, el porcentaje de partículas invertidas obtenido fue del 60%,
siendo este valor coincidente entre ambas técnicas (Tabla 9) y comparable al descripto
en bibliografía (Degli Espositi y Lenaz 1982).

Tabla 9. Porcentaje de partículas invertidas estimado a partir de la medición del

consumo de O2 y de la actividad NADH:O2 oxidorreductasa

Consumo de O2 NADH:O2 oxidorreductasa

(ng-at O. min-1. mg proteína-1) (nmol. min-1. mg proteína-1)
Estado 4 228  20 203  18
+ citocromo c3+ 377  28 340  26
Partículas invertidas (%)* 60 60

* El porcentaje de partículas invertidas fue calculado como:

3+ 3+
actividad en ausencia de citocromo c x 100 / actividad en presencia de citocromo c .

Los resultados obtenidos en referencia a la caracterización de las partículas

submitocondriales invertidas fosforilantes (ETPH) de corazón de vaca, muestran que las
mismas poseen características que las hacen adecuadas para su utilización en el estudio
de la interacción funcional entre proteínas del complejo I y la enzima mtNOS.

2. Actividad NAD+ reductasa

2.1. Efecto de la temperatura sobre la actividad NAD+ reductasa

La actividad NAD+ reductasa muestra la capacidad de las partículas ETPH de

reducir NAD+ a través de establecer el flujo reverso de electrones de la cadena
respiratoria mitocondrial. El flujo reverso de electrones se genera como consecuencia de
la oxidación de succinato y es inducido por la fuerza protón-motriz (Δp) generada por la
hidrólisis de ATP. Para que esto ocurra, se debe adicionar KCN a medio de reacción para
inhibir la enzima citocromo oxidasa.

La actividad NAD+ reductasa se estudió a 30 ºC, tal como se describe en la técnica

original (Turrens y Boveris, 1980; Ernster y Lee, 1967) y a 37 ºC, debido a que esta
88
Resultados I

última, es la temperatura a la cual se determina la velocidad de producción de NO

(Murphy y Noack, 1994). Como se observa en la Tabla 10, a 30 ºC las partículas ETPH
redujeron aproximadamente 45 nmol NAD+. min-1. mg proteína-1, y a 37 ºC dicha actividad
fue un 43% mayor respecto a la determinada a 30 ºC, en concordancia con la
dependencia de la constante de velocidad de una reacción química con respecto a la
temperatura, que describe la ecuación de Arrhenius.

Por consiguiente, los experimentos subsiguientes fueron realizados a 37 ºC, así

como la determinación de la producción de NO sostenida tanto por un dador exógeno de
electrones (NADPH), como por el flujo reverso de la cadena respiratoria.

Tabla 10. Efecto de la temperatura sobre la actividad NAD+ reductasa

Condición experimental Actividad NAD+ reductasa

(nmol. min-1. mg proteína-1)

ETPH en MST
T = 30 ºC 44.5  1.2
T = 37 ºC 63.9  3.3***

*** p < 0.005 respecto a T = 30 ºC (Test t de Student)

2.2. Elección del medio de conservación de las partículas ETPH

Con el fin de seleccionar el medio más adecuado en el cual conservar las

partículas, las preparaciones de vesículas invertidas fueron resuspendidas en tres medios
diferentes: (a) en un medio isotónico MST (manitol 0.23 M, sacarosa 0.07 M, Tris-HCl
30 mM, pH 7.50), (b) en MST adicionado con MgCl2 5 mM + ATP 2 mM o (c) en MST
adicionado con MgCl2 5 mM + ATP 2 mM + succinato 4 mM + GSH 2 mM (Beyer, 1967).
En todos los casos las partículas fueron guardadas a -80 °C. En dichas preparaciones, se
determinó la actividad NAD+ reductasa, a 37 ºC.
La Tabla 11 muestra que las partículas ETPH redujeron 63.9  3.3 nmol NAD+.
min-1. mg proteína-1 cuando las mismas se conservaron en solución amortiguadora MST.
La adición de MgCl2 y ATP al medio de conservación no modificó la actividad de NAD+
reductasa de las partícula invertidas respecto a las conservadas en MST. Adicionalmente,
se comprobó que la suplementación con succinato y GSH redujo significativamente la
actividad NAD+ reductasa en un 35%. De acuerdo a los resultados obtenidos, se

89
Resultados I

consideró que el medio óptimo para conservar las partículas fue la solución
amortiguadora MST pH 7.50, sin agregado de otros componentes.

Tabla 11. Efecto del medio de resuspensión en la actividad NAD+ reductasa de las
partículas ETPH

Medio de resuspensión Actividad NAD+ reductasa

(nmol NADH. min-1. mg proteína-1)

ETPH en MST 63.9  3.3

+ MgCl2 + ATP 58.3  2.8
+ MgCl2 + ATP + Succinato + GSH 41.3  6.5**

** p < 0.01 vs. ETPH en MST; (ANOVA – post test Dunnett).

2.3. Efecto de rotenona, oligomicina y m-CCCP sobre la actividad NAD+

reductasa

La actividad NAD+ reductasa fue determinada en ausencia (control) o en presencia

del inhibidor de la cadena de transferencia de electrones, rotenona; del inhibidor de la
síntesis de ATP, oligomicina; o del desacoplante de la fosforilación oxidativa, m-CCCP.
Como muestra la Figura 30 A, el agregado de ATP a la mezcla de reacción, inicia la
reducción del NAD+, medida como el cambio de absorbancia a 340 nm. Dicha actividad,
determinada en 6 experimentos independientes, correspondió a 63.9  3.3 nmol NAD+.
min-1. mg proteína-1 (Tabla 12).

La actividad NAD+ reductasa fue inhibida totalmente (99%) por el agregado de

rotenona (Figura 30 B; Tabla 12), debido al bloqueo de la transferencia de electrones
hacia la FMN del complejo I y, como consecuencia, al último aceptor de electrones, el
NAD+. En presencia de oligomicina en el medio de reacción la reducción de NAD+ se
inhibió en un 98% (Figura 30 C; Tabla 12). Esta inhibición ocurre como consecuencia de
la interrupción de la hidrólisis de ATP y de la generación del Δp, lo cual impide realizar la
transferencia de electrones en contra de sus potenciales de reducción hacia el complejo I.
El agregado de m-CCCP, un protonóforo que colapsa el Δp, disminuyó significativamente
la reducción de NAD+ (98%) debido a la imposibilidad de generar el flujo reverso de
electrones hacia el complejo I en ausencia de Δp (Figura 30 D; Tabla 12).

90
Resultados I

MST + ETPH-Mg2+ + Succinato

+ MgCl2 + KCN + NAD+ ATP

Rotenona + ATP

Oligomicina + ATP
C
Δabs = 0.030

t = 0.5 min

m-CCCP + ATP
D

Producción de NADH
(340-380 nm)

Figura 30. Trazos representativos de la actividad NAD+ reductasa determinada en las

partículas ETPH en ausencia (A) o presencia de rotenona 1 M (B), oligomicina 0.25 M
(C) o m-CCCP 1 M (D). La reacción fue iniciada por el agregado de ATP.

91
Resultados I

Tabla 12. Efecto de rotenona, oligomicina y m-CCCP sobre la actividad de NAD+

reductasa de partículas ETPH

Condición experimental Actividad NAD+ reductasa

(nmol NADH. min-1. mg proteína-1)

ETPH en MST (control) 63.9  3.3

+ rotenona 1 M 0.41  0.03**
+ oligomicina 0.25 M 0.33  0.07**
+ m-CCCP 1 M 0.96  0.10**

** p < 0.01 vs. ETPH en MST (ANOVA – post test Dunnett).

2.4. Efecto de la concentración de MgCl2 y KCN sobre la actividad NAD+

reductasa

2.4.1. Efecto del MgCl2

El Mg2+ es un catión esencial para establecer el flujo reverso de electrones. Sin

embargo, dicho catión inhibe la actividad de la enzima mtNOS en forma
dosis-dependiente (Manzo-Avalos y col. 2003; Zaobornyj, 2007). Por ello, y con el fin de
establecer las condiciones experimentales que permitan sostener adecuadamente el flujo
reverso de electrones, y medir, a su vez, la actividad de la enzima mtNOS en las
partículas ETPH, se estudió el efecto del MgCl2 sobre la actividad de NAD+ reductasa. De
esta forma, se siguió la reducción del NAD+ en ausencia y en presencia de 0.25 mM a
3 mM de MgCl2 (Figura 31).

La Figura 31 muestra que la reducción del NAD+ se incrementa hiperbólicamente a

medida que aumenta la concentración de MgCl2. La ausencia de MgCl2 en el medio de
reacción no permitió la reducción de NAD+, indicando que dicho catión es necesario para
establecer el flujo reverso de electrones. Cuando se utilizó MgCl2 0.5 mM y 1.5 mM en el
medio de reacción, se obtuvieron actividades comparables (47.5 ± 7.5 y 53.6 ± 4.2 nmol
NADH. min-1. mg proteína-1, respectivamente) y sin diferencias estadísticamente
significativas a la obtenida en presencia de la concentración óptima de MgCl2 para
determinar la reducción del NAD+, es decir 3 mM. Sin embargo, cuando se utilizó MgCl2
0.25 mM las partículas ETPH redujeron al NAD+ a una velocidad 55% menor a la
obtenida en presencia de MgCl2 3 mM (28.7 ± 5.6 vs. 63.9 ± 3.3 nmol NADH. min-1.
mg proteína-1).

92
Resultados I

80

(nmol NADH. min . mg proteína )

-1
Actividad NAD+ reductasa
60

-1

40
**

20

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
[MgCl2] (mM)

Figura 31. Efecto del MgCl2 sobre la actividad de NAD+ reductasa sostenida por el
flujo reverso de electrones en presencia de KCN 0.5 mM.
**p< 0.01 vs. MgCl2 3 mM (ANOVA; post-test Dunnett).

De acuerdo a estos resultados, se consideró que en las condiciones experimentales

utilizadas, la menor concentración de MgCl2 que sostiene un flujo de electrones
comparable con el optimo, es 0.5 mM. Por ello, esta fue la concentración de MgCl2
utilizada para determinar la producción de NO por estas partículas.

2.4.2. Efecto del KCN

La actividad de NAD+ reductasa detectada, en ausencia de KCN en el medio de

reacción, fue menor a 3.0 nmol. min-1. mg proteína-1, indicando que este compuesto es
necesario para forzar, experimentalmente, el flujo reverso de electrones y detectarlo a
través de la reducción del NAD+. Sin embargo, la presencia de KCN interfiere con el
método de detección utilizado para determinar la producción de NO (Murphy y Noack,
1994). Por este motivo, y con el fin de seleccionar la menor concentración de KCN que
permita tener un flujo reverso de electrones y no interfiera considerablemente en la
determinación de la producción de NO por el método de la oxidación de la HbO2, se
decidió determinar el efecto de concentraciones crecientes de KCN (entre 0.05 y 0.6 mM)
sobre la actividad NAD+ reductasa, utilizando 0.5 y 3 mM de MgCl2 (Figura 32). Para
93
Resultados I

ambas concentraciones de MgCl2, se observa un crecimiento hiperbólico a medida que se

incrementa la concentración de KCN, alcanzando un plateau entre 0.3 y 0.4 mM de KCN.

80

(nmol NADH. min . mg proteína )

-1
Actividad NAD+ reductasa

60
-1

40

20

0
0.0 0.2 0.4 0.6
KCN (mM)

Figura 32. Efecto de la concentración de KCN sobre la actividad NAD+ reductasa en

partículas ETPH. [MgCl2] = 3 mM (círculos blancos); 0.5 mM (círculos negros).

En función de los resultados obtenidos, se eligió 0.3 mM de KCN como la

concentración más apropiada para ser utilizada en la determinación de la producción de
NO por las partículas ETPH, debido a que permitió sostener el flujo reverso de electrones
en presencia de MgCl2 0.5 mM, reduciendo 47.6  1.6 nmol NAD+. min-1. mg proteína-1.

3. Producción de óxido nítrico por las partículas ETPH

3.1. Producción de NO usando NADPH como dador de electrones

La producción de NO por las partículas ETPH fue determinada

espectrofotométricamente siguiendo la oxidación de la HbO2 por las mismas, durante los
primeros 1.5 min de la reacción, tal como se describe en la sección 5.2.2. de Materiales y
Métodos. La Figura 33 muestra un registro típico de variación de absorbancia en función
del tiempo: se utilizó NADPH como dador de electrones, en presencia del sustrato
L-arginina (Figura 33 A) y de los cofactores necesarios para sustentar la actividad de

94
Resultados I

mtNOS, obteniendo una pendiente de ~11 x 10-3 Abs. min-1. Cuando se reemplazó la
L-arginina por el inhibidor competitivo L-NMMA, la oxidación de la HbO2 disminuyó,
obteniendo una pendiente de ~4.7 x 10-3 Abs. min-1. Solo la fracción inhibible por el
inhibidor fue considerada para calcular la producción de NO.

0.144 0.164 0.4

A B

(nmol NO. min .ml )

-1
Producción de NO
0.3

Absorbancia por ETPH + L-NMMA

0.140 0.160
Absorbancia por ETPH + L-arg

-1
0.2
0.136 0.156

0.1

0.132 0.152
0.0
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Proteína (mg. ml-1)

0.128 0.148

0.000 0.000
0.0 0.5 1.0 1.5
Tiempo (min)

Figura 33. Producción de NO por las partículas ETPH a expensas de los electrones
cedidos por el NADPH. A. Trazos representativos que muestran la oxidación de HbO2
(577-591 nm) por la actividad de mtNOS en presencia del sustrato de la enzima
L-arginina (──) o su inhibidor L-NMMA (----). B. Correlación lineal (r2 = 0.972) entre la
producción de NO y la concentración de proteínas de la suspensión de partículas
ETPH.

Así, y con el fin de caracterizar el sistema enzimático, se siguió la actividad de

mtNOS en función de la concentración de proteínas de la suspensión de partículas,
determinándose la producción de NO como la diferencia entre la oxidación de HbO 2 en
presencia de L-arginina y la obtenida en presencia de L-NMMA. La Figura 33 B muestra
una dependencia lineal (r2 = 0.972) de la producción de NO hasta una concentración
0.4 mg proteina. ml-1.

La velocidad de producción de NO por las ETPH, calculada a partir de los cambios

de absorbancia por minuto, resultó ser de 1.20  0.10 nmol. min-1. mg proteína-1 y se
muestra en la Tabla 13.

95
Resultados I

Tabla 13. Actividad de mtNOS en las partículas ETPH en presencia de NADPH

Condición experimental Oxidación de HbO2

(nmol. min-1. mg proteína-1)
Partículas ETPH

+ L-arginina 1 mM 3.70  0.20

+ L-NMMA 2 mM 2.50  0.20***
Producción de NO 1.20  0.10

*** p < 0.001 vs. L-arginina (Test t de Student).

3.2 Producción de NO por las partículas ETPH a expensas del flujo reverso
de electrones de la cadena respiratoria

Se estudió la producción de NO por las partículas ETPH sostenida por el flujo

reverso de electrones. Debido a que tanto el agregado de Mg2+ como el de KCN son
necesarios para llevar a cabo experimentalmente el flujo reverso de electrones, y que
dichos compuestos interfieren con la determinación de la producción de NO, fue
necesario seleccionar concentraciones de compromiso de dichas especies que permitan
determinar la actividad de mtNOS sostenida por los electrones provenientes de la cadena
respiratoria. La determinación se llevo a cabo utilizando MgCl2 0.5 mM y KCN 0.3 mM en
el medio de reacción. Como se describió en las secciones 2.4.1 y 2.4.2., éstas
concentraciones fueron las mínimas para que el flujo reverso de electrones, evaluado a
través de la reducción del NAD+, no se diferencie significativamente de las
concentraciones óptimas descriptas en la literatura (Ernster y Lee, 1967; Turrens y
Boveris, 1980).

En la Figura 34 se ilustra un registro típico del cambio de absorbancia en función

del tiempo, debido a la oxidación de HbO2, cuando los electrones provienen de la cadena
respiratoria (flujo reverso) y no de un dador exógeno como el NADPH. Dicha oxidación se
siguió en presencia del sustrato L-arginina (~5.7 x 10-3 Abs. min-1) o del inhibidor
L-NMMA (~2.1 x 10-3 Abs. min-1), el cual redujo parcialmente la oxidación de la HbO2.

96
Resultados I

0.300 0.183 0.5

flujo reverso (nmol NO. min . ml )

-1
A B

Producción de NO sostenida por

-1
0.4

0.297 0.180

Absorbancia (577-591 nm)

0.3
Absorbancia (577-591 nm)

por ETPH + L-NMMA

por ETPH + L-arg

0.2
0.294 0.177

0.1

0.291 0.174 0.0

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
-1
Proteína (mg. ml )

0.288 0.171

0.000 0.000
0.0 0.5 1.0 1.5
Tiempo (min)

Figura 34. Producción de NO por las partículas ETPH sostenida por el flujo reverso de
electrones. La determinación se realizó en ausencia de NADPH y en presencia de
L-arginina y de los reactivos necesarios para establecer el flujo reverso de electrones.
A. Trazos representativos que muestran la oxidación de HbO2 (577-591 nm) en
presencia de L-arginina (──) o de L-NMMA (----). B. Correlación lineal (r2 = 0.960) entre
la producción de NO y la concentración de proteínas de la suspensión de partículas
ETPH.

En estas condiciones, se estudió la dependencia de la producción de NO con la

concentración de proteínas en la cubeta de medida (Figura 34 B). Dicha producción se
calculó teniendo en cuenta la fracción sensible al inhibidor L-NMMA, observándose una
correlación lineal (r2 = 0.961) en el rango de concentraciones ensayadas (hasta 0.5 mg
proteína. ml-1).

Tabla 14. Actividad de la enzima mtNOS en partículas ETPH a expensas de los

electrones provenientes de la cadena respiratoria

Condición experimental Oxidación de HbO2

Partículas ETPH (nmol. min-1. mg proteína-1)

+ L-arginina 1 mM 3.41  0.20

+ L-NMMA 2 mM 2.44  0.31 *
Producción de NO 0.97  0.07

* p < 0.05 vs. L-arginina (Test t de Student).

97
Resultados I

La producción de NO sostenida por el flujo de electrones de la cadena respiratoria,

actuando en sentido reverso, a expensas de la hidrólisis de ATP y de la oxidación del
succinato, fue de 0.97  0.07 nmol. min-1. mg proteína-1 (Tabla 14). Estos resultados
sugieren que la enzima mtNOS puede utilizar electrones provenientes de la cadena
respiratoria mitocondrial para su actividad enzimática.

3.2.1. Efecto de la concentración de MgCl2 sobre la producción de NO

Se estudió el efecto del agregado de MgCl2 0.5 mM, 1.5 mM y 3.0 mM, sobre la
producción de NO por las partículas ETPH, en presencia de KCN 0.3 mM. La Figura 35
muestra que la producción de NO sostenida por el flujo reverso de electrones, disminuye
con el incremento del Mg2+ en el medio de reacción. Aunque dicha disminución no fue
estadísticamente significativa, la misma muestra una tendencia, siendo la producción a
3.0 mM Mg2+ 10% menor que la medida en presencia de 0.5 mM Mg2+.

1.1
Producción de NO sostenida por flujo reveso

1.0
) -1-1)
(nmol. min-1. mg proteina-1

0.9

0.8

0.7

0.6

0.0
0.5 1.5 3.0

[MgCl2] (mM)

Figura 35. Producción de NO sostenida por el flujo reverso de electrones en presencia

de KCN 0.3 mM en el medio de reacción, utilizando MgCl2 3.0 mM 1.5 mM y 0.5 mM.

Como se puede observar en la Figura 36, la velocidad de producción de NO

sostenida por el flujo reverso de electrones se correlacionó inversa y linealmente
(r2 = 0.982) con la reducción del NAD+, dependiendo de la concentración de MgCl2 en el
98
Resultados I

medio de reacción. Así, la producción de NO decrece con el aumento de la concentración

de Mg2+, tal como fue descripto por Manzo-Avalos y col. (2003), mientras que la actividad
NAD+ reductasa aumenta debido a la presencia de una mayor concentración del catión, el
cual es esencial para establecer el flujo reverso de electrones.

Producción de NO sostenida por flujo reveso 1.1

(nmol.min-1.mg proteína-1)

1.0

0.9

0.8

0.7

0.0
0 40 50 60 70

Actividad NAD+ reductasa

(nmol NADH. min-1. mg proteína-1)

Figura 36. Correlación lineal inversa (r2 = 0.982) entre la velocidad de producción de NO
sostenida por el flujo reverso de electrones y la actividad NAD+ reductasa. Las
determinaciones se realizaron en presencia de KCN 0.3 mM y de MgCl2 0.5 mM
(cuadrado negro), 1.5 mM (triángulo blanco) o 3.0 mM (círculo negro).

3.2.2. Efecto de rotenona, oligomicina y m-CCCP sobre la producción de NO

Se estudió el efecto del agregado de rotenona, inhibidor del complejo I mitocondrial,

del inhibidor de la ATPasa oligomicina y del desacoplante m-CCCP, sobre la producción
de NO sustentada por el flujo reverso de electrones.

Como puede verse en la Tabla 15, la producción de NO de

0.97  0.07 nmol. min-1. mg proteína-1 fue completamente inhibida cuando se agregó
rotenona al medio de reacción, sugiriendo que la rotenona interrumpe el flujo de
electrones hacia la enzima generadora de NO.

99
Resultados I

Tabla 15. Efecto del agregado de rotenona, oligomicina y m-CCCP sobre la actividad de
la mtNOS en partículas ETPH

Condición experimental Actividad mtNOS

(nmol. min-1. mg proteína-1)

Flujo reverso de electrones 0.97  0.07

+ rotenona 1 M ND*
+ oligomicina 0.25 M ND*
+ m-CCCP 1 M ND*

* ND: No detectable

El mismo efecto fue observado con la adición de oligomicina o de m-CCCP

(Tabla 15). La presencia de oligomicina impide la hidrólisis del ATP y la generación del
Δp, imposibilitando la transferencia de electrones en contra de sus potenciales de
reducción hacia el complejo I. El agregado de m-CCCP colapsa el potencial de
membrana perturbando el flujo reverso de electrones hacia el complejo I. En ambos
casos, se anuló la generación de NO por la enzima mtNOS, afirmando que en estas
condiciones experimentales y en ausencia del dador exógeno de electrones usual, el
NADPH, el NO está formándose como consecuencia de una transferencia de electrones
reversa a través de la cadena respiratoria, y a su vez, desde el complejo I a la mtNOS.

Estos resultados en su conjunto indican que la enzima mtNOS puede utilizar

electrones provenientes del complejo I de la cadena respiratoria, cuando la misma
funciona con un flujo reverso de electrones, para llevar a cabo su actividad enzimática,
sugiriendo, a la vez, algún grado de interacción entre proteínas del complejo I y la
mtNOS.

3.3. Producción de NO por la enzima nNOS recombinante

Con el propósito de dilucidar si la inhibición de la producción de NO observada

como resultado del agregado de rotenona al medio de reacción, era consecuencia del
efecto de dicho compuesto sobre la transferencia de electrones en el complejo I o una
acción directa sobre el dominio reductasa de la mtNOS, se estudió el efecto de la
rotenona sobre la producción de NO utilizando la enzima nNOS comercial, recombinante.
La actividad de nNOS fue medida utilizando el método de oxidación de la HbO2, según se
detalla en la sección 5.2.3. de Materiales y Métodos. Como se muestra en la Tabla 16, en
condiciones experimentales óptimas, se produjeron 0.93  0.05 nmol NO. min-1. Ue-1.
100
Resultados I

Tabla 16. Efecto de la rotenona sobre la actividad de la enzima nNOS recombinante

Condición experimental Producción de NO

(nmol NO. min-1. Ue-1)

Medio de reacción completo 0.93  0.05

- calmodulina 0.29  0.05**
+ rotenona 1 M 1.10  0.10

**p<0.01 vs. medio de reacción completo

En ausencia de calmodulina en el medio de reacción la actividad se redujo en un

69%, mostrando que es un cofactor esencial para la actividad enzimática de la nNOS
aislada. La adición de rotenona (Tabla 16) al medio de reacción no modificó la actividad
enzimática, a diferencia de lo observado en la actividad de mtNOS sostenida por el flujo
reverso de electrones en las partículas ETPH (Tabla 15). Los resultados obtenidos
permiten concluir que el efecto inhibitorio de la rotenona sobre la producción de NO
detectada utilizando partículas ETPH ocurre como consecuencia de la inhibición en la
transferencia de electrones en el complejo I, los cuales no podrían alcanzar el dominio
oxigenasa de la mtNOS, y no debido a una acción directa sobre la estructura de la
enzima.

3.4. Producción de NO por la fracción mitocondrial enriquecida en complejo I

Los resultados obtenidos e incluidos en las secciones 3.2. y 3.3. precedentes

sugieren que la mtNOS podría estar interactuando física y funcionalmente con proteínas
del complejo I. Por ello, a partir de mitocondrias de corazón bovino se aisló una fracción
mitocondrial enriquecida en complejo I, en la que se determinó la producción de NO. La
Figura 37 A muestra un registro típico de la oxidación de la HbO2 por esta fracción en
presencia de L-arginina, la cual fue parcialmente inhibida por L-NMMA. La velocidad de
producción de NO por esta fracción, calculada considerando solo la fracción sensible al
inhibidor, fue de 1.72 ± 0.18 nmol. min-1. mg proteína-1 (Tabla 17).

Como puede observarse en la Figura 37 B, la producción de NO dependió

linealmente (r2 = 0.920) de la concentración de proteínas de la fracción mitocondrial
enriquecida en complejo I, agregada a la cubeta de medida. Este comportamiento fue
valido en el rango de concentraciones ensayadas, es decir, hasta 0.15 mg proteína. ml-1.

101
Resultados I

0.160 0.152 0.25

A B

(nmol NO. min .ml )

-1
Producción de NO
0.20

enriquecida en Complejo I + L-NMMA

-1
enriquecida en Complejo I + L-arg

0.156 0.148

AAbsorbancia por la fracción

0.15
Absorbancia por la fracción

0.10
0.152 0.144
0.05

0.00
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20
0.148 0.140
-1
Proteína (mg. ml )

0.144 0.136

0.000 0.000
0.0 0.5 1.0 1.5
Tiempo (min)

Figura 37. Producción de NO por la fracción enriquecida en complejo I. A. Trazos

representativos que muestran la oxidación de HbO2 (577-591 nm) por la actividad de
mtNOS a expensas de los electrones cedidos por NADPH y del agregado del sustrato
de la enzima L-arginina (──) o su inhibidor L-NMMA (----). B. Correlación lineal
(r2 = 0.920) entre la producción de NO y la concentración de proteínas de la fracción
enriquecida en complejo I.

En la Tabla 17 se incluyen los valores de producción de NO determinados en

fracciones mitocondriales sostenida por un dador exógeno de electrones (NADPH) o por
electrones provenientes de la cadena respiratoria actuando de manera reversa, los cuales
fueron mostrados en las secciones 3.1. y 3.2.

Tabla 17. Producción de NO por mitocondrias de corazón de vaca, partículas ETPH y

por la fracción enriquecida en complejo I

Preparación Fuente de electrones Producción de NO

(nmol. min-1. mg proteína-1)

Mitocondrias* NADPH 1.14  0.10

ETPH NADPH 1.20  0.10

Flujo reverso de electrones 0.97  0.07

Fracción enriquecida en NADPH 1.72  0.18

complejo I

102
Resultados I

Asimismo, y con fines comparativos, se incluye el valor de producción de NO por

membranas mitocondriales provenientes de corazón de vaca. Este valor es semejante a
los publicados para membranas mitocondriales provenientes de corazón de ratón, 0.65 -
0.75 nmol NO. min-1. mg proteína-1 (Boveris y col., 2002a; Navarro y Boveris 2007) y de
rata, 1.07 ± 0.02 nmol NO. min-1. mg proteína-1 (Valdez y col., 2006).

4. Expresión de NOS en mitocondrias de corazón bovino, partículas ETPH y en

la fracción mitocondrial enriquecida en complejo I

La actividad de NADH-ubiquinona reductasa determinada en la fracción enriquecida

en complejo I fue de 260 ± 25 nmol NADH oxidado. min-1. mg proteína-1, considerando
solamente la fracción sensible a rotenona.

Asimismo, dicha fracción fue analizada en cuanto a su reactividad frente a

anticuerpos anti-nNOS, debido a que la mtNOS corresponde a la variante α de la
isoforma nNOS, con modificaciones postraduccionales (fosforilación y miristoilación) y a
que no existen anticuerpos específicos dirigidos contra la enzima NOS mitocondrial
(Valdez y col., 2011c). En la Figura 38 se puede observar que no solo la fracción de
mitocondrias de corazón bovino y las partículas ETPH fueron reconocidas por
anticuerpos anti-nNOS, sino también la fracción mitocondrial enriquecida en complejo I.
Este resultado sugiere que la enzima mtNOS se encuentra presente en todas las
preparaciones mitocondriales incluidas en la Figura 38, indicando que la mtNOS podría
interaccionar físicamente con el complejo I mitocondrial.

PM (kDa)

146

Partículas Mitocondria Fracción

ETPH enriquecida en
Complejo I

Figura 38. Imagen representativa de los análisis de Western Blot realizados en las
partículas ETPH, membranas mitocondriales de corazón bovino y en la fracción
enriquecida en complejo I, usando anticuerpos anti-nNOS (H299, Santa Cruz Biotech.).

103
Resultados II

CAPÍTULO II
FUNCIONALIDAD MITOCONDRIAL EN ATONTAMIENTO MIOCÁRDICO.
EFECTO DE LA ADENOSINA.

1. Función ventricular

Se estudió la función ventricular en corazón de conejo sometido a

isquemia/reperfusión ex vivo, perfundido según la técnica de Langendorff. Se midió la
presión desarrollada por el ventrículo izquierdo (PDVI), la presión de fin de diástole del
ventrículo izquierdo (PDFVI), la máxima velocidad de aumento de presión en ventrículo
izquierdo (+dP/dtmáx) y la presión de perfusión coronaria (PPC). Dichos parámetros se
determinaron en situaciones de normoxia (60 min de perfusión), y en protocolos de
isquemia/reperfusión de 15 min de estabilización (0/0) seguidos de 15 min de isquemia
(15/0) y de 5 ó 30 min de reperfusión (15/5 y 15/30, respectivamente).

El estado contráctil miocárdico, es decir, la función ventricular sistólica, se evaluó a

través de la PDVI y la +dP/dtmáx. Tal como se muestra en la Figura 39 A, en los corazones
sometidos a 60 min de normoxia no se vio modificada la PDVI durante el tiempo de
experimentación. Sin embargo, los corazones sometidos a isquemia/reperfusión
recobraron solamente el 63% de la contractilidad cardíaca, luego de 30 min de
reperfusión, respecto a los valores pre-isquémicos (PDVI: 67 ± 3 vs. 107 ± 7 mmHg,
respectivamente). Un comportamiento similar fue obtenido cuando se evaluó la +dP/dtmáx
(Figura 39 B), de los corazones normóxicos y los sometidos a isquemia/reperfusión,
donde al finalizar la reperfusión, el estado contráctil quedó reducido a un 56% de los
valores pre-isquémicos (+dP/dtmáx: 884 ± 68 vs. 496 ± 28 mmHg. s-1).

La rigidez miocárdica, evaluada a través de la PDFVI, aumentó 3 veces, a los 30

min de la reperfusión, en los corazones sometidos a isquemia/reperfusión respecto a los
corazones normóxicos (35 ± 3 vs. 11 ± 1 mmHg, respectivamente), observándose una
diferencia significativa a partir de los 15 min de reperfusión (Figura 39 C). Por otro lado,
en un corazón perfundido a flujo constante, la PPC indica la resistencia vascular
coronaria. Así, los corazones sometidos a isquemia/reperfusión presentaron un
incremento del 42% en la PPC (Figura 39 D) a los 30 min de reperfusión, respecto a los
valores pre-isquémicos.

104
Resultados II

A 140 B 1400

120 1200

+dP/dt max (mmHg/s)

100  1000
PDVI (mmHg)

80 & 800
& &

& & &

60 600 & &
& & &
40 400

20 200

0 0
0 15 30 45 60 0 15 30 45 60

Basal Isquemia Reperfusión Basal Isquemia Reperfusión

Tiempo (min) Tiempo (min)

C 40 D 120


100 &
&
30
&
PDFVI (mmHg)

PPC (mmHg)

& 80

&
20 60

& 40
10
20

0 0
0 15 30 45 60 0 15 30 45 60

Basal Isquemia Reperfusión Basal Isquemia Reperfusión

Tiempo (min) Tiempo (min)

Figura 39. Función ventricular. A. Presión diastólica del ventrículo izquierdo (PDVI). B.
Máxima velocidad de incremento de presión (+dP/dtmáx) en ventrículo izquierdo. C.
Presión de fin de diástole del ventrículo izquierdo (PDFVI). D. Presión de perfusión
coronaria (PPC). Parámetros determinados durante un período de perfusión sostenida
(normoxia, círculos negros) o de isquemia/reperfusión (cuadrados negros), en
corazones aislados de conejos.
p < 0.05, estadísticamente significativo respecto al mismo tiempo de normoxia
&p < 0.005, estadísticamente significativo respecto al mismo tiempo de normoxia

105
Resultados II

Así, la reducción de la PDVI (37%) y de la +dP/dtmax (42%), y el aumento en la PPC

(26%) y en la PDFVI (3 veces) observada en los corazones de los animales sometidos a
15 min de isquemia y 30 min de reperfusión evidencia un deterioro en la función
ventricular, con disminución del estado contráctil e incremento de la rigidez miocárdica,
en comparación con los corazones control sometidos a normoxia.

2. Tamaño de infarto

Con el fin de confirmar que en el modelo utilizado de atontamiento miocárdico no

hay áreas necrosadas en el tejido, se determinó el tamaño del área infartada utilizando la
técnica de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) en corazones de conejos sometidos a
isquemia/reperfusión. Luego de 15 min de isquemia global se realizaron 120 min de
reperfusión, que es el tiempo necesario para eliminar la presencia de deshidrogenasas y
cofactores liberados desde los tejidos necrosados, los cuales llevarían a la aparición de
resultados falsos negativos. En la Figura 40 se pueden observar fotografías
representativas de cortes transversales de un corazón teñido con TTC. La ausencia de
áreas TTC negativas, es decir áreas grises o blancas, denota la ausencia de tejido
infartado como consecuencia del modelo experimental de isquemia/reperfusión realizado.

Figura 40. Cortes representativos de corazón sometido a 15 min de isquemia y 120

min de reperfusión, teñido con TTC. Las áreas viables están teñidas de color rojo. Las
áreas infartadas son blancas o grises.

Este resultado indica que el modelo de atontamiento miocárdico utilizado no lleva a

daño tisular irreversible.

106
Resultados II

3. Consumo de oxígeno en cortes de tejido

Los corazones fueron removidos del aparato de perfusión de Langendorff y se

determinó la velocidad de consumo de O2 tisular, utilizando cortes de ventrículo izquierdo
de 1 mm3, tamaño que permite que el O2 difunda al centro del tejido sin dejar áreas
anaeróbicas durante la determinación. Se estableció la relación entre la velocidad de
consumo de O2 y la cantidad de cortes de tejido, o masa de tejido, utilizados. Como se
aprecia en la Figura 41, el consumo de O2 por cortes corazón se relacionó de manera
lineal (r2 = 0.965) con el número de cortes agregados a la cámara de medida del oxígrafo.

12

10
Consumo de O2 (M.min-1)

0
0 1 2 3 4 5

Número de cubos

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5

Peso de los cubos (mg)

Figura 41. Consumo de O2 en función del número de cortes (cubos de 1 mm3) o del
peso de corazón de conejos no sometidos a isquemia/reperfusión (r2 = 0.965).

En la Figura 42 se incluyen trazos representativos de consumo de O2 por cortes de

corazón, correspondientes a los registros obtenidos mediante el oxígrafo Oroboros. Como
puede observarse, la velocidad de consumo de O2 disminuyó progresivamente a lo largo
de los tiempos de isquemia, reperfusión temprana y reperfusión tardía.

107
Resultados II

La velocidad de consumo de O2, expresada en mol. min-1. g tejido-1, obtenida para

cada tiempo de isquemia/reperfusión se incluyen en la Tabla 18. Las muestras control
(0/0) consumieron 1.57 ± 0.10 mol O2. min-1. g de tejido-1. La velocidad de consumo de
O2 disminuyó 2.5%, 17% y 46% cuando se sometió a los corazones a 15 min de isquemia
(15/0), 15 min de isquemia y 5 min de reperfusión (15/5), y 15 min de isquemia y 30 min
de reperfusión (15/30), respectivamente. Dicha disminución fue estadísticamente
significativa al final de la reperfusión (0.85 ± 0.08 µmol O 2. min-1. g de tejido-1), indicando
que el ventrículo izquierdo de corazón sometido a isquemia/reperfusión posee menor
capacidad de consumo de O2, aún en ausencia de un trabajo de esfuerzo. Cabe
mencionar que la velocidad de consumo de O2 así determinada, es principalmente
consecuencia de mitocondrias en estado de respiración de reposo (estado 4), en
concordancia con la actividad respiratoria de un miocardio parcialmente quiescente
(Boveris y col., 1999b).

0/0

15/0

15/5
21 µM O 2

15/30

t = 1 min

Figura 42. Trazos representativos correspondientes a la determinación de consumo

de O2 en cortes de tejido de corazón de 1 mm3 en cada tiempo de
isquemia/reperfusión estudiado (0/0, 15/0; 15/5 y 15/30).

108
Resultados II

Tabla 18. Consumo de O2 por cortes de tejido de ventrículo izquierdo de corazón de

conejos sometidos a isquemia/reperfusión

Isquemia/reperfusión Consumo de O2
(min) (mol. min-1. g tejido-1)

0/0 1.57  0.10

15/0 1.53  0.11

15/5 1.30  0.12

15/30 0.85  0.08 *** ###

***p < 0.005, estadísticamente significativo respecto al control (0/0)

###
p < 0.005, estadísticamente significativo respecto a I/R = 15/0

Más aún, el consumo de O2 tisular se correlacionó linealmente (Figura 43,

2
r = 0.947) con la presión desarrollada por el ventrículo izquierdo. Dicha correlación
refuerza la idea que el miocardio depende de la disponibilidad de O2 en el tejido para
lograr la fuerza de contracción necesaria para realizar el trabajo cardíaco.

1.8

1.6
Consumo de O2 (mol. min-1. g tejido-1)

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

0.0
0 60 80 100 120

PDVI (mmHg)

Figura 43. Correlación lineal entre el consumo de O2 tisular y la presión desarrollada por
el ventrículo izquierdo (r2 = 0.947), en corazones de conejos sometidos a
isquemia/reperfusión.

109
Resultados II

4. Funcionalidad mitocondrial

4.1. Consumo de O2 en mitocondrias de ventrículo izquierdo

Debido a las alteraciones observadas en la velocidad de consumo de O2 en cortes

de tejido, y considerando que gran parte de dicho consumo es consecuencia de su
utilización por parte de las mitocondrias, se determinó el consumo de O2 en mitocondrias
aisladas de ventrículo izquierdo.

Como puede observarse a partir de los trazos representativos de consumo de O 2,

utilizando malato y glutamato como sustratos (Figura 44), el estado de respiración pasiva
o estado 4 no se modificó con los tiempos de isquemia y de reperfusión. Sin embargo, el
estado 3, generado por el agregado de ADP, disminuyó progresivamente en los tiempos
de isquemia/reperfusión estudiados.

Malato-Glutamato

ADP

0/0

15/0

15/5

15/30
21 µM O2

t = 1 min

Figura 44. Trazos representativos mostrando el consumo de O2 en mitocondrias de

corazón de conejo en estado 4 (malato-glutamato) y en estado 3 (ADP), a los tiempos
de isquemia/reperfusión estudiados (0/0, 15/0; 15/5 y 15/30).

110
Resultados II

En la Tabla 19 se muestran los valores de consumo de O2 mitocondrial,

determinados utilizando malato-glutamato o succinato como sustratos del complejo I o II,
respectivamente, y expresados en ng-at O. min-1. mg proteína-1. Como puede observarse,
cuando se utilizaron sustratos del complejo I, el estado de respiración pasiva no se vio
modificado respecto al control (0/0, 23 ± 2 ng-at O. min-1. mg proteína-1) en ninguno de los
tiempos de isquemia/reperfusión estudiados. Sin embargo, el consumo de O 2 en estado 3
se redujo 12%, 19% y 32% a 15/0, 15/5 y 15/30, respectivamente. De esta forma, el
control respiratorio, un parámetro que da cuenta de la integridad mitocondrial y del
acoplamiento entre la fosforilación y la oxidación de los componentes de la cadena de
transferencia de electrones, disminuyó también en forma progresiva, 8%; 19% y 29%,
respecto al valor de 6.2 calculado para los corazones no sometidos a
isquemia/reperfusión (Tabla 19).

Tabla 19. Consumo de O2 de mitocondrias de ventrículo izquierdo de corazones de

conejos sometidos a isquemia/reperfusión

Consumo de O2
(ng-at O. min-1. mg proteína-1)

Isquemia/reperfusión
0/0 15/0 15/5 15/30
(min)

Sustrato: Malato-glutamato

Estado 4 23  2 22  2 23  2 22  2

Estado 3 142  5 125  6 115  5* 96  5*** #

Control respiratorio 6.2  0.1 5.7  0.1** 5.0  0.1*** ### 4.4  0.1 *** ### †

Sustrato: Succinato

Estado 4 67  4 69  5 65  5 68  5

Estado 3 219  9 215  9 218  9 221  7

Control respiratorio 3.30  0.07 3.10  0.08 3.40  0.09 3.30  0.08

*p < 0.05, **p < 0.01; ***p < 0.005, estadísticamente significativo respecto al control (0/0)
# ###
p < 0.05, p < 0.005, estadísticamente significativo respecto a I/R = 15/0
†
p < 0.001, estadísticamente significativo respecto a I/R = 15/5

111
Resultados II

En contraste, cuando se utilizó succinato como sustrato, el cual cede electrones al

complejo II de la cadena respiratoria, no se observaron modificaciones significativas ni el
consumo de O2 en estado 4 ni en la respiración en estado 3, obteniéndose el mismo
control respiratorio a cada tiempo de isquemia/reperfusión estudiado (Tabla 19).

La respuesta observada, dependiente del sustrato empleado, sugiere que en el

modelo de atontamiento miocárdico podría estar disminuida la actividad del complejo I.

4.2. Actividad de los complejos mitocondriales

Teniendo en cuenta que la disfunción observada en el consumo de O2 mitocondrial,

puede deberse a modificaciones en la actividad de los complejos de la cadena de
transferencia de electrones, se determinó la actividad de los complejos mitocondriales
I-III, II-III y IV (Tabla 20).

Tabla 20. Actividad de los complejos I-III, II-III y IV de la cadena de transferencia de

electrones

Isquemia/reperfusión Complejo I-III Complejo II-III Complejo IV

-1 -1
(min) (nmol. min . mg (nmol. min . mg (min-1 mg proteína-1)
proteína-1) proteína-1)

0/0 577  25 128  10 49.9  2.6

15/0 541  24 119  10 48.8  2.0

15/5 515  22 117  9 52.0  3.1

15/30 413  22 *** # 120  10 50.2  2.5

*** p<0.005 Estadísticamente significativo respecto al control (0/0)


p< 0.05 Estadísticamente significativo respecto a I/R = 15/0.

La actividad de los complejos I-III disminuyó progresivamente a lo largo de los

tiempos de isquemia/reperfusión, llegando a la máxima inhibición (28%) a los 30 min de
reperfusión (Tabla 20). Este resultado está de acuerdo con los valores obtenidos para el
consumo de O2 mitocondrial, utilizando malato-glutamato como sustratos. Más aún, se
observó una correlación lineal (r2 = 0.939; Figura 45) entre la actividad del complejo I-III y
el consumo de O2 mitocondrial en estado 3 sustentado por malato-glutamato, sugiriendo

112
Resultados II

que la disminución progresiva en el consumo de O2 utilizando sustratos del complejo I es

consecuencia de la disfuncionalidad de dicho complejo.

650

600
(nmol. min-1. mg proteína-1)
Actividad Complejo I-III

550

500

450

400

350

0
0 90 100 110 120 130 140 150 160

Consumo de O2 en estado 3
(ng-at O. min-1. mg proteína-1)

Figura 45. Correlación lineal entre la actividad del complejo I-III y el consumo de O2
mitocondrial en estado 3 utilizando malato-glutamato como sustrato (r2 = 0.939),
determinado en mitocondrias de corazón de conejo sometidos a isquemia/reperfusión:
0/0; 15/0; 15/5 y 15/30. Los datos fueron tomados de las Tablas 19 y 20.

Contrariamente, la actividad del complejo II no presentó cambios significativos

(Tabla 20), tal como evidenció el consumo de O2 con dicho sustrato. Adicionalmente, la
actividad de la citocromo oxidasa o complejo IV, no se vio modificada en cada tiempo de
isquemia/reperfusión estudiado.

4.3. Producción mitocondrial de NO

4.3.1. Actividad bioquímica de mtNOS

La actividad bioquímica de la enzima mtNOS fue evaluada midiendo la velocidad de

producción de NO por mitocondrias de ventrículo izquierdo, por el método
espectrofotométrico de la oxidación de la HbO2. Como puede observarse en la Tabla 21,
la actividad de mtNOS disminuyó con los tiempos de isquemia/reperfusión, siendo esta

113
Resultados II

disminución estadísticamente significativa y del 28% a los 15 min de isquemia y 30 min

de reperfusión.

Tabla 21. Actividad de mtNOS en mitocondrias de corazón de conejos sometidos a

isquemia/reperfusión

Isquemia/reperfusión Actividad mtNOS

(min) (nmol. min-1. mg proteína-1)

0/0 0.90  0.05

15/0 0.86  0.06

15/5 0.80  0.05

15/30 0.65  0.05**

** p< 0.01 Estadísticamente significativo respecto al control (0/0).

650 160

150
600
(ng-at O. min-1. mg proteína-1)
Consumo de O2 en estado 3
(nmol. min-1. mg proteína-1)

140
Actividad Complejo I-III

550
130

500
120

450
110

400 100

90
350

0 0
0.0 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

Actividad mtNOS
(nmol NO. min-1. mg proteína-1)

Figura 46. Correlación lineal entre la actividad bioquímica de mtNOS y la actividad del
complejo I-III (círculos negros; r2 = 0.994), y entre la actividad bioquímica de mtNOS y
el consumo de O2 en estado 3 utilizando malato-glutamato como sustratos (círculos
blancos; r2 = 0.932) determinados en mitocondrias de corazón de conejo sometidos a
isquemia/reperfusión. Los datos fueron tomados de las Tablas 19, 20 y 21.

114
Resultados II

Asimismo, se observó que existe una correlación lineal (Figura 46) entre la actividad
bioquímica de mtNOS y la actividad del complejo I mitocondrial (r2 = 0.994), y entre la
actividad bioquímica de mtNOS y el consumo de O2 en estado 3 utilizando malato-
glutamato como sustratos (r2 = 0.932). El patrón de disminución de la actividad
bioquímica de mtNOS en cada tiempo de isquemia/reperfusión sigue el mismo perfil de
decrecimiento que los observados en la actividad del complejo I-III y en el consumo de O2
en estado 3 utilizando malato y glutamato como sustratos.
Estos resultados refuerzan los datos obtenidos y explicados en el capítulo I de este
trabajo de Tesis, en donde se observa que la mtNOS y el complejo I interaccionan
funcionalmente, probablemente debido a una cercanía estructural.

4.3.2. Actividad funcional de mtNOS

La actividad funcional de la enzima mtNOS fue determinada midiendo la inhibición

del consumo de O2 en situaciones experimentales de máxima y mínima concentración de
NO mitocondrial (Valdez y col., 2005; Brown y Cooper, 1994). Para ello, el consumo de
O2 en estado 3 fue determinado adicionando al medio de reacción L-arginina, sustrato de
la enzima mtNOS, para lograr la máxima producción de NO intramitocondrial; o
agregando L-NMMA como inhibidor de la enzima, para alcanzar la mínima producción de
NO. La diferencia entre el consumo de O2 en estas dos condiciones experimentales, y
expresada como porcentaje de la fracción respecto a la velocidad de consumo en estado
3, corresponde a la actividad funcional de la mtNOS en la inhibición de la citocromo
oxidasa.
En la Tabla 22 se observa que el agregado de L-arginina al medio de reacción
disminuye la velocidad de consumo de O2 en estado 3, mientras que el agregado de
L-NMMA aumenta dicha actividad, tanto cuando se utiliza sustratos del complejo I como
del complejo II. Cuando se utilizó malato-glutamato, la actividad funcional de mtNOS
disminuyó gradualmente, desde 73  12 hasta 25  9 ng-at O. min-1. mg proteína-1, este
último valor obtenido en la reperfusión tardía (30 min). La disminución en la actividad
funcional de mtNOS se correlacionó con la disminución en la actividad bioquímica
(Tabla 21) la cual alcanza una inhibición máxima, del 28%, a los 30 min de reperfusión.
Un efecto similar se pudo observar cuando se utilizó succinato como sustrato, con
una disminución progresiva de la actividad funcional en cada tiempo de
isquemia/reperfusión. Sin embargo, la máxima disminución de la actividad funcional que
se alcanzó cuando se utilizó el dador de electrones del complejo II fue del 26% (89  15
vs. 66  13 ng-at O. min-1. mg proteína-1) respecto del control (0/0), en comparación con

115
Resultados II

la disminución del 49% (73  12 vs. 25  9 ng-at O. min-1. mg proteína-1) que se logró
utilizando malato-glutamato como sustratos.

Tabla 22. Actividad funcional de mtNOS en la inhibición del consumo de O2 de

ventrículo izquierdo de corazones de conejos sometidos a
isquemia/reperfusión

Consumo de Oxígeno
(ng-at O. min-1. mg proteína-1)

Isquemia/reperfusión (min) 0/0 15/0 15/5 15/30

Sustrato: malato-glutamato

Estado 3 142  5 125  6 115  5 96  5

+ L-arginina (a) 76  6 81  5 87  6 92  4

+ L-NMMA (b) 149  10 123  8 121  8 117  8

[(b-a)] 73  12 42  9 34  10 25  9*

Actividad funcional mtNOS (%) 51 34 30 26

Sustrato: succinato

Estado 3 219  9 215  9 218  9 221  7

+ L-arginina (a) 184  10 189  10 193  10 198  9

+ L-NMMA (b) 273  11 268  10 258  10 264  10

[(b-a)] 89  15 79  14 65  14 66  13

Actividad funcional mtNOS (%) 41 37 30 30

La actividad funcional de mtNOS fue calculada como: [(b-a)/estado 3)] x 100

* p< 0.05, estadísticamente significativo respecto al control (0/0)

4.4. Expresión de mtNOS

La expresión de la enzima mtNOS fue analizada mediante la técnica de Western

Blot utilizando anticuerpos anti-nNOS. Como se puede apreciar en la Figura 47, la
isquemia/reperfusión no modificó la expresión de la proteína mtNOS, indicando que las
variaciones observadas en las actividades bioquímica y funcional se deben a un daño o

116
Resultados II

inactivación de la enzima, sin ocurrencia de una degradación de las proteínas durante el

período de isquemia/reperfusión (15 min/30 min).

Tiempo I/R (min)

0/0 15/0 15/5 15/30

205 kDa

116 kDa

Figura 47. Análisis de la expresión de la enzima mtNOS en membranas mitocondrias

aisladas de ventrículo izquierdo de corazones de conejos sometidos a
isquemia/reperfusión, usando anticuerpos anti-nNOS (H299, Santa Cruz Biotech.)

4.5. Producción mitocondrial de H2O2

La producción mitocondrial de H2O2 se determinó utilizando malato-glutamato o

succinato como sustratos y adicionando inhibidores del complejo I (rotenona) o del
complejo III (antimicina) de la cadena respiratoria (Tabla 23).

La disminución progresiva de la actividad del complejo I, evidenciada a lo largo de

los tiempos de isquemia/reperfusión, se reflejó en un aumento, también progresivo, en la
producción de H2O2 en estado 4 (15/0: 11%, 15/5: 44% y 15/30: 77%) cuando los
sustratos fueron malato y glutamato (Tabla 23). La producción de H2O2 fue 77% mayor en
mitocondrias sometidas a 15 min de isquemia y 30 min de reperfusión respecto a los
valores obtenidos para las mitocondrias control (0/0). Contrariamente, la producción de
H2O2 no se modificó cuando se utilizó succinato, en concordancia con la no modificación
de la actividad del complejo II (Tabla 20).

El agregado de rotenona incrementó la producción de H2O2 en estado 4, en todos

los tiempos de isquemia/reperfusión estudiados (Tabla 23). La rotenona inhibe la
transferencia de electrones por unión a un centro Fe-S ubicado entre el sitio de unión de
la UQ y la FMN del complejo I (Nichols y Ferguson, 2002). Asimismo, dicho compuesto
produce la ruptura de puentes hidrofóbicos que mantienen estable la estructura del
complejo I. De esta manera, se incrementa la producción de O2-, y como consecuencia de
su dismutación, la de H2O2 por el complejo I. El agregado de rotenona a mitocondrias de

117
Resultados II

corazones sometidos a 30 min de reperfusión incrementó la producción de H2O2 en

estado 4 (0.32  0.04 vs. 0.48  0.04 nmol H2O2. min-1. mg proteína-1) sólo un 50%,
mientras que dicho aumento en mitocondrias de corazones control (0/0) fue de 116%
(0.18  0.02 vs. 0.39  0.03 nmol H2O2. min-1. mg proteína-1). Considerando que la
máxima producción de H2O2 por el complejo I corresponde a la determinada en presencia
de rotenona, los resultados obtenidos indican que cuanto más se asemeja la producción
de H2O2 en estado 4 a la máxima producción, el complejo I podría hallarse más dañado
y/o modificado. Así, la relación estado 4/rotenona es mayor (0.67) para mitocondrias
provenientes de corazones 15/30 que para las mitocondrias obtenidas de corazones 0/0
(0.46), sugiriendo la existencia de modificaciones estructurales en las proteínas del
complejo I de corazones sometidos a isquemia/reperfusión.

Tabla 23. Producción de H2O2 por mitocondrias aisladas de ventrículo izquierdo de

corazones de conejos sometidos a isquemia/reperfusión

Producción de H2O2
(nmol H2O2. min-1. mg proteína-1)

Isquemia/reperfusión (min) 0/0 15/0 15/5 15/30

Sustrato: Malato-Glutamato

Estado 4 0.18  0.02 0.20  0.02 0.26  0.04 0.32  0.04*

+ Rotenona 0.39  0.03 0.44  0.03 0.46  0.04 0.48  0.05

Estado 4/Rotenona 0.46 0.45 0.56 0.67

Sustrato: Succinato

Estado 4 0.50  0.04 0.52  0.04 0.51  0.05 0.53  0.05

+ Antimicina 0.60  0.05 0.62  0.05 0.64  0.06 0.65  0.06

Estado 4/Antimicina 0.83 0.84 0.80 0.82

* p < 0.05, estadísticamente significativo respecto al control (0/0)

Cuando se utilizó antimicina como inhibidor de la transferencia de electrones entre

los citocromos b y c en el complejo III, se observó un incremento del 20% en la
producción de H2O2 en comparación con los valores determinados en ausencia de dicho
inhibidor en cada tiempo de isquemia/reperfusión. De esta forma, no se observaron

118
Resultados II

diferencias en la relación entre la velocidad de producción de H2O2 en ausencia y en

presencia de antimicina (Tabla 23).

4.6. Actividad y concentración de Mn-SOD

En la Tabla 24 se detallan los valores de actividad de Mn-SOD en mitocondrias de

corazón de conejo. En las mitocondrias control la actividad de Mn-SOD fue igual a
53 ± 5 USOD. mg proteína-1 sin obtenerse variaciones luego de someter a los corazones a
isquemia/reperfusión. Dicha actividad se corresponde con una concentración de enzima
en la matriz mitocondrial de 7.4 ± 0.7 M Mn-SOD (expresado como homotetrámero).
Dado que la actividad y/o concentración de la enzima que dismuta el H2O2 en la matriz
mitocondrial no se modificó como consecuencia de la isquemia/reperfusión, el incremento
en la producción de H2O2 podría interpretarse en términos de un aumento en la
producción mitocondrial de de su precursor estequiométrico, el O2-.

Tabla 24. Actividad y concentración de Mn-SOD en mitocondrias aisladas de ventrículo

izquierdo de corazón de conejos sometidos a isquemia/reperfusión

Isquemia/reperfusión Mn-SOD

(min) Actividad Concentración (M)

(USOD. mg proteína-1) Centro Activo Homotetrámero

(enzima)

0/0 53  5 30  3 7.4  0.7

15/0 51  6 31  4 7.9  0.9

15/5 55  7 33  6 8.1  1.2

15/30 56  3 32  2 7.9  0.4

119
Resultados II

5. Modificaciones oxidativas y/o nitrosativas a lípidos y proteínas

5.1. Daño oxidativo a lípidos y proteínas

En la Figura 48 puede observarse un aumento moderado y progresivo a lo largo del

tiempo de reperfusión en los productos de oxidación a lípidos (TBARS), siendo dicho
aumento estadísticamente significativo a los 30 min de reperfusión (42%).

Por otro lado, la oxidación a proteínas, estimada a través del contenido de grupos
carbonilos asociados a proteínas, se incrementó ligeramente llegando a un 17% luego de
15 min de isquemia y 30 min de reperfusión (Figura 48), siendo este aumento no
estadísticamente significativo.

180 15

*#
150
12

(nmol. mg proteína-1)
Carbonilos proteicos
(pmol. mg proteína-1)

120
9
TBARS

90

6
60

3
30

0 0
0/0 15/0 15/5 15/30

Tiempo de Isquemia-Reperfusión (min)

Figura 48. Productos de la oxidación a lípidos (TBARS) y carbonilos asociados a

proteínas en mitocondrias obtenidas a partir de ventrículo izquierdo de corazones
sometidos a diferentes tiempos de isquemia/reperfusión.
*p<0.05, estadísticamente significativo respecto al control (0/0)
#
p<0.05, estadísticamente significativo respecto a I/R = 15/0

5.2. Nitración de tirosinas

La modificación de proteínas mitocondriales también se evidenció evaluando la

nitración de tirosinas por análisis de Western Blot utilizando un anticuerpo
anti-nitrotirosina. En la Figura 49, puede observarse un incremento en el contenido de

120
Resultados II

proteínas nitradas, detectándose un 52% de aumento a los 15 min de isquemia y 5 min

de reperfusión (15/5), y un 70% de aumento a los 30 min de reperfusión (15/30), en
ambos casos respecto al control (I/R: 0/0).

A Tiempo de I/R B 240

(min)

Unidades Densitométricas (%)

200 * #

0/0 0/0 15/0 15/5 15/30

+ ONOO- 160

120

80

40

0
0/0 15/0 15/5 15/30

Tiempo isquemia/reperfusión
(min)

Figura 49. Análisis por Western Blot de membranas mitocondriales de ventrículo

izquierdo aisladas a partir de corazones de conejos sometidos a isquemia/reperfusión,
usando anticuerpos anti-nitrotirosina. (Millipore, clone 1A6). A. Se muestra un gel
representativo con los niveles de nitrotirosina. En la calle izquierda puede observarse un
control positivo realizado adicionando ONOO- 100 μM a una preparación de
mitocondrias provenientes de corazones control (0/0). B. Unidades densitométricas
(n = 4) expresadas como porcentaje respecto al control 0/0 (100%).
* p < 0.05, estadísticamente significativo respecto al control 0/0.
#
p < 0.05, estadísticamente significativo respecto a I/R = 15/0

6. Efecto de la Adenosina

Se ha mostrado que la administración exógena de adenosina, o agonistas del

receptor de adenosina, previos a un episodio de isquemia reduce el tamaño de infarto,
mejora la recuperación de la función ventricular durante la reperfusión (atenuando el
atontamiento miocárdico) y prolonga al período para la contractura isquémica. Por otro
lado, la administración de adenosina durante la reperfusión protege al miocardio de las
alteraciones sistólicas post-isquémicas y del incremento de la rigidez diastólica, sin
modificar la relajación isovolúmica (Donnato y Gelpi, 2003). Por lo tanto, se decidió

121
Resultados II

estudiar el efecto de la adenosina sobre la disfunción ventricular y mitocondrial observada

en corazón de conejos sometidos a atontamiento miocárdico.

6.1. Efecto de la adenosina sobre la función ventricular

Se evaluó el efecto de la adenosina sobre la función ventricular de los corazones

sometidos a isquemia/reperfusión. Como se mostró en la sección 1 de este capítulo, la
función ventricular, evaluada a través de la reducción de la PDVI (37%), de la reducción
de la +dP/dtmax (44%), del aumento en la PPC (42%), y del incremento en 3 veces de la
PDFVI, -respecto a los valores pre-isquémicos-, se deterioró como consecuencia de los
15 min de isquemia y 30 min de reperfusión. La perfusión, previa a la isquemia y durante
todo el tiempo de reperfusión. en presencia de adenosina en una concentración 0.03 µg.
kg de peso-1. min-1, mejoró la recuperación de la función ventricular (Figura 50). La
adición de dicha droga permitió alcanzar una PDVI de 97 ± 6 mmHg al final de la
reperfusión, semejante al valor de los corazones normóxicos (107 ± 7 mmHg). Un efecto
similar fue obtenido para la +dP/dtmáx, donde se alcanzó un valor de 702 ± 75 mmHg. s-1
al finalizar la reperfusión, comparable con el valor obtenido para los corazones
normóxicos (848 ± 80 mmHg. s-1). Adicionalmente, el agregado de adenosina permitió
revertir el aumento de la rigidez miocárdica llegando a los valores alcanzados por los
animales normóxicos (12 ± 1 mmHg).

Por otro lado, dicha droga produjo un efecto vasodilatador durante la etapa de
estabilización del miocardio generando una disminución de la PPC de un 20%, previo a la
inducción de la isquemia, respecto a los corazones que no fueron perfundidos con la
droga. La adenosina logró revertir el aumento de la PPC ocasionado por la
isquemia/reperfusión, alcanzando una reducción del 25% en dicho parámetro y
manteniendo los valores semejantes a los del período de estabilización. Así, la PPC a los
30 min de reperfusión fue de 73 ± 1 mmHg para corazones normóxicos, de 92 ± 6 mmHg
para aquellos sometidos a isquemia/reperfusión y de 66 ± 3 mmHg, para los corazones
sometidos a isquemia/reperfusión pero perfundidos en presencia de adenosina.

122
Resultados II

140 1400
A B
120 1200

+dP/dt max (mmHg/s)

100 1000
PDVI (mmHg)

80 * * 800
* *
60 600
* *
40 400

20 200

0 0
0 15 30 45 60 0 15 30 45 60

Basal Isquemia Reperfusión Basal Isquemia Reperfusión

Tiempo (min) Tiempo (min)

40 120
C D
100
30
PDFVI (mmHg)

PPC (mmHg)

80

20 60
* * * * *
* * 40
10
20

0 0
0 15 30 45 60 0 15 30 45 60

Basal Isquemia Reperfusión Basal Isquemia Reperfusión

Tiempo (min) Tiempo (min)

Figura 50. Efecto de la adenosina sobre la función ventricular en corazones aislados de

conejos. A. Presión diastólica del ventrículo izquierdo (PDVI). B. Máxima velocidad de
incremento de presión (+dP/dtmáx) en ventrículo izquierdo. C. Presión de fin de diástole
de ventrículo izquierdo (PDFVI). D. Presión de perfusión coronaria (PPC). Parámetros
determinados durante un período de perfusión sostenida (normoxia, círculos negros),
isquemia/reperfusión (cuadrados negros) o isquemia/reperfusión en presencia de
adenosina (círculos blancos) en el medio de perfusión (0.03 µg. kg de peso-1. min-1).

* p < 0.05 estadísticamente significativo respecto al mismo tiempo de I/R sin adenosina

123
Resultados II

6.2. Efecto de la adenosina sobre la funcionalidad mitocondrial

Debido a que la adición de adenosina al medio de perfusión revirtió los parámetros

de funcionalidad ventricular afectados como consecuencia de la isquemia/reperfusión, se
estudió si esta droga podría revertir la disfunción mitocondrial observada previamente y
descripta en las secciones 4 y 5 de este capítulo. Para ello, se evaluó el consumo de O2
tisular, la actividad del complejo I y de mtNOS, la oxidación a fosfolípidos y la nitración de
tirosinas, en corazones perfundidos en presencia de adenosina.

En la Figura 51 se ilustra la velocidad de consumo de O2 por cortes de ventrículo

izquierdo de corazones de conejos sometidos a isquemia/reperfusión, perfundiéndolos en
presencia de adenosina, en comparación con los resultados mostrados previamente
(sección 3, Tabla 18) realizando la reperfusión en ausencia de dicha droga.

2.0
- Adenosina
+ Adenosina
Consumo de O2 (mol. min-1. g tejido-1)

aaa
1.6

1.2
, ##
**

0.8

0.4

0.0
0/0 15/0 15/5 15/30

Tiempo Isquemia-Reperfusión (min)

Figura 51. Consumo de O2 en cortes de ventrículo izquierdo de corazón de conejos

sometidos a isquemia/reperfusión, en ausencia (barras blancas) o presencia (barras
grises) de adenosina (0.03 µg. kg de peso-1. min-1) en el medio de perfusión.
**p < 0.01, estadísticamente significativo respecto al control (0/0)
##
p < 0.01, estadísticamente significativo respecto a I/R = 15/0.
aaa
p < 0.005, estadísticamente significativo respecto a I/R = 15/30 sin ADO

124
Resultados II

Se puede observar que la disminución obtenida en el consumo de O2 por cortes de

ventrículo izquierdo luego de 15 min de isquemia y 30 min de reperfusión respecto a los
controles (46%, Tabla 18 sección 3.), se revirtió cuando se incluyó la adenosina en el
medio de perfusión, logrando un aumento del 67% respecto al mismo tiempo de
isquemia/reperfusión sin adenosina adicionada (1.42 ± 0.16 vs. 0.85 ± 0.08 mol. min-1. g
tejido-1, respectivamente). Asimismo, los corazones sometidos a 15 min de isquemia y
5 min de reperfusión en presencia de adenosina lograron alcanzar un consumo de O2
semejante al control (0/0), mejorando la actividad respecto a la que había sido
determinada en ausencia de adenosina en el medio (1.53 ± 0.10 vs. 1.30 ± 0.12 mol.
min-1. g tejido-1, respectivamente).

Por otro lado, se estudiaron las actividades del complejo I-III y de la enzima mtNOS
en mitocondrias aisladas de corazones perfundidos en presencia de adenosina
(Tabla 25).

Tabla 25. Actividad del complejo I-III y de mtNOS en mitocondrias de corazón de

conejos sometidos a isquemia/reperfusión en presencia de Adenosina

Isquemia/Reperfusión Complejo I-III Actividad mtNOS

(min) (nmol. min-1. mg proteína-1) (nmol. min-1. mg prot.-1)

Control a 0/0 577  25 0.90  0.05

Adenosina b 0/0 559  22 0.85  0.10

15/0 525  29 0.85  0.22

15/5 523  34 0.83  0.13

15/30 541  28 0.77  0.09

Protección por adenosina (%)c 95% 85%

a
Control: se refiere al grupo sin isquemia/reperfusión y sin adición de adenosina al medio de
perfusión
Adenosina adicionada al medio de perfusión (0.03 g. kg de peso . min )
b -1 -1

c
La protección por adenosina fue calculada como la relación entre cada parámetro medido en las
muestras 15/30 perfundidas con adenosina, respecto a los valores observados en los animales
control (0/0), y expresados como porcentaje de cambio.

125
Resultados II

Se eligió evaluar solamente la actividad del complejo I-III, debido a que fue el
componente de la cadena de transferencia de electrones que había presentado una
disminución progresiva en su actividad, a lo largo de los tiempos de isquemia y
reperfusión (Tabla 20). En la Tabla 25 se muestra la actividad del complejo I-III, para las
cuatro condiciones de isquemia/reperfusión evaluadas, perfundiendo en presencia de
adenosina, y se los compara con el valor obtenido para las muestras control (0/0),
perfundiendo los corazones sin adenosina. Se observa que el agregado de adenosina
revirtió el patrón de disminución observado en la actividad de dicho complejo (Tabla 20),
alcanzando un aumento del 30% en los corazones sometidos a 15 min de isquemia y
30 min de reperfusión, respecto al mismo tiempo de isquemia/reperfusión sin adenosina
adicionada (Tabla 25).

Del mismo modo, y dado que la diminución en la actividad del complejo I-III fue
acompañada por el mismo patrón de diminución en la actividad de mtNOS, alcanzando el
mínimo a los 30 min de reperfusión (28%, Tabla 21), se evaluó la actividad de dicha
enzima. El agregado de adenosina al medio de perfusión permitió incrementar un 19%, la
actividad de mtNOS (Tabla 25), respecto a los valores obtenidos para la muestra 15/30
perfundidas sin adenosina, llegando a ser comparable con los valores obtenidos para las
muestras control (0/0, Tabla 25).

De esta forma, la adenosina no solo ejerció un efecto protector sobre la función

ventricular, sino también revirtió la disfunción mitocondrial observada como consecuencia
de la isquemia/reperfusión. La adición de adenosina en el medio de perfusión ejerció una
protección frente a la injuria por isquemia/reperfusión, la cual fue calculada como la
relación entre cada parámetro medido en las muestras 15/30 perfundidas en presencia de
adenosina, respecto a los valores observados en los animales control (0/0), y expresados
como porcentaje de cambio (Tabla 25). Dicha protección fue 90% en el consumo de O2
tisular, 95% en la actividad del complejo I-III y 85% en la actividad de la enzima mtNOS.

6.3. Efecto de la adenosina sobre el daño oxidativo y nitrosativo

Se estudió el efecto de la adenosina frente al daño oxidativo y nitrosativo detectado

en mitocondrias de ventrículo izquierdo de corazones sometidos a isquemia/reperfusión.
La suplementación del medio de perfusión con adenosina (0.03 µg. kg de peso-1. min-1)
logró revertir en un 25% el daño oxidativo a lípidos, evaluado a través de las TBARS,
observado en mitocondrias de ventrículo izquierdo, a los 15 min de isquemia y 30 min de
reperfusión (Tabla 26). Los valores alcanzados luego de la adición de adenosina al medio
de perfusión (108  8 pmol. mg proteína-1) fueron semejantes a los encontrados en las

126
Resultados II

muestras control (0/0) con o sin el agregado de dicha droga. De esta forma, la perfusión
con adenosina permitió proteger en un 100% la oxidación de lípidos ocasionada como
consecuencia de la isquemia/reperfusión.

Tabla 26. Efecto de la adenosina sobre la oxidación de lípidos en mitocondrias de

corazón de conejos sometidos a isquemia/reperfusión

Isquemia/Reperfusión TBARS
(min) (pmol. mg proteína-1)

Control 0/0 101  6

15/30 143  9*

Adenosina 0/0 104  6

15/30 108  8a

Protección por adenosina (%)b 100%

*p< 0.05, estadísticamente significativo respecto al 0/0 control

a
p < 0.05, estadísticamente significativo respecto a I/R = 15/30 control
b
La protección por adición de adenosina al medio de perfusión fue calculada como la relación
entre el daño oxidativo a lípidos en las muestras 15/30 + adenosina respecto a los valores
observados en los animales control (0/0), y expresados como porcentaje de cambio.

Adicionalmente, como se muestra en la Figura 52, la perfusión con adenosina

redujo en un 65% la nitración de tirosinas luego de 15 min de isquemia y 30 min de
reperfusión (Figura 49), respecto a las muestras control (0/0). En la Tabla 27 se muestra
el efecto de la adición de adenosina al medio de perfusión sobre la nitración de tirosinas
en membranas mitocondriales. Los resultados se expresan como el porcentaje de las
unidades densitométricas obtenidas para cada tiempo de isquemia/reperfusión, respecto
a la muestra control, sin adenosina adicionada en el medio y tomada como 100%.

127
Resultados II

B 200
A Tiempo de I/R
(min)

Unidades Densitométricas (%)

160
0/0 0/0 15/0 15/5 15/30 15/30

+ Adenosina
120

+ Adenosina
80

40

0
0/0 0/0 15/0 15/5 15/30 15/30

Tiempo de Isquemia/Reperfusión
(min)

Figura 52. Efecto de la adenosina sobre la nitración de proteínas. A. Gel representativo que
muestra la reducción en la nitración de proteínas de membranas mitocondriales de
ventrículo izquierdo de corazones de conejos sometidos a isquemia/reperfusión, usando
anticuerpos anti-nitrotirosinas (Millipore, clone 1A6). B. Unidades densitométricas (n=3)
expresadas como porcentaje respecto al control 0/0 (100%).

Tabla 27. Efecto de la adenosina sobre la nitración de tirosinas de mitocondrias de

corazón de conejos sometidos a isquemia/reperfusión

Isquemia/Reperfusión Nitración de tirosinas

(min)
Unidades densitométricas (%)

Control 0/0 100

Adenosina 0/0 44

15/0 46

15/5 42

15/30 37

Los porcentajes de las unidades densitométricas fueron calculados respecto a los controles (0/0;
100%) de cada gel (n = 3).

128
Resultados III

CAPÍTULO III
FUNCIONALIDAD Y BIOGÉNESIS MITOCONDRIAL CARDÍACA EN
DIABETES INDUCIDA POR ESTREPTOZOTOCINA

1. Caracterización de los animales diabéticos: glucemia, peso de los animales y

peso del corazón

La inducción de Diabetes Mellitus (DM) en los animales inyectados con

estreptozotocina (STZ) fue confirmada por la elevación de la concentración de glucosa en
sangre, 72 h posteriores a la administración de la droga. Como se observa en la
Figura 53, los valores de glucemia en los animales tratados con STZ (423 ± 15 mg. dl-1)
fueron superiores a 250 mg. dl-1, valor a partir del cual se pueden considerar a los
animales como diabéticos (Joffe y col., 1999). Aquellos animales con valores por debajo
de ese límite no fueron considerados para realizar las determinaciones bioquímicas. Por
otro lado, los animales control, inyectados con el vehículo, presentaron glucemias
normales, de 120 ± 5 mg. dl-1.

600

500
***

***
400
Glucemia
(mg. dl )
-1

300

200

100

0
C C DM DM
72 h Día 28 72 h Día 28

Figura 53. Glucemias medidas a las 72 h y a las 4 semanas post-inducción de

Diabetes por inyección i.p. con STZ o vehículo (solución amortiguadora citrato de
sodio). Control (C; círculos blancos), Diabéticos (DM; círculos grises). La determinación
de glucemia a las 4 semanas post-inducción de Diabetes se realizó en forma aleatoria
sólo a 6 animales de cada grupo.
***p< 0.0001 estadísticamente significativo respecto al grupo control.

129
Resultados III

Cuatro semanas posteriores a la inducción de Diabetes, se midieron nuevamente

los valores de glucemia (C: 141 ± 11 mg. dl-1 vs. DM: 484 ± 26 mg. dl-1), no habiendo
cambios en los niveles de dicho parámetro con respecto a los valores determinados a las
72 h (Figura 53).

Por otro lado, el peso de los animales control fue incrementando gradualmente a lo
largo del tratamiento: a los 28 días de seguimiento el peso de dichos animales aumentó
un 69%, estando de acuerdo con el crecimiento normal de los animales en ese período
(Tomita y col., 1996; Mora y col., 2009). Sin embargo, como se observa en la Figura 54,
las ratas diabéticas no mostraron cambios significativos en el peso corporal luego de la
instauración de la Diabetes, habiendo aumentado sólo un 15% su peso corporal, a los 28
días de seguimiento, no alcanzando el peso correspondiente a su edad.

450

375
Peso de los animales (g)

300
* *** *** ***

225

150

75

0
0 1 2 3 4

Tiempo (semanas)

Figura 54. Peso de los animales control (barras blancas) y Diabéticos (barras grises) a
lo largo de las 4 semanas posteriores a la inyección de STZ.
*p<0.05; ***p < 0.005 estadísticamente significativo respecto al grupo control, en la misma
semana de tratamiento.
§§§
p< 0.005 estadísticamente significativo respecto al grupo control al inicio del tratamiento.

La incapacidad en los animales diabéticos de incorporar correctamente glucosa y

nutrientes a las células, lleva a un desequilibrio metabólico, con pérdida de proteínas, las
cuales son catabolizadas, en reemplazo a la imposibilidad de usar carbohidratos como

130
Resultados III

fuente de energía. Esto conlleva a un menor crecimiento de los animales en el período

estudiado, lo cual también se asocia a una excesiva diuresis, signo característico de la
Diabetes tipo I.

La diminución observada en el peso de los animales diabéticos respecto a los

animales control a las 4 semanas, se vio acompañada de una disminución del 30% en el
peso de los corazones, al momento del sacrificio (Figura 55 A). En la Figura 55 B se
puede ver que los animales con menor peso corporal y menor peso del corazón
corresponden a los animales diabéticos (círculos grises), mientras que los animales de
mayor peso corporal y mayor peso del corazón corresponden a los animales control
(círculos blancos), observándose una correlación lineal (r2 = 0.647) entre ambos
parámetros. Debido a que los animales diabéticos presentaron no solo menor peso
corporal sino menor peso del corazón, el índice cardíaco porcentual, calculado como la
relación entre el peso del corazón y el peso del animal al final del tratamiento, no
presentó diferencias significativas entre grupos (C: 0.34 ± 0.04% vs. DM: 0.36 ± 0.06%).
Este resultado indica que a las 4 semanas de instaurada la Diabetes no se observa
hipertrofia cardíaca.

1.6 0.5 2.0

A B

0.4
1.2 1.6
Peso del corazón (g)

Peso del corazón (g)

Índice cardíaco (%)

***
0.3
1.2
0.8

0.2

0.8
0.4
0.1

0.4
0.0 0.0 0.0
C DM C DM 0 150 200 250 300 350 400 450 500

Peso del animal (g)

Figura 55. A. Peso de los corazones (Control: barra blanca, Diabéticos: barra gris) e
Indice cardíaco (Control: barra blanca rayada, Diabéticos: barra gris rayada) a las 4
semanas de la inyección de STZ ó vehículo. B. Correlación entre el peso del corazón y
el peso del animal, al finalizar el tratamiento (r2 = 0.647). Control (círculos blancos),
Diabéticos (círculos grises).
***p < 0.0001, estadísticamente significativo respecto al grupo control.

131
Resultados III

2. Función ventricular

Se evaluó la función ventricular en corazones de animales diabéticos y controles,

utilizando un sistema de perfusión para órgano aislado según la técnica de Langendorff,
en ausencia y en presencia de un estímulo β-adrenérgico, logrado por la perfusión con
isoproterenol.

La función ventricular sistólica se evaluó a través de la presión desarrollada por el

ventrículo izquierdo (PDVI) y la máxima velocidad de aumento de presión en ventrículo
izquierdo o contractilidad miocárdica (+dP/dtmáx).

A las 4 semanas de tratamiento y en condiciones basales (Figura 56 A), la PDVI fue

similar tanto en corazones de animales control como diabéticos (C: 106 ± 6 vs. DM: 112 ±
5 mmHg). Cuando se utilizó isoproterenol como estímulo β-adrenérgico, la PDVI en
corazones de animales control se incrementó en un 52%; aumento que concuerda con el
valor esperado (~60%) cuando se induce sobrecarga de trabajo a un miocardio normal.
Sin embargo, la contractilidad cardíaca como respuesta a un agonista β se encontró
atenuada en los corazones de los animales diabéticos, observándose solamente un
aumento del 32% en la PDVI. Aunque no se observaron diferencias en el estado
contráctil en condiciones basales entre grupos, luego de un estímulo β-adrenérgico, los
animales diabéticos presentaron una respuesta contráctil disminuida, calculada como la
diferencia entre la PDVI en presencia y ausencia de isoproterenol, que fue un 38% menor
respecto a los animales control (Figura 56 B).

La +dP/dtmax, fue similar en los corazones de los animales diabéticos (2618 ± 265
mmHg. s-1) con respecto a la determinada en los corazones de los animales control
(2427 ± 82 mmHg. s-1) en condiciones basales. Luego de la adición de isoproterenol se
observó aumento en la +dP/dtmáx en ambos grupos experimentales. El incremento
observado en la +dP/dtmáx en los corazones control fue del 87% y en los corazones de los
animales diabéticos del 55% (+dP/dtmáx post estímulo β-adrenérgico C: 4552 ± 276 vs.
DM: 4046 ± 509 mmHg. s-1). Aunque no se observaron diferencias entre grupos en la
+dP/dtmáx en condiciones basales, luego de un estímulo β-adrenérgico la contractilidad
miocárdica, calculada, como la diferencia en la +dP/dtmáx en presencia y ausencia de
isoproterenol, fue un 37% menor en los corazones diabéticos respecto a los animales
control, en concordancia con el comportamiento observado en la PDVI luego del estímulo
β, mostrando de esta forma una alteración en la reserva inotrópica en los corazones
diabéticos.

132
Resultados III

200 60
A B

Respuesta contráctil (%)

50

40
*
160
30

20
PDVI (mmHg)

120 10

0
C DM
80

40
Basal

0 Isoproterenol
Control Diabetes

5000
C 120

Respuesta inotrópica (%)

100
D
4000 80
+dP/dtmáx (mmHg. s )
-1

60

40
3000
20

0
2000 C DM

1000

0
Control Diabetes

Figura 56. Función ventricular sistólica. A. Presión desarrollada por el ventrículo

izquierdo (PDVI), en condiciones basales (barras vacías) y luego de la adición de
isoproterenol (barras rayadas). B. Respuesta contráctil (%) calculada como la
diferencia entre la PDVI con isoproterenol y basal, relativo a la PDVI basal. C. Máxima
velocidad de ascenso de la presión intraventricular (+dP/dtmáx) en condiciones basales
(barras vacías) y luego de la adición de isoproterenol (barras rayadas). D. Reserva
inotrópica (%) calculada como la diferencia entre el +dP/dtmáx en presencia y en
ausencia de isoproterenol.
La PDVI fue calculada como la diferencia entre el pico de presión sistólica y la presión final
desarrollada por el VI (PFDVI).
*p < 0.05, estadísticamente significativo respecto al grupo control.

133
Resultados III

Por otro lado, la función ventricular diastólica se evaluó a través del indice de
relajación isovolúmica (t50). El t50 o velocidad de relajación al 50%, indica el tiempo
necesario para que la presión intraventricular descienda al 50% de su máximo valor. Así,
una mayor velocidad de relajación, se correlaciona con un menor tiempo para alcanzar el
50% de relajación. La Figura 57 A muestra que el t50 no se modificó significativamente en
corazones de animales diabéticos en condiciones basales (t50: 55 ± 1 ms), respecto a los
animales control (t50: 57 ± 1 ms). Luego de la administración de isoproterenol se observó
una disminución en el t50 en los corazones de animales control, respecto al valor basal,
mostrando de esta forma un aumento en la velocidad de relajación inducida por el
estímulo β-adrenérgico. La diferencia entre el t50 medido en presencia y en ausencia de
isoproterenol, se expresa como una variación porcentual (Δt50 %), que es negativa por el
acortamiento en el tiempo de relajación. En los corazones de los animales control el Δt50C
fue del -26%. En los corazones diabéticos la disminución observada en el t50, luego de la
adición de isoproterenol fue del 11%, siendo menor a la observada en los animales
control. Esto indica una alteración en la reserva lusitrópica en los animales diabéticos en
respuesta a una sobrecarga de trabajo (Figura 57 B).

70 C DM
A 0
B
-5
60
-10
t50 (%)

*
50 -15
***
-20

40
t 50 (ms)

-25

-30
30

20

10 Basal
Isoproterenol
0
Control Diabetes

Figura 57. Función ventricular diastólica. A. Índice de relajación isovolúmica (t50) en

condiciones basales (barras vacías) y luego de la adición de isoproterenol (barras
rayadas). B. Δt50 (%) calculado como la diferencia entre el t50 en presencia y en
ausencia de isoproterenol.
***p < 0.005, estadísticamente significativo respecto al grupo control.

134
Resultados III

Éstos resultados muestran una disfunción ventricular cuando los corazones

provenientes de los animales diabéticos son expuestos a sobrecarga de trabajo, simulada
por un estímulo β-adrenérgico. Esto indica que la reserva contráctil y lusitrópica de los
corazones de los animales diabéticos es menor que la de los corazones de animales
control. No obstante a las 4 semanas post-inyección de STZ no se evidenciaron
alteraciones ventriculares en condiciones basales.

3. Consumo de O2 tisular

Posteriormente a la evaluación de la contractilidad cardíaca, los corazones fueron

removidos del aparato de perfusión de Langendorff y se determinó la velocidad de
consumo de O2 en cortes de de tejido cardíaco de 1 mm3. Tal como se muestra en la
Tabla 28, la velocidad de consumo de O2 tisular en animales diabéticos fue 12% menor
que la determinada en cortes de corazón provenientes de animales control.

Tabla 28. Consumo de O2 por corazón de ratas diabéticas y ratas control

Consumo de O2 cardíaco
Condiciones experimentales
(µmol O2. min-1. g tejido-1)

Control Diabetes

Basal (a) 3.68 ± 0.14 3.24 ± 0.10*

+ KCN (b) 1.20 ± 0.11 1.20 ± 0.12

Consumo de O2 mitocondria-dependiente (a-b) 2.48 ± 0.18 2.04 ± 0.16*

*p < 0.05 estadísticamente significativo respecto al grupo control

a
El consumo de O2 dependiente de la fracción mitocondrial se calculó como la diferencia entre el
consumo de O2 basal y el consumo de O2 en presencia de KCN

Cuando se adicionó KCN en la cámara de medida, el cual inhibe la citocromo

oxidasa y por ende el consumo de O2 mitocondrial, no se observaron diferencias en el
consumo de O2 remanente entre grupos. El consumo de O2 medido en presencia de KCN
corresponde al consumo de O2 tisular, no mitocondrial. La fracción inhibible por KCN, es
decir el consumo de O2 tisular proveniente de la fracción mitocondrial, fue un 18% menor
en el grupo diabético respecto al grupo control. De esta forma, la diferencia observada en
el consumo de O2 en ausencia de KCN entre tejidos provenientes de animales control y

135
Resultados III

de animales diabéticos, puede atribuirse a modificaciones en el consumo de O2

mitocondrial, debido a una disfunción de la cadena de transferencia de electrones.

4. Funcionalidad mitocondrial

4.1. Consumo de O2 mitocondrial y eficiencia en la fosforilación oxidativa

Con el fin de evaluar la funcionalidad mitocondrial, se determinó el consumo de O2

usando tanto sustratos del complejo I (malato-glutamato) como del complejo II
(succinato). Tal como se muestra en la Tabla 29, la respiración en estado 4, o respiración
pasiva, de mitocondrias provenientes de corazones de animales diabéticos no fue
significativamente diferente de la determinada en mitocondrias provenientes de
corazones de animales control, tanto cuando se adicionó malato-glutamato como
succinato al medio de reacción. Sin embargo, se evidenció una disminución en el
consumo de O2 en estado 3 (Tabla 29), en mitocondrias de corazón de animales
diabéticos respecto a las provenientes de animales control, cuando se utilizaron
malato-glutamato (22%) o succinato (17%) como sustratos.

Tabla 29. Consumo de O2 por mitocondrias de corazón de ratas diabéticas y de ratas

control

Consumo de O2 mitocondrial

(ng-at O. min-1. mg proteína-1)

Estado 4 Estado 3 Control respiratorio

Sustrato: Malato-Glutamato

Control 53  8 217  15 4.5  0.2

Diabetes 56  6 169  9* 3.3  0.1*

Sustrato: Succinato

Control 117  9 235  10 2.0  0.2

Diabetes 114  5 198  9* 1.7  0.1

El control respiratorio fue calculado como la relación entre el consumo de O 2 en estado 3 /

consumo de O2 en estado 4.
* p < 0,05, estadísticamente significativo respecto al grupo control.

136
Resultados III

Como consecuencia de los resultados obtenidos para la respiración mitocondrial, el

control respiratorio, un estimador de la integridad mitocondrial y/o del acoplamiento con la
fosforilación oxidativa, resultó significativamente disminuido (27%) en mitocondrias de
corazón de animales diabéticos cuando los electrones ingresaron a la cadena respiratoria
a través del complejo I. Cuando los electrones fueron cedidos por el succinato al
complejo II no se observaron diferencias en el control respiratorio, a pesar de la
disminución observada en el consumo de O2 en estado 3. Estos resultados sugieren la
existencia de una alteración de la funcionalidad de los complejos de la cadena
respiratoria, principalmente del complejo I, que repercute en el consumo de O2 tisular
disminuido, mostrado previamente.

La relación ADP/O, o moles equivalentes de fosfato esterificado por oxígeno

consumido, expresa la eficiencia de la fosforilación oxidativa. En la Tabla 30 se puede
observar que la relación ADP/O disminuyó significativamente cuando se utilizó
malato-glutamato como sustrato (15%), en concordancia con las cambios observados en
el consumo de O2 mitocondrial en estado 3 (Tabla 29). En contraste, no se observaron
diferencias significativas en la relación ADP/O, cuando se utilizó el dador de electrones
del complejo II.

Tabla 30. Moles equivalentes de fosfato esterificado por mol de oxigeno consumido
(ADP/O) en mitocondrias de corazón de ratas diabéticas y control

Sustrato Grupo ADP/O

(nmol. ng-átomo-1)

Malato-Glutamato Control 2.71  0.17

Diabetes 2.30  0.11*

Succinato Control 1.40  0.16

Diabetes 1.25  0.10

* p < 0,05, estadísticamente significativo respecto al grupo control con Malato-Glutamato.

137
Resultados III

4.2. Actividades de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial

Debido a la disfuncionalidad observada en la respiración mitocondrial en corazón de

animales diabéticos, se determinó la actividad de los complejos de la cadena de
transferencia de electrones. Como puede observarse en la Tabla 31, las actividades de
los complejos I-III, II-III y IV fueron menores en mitocondrias de corazón de los animales
diabéticos, respecto a las determinadas en mitocondrias de corazón de animales control.
La actividad del complejo I-III disminuyó un 22%, en concordancia con las disminuciones
observadas en el consumo de O2 y en la eficiencia de la fosforilación oxidativa (ADP/O)
cuando se utilizaron malato y glutamato como sustratos del complejo I (Tablas 29 y 30).
Asimismo, se observó una disminución en las actividades de los complejos II-III y IV en
las mitocondrias provenientes de los animales diabéticos, del 26 y 22%, respectivamente.

Tabla 31. Actividad de los complejos mitocondriales en mitocondrias de corazón de

ratas diabéticas y control

Grupo Complejo I-III Complejo II-III Complejo IV

-1 -1 -1 -1 -1 -1
(nmol. min . mg proteína ) (nmol. min . mg proteína ) (min . mg proteína )

Control 492  22 263  17 60  4

Diabetes 385  16*** 194  13** 47  3*

*p < 0.05; **p < 0.01; estadísticamente significativo respecto al grupo control.

Así, la disfuncionalidad observada en cuanto a la transferencia de electrones por los

complejos de la cadena respiratoria, está de acuerdo con las modificaciones observadas
en el consumo de O2 tanto mitocondrial como tisular en los corazones de los animales
diabéticos respecto a los animales control.

4.3. Potencial de membrana mitocondrial estimado por citometría de flujo

El potencial de membrana es otro indicador de la función mitocondrial que

determina el componente eléctrico del potencial electroquímico generado a través del
bombeo de H+ al espacio intermembranas.

El cambio en el potencial de la membrana mitocondrial fue estimado usando

citometría de flujo, como se detalla en la sección 4.4. de materiales y métodos. Las

138
Resultados III

mitocondrias fueron seleccionadas de acuerdo a la propiedad que poseen de dispersar la

luz (SSC: Side Scatter o desviación lateral del haz de luz vs. FSC: Forward Scatter o
desviación frontal del haz de luz) seleccionando los eventos ubicados dentro de la
ventana R1. Para el análisis fueron elegidos 30 000 eventos (Figura 58 A).

En cada preparación analizada, entre un 60-70% de los eventos dentro de la

población seleccionada R1 fueron NAO positivos (R2), comparado con la señal de auto-
fluorescencia correspondiente a mitocondrias no cargadas con la sonda (Figura 58 B).
Cabe mencionar que la sonda NAO es específica para las mitocondrias debido su
capacidad de unión selectiva a la cardiolipina, fosfolípido que se encuentra en alta
proporción en la membrana interna mitocondrial.

R2
A B 160
Eventos
SSC

R1

FSC NAO

Figura 58 A. Mitocondrias seleccionadas de acuerdo a la propiedad que poseen de

dispersar las luz lateral y frontal (SSC y FSC, respectivamente), se seleccionaron
30 000 eventos dentro de R1. B. Determinación de la población mitocondrial (R2) en
una muestra de mitocondrias control utilizando la sonda NAO (trazo gris oscuro)
comparado con la señal de auto-fluorescencia sin sonda (trazo gris claro).

Por otro lado y como puede apreciarse en los histogramas superpuestos (Figuras
59 A y B), la señal FL1 de la sonda DiOC6 correspondiente a mitocondrias en estado de
respiración pasiva no se modificó entre grupos, ni cuando se utilizó malato-glutamato ni
con el uso de succinato. Sin embargo, el agregado de ADP, el cual lleva a un estado de
respiración activa o estado 3, disminuyó ligeramente el potencial de membrana de
mitocondrias provenientes de corazón de animales diabéticos respecto al obtenido en
mitocondrias de corazón de animales control (Figuras 59 C y D).

139
Resultados III

A B
Estado 4 Malato-Glutamato Estado 4 Succinato
100

100
Eventos

Eventos
DiOC6 DiOC6

C D
Estado 3 Malato-Glutamato Estado 3 Succinato
100

100
Eventos

Eventos

DiOC6 DiOC6

Figura 59. Determinación del potencial de

E membrana por citometría de flujo:
Control positivo m-CCCP Histogramas solapados de los eventos
dentro de R1 vs. la intensidad de
160

fluorescencia de la sonda DiOC6,

correspondientes a mitocondrias de
corazón de animales control (trazos gris
Eventos

oscuro) y diabéticos (trazos gris claro). A

y B. Mitocondrias en estado 4, utilizando
malato-glutamato (A) o succinato (B)
como sustratos. C y D. Mitocondrias en
estado 3, utilizando malato-glutamato (C)
o succinato (D) como sustratos. E. Control
positivo: mitocondrias de corazón
DiOC6
adicionadas con m-CCCP (2 M) para
despolarizar la membrana mitocondrial.
Control: líneas gris oscuro; Diabetes:
líneas gris claro.

140
Resultados III

Esto puede observarse como un corrimiento hacia la izquierda en los histogramas, es

decir, una menor intensidad de fluorescencia de la sonda DiOC6 en las mitocondrias de
animales diabéticos. Este corrimiento puede explicarse teniendo en cuenta que la sonda
entra a la mitocondria por diferencia de potencial de membrana, donde se acumula y
fluoresce, y sale de dicha organela cuando hay una disminución en el potencial de
membrana. El agregado de m-CCCP al medio de reacción produjo la despolarización
completa de las mitocondrias en ambos grupos (Figura 59 E), situación experimental
considerada como control positivo.

La Figura 60 muestra la fluorescencia media de DiOC6 porcentual obtenida a partir

de los histogramas de mitocondrias respirando en estado 3 (Figuras 59 C y D).

50
Eventos visibles dentro de R1 (%)

40

30
Control
Diabetes
20

10

0
Malato-glutamato Succinato m-CCCP

Figura 60. Cuantificación de la fluorescencia media de DiOC6, indicando el potencial

de membrana de mitocondrias de corazón en estado 3 utilizando malato-glutamato o
succinato como sustratos y luego de la adición de m-CCCP como control positivo.
Control (barras blancas), Diabéticos (barras grises).

La adición de m-CCCP produjo la despolarización de las mitocondrias provenientes de

corazón de animales control y de animales diabéticos. Las mitocondrias provenientes de
corazones de animales diabéticos presentaron, en estado de respiración activa, un
porcentaje de eventos visibles dentro de R1 22% menor, cuando se utilizó malato-
glutamato, y 15% menor, al usar succinato como sustratos, comparados con los eventos
registrados para mitocondrias provenientes de corazón de animales control. Así, estos

141
Resultados III

resultados muestran que la membrana mitocondrial de corazón de ratas diabéticas se

halla parcialmente despolarizada.

4.4. Producción mitocondrial de ATP

Dada las modificaciones observadas en cuanto a la disminución en el consumo de

O2 mitocondrial, la reducción en las actividades de los complejos de la cadena
respiratoria y la disminución en el potencial de membrana en estado 3, observadas en
corazón de animales diabéticos, se determinó la velocidad de producción de ATP por
mitocondrias de corazón provenientes de ratas diabéticas y ratas control (Figura 61).

200
(nmol. min . mg proteína )

150
-1
Producción de ATP

* *
100 Control
-1

Diabetes

50

0
Malato-Glutamato Succinato

Figura 61. Producción de ATP por mitocondrias de corazón de ratas control (barras
blancas) o diabéticas (barras grises), utilizando malato-glutamato o succinato como
sustratos.
* p < 0.05, estadísticamente significativo respecto al grupo control.

Como puede apreciarse en la Figura 61, la velocidad de producción de ATP

utilizando sustratos del complejo I fue 44% menor en las mitocondrias de los animales
tratados con STZ, en comparación con mitocondrias provenientes de corazón de
animales control. De la misma forma, cuando se utilizó succinato como dador de
electrones, la producción de ATP fue 37% menor. Estos resultados indican la existencia

142
Resultados III

de una deficiencia en la producción de energía por parte de las mitocondrias de corazón

de animales diabéticos.

4.5. Producción mitocondrial de H2O2

La producción mitocondrial de H2O2 fue evaluada utilizando malato-glutamato o

succinato como sustratos, y adicionando rotenona o antimicina, al medio de reacción,
para lograr la máxima producción de H2O2 por los complejos I o III, respectivamente
(Tabla 32).

Tabla 32. Producción de H2O2 por mitocondrias de corazón de ratas diabéticas y control

Producción de H2O2

(nmol. min-1. mg proteína-1)

Grupo

Sustrato Control Diabetes

Malato - Glutamato

Estado 4 0.40  0.19 0.91  0.08 ***

+ 1 µM rotenona 0.62  0.12 0.95  0.12*

Estado 4 /rotenona
0.65 0.96
Succinato

Estado 4 0.52  0.08 0.62  0.09

+ 1 µM antimicina 0.78  0.10 0.81  0.12

Estado 4 / antimicina 0.67 0.76

*** p < 0.005 estadísticamente significativo respecto al grupo control

* p < 0.05 (Test Mann-Whitney - no paramétrico)

Cuando se utilizó malato-glutamato como sustrato, la velocidad de producción de

H2O2 por mitocondrias de corazón de animales diabéticos se duplicó en comparación con
la determinada en el grupo control. El agregado de rotenona incrementó 55% la
producción de H2O2 por mitocondrias provenientes de corazones de animales control, y

143
Resultados III

solo un 4% la generación de H2O2 por mitocondrias provenientes de corazones de

animales diabéticos, sugiriendo, nuevamente, una disfunción en el complejo I. De esta
forma, la relación calculada entre la producción mitocondrial de H2O2 en estado 4 sobre la
determinada en presencia de rotenona fue más cercana a 1 en el grupo diabético (0.96
vs. 0.65), sugiriendo que las proteínas del complejo I de mitocondrias de corazón de
animales diabéticos podrían estar modificadas como consecuencia del estado de
hiperglucemia en dichos animales.

Por otro lado, cuando se utilizó succinato como sustrato (Tabla 32), la producción
de H2O2 por mitocondrias de corazón de animales diabéticos fue 20% mayor que la
determinada en mitocondrias control, siendo este incremento no estadísticamente
significativo. Asimismo, la producción de H2O2 máxima, en presencia de antimicina no fue
diferente entre grupos, alcanzando valores de producción de H2O2 similares (0.78 ± 0.10
vs. 0.81 ± 0.12 nmol H2O2. min-1. mg proteína-1). Así, la relación determinada entre la
producción mitocondrial de H2O2 en estado 4 en ausencia y presencia del inhibidor del
complejo III antimicina, fue similar entre grupos (0.67 vs. 0.76).

De esta forma, la disfuncionalidad observada en la actividad del complejo I en

mitocondrias de corazón de animales diabéticos, se fortalece con el incremento
observado en la producción de H2O2 sólo cuando se utilizaron malato y glutamato como
sustratos.

4.6. Actividad y concentración de Mn-SOD

Se determinó la actividad de la enzima Mn-SOD y, a partir de esos datos, se calculó

la concentración en la matriz mitocondrial, como se explica en la sección 6 de materiales
y métodos. En la Tabla 33 se muestra que en mitocondrias de corazón provenientes de
animales control la actividad de Mn-SOD fue de 139 ± 17 USOD. mg de proteína-1, la cual
corresponde a una concentración de enzima "activa" en la matriz mitocondrial de 17 ± 3
µM, expresada como homotetrámero de enzima, y 68 ± 9 M expresada por centro
activo. En los animales diabéticos, la actividad enzimática y/o la concentración de enzima
en la matriz mitocondrial resultó ser un 49% menor que la determinada en animales
control. Este resultado sugiere que la descomposición del O2- dentro de la mitocondria
estaría reducida, aumentando, probablemente, su concentración en estado estacionario
dentro de la matriz mitocondrial.

144
Resultados III

Tabla 33. Actividad y concentración de Mn-SOD "activa" en mitocondrias de corazón de

ratas diabéticas y control

Grupo

Actividad Mn-SOD Control Diabetes

USOD. mg proteína-1 139 ± 17 71 ± 8

nmol SOD. mg proteína-1 0.48 ± 0.06 0.24 ± 0.03

Concentración Mn-SOD (µM)

Por centro activo 68 ± 9 35 ± 4

Por enzima 17 ± 3 8.5 ± 0.9

4.7. Actividad y expresión de la enzima mtNOS

La velocidad de producción de NO por mitocondrias de corazón, estudiada como

actividad de mtNOS, se determinó como se detalla en la sección 5.2. de materiales y
métodos. Las mitocondrias de corazón de animales control produjeron
0.93 nmol NO. min-1. mg proteína-1, siendo la producción de NO por mitocondrias de
corazón de animales diabéticos 23% mayor respecto a la determinada en mitocondrias de
animales control (Tabla 34).

Tabla 34. Actividad de mtNOS en mitocondrias de corazón de ratas diabéticas y control

Grupo Actividad mtNOS

(nmol NO. min-1. mg proteína-1)

Control 0.93  0.07

Diabetes 1.14  0.06*

*p < 0.05, estadísticamente significativo respecto al grupo control.

Por otro lado, el análisis de Western Blot (Figura 62), utilizando anticuerpos anti-
nNOS, mostró un aumento del 90% en la expresión de la NOS mitocondrial en corazón

145
Resultados III

de animales diabéticos diabéticos en comparación con la expresión detectada en corazón

de animales control.

250
PM (kDa) AA B

Unidades Densitométricas relativas

162 200

nNOS/VDAC-1 (%)
150

100

30
50

C DM DM 0
Control Diabetes

Figura 62. Expresión de mtNOS en membranas mitocondriales de corazón. A. Análisis

por Western blot usando anticuerpos anti-nNOS H299 (PM: 162 kDa, panel superior) y
VDAC-1 (D-16) (PM: 30 kDa, panel inferior) como control de carga (Santa Cruz
Biotech.). B. Unidades densitométricas de nNOS relativas a VDAC-1, expresadas como
porcentaje respecto al control (100%).

5. Nitración de tirosinas

Se evaluó la nitración de tirosinas por análisis de Western Blot. En la Figura 63,

puede observarse un incremento del 58% en el contenido de tirosinas nitradas en
mitocondrias de corazón de animales diabéticos respecto al determinado en mitocondrias
de corazón de animales control, sugiriendo un aumento en la generación y/o estado
estacionario de ONOO-.

Este resultado está de acuerdo con el incremento en la producción de NO

observada en las mitocondrias de corazón de los animales diabéticos (Tabla 34), junto a
un incremento en la concentración en estado estacionario de O2-, esta última reflejada por
el aumento en la generación de H2O2 (Tabla 32) acompañada por la disminución en la
actividad de la enzima Mn-SOD (Tabla 33).

146
Resultados III

200
A B

Unidades densitométricas relativas

Nitrotirosina / VDAC-1 (%)
150
Anti-nitrotirosina

100

50
Anti-VDAC-1

DM C DM 0
Control Diabetes

Figura 63. Nitración de residuos tirosina en membranas mitocondriales de corazón de

rata. A. Análisis por Western blot, usando anticuerpos anti-nitrotirosina (panel superior)
y VDAC-1 (D-16) (PM: 30 kDa, panel inferior) como control de carga (Santa Cruz
Biotech.). B. Unidades densitométricas de nitrotirosinas relativas a VDAC-1, expresadas
como porcentaje respecto al control (100%)

6. Biogénesis mitocondrial

6.1. Masa mitocondrial estimada a partir de la actividad de citocromo oxidasa

La masa mitocondrial, expresada como mg proteína mitocondrial por gramo de

tejido, puede estimarse a partir de la relación entre la actividad de citocromo oxidasa
medida en homogeneizado total y en la fracción mitocondrial. Dado que la citocromo
oxidasa es una enzima de localización únicamente mitocondrial, la masa mitocondrial es
un indicador útil para la estimación de la ocurrencia de síntesis de novo de proteínas
mitocondriales, y puede ser utilizada como un indicador de la existencia de un proceso de
biogénesis.

Como puede observarse en la Figura 64 A, la actividad de citocromo oxidasa

determinada en el homogeneizado total de corazón de animales diabéticos fue 16%
superior a la determinada en los homogeneizados de animales control. Sin embargo,
dicho aumento no fue significativamente diferente. Asimismo, como se mostró en la
Tabla 31, la actividad del complejo IV en la fracción mitocondrial fue 22% menor en
corazón de animales diabéticos respecto al valor determinado en corazón de animales
control (Tabla 31; Figura 64 B).

147
Resultados III

1000 A 70 B 16 C

14 ***

(k2´ - min-1. mg proteína mitocondrial-1)

60

(mg proteína mitocondrial. g tejido )

-1
800
* 12
Actividad de complejo IV

Actividad de compeljo IV
50
(k1´- min-1.g tejido-1)

10
600
40

k1´/k2´
8
30
400
6

20
4
200
10
2

0 0 0
C DM C DM C DM

Figura 64. Actividad de complejo IV como índice de biogénesis mitocondrial. A.

Actividad determinada en homogenizado total (k1´), B. Actividad determinada en
mitocondrias de corazón (k2´). C. Relación entre k1´ y k2´ como índice de masa
mitocondrial, expresando los miligramos de proteína mitocondrial por gramo de tejido.
*p < 0.05; *** p < 0.005, estadísticamente significativo respecto al grupo control.

Teniendo en cuenta la actividad de citocromo oxidasa, determinada en

mitocondrias y expresada como k2’ (en min-1. mg proteína-1) y el valor de citocromo
oxidasa determinado en homogeneizado total y expresada como k1’ (en min-1. g tejido-1)
es posible determinar la masa mitocondrial por gramo de tejido a través de la relación
k1’/k2’. Así, la masa mitocondrial por gramo de corazón (11.1  0.1 vs. 16.3  0.1 mg
proteína mitocondrial. g tejido-1) fue un 47% mayor en los animales diabéticos que la
estimada para animales control (Figura 64 C).

Estos resultados muestran que en el corazón de los animales diabéticos hay una
mayor masa mitocondrial, sugiriendo la presencia de síntesis de novo de proteínas
mitocondriales en el corazón de los animales inyectados con STZ.

6.2. Estudios microscópicos de tejido cardíaco

6.2.1. Microscopía electrónica de corazón

Con el fin de observar la estructura mitocondrial se realizaron imágenes de

microscopía electrónica de tejido cardíaco de animales diabéticos y control.

148
Resultados III

En la Figura 65 se muestra un corte longitudinal de tejido cardíaco de un animal

control, a 20 000 X (A) y 85 000 X (B), donde se pueden observar las mitocondrias con
tamaño y morfología conservada.

me c

mi c

Figura 65. Microfotografías de microscopia electrónica de transmisión de tejido cardíaco

de un rata control. Se pueden observar mitocondrias de morfología conservada,
distinguiéndose claramente la membrana interna (mi), la membrana externa (me) y las
crestas mitocondriales. Las barras de escala representan 0.5 m (A) y 0.1 m (B).

149
Resultados III

En la Figura 66 B se puede observar un aumento en el número de mitocondrias en

el tejido cardíaco proveniente de animales diabéticos, junto con una mayor
desorganización mitocondrial entre las fibras musculares dentro del tejido, respecto al
numero de mitocondrias y organización obtenidas en tejido de los animales control
(Figura 66 A). Asimismo, en el tejido proveniente de los animales diabéticos, se observa
variabilidad en los tamaños de las mitocondrias, con presencia de mitocondrias pequeñas
y otras de mayor tamaño.

Figura 66. Microfotografías de microscopía electrónica de transmisión de tejido cardíaco

de una rata control (A) y de una rata diabética (B). Barras de escala: 0.5 m.

150
Resultados III

En la Figura 67 se observan microfotografías comparativas de tejido cardíaco

proveniente de una rata control (Figura 67 A) y de una rata diabética (Figura 67 B) a un
mismo aumento de microscopio (30 000 X). En la Figura 67 B se puede observar la
presencia de un mayor número de mitocondrias, desorganización del tejido y alteraciones
estructurales en la mitocondrias tales como disrupción y/o pérdida de las membranas
mitocondriales y swelling mitocondrial.

sm
B

sm
dmi
sm

dmi dmi

dmi

dmi

Figura 67. Microfotografías de microscopía electrónica de transmisión de tejido

cardíaco de una rata control (A) y de una rata diabética (B). En el panel inferior se
observan mitocondrias con la presencia de disrupción de membrana interna (dmi,
flechas de puntos) y swelling mitocondrial (sm, flechas continuas). Barras de escala:
0.2 m.

151
Resultados III

6.2.2. Análisis estereológico de mitocondrias de corazón

A partir de las imágenes de microscopía electrónica se realizó un análisis

estereológico de las mitocondrias, es decir, la interpretación espacial de secciones planas
de tejidos. Se determinó la densidad volumétrica, el área promedio de cada mitocondria,
el número de mitocondrias por área y la densidad numérica de las mitocondrias en el
tejido cardíaco (Tabla 35).

Tabla 35. Análisis estereológico de las mitocondrias en el tejido cardíaco de ratas

diabéticas y control

Control Diabetes

Densidad volumétrica (Vmi) 0.30  0.01 0.39  0.01***

Densidad volumétrica (Vmi %) 30 39***

Área promedio de cada mitocondria (µm2) 0.70  0.06 0.54  0.06

Nº de mitocondrias por unidad de área

(mitocondrias/µm2) 0.44 ± 0.06 0.67 ± 0.02***

Densidad numérica mitocondrial (%) 100 166*

*p < 0.05; ***p < 0.005, estadísticamente significativo respecto al grupo control.

La densidad volumétrica mitocondrial (Vmi), o la fracción del volumen citosólico

ocupado por mitocondrias, es otro índice de biogénesis mitocondrial. Se analizaron 40
microfotografías provenientes de 3 ratas control y 60 microfotografías provenientes de 4
ratas diabéticas. La Vmi fue un 30% mayor en el tejido cardíaco proveniente de animales
diabéticos, respecto al tejido de los animales control. Contrariamente, el área promedio
de cada mitocondria, es decir el tamaño en m2, fue 23% menor en el tejido cardíaco
proveniente de los animales diabéticos respecto al tamaño en corazón control.

Dado que cada mitocondria es de menor tamaño en el corazón de animales

diabéticos, la mayor densidad volumétrica mitocondrial, estaría dada por un mayor
número de mitocondrias en el tejido. Este hecho se refuerza al determinar el número de
mitocondrias por unidad de área (Na), para lo cual se determina el número de
mitocondrias contabilizadas en el área del campo del microscopio en un aumento
12 000X (112 µm2), y se refieren a 1 µm2. Así, el número de mitocondrias por µm2 en

152
Resultados III

corazón de animales diabéticos (0.67 ± 0.02 mitocondrias. µm-2) fue 53% mayor que el
determinado en los animales control (0.44 ± 0.06 mitocondrias. µm-2).

La densidad numérica mitocondrial (Nmi), la cual expresa el número de mitocondrias

contabilizadas por unidad de volumen, fue calculada a partir de la densidad volumétrica
mitocondrial y el número de mitocondrias por unidad de área (Vmi y Na), utilizando la
ecuación desarrollada por Weibel y col. (1969). Como puede verse en la Tabla 35, la
densidad numérica mitocondrial fue 66% mayor en el tejido cardíaco proveniente de
animales diabéticos respecto a a la determinada en corazón de animales control (0.39 ±
0.02 vs. 0.24 ± 0.04, respectivamente). Este resultado está de acuerdo con el incremento
en la masa mitocondrial determinado a través de la actividad de la citocromo oxidasa
(47%), sugiriendo la presencia de un proceso de biogénesis mitocondrial.

El daño en la funcionalidad mitocondrial encontrado en este modelo, parecería

mostrar que el proceso de biogénesis mitocondrial existente no es suficiente para poder
corregir las alteraciones funcionales mitocondriales observadas.

6.3. Expresión de PGC-1α como marcador de biogénesis mitocondrial

Se determinó la expresión del factor de transcripción PGC-1α debido a que el

mismo se encuentra involucrado en la cascada de señalización que finaliza con la
biogénesis mitocondrial. Debido a su localización citosólica, la expresión se analizó en el
homogeneizado total de tejido cardíaco proveniente de animales diabéticos y control.

En la Figura 68 se puede observar un aumento del 76% en la expresión de PGC-1α

en homogeneizados de corazón de animales diabéticos, a los 28 días post-inyección de
STZ, en comparación con la expresión determinada en homogeneizados de corazón de
animales control. Este resultado está de acuerdo con los resultados descriptos en cuanto
al aumento de la masa mitocondrial por gramo de tejido estimada a partir de la actividad
de citocromo oxidasa (Figura 64 C), y al mayor número de mitocondrias y aumento en la
densidad volumétrica mitocondrial en tejido cardíaco de animales diabéticos obtenidos a
partir de las microscopía electrónicas (Tabla 35).

153
Resultados III

250
PM (kDa) A B

Unidades Densitométricas relativas

200

PGC-1 / -actina (%)

103 150

100

43
50

D C D
0
Control Diabética

Figura 68. Expresión de PGC-1α en homogeneizado total de corazón. A. Western blot

usando anticuerpos anti-PGC-1α (K15) (PM. 103 kDA, panel superior) y β-actina (PM: 43
kDa, panel inferior) como control de carga (Santa Cruz Biotech.). B. Unidades
densitométricas de PGC-1α relativas a β-actina, expresadas como porcentaje respecto
al control (100%).

154
Discusión
Discusión

DISCUSIÓN

1. Interacción funcional entre el complejo I y la mtNOS en corazón

En esta sección se discute acerca de la capacidad de las partículas

submitocondriales invertidas fosforilantes (ETPH) de producir NO, sostenido no solo por
el clásico dador de electrones de las NOS, el NADPH, sino también por electrones
provenientes de la cadena respiratoria actuando en condiciones de flujo reverso.
Asimismo, se muestra que la enzima mtNOS estaría interaccionando funcionalmente con
el complejo I mitocondrial, probablemente debido a una relación estructural entre las
proteínas del complejo I y la mtNOS, que permitiría, a esta última, utilizar a la cadena de
transferencia de electrones como fuente alternativa de equivalentes de reducción,
respecto a su dador fisiológico convencional.

1.1. Asociación funcional entre el complejo I y la mtNOS en corazón

1.1.1. Caracterización funcional de las partículas invertidas

Las partículas ETPH, obtenidas a partir de corazón de vaca, funcionando en

condiciones de flujo reverso, han mostrado ser una estrategia experimental de utilidad
para el estudio de la asociación funcional entre el complejo I y la mtNOS. En estas
vesículas, la membrana interna posee una orientación inversa permitiendo la exposición,
hacia el medio circundante, de los componentes direccionados hacia la matriz, tales
como el centro activo de unión al NADH en el complejo I, la mtNOS y la ATPasa. Este
hecho permite realizar las determinaciones enzimáticas evitando posibles reacciones con
componentes presentes en la matriz mitocondrial, el espacio intermembranas y la
membrana externa.

Los resultados presentados en el Capítulo I muestran que un 60% de la suspensión

obtenida a partir de mitocondrias de corazón bovino, se ha invertido correctamente
(Tabla 9), hecho evidenciado por el efecto de la adición del citocromo c en la
determinación del consumo de O2 y en la determinación de la actividad de NADH-O2
oxidorreductasa. Este resultado coincide con el porcentaje de vesículas invertidas
obtenido por Degli Espositi y Lenaz del 60-75% (Degli Espositi y Lenaz, 1982), en
preparaciones similares a las utilizadas en este trabajo de Tesis.

Asimismo, la preparación de partículas ETPH obtenida posee características que la

hace adecuada para el estudio de la interacción entre la mtNOS y la cadena de

155
Discusión

transferencia de electrones, permitiendo la utilización de las mismas en la determinación

de actividades enzimáticas. Las oxidaciones tanto de NADH como de succinato (Tabla 6)
por los complejos I y II, respectivamente, permitieron obtener altas velocidades de
consumo de O2, indicando un correcto funcionamiento de la cadena de transferencia de
electrones mitocondrial. Adicionalmente, se comprobó que las mismas poseen potencial
de membrana debido a que frente a la adición del protonóforo m-CCCP, el consumo de
O2 se incrementó, aproximadamente, en un 65%. Además, el hecho que las actividades
de los complejos de la cadena de transferencia de electrones, I-III, II-III y IV, medidas en
dichas partículas (Tabla 7), sean comparables con las actividades obtenidas y
publicadas, tanto para este tipo de muestras (Poderoso y col., 1996) como para
preparaciones mitocondriales de corazón de otras especies, tales como rata y conejo
(Boveris y col., 2002a; Vanasco y col., 2008; Valdez y col., 2011) (Tabla 36), aportan otro
indicio de la integridad de los componentes de la cadena respiratoria mitocondrial en la
preparación de ETPH obtenida.

Tabla 36. Actividades de los complejos respiratorios en preparaciones mitocondriales de

corazón de diferentes especies

Muestra Complejo I-III Complejo II-III Complejo IV Referencia

-1 -1 -1 -1
(nmol. min . mg proteína ) (min . mg proteína )

ETPH de corazón 199 ± 11 112 ± 6 19 ± 1 Poderoso y

de vaca col., 1996

Mitocondrias de 328 ± 21 120 ± 5 75 ± 10 Vanasco y

corazón de rata col., 2008

Mitocondrias de 577 ± 25 128 ± 10 50 ± 3 Capítulo II y

corazón de conejo Valdez y col.,
2011

El grado de acoplamiento de las partículas ETPH se verificó a través de la

capacidad de establecer el flujo reverso de electrones, dependiente de succinato y ATP,
presentando actividad de NAD+ reductasa, al reducir NAD+ a NADH en el complejo I. En
las condiciones experimentales ensayadas, y discutidas posteriormente en el punto 1.1.2,
la preparación mitocondrial obtenida permitió la reducción de 45  1 ó 64  3 nmol NAD+.
min-1. mg proteína-1, a 30 °C ó 37 °C, respectivamente (Tabla 10).

156
Discusión

1.1.2. Actividad de NAD+ reductasa sostenida por el flujo reverso de electrones

El complejo I cataliza la transferencia de dos electrones desde el NADH, vía la FMN

y una serie de hierro-sulfoproteínas hacia a la UQ, en una reacción asociada a la
transferencia de H+ desde la matriz hacia el espacio intermembranas, contribuyendo con
la fuerza protón-motriz (p).

NADH + UQ + H+ + 4H+N NAD+ + UQH2 + 4H+P

A su vez, el complejo I es capaz de reducir NAD+ en presencia de succinato y ATP,

reacción llevada a cabo a través del flujo reverso de electrones. En esta situación, el
succinato es necesario para la reducción de la UQ, y el ATP permite generar el p
necesario para superar la diferencia de potenciales de reducción, existente entre el
ubiquinol (Eº´UQ/UQH2 = +50 mV) y el NAD+ (Eº´NAD(P)+/NAD(P)H = -320 mV).

El flujo reverso de electrones es posible debido a la reversibilidad de las reacciones

que ocurren en cada complejo mitocondrial, permitiendo que la reacción global sea
también reversible. En esta reacción se transfieren dos H+ desde el succinato, en la
enzima succinato deshidrogenasa, al NAD+, en la NADH-deshidrogenasa, a través de la
UQ, las Fe-S proteínas y el citocromo b, según: succinato  FP2  citocromo b  FP1 
NAD+. La reacción implica la reversión de la fosforilación del ADP, es decir, la hidrólisis
de ATP por el complejo V, la cual aporta la energía suficiente para que ocurra la
transferencia de electrones desde un potencial electropositivo a un potencial
electronegativo (Stoppani y Boveris, 1983a; 1983b), según:

succinato + NAD+ + ATP fumarato + NADH + H+ + ADP + Pi

E°´succinato/fumarato = +31 mV

E°´NAD+/NADH = - 320 mV

Si se comparan los potenciales de reducción de las dos cuplas intervinientes

(E°´succinato/fumarato y E°´NAD+/NADH), la reacción espontánea corresponde a la reducción de
fumarato y a la oxidación de NADH con la consecuente conservación de la energía a
través del gradiente electroquímico de H+ para la síntesis de ATP. Esta reacción es de
gran importancia en el metabolismo celular, dado que provee el NAD+ necesario para el
ciclo de Krebs, y es el mayor punto de entrada de equivalentes de reducción a la cadena
respiratoria involucrados en la generación del p y como consecuencia, en la síntesis de
ATP (Vinogradov y Grivennikova, 2001). Sin embargo, en presencia de succinato y

157
Discusión

elevadas concentraciones de ATP, es posible invertir el sentido de la reacción, a

expensas de la energía proveniente de la hidrólisis de ATP, reduciendo de esta forma el
NAD+ (Chance y Hollunger, 1961; Heldt y col., 1965).

Por lo tanto, el complejo I es una enzima termodinámicamente reversible

(Vinogradov, 1998; Wilson y col., 1974), que puede catalizar tanto la oxidación de NADH
(reacción directa) como la reducción de NAD+ (reacción inversa) cambiando
continuamente a través de un punto de equilibrio en el cual la energía libre de la reacción
es igual y opuesta a la de la transferencia de H+ (Pryde y Hirst, 2011). Se postula que las
reacciones directa e inversa en el complejo I ocurren por mecanismos diferentes y, por lo
tanto, que existen dos sitios de unión para los nucleótidos NADH y NAD+, separados
espacialmente para las reacciones directa y reversa, respectivamente (Vinogradov y
Grivennikova, 2001). A pesar que el NAD+ es un inhibidor competitivo por el sitio de unión
del NADH, la Ki (1.2 mM) del NAD+ en la reacción de oxidación de NADH es
aproximadamente 3 órdenes de magnitud mayor que la Km (7 M) del NAD+ en la
reacción reversa, haciendo del nucleótido en su forma oxidada un inhibidor débil en el
sitio de unión del NADH.

De esta forma, el establecimiento del flujo reverso de electrones es el resultado de

la actividad simultánea de tres complejos enzimáticos: el complejo II, que utiliza los
electrones provenientes del succinato para la reducción de la UQ a UQH2, el complejo V
o FoF1-ATPasa el cual, actuando en forma reversible, hidroliza ATP y genera la fuerza
protón-motriz (p), y el complejo I que utiliza el p para la reacción de reducción del
NAD+ a NADH por el UQH2 (Figura 69). Este proceso reversible de la cadena de
transferencia de electrones se evidencia experimentalmente en condiciones en las cuales
la actividad de ubiquinol oxidasa o de citocromo oxidasa se encuentran inhibidas por
antimicina o KCN, respectivamente (Vinogradov, 1998).

Tanto mitocondrias acopladas como partículas EPTH son capaces de reducir el

NAD+ dependiente del p, en presencia del flujo reverso de electrones (Vinogradov y
Grivennikova, 2001). En las Tablas 7 y 12 del capítulo I se muestra que la velocidad de
oxidación de NADH (actividad del complejo I-III) obtenida en las partículas ETPH fue de
349 ± 6 nmol. min-1. mg proteína-1 y la velocidad de reducción del NAD+
64 ± 3 nmol. min-1. mg proteína-1, mostrando que la relación de velocidades de
reducción/oxidación fue aproximadamente de 1/5 en nuestras condiciones
experimentales. En concordancia con esta observación, Kotlyar y Vinogradov (Kotlyar y
Vinogradov, 1990) han mostrado que en partículas ETPH correctamente acopladas, la
velocidad del flujo reverso de electrones, a concentraciones saturantes de NAD+, es
aproximadamente 1/4 de la velocidad de oxidación de NADH (no acoplado).

158
Discusión

NAD+
(-Rotenona)
FMN
Fe-S
NADH

JH+
I
Succinato
Q
II
Fumarato

III
c
(-KCN) IV
ADP + Pi
V
ATP

Figura 69. Diagrama clásico del flujo reverso de electrones obtenido cuando las
partículas ETPH son incubadas en presencia de NAD+, succinato, KCN, para inhibir la
citocromo oxidasa, y generando el Δp a través de la hidrólisis de ATP.
I (Complejo NADH-ubiquinona oxidorreductasa); II (Complejo succinato-deshidrogenasa); Q
(ubiquinona); III (Complejo ubiquinol-citocromo c oxidorreductasa); c (citocromo c); IV (Complejo
citocromo c oxidorreductasa) y V (ATP sintasa).

La capacidad de las ETPH de reducir NAD+ a NADH a expensas de la energía

provista por el ATP resultó ser un 43% mayor cuando la reacción se realizó a 37 ºC,
respecto a la temperatura de 30 ºC utilizada en la técnica original (Ernster y Lee, 1967;
Turrens y Boveris, 1980), por lo que se utilizó 37 ºC para el resto de las determinaciones
enzimáticas.

La actividad NAD+ reductasa, dependiente de ATP y Mg2+, se inhibió casi

completamente (Tabla 12) por el agregado del inhibidor del complejo I rotenona, por
disipación del potencial de membrana mitocondrial con m-CCCP y/o por la inhibición de la
FoF1-ATPasa por oligomicina. Estas inhibiciones pueden explicarse debido a que, en
todos los casos, se interrumpe el flujo reverso de electrones hacia el complejo I. La
rotenona inhibe al complejo I, por unión a un centro Fe-S ubicado entre el sitio de unión
de la UQ y la FMN (Nicholls y Ferguson, 2002), y a su vez, produce la ruptura de puentes
hidrofóbicos que mantienen estable la estructura del complejo I (Chance y col., 1963;
Gomez y col., 2007). Como consecuencia de esta inhibición y en condiciones de flujo

159
Discusión

reverso, existe un impedimento al pasaje de los electrones provenientes de la oxidación

del succinato en el complejo II, hacia la FMN en el complejo I, imposibilitando la
reducción de NAD+ a NADH. En presencia de oligomicina, se inhibe el componente Fo de
la FoF1-ATPasa y como consecuencia no se genera el Δp necesario para impulsar la
transferencia de electrones en contra de los potenciales de reducción. De este modo, los
electrones no pueden fluir en contra de su gradiente electroquímico desde el succinato al
NAD+. Finalmente, el m-CCCP genera una disrupción del potencial de membrana
mitocondrial, disipando el Δp generado por la hidrólisis de ATP, e impidiendo la llegada
de los electrones al complejo I vía flujo reverso.

Asimismo, uno de los objetivos de este trabajo de Tesis fue establecer las
condiciones experimentales que permitan la inversión del flujo de electrones, y que
puedan utilizarse para la detección de la producción de NO. El Mg2+ es un catión esencial
para la actividad de la FoF1-ATPasa, permitiendo la hidrólisis de ATP y la generación del
p. Por otro lado, el KCN es necesario para establecer el flujo reverso, ya que en
ausencia del mismo la actividad NAD+ reductasa se reduce en un 95%. Las
concentraciones óptimas de MgCl2 y KCN para la determinación de la actividad de NAD+
reductasa son 3.0 mM y 0.6 mM, respectivamente (Ernster y Lee, 1967). Sin embargo, en
el caso de la detección de la producción de NO, la presencia de Mg2+ inhibe la actividad
de la enzima (Manzo-Avalos y col. 2002; Zaobornyj, 2007). En experimentos realizados
con mitocondrias impermeabilizadas de corazón de rata, en presencia de
2+
concentraciones de Mg entre 0.2 y 3.2 mM, Manzo-Avalos y col. (2002) observaron que
la actividad de mtNOS fue inhibida entre un 24% y un 59% al aumentar la concentración
de dicho catión. Más aún, Zaobornyj y Ghafourifar (2012) han mostrado que cambios en
la concentración de Mg2+, modulan la síntesis de NO por la mtNOS en forma
dosis-dependiente. Por otro lado, el KCN interfiere con la técnica de detección utilizada
ya que el CN- en altas concentraciones reacciona con el Fe3+ de la metahemoglobina
dando cianometahemoglobina, un derivado muy estable que absorbe a 540 nm. Por
consiguiente, se estudió el efecto de la concentración de MgCl2 y del KCN sobre la
actividad de NAD+ reductasa (Figuras 31 y 32), a fin de obtener las concentraciones
mínimas de dichas especies, que permitan establecer el flujo reverso de electrones
mitocondrial y que no se diferencien respecto a las condiciones óptimas. Así, 0.5 mM de
MgCl2 y 0.3 mM de KCN permitieron obtener una actividad de NAD+ reductasa de
48 ± 2 nmol. min-1. mg proteína-1, la cual no fue estadísticamente diferente a la
determinada en las condiciones experimentales óptimas (64 ± 3 nmol. min-1.
mg proteína-1). Por ello, dichas concentraciones fueron las utilizadas para determinar la
producción de NO por las EPTH, sostenida por el flujo reverso de electrones.

160
Discusión

1.1.3. Producción de NO por las partículas ETPH

Los resultados obtenidos e incluidos en el capítulo I muestran que no solo las

membranas mitocondriales sino también las partículas invertidas provenientes de
mitocondrias de corazón bovino (ETPH) fueron capaces de producir 1.1-1.2 nmol NO.
min-1. mg proteína-1 (Tabla 17), utilizando al dador convencional de electrones de la
enzima, el NADPH (Boveris y col., 2002; Valdez y col., 2006; Boveris y col., 2006). Las
NOS son proteínas homodiméricas compuestas por un dominio oxigenasa y un dominio
reductasa (Alderton y col, 2001), por lo tanto actúan como oxidorreductasas. Cada
monómero adopta una conformación tal que le permite al dominio reductasa de un
monómero interaccionar con el dominio oxigenasa del otro monómero. El flujo de
electrones dentro de la enzima ocurre vía NADPH (el sustrato de la enzima)  FAD 
FMN en el dominio reductasa de un monómero, hacia el hierro unido al grupo hemo del
dominio oxigenasa del monómero acoplado, donde luego son transferidos al O2 para
formar NO y L-citrulina, de acuerdo a los potenciales de las cuplas de óxido-reducción
(Noble y col., 1999). Los potenciales de reducción en la NOS son: Eº´NAD(P)/NAD(P)H = -320
mV; Eº´FAD/FADH = -280 mV, Eº´FMN/FMNH = -278 mV, Eº´Fe3+/Fe2+ = -248 mV (Alderton, 2001;
Noble y col., 1999).

Asimismo, la partículas ETPH produjeron 0.97  0.07 nmol NO. min-1. mg proteína-1,
en condiciones de flujo reverso de electrones utilizándolos electrones provenientes del
complejo I mitocondrial (Figura 34). En las condiciones de flujo reverso, los electrones
son transferidos desde el succinato hacia la FMN del complejo I, donde no solo pueden
ser derivados a la reducción del NAD+, sino que también podrían participar en la
producción de NO por la mtNOS (Figura 70). Teniendo en cuenta los potenciales de
reducción, el hierro unido al grupo hemo (Eº´Fe3+/Fe2+= -240 mV) en el dominio oxigenasa
de la mtNOS, podría recibir electrones provenientes de la FMN del complejo I
(Eº´FMN/FMNH = -290 mV) (Figura 71).

Más aún, la producción de NO sostenida por el flujo reverso de electrones fue

inhibida completamente en presencia de rotenona en el medio de reacción (Tabla 15), en
correlación con la inhibición observada de la actividad NAD+ reductasa. Como
consecuencia de la inhibición de la transferencia de electrones en el complejo I por la
rotenona, y en condiciones experimentales de flujo reverso, existe un impedimento al
pasaje de los electrones provenientes de la oxidación del succinato en el complejo II,
hacia la FMN en el complejo I, por lo cual no podrían cederse al dominio oxigenasa de la
mtNOS, con la consiguiente inhibición de la producción de NO. Este resultado explicaría
por qué la rotenona, al inhibir al complejo I, inhibe también la producción de NO sostenida
por el flujo reverso.

161
Discusión

Estos resultados están de acuerdo con los datos publicados por Parihar y col.
(2008a), los cuales muestran que, en mitocondrias de cerebro de rata y en células
humanas SHSY provenientes de un neuroblastoma dopaminérgico, la inactivación del
complejo I por rotenona genera una disminución en la producción mitocondrial de NO.

DO
NADPH DR
FAD L-arginina + O2

NADP+ FMN L-citrullina + NO

(-Rotenona) NAD+ + H+
FMN
Fe-S NADH

Q
Succinato

II Fumarato

Figura 70. Diagrama hipotético que muestra la asociación entre el complejo I y la

mtNOS en la membrana mitocondrial interna. En condiciones de flujo reverso de
electrones, el grupo hemo del dominio oxigenasa (DO) de la mtNOS podría aceptar los
electrones provenientes de la FMN del complejo I.
DO: dominio oxigenasa de la mtNOS; DR: dominio reductasa de la mtNOS.

Cabe mencionar que, en nuestras condiciones experimentales, la adición de

rotenona al medio de reacción no inhibió la producción de NO por la enzima nNOS
recombinante purificada (Tabla 16), mostrando que la inhibición de la producción de NO
en las ETPH sostenida por el flujo reverso, es consecuencia de una interrupción del flujo
de electrones y no debido a una acción directa sobre la estructura de la enzima. En
referencia a la ausencia de un efecto inhibitorio directo de la rotenona sobre la actividad
mtNOS, Alvarez y col. (2003) mostraron que la producción de NO, determinada en

162
Discusión

membranas mitocondriales de hígado de rata (0.56 ± 0.02 nmol NO. min-1. mg proteína-1),
no se modifica por el agregado de rotenona al medio de reacción.

La presencia de oligomicina o de m-CCCP anuló la producción de NO sostenida por

el flujo reverso de electrones en las partículas ETPH (Tabla 15), ya sea debido a
inhibición de la hidrólisis del ATP, o al colapso del potencial de membrana. En ambos
casos, los electrones no llegan a la FMN del complejo I y como consecuencia, no pueden
utilizarse para la síntesis de NO.

Grupo de alto potencial

Complejo I
ADP
Fe2+ -S FMN NADH

Δp E°´: -270 mV E°´: -290 mV E°´: -320 mV

ATP NAD+
Fe3+ -S FMNH2

Flujo directo de electrones

Ubiquinona

mtNOS (DO)

UQH2 UQ Hemo Hemo

E°´: +45 mV
(Fe3+) (Fe2+ )
E°´: -248 mV
Grupo de bajo potencial

Fe3+ -S Fe2+ -S H2O O2

Complejo II

E°´: +20 mV + (NO + L-citrullina) + (L-arginina)

FADH2 FAD
E°´: -10 mV

E°´: -31 mV

Fumarato Succinato

Figura 71. Potenciales de reducción y dirección de los electrones en condiciones de

flujo reverso: reducción de NAD+ dependiente de la oxidación de succinato en presencia
de KCN y del p generado por la hidrólisis de ATP. En ausencia de NAPDH, el grupo
hemo del dominio oxigenasa (DO) de la mtNOS podría aceptar los electrones
provenientes de la oxidación de la FMNH2 en el complejo I, de acuerdo a los potenciales
de reducción de ambos pares redox.

163
Discusión

1.2. Interacción entre el complejo I mitocondrial y la mtNOS

En este trabajo de Tesis se muestra que la fracción enriquecida en complejo I,

obtenida a partir de mitocondrias de corazón de vaca, presentó una actividad de
NADH-Q1 reductasa (complejo I) sensible a rotenona igual a 260  25 nmol NADH
oxidado. min-1. mg proteína-1. Esta fracción no sólo produjo 1.72 ± 0.18 nmol NO. min-1.
mg proteína-1, sino que la misma fue reconocida por anticuerpos anti-nNOS (Figura 38),
los cuales también reaccionaron con la mtNOS de membranas mitocondriales y de las
partículas ETPH. Estos resultados sugieren la presencia de la enzima en la fracción
enriquecida en complejo I, permitiendo inferir acerca de una posible interacción
estructural entre el complejo I y la mtNOS, reforzando la interacción funcional observada,
que permite a la mtNOS aceptar los electrones provenientes de la cadena de
transferencia de electrones para su actividad enzimática.

En la última década, ha comenzado el estudio de la asociación entre la mtNOS y

los componentes de la cadena respiratoria. Persichini y col (2005) observaron, mediante
microscopía electrónica de inmunolocalización, que en corteza cerebelosa de rata la
mtNOS se asocia físicamente a la citocromo oxidasa. Más aún, evidenciaron dicha
asociación utilizando homogeneizados y mitocondrias de cerebro de ratón y técnicas de
co-inmunoprecipitación. A través de cromatografías de afinidad determinaron que el
dominio PDZ de la mtNOS se asocia al péptido C-terminal de la subunidad Va de la
citocromo oxidasa. Asimismo, la asociación proteína-proteína fue confirmada a través de
modelado y dinámica molecular. La interacción mtNOS-citocromo oxidasa y la generación
de NO en la cercanía de su blanco de acción, forman parte de la regulación fina que
ejerce el NO sobre la respiración mitocondrial, de forma que no sólo el NO inhibe a la
actividad del complejo IV, sino que, a su vez, la citocromo oxidasa regula la
concentración de NO en estado estacionario intramitocondrial.

Por otro lado, Parihar y col. (2008b) han mostrado que la actividad de la enzima
mtNOS en hígado y cerebro de rata se encuentra asociada a la actividad del complejo I.
Estos hallazgos están de acuerdo con los resultados obtenidos por el grupo de trabajo de
Poderoso (Franco y col., 2006) quienes mostraron, en un modelo de hipotiroidismo, que
la enzima mtNOS de mitocondrias de hígado de rata co-inmunoprecipita no solo con
proteínas del complejo IV sino también con proteínas del complejo I de la cadena
respiratoria. Estos autores propusieron que la interacción entre la mtNOS y el complejo I
favorecería el incremento en la velocidad de producción de O2- y consecuentemente de
H2O2, en situaciones fisiopatológicas, tal como el hipotiroidismo. Cabe mencionar que la
co-localización de la producción de NO y O2- en microdominios mitocondriales, podría
explicar el aumento en la nitración de residuos tirosina en situaciones patológicas, como

164
Discusión

consecuencia de la formación incrementada de ONOO- que llevaría, en última instancia, a

la reducción de la actividad del complejo I.

Por lo expuesto, la asociación entre las proteínas de los complejos I y IV con la

mtNOS, está de acuerdo con el concepto de formación de supercomplejos entre los
componentes de la cadena respiratoria en la membrana interna mitocondrial (Schafer y
col., 2006; Genova y Lenaz, 2014, Stroh y col., 2004; Persichini y col., 2005). Se ha
descripto que la formación de supercomplejos permite aumentar la eficiencia catalítica de
los complejos respiratorios, disminuir el tiempo de difusión de intermediarios y reducir el
escape de electrones, atenuando de esta forma la producción de O2- (Fersht, 1999;
Shägger y Pfeiffer, 2000).

En mitocondrias humanas, los complejos mitocondriales I y III forman un core, el

cual interactúa con el complejo IV. En mitocondrias de corazón bovino, el supercomplejo
con estequiometria I1III2IV1 es el componente mayoritario dentro de la cadena respiratoria,
con un PM aproximado de 1700 kDa (Shägger y Pfeiffer, 2000). El concepto actual de la
disposición de los componentes de la cadena respiratoria sugiere que las proteínas
constitutivas de la membrana interna están densamente empaquetadas, presentando
fuertes interacciones proteína-proteína entre los complejos, la FoF1-ATPasa y las
proteínas regulatorias. Adicionalmente, se mostró que la presencia de cardiolipina es
esencial para la asociación de los supercomplejos (Zhang y col., 2002; Lenaz y Genova,
2007) y que la formación de supercomplejos es esencial para el ensamblaje y estabilidad
del complejo I. Más aún, una disminución en el contenido de cardiolipina en la membrana
interna mitocondrial, como consecuencia de la oxidación lipídica ocasionada por un
aumento en la producción de especies reactivas del oxígeno, lleva a disrupción de la
formación de supercomplejos y a una menor actividad del complejo I (Paradies y col.,
2004) y del complejo III (Petrosillo y col., 2003).

Asimismo, la interacción entre la mtNOS y los complejos de la cadena respiratoria

IV y I, estaría de acuerdo con la dependencia de la actividad de mtNOS con los estados
metabólicos mitocondriales y con el potencial de membrana (Valdez, 2006; Valdez, 2007;
Boveris, 2006), así como con la regulación que ejerce el propio NO sobre la respiración
mitocondrial y sobre la producción de otras especies reactivas del oxígeno (Antunes y
Boveris, 2004, Antunes y Boveris, 2007; Parihar y col., 2008; Persichini y col., 2005).
Valdez y col. (2006) han mostrado que la producción de NO por la mtNOS es regulada
por el estado metabólico mitocondrial y por el potencial de membrana. Cuando las
mitocondrias se encuentran respirando en estado 3, con un potencial de membrana de
155-160 mV, la producción de NO por mitocondrias de corazón es de 1.2 nmol NO.
min-1. mg proteína-1. Dicho valor es 40-50% menor al obtenido (2.2 nmol NO. min-1. mg

165
Discusión

proteína-1) a potenciales correspondientes a mitocondrias respirando en estado 4 (Δ =

170-180 mV). Esta dependencia se refuerza con la máxima y mínima producción de NO
que se logra ante la presencia de agentes que hiperpolarizan (oligomicina) o colapsan el
potencial de membrana mitocondrial (m-CCCP o F-CCCP), respectivamente. De esta
forma, pequeños cambios en el potencial de membrana, en el rango fisiológico, producen
grandes variaciones en la producción de NO (Valdez y col., 2006). La transición entre el
estado metabólico 4 al estado 3 establece un incremento del flujo de H+ a través del
componente Fo de la ATPasa, lo cual modifica la velocidad de transferencia de
electrones, el estado de oxido reducción de los componentes de la cadena respiratoria, el
potencial de membrana mitocondrial y la sensibilidad de la citocromo oxidasa al NO
(Antunes y Boveris, 2004).

Los resultados incluidos en el capítulo I de este trabajo y discutidos en esta sección

refuerzan la idea de la interacción funcional entre el complejo I y la mtNOS, ambas
formando parte de un supercomplejo, en el cual la citocromo oxidasa estaría también
involucrada (Figura 72).

A B
II
-
ONOO -
O2-
O2- III
I
I NO - III
- c
IV

IV

Vista desde la matriz Vista desde el espacio intermembranas

(Lado N) (Lado P)

Figura 72. Esquema representativo de la posible disposición de los complejos

mitocondriales formando supercomplejos en la membrana interna mitocondrial. A. Vista
desde la matriz, donde puede observarse la posible ubicación de la mtNOS
interaccionando con las proteínas de los complejos I y IV. B. Vista desde el espacio
intermembranas. Tomado de Valdez y Boveris (2007) y modificado.

166
Discusión

Esta interacción está de acuerdo con la interacción física descripta previamente por los
grupos de Poderoso (Franco y col., 2006), Parihar (2008) y Persichini (2005), con la
dependencia de la actividad de mtNOS con los estados metabólicos mitocondriales y con
el potencial de membrana, y con el concepto de la formación de supercomplejos entre los
componentes de la cadena respiratoria en la membrana interna, esenciales para el
ensamblaje y estabilidad del complejo I.

2. Funcionalidad mitocondrial en atontamiento miocárdico. Efecto de la

adenosina.

En esta sección se discuten los resultados mostrados en el capítulo II de este

trabajo de Tesis, en cuanto a la función ventricular y a su relación con el consumo de O 2
tisular, así como a la participación de las mitocondrias en la disfunción cardíaca en un
modelo de atontamiento miocárdico ex vivo en corazón de conejo.

2.1. Atontamiento miocárdico

Dado que el corazón, para suplir la demanda metabólica y contráctil, depende del
suministro de O2 y de ATP, la exposición a períodos cortos de isquemia seguidos de
reperfusión llevan a modificaciones en el tejido, tal como ocurre en el infarto o en un
síndrome isquémico (Solaini y Harris, 2005). El atontamiento miocárdico es una injuria
relativamente moderada y sub-letal, en el cual la isquemia es transitoria y no lleva a
necrosis tisular. A pesar que la reserva contráctil se encuentra conservada, la función
ventricular mecánica sistólica y diastólica se encuentra modificada y perdura por horas o
días posteriores al episodio de isquemia/reperfusión (Bolli, 1990; Donato y Gelpi, 2003).
Sin embargo, independientemente de la duración o severidad de la disfunción
post-isquémica generada, la misma es totalmente reversible, y el corazón recupera la
función ventricular normal.

Se han propuesto una serie de mecanismos involucrados en la secuencia de

eventos por los cuales una isquemia transitoria conlleva a la disfunción contráctil, los
cuales se resumen en la Tabla 37. Durante un episodio de isquemia cardíaca, el
suministro de O2 al tejido y a las mitocondrias es limitante. Es sabido que, frente a un
episodio isquémico, la reperfusión es la terapia de elección; sin embargo, la misma trae
aparejada las lesiones por reperfusión, que se generan como consecuencia de aumentos
en las concentraciones en estado estacionario de especies reactivas derivadas del
oxígeno, principalmente O2- y H2O2 (Gonzalez-Flecha y col., 1993). De esta forma, el

167
Discusión

estrés oxidativo, definido como un desbalance reversible con un exceso de oxidantes y/o
disminución de antioxidantes (Sies, 1985; Sies y Jones, 2007), constituye el principal
mecanismo responsable de las alteraciones celulares observadas durante la reperfusión.

Tabla 37. Mecanismos propuestos como causantes del atontamiento miocárdico

Mecanismos más aceptados

Aumento en la generación de especies reactivas derivadas del oxigeno

Sobrecargas de calcio

Desacoplamiento excitación-contracción como consecuencia de la disfunción del retículo

sarcoplásmico

Otros mecanismos posibles

Producción de energía insuficiente en la mitocondria

Alteraciones en la perfusión cardíaca

Alteraciones en el uso de energía por los miofilamentos

Daño de la matriz de colágeno extracelular

Disminución de la sensibilidad al calcio por los miofilamentos

Tomado de Bolli, 1990.

Cabe mencionar que la interrupción del flujo coronario promueve una disminución
en el pH intracelular, activando al intercambiador Na+/H+ (NHE). Esto ocasiona un
aumento en los niveles intracelulares de Na+, y como consecuencia un incremento en la
concentración de Ca2+ que se genera a través del intercambiador Na+/Ca2+ (Carrozza y
col., 1992; Gao y col., 1995). La sobrecarga intracelular de Ca2+ puede llevar a daño
celular por activación de fosfolipasas y proteasas, con disminución de los niveles
intracelulares de ATP, afectando la contractilidad cardíaca.

2.2. Función ventricular en atontamiento miocárdico

Los resultados presentados en el capítulo II manifiestan que existen alteraciones

funcionales sistólicas y diastólicas en corazón de conejos sometidos a atontamiento
miocárdico ex vivo, no observándose áreas necrosadas, aún luego de 120 min de
reperfusión, siendo el tejido totalmente viable.

168
Discusión

En la Figura 39 se muestran los parámetros de funcionalidad ventricular

determinados utilizando un sistema de perfusión para órgano aislado según la técnica de
Langendorff. La función ventricular sistólica de los corazones se evaluó a través de la
determinación de la presión desarrollada por el ventrículo izquierdo (PDVI) y la máxima
velocidad de incremento de la presión en ventrículo izquierdo (+dP/dtmax). Los corazones
sometidos a 15 min de isquemia y 30 min de reperfusión presentaron una PDVI
significativamente menor (36%) respecto al grupo normóxico (control; 105 ± 8 mmHg). A
su vez, no lograron recuperar la contractilidad cardíaca que presentaban previo a la
isquemia, alcanzando solamente un 63% de la observada en el período de estabilización
(107 ± 7 mmHg). Un comportamiento similar se observó para la +dP/dtmáx con una
disminución del 42% respecto al grupo control. Estos resultados en su conjunto indican
una disfunción en la contractilidad ventricular en los corazones sometidos a
isquemia/reperfusión.

La funcionalidad ventricular diastólica se evaluó a través de la presión de fin de

diástole (PDFVI), parámetro que indica la rigidez cardíaca. La PDFVI se incrementó 3
veces a los 30 min de reperfusión en los corazones sometidos a isquemia/reperfusión
respecto a los corazones normóxicos. En concordancia con el aumento en la rigidez
cardíaca (PDFVI), la presión de perfusión coronaria (PPC), índice de resistencia vascular
cuando el corazón se perfunde a flujo coronario constante, se incrementó un 44% en los
corazones sometidos a 15 min de isquemia y 30 min de reperfusión, respecto a los
valores pre-isquémicos.

En correlación con la disfunción ventricular observada y en particular con la

disminución en la contractilidad cardíaca, el consumo de O2 determinado en cortes de
tejido, mostró una disminución progresiva en cada tiempo de isquemia/reperfusión
(Tabla 18). Se puede establecer una relación entre el consumo de O2 y el ATP generado
en el cardiomiocito, con la contracción cardíaca. Aproximadamente dos tercios del ATP
hidrolizado en los cardiomiocitos es usado por el aparato contráctil actina-miosina,
mientras que el tercio restante es utilizado por bombas ATP dependientes que mantienen
el balance iónico, en particular la Ca2+-ATPasa del retículo sarcoplásmico y la Na+/K+-
ATPasa del sarcolema (Opie, 1991). Los resultados obtenidos y mostrados en la
Figura 43 afirman que la utilización de O2 por el corazón se correlaciona linealmente con
la contracción cardíaca (Reimer y Jennings, 1986) estimada por la PDVI. De esta forma,
el miocardio depende del O2 consumido para poder desarrollar la fuerza de contracción.
Así, la disminución en la velocidad de consumo de O2 tisular, lleva a una reducción en la
capacidad de síntesis de ATP por la mitocondria, y por consiguiente, a una deficiencia
energética miocárdica.

169
Discusión

2.3. Funcionalidad mitocondrial en atontamiento miocárdico

González-Flecha y col. (1993) han mostrado que en hígado, períodos de isquemia

menores a 60 min, ocasiona un daño celular reversible, que se restituye una vez
normalizado el consumo de O2 tisular. Sin embargo, en corazón, si la isquemia es
sostenida durante un tiempo mayor a 20 min, comienzan a aparecer focos de necrosis y/o
apoptosis celular, mientras que si la isquemia es transitoria, menor a 20 min, ocasiona
cambios reversibles.

Los resultados incluidos en el capítulo II evidencian la presencia de disfunción

mitocondrial en corazón de conejo sometido a atontamiento miocárdico. Las
modificaciones observadas en la función mitocondrial, en cuanto al consumo de O 2
mitocondrial, a la actividad del complejo I, y a la producción de H2O2 y NO, fueron
graduales a lo largo de los tiempos de isquemia, reperfusión temprana y reperfusión
tardía: luego de la isquemia no se observaron cambios sustanciales respecto al control,
en la reperfusión temprana comenzaron a aparecer cambios leves, y con la reperfusión
tardía se evidenciaron alteraciones moderadas, siendo, en este último caso, todas las
modificaciones estadísticamente significativas.

Puntualmente, se ha observado una disminución en el consumo de O2 mitocondrial

únicamente durante el estado de respiración activa o estado 3 cuando se utilizaron, como
fuente de electrones, sustratos del complejo I (malato-glutamato). Esta disminución fue
progresiva en la isquemia (12%), reperfusión temprana (19%) y tardía (32%). Por el
contrario, la respiración pasiva o estado 4, no se vio modificada en cada tiempo de
isquemia/reperfusión estudiado. Como consecuencia, el índice de integridad y
acoplamiento mitocondrial, o control respiratorio, disminuyó concomitantemente con el
consumo en estado 3, llegando a un 29% de disminución a los 30 min de reperfusión.

Adicionalmente, la actividad del complejo I mitocondrial fue menor en cada tiempo

de isquemia/reperfusión, con una inhibición máxima a los 30 min de reperfusión (28%). El
perfil de disminución en la actividad del complejo I se correlacionó con la disminución
observada en el consumo de O2 en estado 3, utilizando malato-glutamato como sustratos
(Figura 45). De esta forma, la disminución en el consumo de O 2 en estado activo, cuando
la cadena de transferencia de electrones mitocondrial es sometida a funcionar a elevada
velocidad para generar ATP, se debe principalmente a la reducción en la actividad del
complejo I. Inversamente, no se observaron cambios en la actividad del complejo II-III, de
acuerdo con la ausencia de modificaciones en el consumo de O2 mitocondrial, cuando los
electrones fueron cedidos por el succinato al complejo II. Estos resultados sugieren la
presencia de una disfunción del complejo I como consecuencia de la reperfusión.

170
Discusión

Los resultados obtenidos apoyan la hipótesis que, durante la isquemia, la inhibición

de la respiración mitocondrial debida a la falta del último aceptor de electrones de la
cadena respiratoria, el O2, hace que los componentes de la cadena respiratoria se
encuentren en un estado de máxima reducción. Durante la reperfusión, la restitución de
los niveles de O2 permite establecer nuevamente el metabolismo oxidativo, generando
una elevada cantidad de O2-, como consecuencia del aumento en la velocidad de
auto-oxidación tanto de la UQH• en el complejo III, como de la FMN• de la
NADH-deshidrogenasa en el complejo I.

En este trabajo, la disfunción del complejo I se ha mostrado no solo por la

disminución de la actividad enzimática de dicho complejo mitocondrial, sino también por
un aumento concomitante en la producción de H2O2, progresivo en cada tiempo de
isquemia/reperfusión. Este incremento en la producción de H2O2 ocurrió solamente
cuando se adicionaron malato-glutamato, no así cuando las determinaciones se
realizaron en presencia del sustrato del complejo II, succinato. Frente a la adición de
malato-glutamato la producción de H2O2 aumentó un 11% luego de la isquemia, 44% en
la reperfusión temprana y 78% en la reperfusión tardía, respecto al grupo control.
Asimismo, la producción de H2O2 en estado 4 en cada tiempo de isquemia/reperfusión se
fue asemejando a la máxima capacidad de producción por el complejo I, la cual se logra
experimentalmente, en presencia de rotenona. Cuanto más se asemeja la producción de
H2O2 en estado 4 a la máxima producción, más modificado y/o dañado podría hallarse el
complejo I. De esta forma, en el modelo de atontamiento miocárdico estudiado, el
incremento observado en la producción de H2O2 dependiente del complejo I, sugiere la
presencia de modificaciones estructurales en las proteínas de dicho complejo, tales como
S-nitrosilación, oxidación y/o nitración. En contraste, cuando se utilizó antimicina para
inhibir la transferencia de electrones en el complejo III, tanto en mitocondrias control
como en las mitocondrias provenientes de corazones sometidos a isquemia/reperfusión,
se obtuvo un aumento del 20% en todos los casos y, como consecuencia, una relación de
producción de H2O2 en ausencia y presencia de antimicina sin diferencias significativas
(Tabla 23).

Los resultados obtenidos y mostrados en esta Tesis están de acuerdo con Hensley
y col. (2000) quienes propusieron que el incremento en la producción de H2O2 podría
ocasionar modificaciones en la actividad del complejo I, y con los trabajos de Galkin y col.
(2009) quienes mostraron que la privación de O2, que ocurre en un episodio isquémico,
conduce a una forma estructural y catalíticamente inactiva del complejo I, la forma D
"latente o inactiva" (Vinogradov, 1998), la cual es susceptible a inhibición por nitrosotioles
y/o ONOO- (Galkin y Moncada, 2007).

171
Discusión

Teniendo en cuenta que la producción mitocondrial de H2O2 es consecuencia,

principalmente, del O2- generado, se puede considerar que el aumento en la producción
de H2O2 por el complejo I proviene de un incremento en la producción de O 2- por dicho
complejo. Cabe mencionar que, en este caso, la actividad de la enzima Mn-SOD, la cual
cataliza la dismutación de O2- a H2O2 en la matriz mitocondrial, no se encontró modificada
luego de la isquemia/reperfusión.

Recientemente, Chouchani y col. (2015) han mostrado que, durante la isquemia, se

acumula succinato en la mitocondria, el cual es responsable del aumento en la
producción de H2O2 durante la reperfusión. El succinato acumulado durante la isquemia
es rápidamente re-oxidado por deshidrogenasas durante la reperfusión con el fin de
mantener el pool de ubiquinona reducido, generando, de esta manera, la fuerza
protón-motriz necesaria para la transferencia de electrones hacia el O2. Simultáneamente,
se transfieren electrones, vía flujo reverso, desde el complejo II hacia el complejo I,
permitiendo una mayor producción de O2- por éste último. El O2- generado, tanto por flujo
directo como por flujo reverso de los electrones de la cadena respiratoria, es rápidamente
convertido a H2O2 por acción de la Mn-SOD en la matriz mitocondrial (k = 1.9 x 109 M-1
s-1), o puede reaccionar con el NO y formar ONOO- a velocidades cercanas al límite
difusional (k = 1.9 x 1010 M-1 s-1; Beckman, 1990; Kissner y col., 1997). Como
consecuencia del aumento en la generación de O2-, los componentes de la matriz
mitocondrial pueden hallarse expuestos a mayores velocidades de producción y
concentración en estado estacionario de ONOO-, el cual conduce a nitración y/o
nitrosilación de proteínas de los complejos mitocondriales. Así, la generación de dichas
especies reactivas, en las cercanías del centro activo del complejo I, conduce a su
modificación y/o inactivación, llevando a una disfunción mitocondrial (Pacher y col.,
2007). Se ha sugerido que la inhibición transitoria y reversible de la cadena de
transferencia de electrones, principalmente por S-nitrosación del complejo I, preserva la
respiración mitocondrial durante la reperfusión, minimizando la injuria causada por la
isquemia/reperfusión (Zaobornyj y Ghafourifar, 2012).

Cabe mencionar que, en el modelo de atontamiento miocárdico, se ha observado

un patrón de disminución de la actividad bioquímica de la mtNOS similar al obtenido para
el complejo I, alcanzando la máxima inhibición (28%) a los 30 min de reperfusión,
reforzando la idea de una asociación funcional entre ambas proteínas. La menor actividad
de la mtNOS posterior a la isquemia y durante la reperfusión, no se debe a una
degradación de la enzima durante el período estudiado, dado que su expresión en
mitocondrias fue similar en cada tiempo de isquemia/reperfusión (Figura 47). La
disminución de la actividad de mtNOS, tanto funcional -evaluada a través de la inhibición

172
Discusión

del consumo de O2-- como bioquímica, puede ser consecuencia de modificaciones

oxidativas y/o nitrosativas en la estructura de la enzima.

Los resultados obtenidos en cuanto a la reducción conjunta de las actividades de

complejo I y de mtNOS (28%), están de acuerdo con los datos publicados por Parihar y
col. (2008a) y por Navarro y col. (2010), quienes proponen que la mtNOS y el complejo I
se encuentran estructuralmente adyacentes. Más aún, este hecho se refuerza por los
resultados incluidos en el capítulo I de este trabajo de Tesis, de los cuales se deduce que
las proteínas del complejo I estarían interaccionando funcionalmente con la mtNOS. Cabe
mencionar que el grupo de trabajo de Poderoso (Franco y col., 2006) mostró que la
enzima nNOS translocada a la mitocondria, es decir la mtNOS, co-inmunoprecipita con
las proteínas de los complejos I y IV, evidenciando una interacción física entre dichas
proteínas.

2.3.1. Estimación de las concentraciones de O2- y de NO en estado estacionario, y

de la velocidad de generación de ONOO-

A partir de los resultados obtenidos e incluidos en el capítulo II, se estimaron las

concentraciones de O2- y NO en estado estacionario, y se calculó la velocidad de
producción de ONOO- en corazón de conejo sometido a atontamiento miocárdico.

Las concentraciones de O2- y de NO en estado estacionario ([O2-]ss y [NO]ss) en la

matriz mitocondrial se calcularon a partir de las velocidades de producción de H2O2 y NO
determinadas experimentalmente en cada tiempo de isquemia/reperfusión, considerando
la concentración de Mn-SOD determinada en la matriz mitocondrial, y teniendo en cuenta
las concentraciones de ubiquinol (UQH2, 277 M) y citocromo oxidasa (5.6 M) en la
mitocondria.

La velocidad de producción de O2- se estimó a partir de la velocidad de producción

de H2O2 medida en las mitocondrias, según:

- d[O2-]/dt = 2 d[H2O2]/dt

En estado estacionario, la velocidad de producción se iguala a la velocidad de consumo

de una determinada especie química. En el caso del O2-:

- d[O2-]/dt = d[O2-]/dt

En las mitocondrias el O2- se consume, principalmente, a través de dos reacciones: (a) la

reacción controlada por difusión entre O2- y el NO, para dar lugar a la formación de

173
Discusión

ONOO- y (b) la reacción de dismutación del O2- catalizada por la enzima Mn-SOD, que
conlleva a la producción de H2O2.

O2- + NO  ONOO- k1 = 1.9 x 1010 M-1 s-1

2 O2- + 2 H+  H2O2 + O2 k2 = 2.3 x 109 M-1 s-1

Si se consideran dichas reacciones, las velocidades de producción y de consumo de O2-

estarían dadas por las siguientes expresiones diferenciales:

Velocidad de producción: d[O2-]/dt= 2 d[H2O2]/dt

Velocidad de consumo: - d[O2-]/dt = k1 [O2-] [NO] + k2 [O2-] [Mn-SOD]

En estado estacionario: d[O2-]/dt = - d[O2-]/dt

Reemplazando cada expresión:

2 d[H2O2]/dt = [O2-]ss (k1 [NO] + k2 [Mn-SOD])

[O2-]ss = 2 d[H2O2]/dt / (k1 [NO] + k2 [Mn-SOD])

donde k1 es la constante de velocidad de la reacción de formación de ONOO-, k2 es la

constante de velocidad de la reacción de dismutación del O2- y [Mn-SOD] es la
concentración de SOD determinada en la matriz mitocondrial para cada muestra
(Tabla 24).

Por otro lado, el NO se produce en la matriz mitocondrial a través de la reacción

catalizada por la mtNOS, y se consume, principalmente, a través de las reacciones con el
O2- (84%), el UQH2 (14%) y la citocromo oxidasa (cit a3-Fe2+, 4%), según:

NO + O2-  ONOO- k1 = 1.9 x 1010 M-1 s-1

NO + UQH2  UQH + H+ + NO- k3 = 1.5 x 104 M-1 s-1

NO + Cit a3-Fe2+  Cit a3-Fe3+ + NO- k4 = 4 x 107 M-1 s-1

Así, la velocidad de producción mitocondrial de NO se puede expresar como:

174
Discusión

d[NO]/dt = - d[NO]/dt = k1 [NO] [O2-] + k3 [NO] [UQH2] + k4 [NO] [Cit a3-Fe2+]

d[NO]/dt = [NO]ss (k1 [O2-] + k3 [UQH2] + k4 [Cit a3-Fe2+])

[NO]ss = d[NO]/dt / (k1 [O2-] + k3 [UQH2] + k4 [Cit a3-Fe2+])

La concentración intramitocondrial de UQH2 en mitocondrias de corazón (~277 M) se

estimó teniendo en cuenta el contenido de ubiquinol en las mismas, el cual es de 2.0
nmol UQ10H2. mg proteína-1 (Boveris y Stoppani, 1970) y considerando que la matriz
mitocondrial ocupa un volumen de 7.2 l por cada mg de proteína mitocondrial (Costa y
col., 1988).

Teniendo en cuenta que para el cálculo de la concentración de O2- en estado

estacionario ([O2- ]ss) se necesita la concentración de NO en estado estacionario ([NO]ss),
y para el cálculo de la [NO]ss es necesario el dato de la [O2- ]ss, se utilizó el método
matemático de las aproximaciones sucesivas para obtener ambas concentraciones
(Valdez y col., 2000). En la Tabla 38 se muestran las concentraciones de O2- y de NO en
estado estacionario estimadas para mitocondrias de corazón de conejos sometidos a
isquemia/reperfusión.

Tabla 38. Concentraciones en estado estacionario de NO y O2- en la matriz mitocondrial

de corazón de conejo

Isquemia/Reperfusión [NO]ss [O2-]ss

(min) (10-9 M) (10-11 M)

0/0 9.1 4.8

15/0 8.7 5.0

15/5 8.1 6.4

15/30 6.6 8.1

Como puede observarse, la [O2- ]ss estimada a los 15 min de isquemia no fue
diferente a la obtenida para el control, sin embargo se incrementaron un 32% y un 67%
luego de 5 o 30 min de reperfusión, respectivamente. De esta forma, el aumento en la
velocidad de producción de H2O2 observado en las mitocondrias provenientes de los
corazones sometidos a isquemia/reperfusión (Tabla 23), es consecuencia de una mayor

175
Discusión

producción de O2-, y dado que no se observaron diferencias en la actividad de la enzima

Mn-SOD, una producción de O2- incrementada lleva a un aumento significativo en la
concentración en estado estacionario de dicha especie. Por otro lado, la concentración de
NO en estado estacionario disminuyó en cada tiempo de isquemia/reperfusión, en
concordancia con la velocidad de producción de NO por membranas mitocondriales
(Tabla 21).

El O2- es capaz de reaccionar con el NO, en una reacción de terminación de

radicales libres que ocurre a velocidades cercanas al límite difusional (k 1 = 1.9 x 1010 M-1
s-1 Kissner y col., 1997), generando ONOO-. La velocidad de formación de ONOO-
intramitocondrial puede calcularse teniendo en cuenta la [NO]ss y la [O2-]ss en la matriz
mitocondrial y la constante de velocidad de segundo orden de la reacción de formación
de ONOO- (k1), según:

d[ONOO-]/dt = k1 [O2-]ss [NO]ss

En la Tabla 39 se muestra que la velocidad de producción de ONOO- se incrementó

~20% en las mitocondrias provenientes de los corazones sometidos 15 min de isquemia y
30 min de reperfusión.

Tabla 39. Velocidad de formación de ONOO- en la matriz mitocondrial de corazón de

conejo

Isquemia/Reperfusión d[ONOO-]/dt

(min) (nM s-1)

0/0 8.4

15/0 8.3

15/5 9.8

15/30 10.1

Cabe mencionar que, en situaciones fisiológicas, sólo el 15% del O2- generado en la
mitocondria es metabolizado por la reacción con el NO, siendo ésta la vía principal de
metabolización de NO (~80%). Sin embargo, en situaciones en las cuales existe un
incremento en la [O2-]ss, tal como en el atontamiento miocárdico, a pesar de la disminución
observada en la actividad de mtNOS (Tabla 21) y de la [NO]ss, esta ruta metabólica podría

176
Discusión

estar exacerbada, debido a que la actividad de Mn-SOD no se modificó como

consecuencia de la isquemia/reperfusión.

Asimismo, el aumento en la velocidad de producción de ONOO- en los corazones

sometidos 15 min de isquemia y 30 min de reperfusión, está de acuerdo con el
incremento en los niveles de nitración de tirosinas observado en las membranas
mitocondriales luego de la reperfusión (Figura 49).

De esta forma, se evidencia que en la isquemia/reperfusión cardíaca se altera el

metabolismo del NO, modificándose el balance entre el NO y el O2- en la mitocondria,
dando como resultado un aumento en la formación de ONOO-. El metabolismo
interdependiente entre el NO y O2- en la mitocondria está centrado en la reacción de
generación de ONOO- siendo, dicha reacción, la vía principal de utilización de NO y
determinante de su concentración en estado estacionario (Figura 73). Por un lado, el NO
ejerce un papel regulador en situaciones fisiológicas, inhibiendo a la actividad de
citocromo oxidasa en forma reversible con las concentraciones de O2 (Poderoso y col.,
1996, 1998), y por otro lado, participa en los mecanismos moleculares involucrados en
situaciones patológicas como inflamación, enfermedades neurodegenerativas e
isquémicas (Brown, 1997; Pacher y col., 2007), a través de la generación de ONOO -,
potente oxidante relacionado con efectos deletéreos sobre las mitocondrias y las células.
(Xie y col., 1998; Boczkowski y col., 1999; Pacher y col., 2007).

Teniendo en cuenta la totalidad de los resultados, y de acuerdo con la hipótesis

planteada por el grupo de trabajo de Poderoso (Riobo, y col., 2001) y por Abe y col.
(1999), se puede considerar que el ONOO- podría ser la especie responsable de la
modificación e inhibición del complejo I durante la reperfusión. De acuerdo a esto, en el
modelo de atontamiento miocárdico estudiado, se ha observado que, luego de 15 min de
isquemia y 30 min de reperfusión, se incrementó un 42% la oxidación de lípidos, 17% la
oxidación de proteínas y un 70% la nitración de proteínas mitocondriales (Figuras 48 y
49, respectivamente).

Trabajos previos (Hardy y col., 1991; Paradies y col., 2004) muestran que el
complejo I es el principal blanco del O2- generado en condiciones de
isquemia/reperfusión. Jekabsone y col (2003) mostraron que el complejo I se inhibe por
exposición a flujos de NO, y que dicha inhibición se anula por adición de SOD al medio.
Por lo tanto, O2-, NO y/o ONOO- en concentraciones como las alcanzadas luego de un
periodo de isquemia/reperfusión, podrían inactivar al complejo I. Se ha descripto que las
reacciones que inactivan al complejo I, mediadas por radicales libres, tales como
radicales peroxilo (ROO•), aldehídos y/o ONOO-, causan modificaciones en las uniones

177
Discusión

intermoleculares débiles no covalentes de las proteínas que las mantienen unidas, y

promueven interacciones cruzadas covalentes que tienen como consecuencia la
inactivación del complejo (Liu y col., 2003; Sayre y col., 1999).

Espacio intermembranas
(Lado P) A
4H+ 4H+ 2H+ H+

e-
e- e- Cit c
e- e-

I Q III IV
2e-
e- II 2e -
e-
e- e- 2 e-
e-
V

NADH NAD+ + H+ Succinato Fumarato

½ O2 + 2H+ H2O
ADP + Pi ATP
Matriz mitocondrial
(Lado N)

Isquemia

Espacio intermembranas
(Lado P) B
Cu,Zn-SOD
H2O2 O2- NO
H2O2 4H+ 4H+ 2H+ H+

e- e-
e- e- e-
Cit c

I Q III IV
2e-
e- II 2e -
e-
e- e- 2 e-
e-
V
- - -
NADH NAD+ + H+ Succinato Fumarato H2O
½ O2 + 2H +
ADP + Pi ATP
O2-

Mn-SOD Reperfusión
- ONOO- NO

Matriz mitocondrial H2O2

(Lado N)

Figura 73. Esquema que ilustra el metabolismo mitocondrial de O2-, NO y ONOO- en

situaciones de isquemia (A) y reperfusión (B).

178
Discusión

Cabe destacar que el NO generado en el miocardio es esencial para la

homeostasis del corazón y su actividad mecánica (Hare, 2003). El NO es considerado un
cardioprotector endógeno, ya que no solo actúa sobre la cadena respiratoria mitocondrial
regulando la respiración, a través de la inhibición de la actividad de citocromo oxidasa y
de la transferencia de electrones entre los citocromos b y c, sino que también actúa a
través de vías de señalización GMPc-dependientes (Chesnais y col., 1999; Paolocci y
col., 2000). Los mecanismos postulados por los cuales el NO, o su segundo mensajero el
GMPc, aumentan la resistencia de los miocitos a la injuria causada por un episodio de
isquemia aguda involucran: la inhibición de la sobrecarga de Ca2+, el antagonismo de la
estimulación β-adrenérgica, la disminución de la contractilidad miocárdica, la reducción
en la demanda de O2, la apertura de canales de potasio sarcolemales y/o mitocondriales
dependientes de ATP, y la activación de ciclooxigenasas (Bolli, 2001 y 2007).

2.4. Síndrome del complejo I

La disfunción mitocondrial observada en el atontamiento miocárdico posee las

mismas modificaciones que las descriptas en el "síndrome del complejo I", término
definido por Boveris, Carreras y Poderoso (2010). En este síndrome se observa una
disminución en la velocidad de consumo de O2 mitocondrial cuando se utilizan malato-
glutamato como sustratos, una reducción en la actividad del complejo I, un incremento en
los niveles de oxidación a proteínas y lípidos y en la nitración de proteínas, así como un
aumento en la velocidad de producción de O2- y de H2O2.

El síndrome del complejo I ha sido observado inicialmente en la enfermedad de

Parkinson, en estudios realizados en modelos animales in vitro e in vivo y en biopsias de
cerebros humanos realizadas post mortem (Schapira y col., 1990; Schapira y col., 1990b;
Schapira 2008b, Gomez y col., 2007; Navarro y col., 2009; Navarro y Boveris, 2009).
Debido al incremento observado en la producción de O2- y de H2O2 y a la disfunción de la
cadena respiratoria mitocondrial, especialmente por alteraciones en la actividad del
complejo I, detectada en neuronas de la substantia nigra (Schapira y col., 1990; Schapira
y col., 1990b; Schapira 2008b) y de la corteza frontal (Navarro y col., 2009; Navarro y
Boveris, 2009), dichos estudios postulan la existencia de una situación de estrés oxidativo
en la etiopatogenia de la enfermedad. Es interesante destacar que los resultados
presentados en el capítulo II de esta Tesis muestran una disminución conjunta en la
actividad del complejo I y en las actividades bioquímica y funcional de la mtNOS en cada
tiempo de isquemia/reperfusión. Estos datos condicen con los resultados obtenidos por
Gomez y col. (2007) y Navarro y col. (2009) en modelos experimentales que simulan la

179
Discusión

enfermedad de Parkinson. En dichos experimentos, realizados a los 30 y 60 días

post-tratamiento de los animales con rotenona, observaron una disminución en la
velocidad de respiración mitocondrial en estado 3, utilizando malato-glutamato como
sustrato, y en la actividad del complejo I (17% y 57%, respectivamente) acompañada de
una menor actividad bioquímica (27% y 62%, respectivamente) y funcional (27% y 71%)
de la mtNOS, en mitocondrias de cerebro.

En el cardiomiocito, la aparición de este síndrome tiene como consecuencia, una

disminución significativa en la capacidad de las células de generar la energía suficiente
para mantener la composición iónica necesaria para la contracción miocárdica. A pesar
de ser una injuria reversible, durante este período existe un estado en el cual la
producción de energía en la mitocondria es deficiente y por lo tanto, un factor limitante
para la función y homeostasis del cardiomiocito.

El mecanismo molecular responsable de las alteraciones relacionadas al síndrome

del complejo I, presente en el modelo utilizado en este trabajo de Tesis, podría implicar
una suma de procesos y/o reacciones que culminan con la inactivación del complejo I. En
primer lugar, ocurren procesos de peroxidación lipídica y reacción de los intermediarios
derivados de los radicales libres (principalmente ROO•) y de los aldehídos generados en
ese proceso (4-OH-nonenal y malondialdehído) con carbonos alílicos y grupos amino,
respectivamente, presentes en las cadenas polipeptídicas de las proteínas del complejo I.
En segundo lugar, la formación de ONOO- en la matriz mitocondrial, por la reacción entre
el NO y el O2- en la vecindad del centro activo de la NADH-deshidrogenasa (Turrens y
Boveris, 1980), podría ser otros de los mecanismos de inactivación del complejo I. Es
interesante notar que la inactivación del complejo I se acompaña de un aumento en la
velocidad de producción de O2- y por consiguiente, un aumento en la generación de H2O2
(Navarro y col., 2011). El aumento en dichas especies, sería responsable de la oxidación
a lípidos y proteínas observados en las mitocondrias (Hensley y col., 2000).

2.5. Efecto de la adenosina

2.5.1. Función ventricular

Es sabido que la adenosina tiene efectos protectores sobre la funcionalidad

cardíaca cuando existe una injuria por isquemia/reperfusión, tanto en modelos in vivo
como in vitro. La administración exógena de adenosina, o agonistas del receptor de
adenosina, previos a un episodio de isquemia reduce el tamaño de infarto, mejora la
recuperación de la función ventricular durante la reperfusión y prolonga el período para la
contractura isquémica (Donnato y Gelpi, 2003). Los efectos protectores se atribuyen a su

180
Discusión

capacidad de estimular la glicólisis en cardiomiocitos (Forman y col., 1993), reducir la

depleción de ATP durante la isquemia y restituir sus niveles en la reperfusión (Hori y col.,
1991), normalizar la relación entre la demanda y la disponibilidad de O2 en el tejido e
inhibir la agregación de neutrófilos y la agregación plaquetaria (Belardinelli y col., 1989).

Por ello, se decidió estudiar el efecto de dicha droga sobre la función mitocondrial
en corazón de conejo sometido a atontamiento miocárdico. Tal como se describió
previamente (Donnato y Gelpi, 2003), se observó que la adición de adenosina al medio
de perfusión, previo a la isquemia y durante la reperfusión, revirtió las alteraciones
observadas en la funcionalidad ventricular cardíaca. El estado contráctil del miocardio,
evaluado como la PDVI, sometido a isquemia y reperfundido en presencia de adenosina
se incrementó un 45% respecto a los corazones sometidos a isquemia/reperfusión sin
adenosina (67 ± 3 mmHg), alcanzando, de esta forma, valores semejantes a los
obtenidos para los animales normóxicos (97 ± 6 vs. 107 ± 7mmHg, respectivamente). La
adenosina logró aumentar la +dP/dt en un 42%, respecto al grupo isquemia/reperfusión.
La rigidez cardíaca, disminuyó 2 veces en los corazones perfundidos en presencia de
adenosina, respecto a los corazones sometidos a isquemia/reperfusión sin tratamiento
con dicha droga (35 ± 3 mmHg), llegando a valores semejantes a los de corazones
normóxicos (12 ± 1 vs.11 ± 1 mmHg, respectivamente). Adicionalmente, la adenosina
logró reducir (28%) el aumento en la PPC ocasionado por la isquemia/reperfusión. Por
consiguiente, la adenosina protegió al miocardio de las alteraciones post-isquémicas
sistólicas y del aumento de la rigidez miocárdica, revirtiendo las alteraciones funcionales
presentes en el corazón atontado como consecuencia de la isquemia/reperfusión
(Figura 50).

Adicionalmente, la reperfusión en presencia de adenosina protegió al corazón de la

diminución (46%) en el consumo de O2 observada en cortes de ventrículo izquierdo luego
de 15 min de isquemia y 30 min de reperfusión (0.85 ± 0.08 mol. min-1. g tejido-1),
respecto a los corazones control. La adición de adenosina al medio de perfusión logró
incrementar el consumo de O2 tisular un 67% luego de 30 min de reperfusión en
comparación con los corazones sometidos al mismo tiempo de reperfusión pero sin
adenosina, y alcanzando valores semejantes a los corazones control (I/R + adenosina:
1.42 ± 0.20 vs. control: 1.57 ± 0.10 mol. min-1.g tejido-1).

Se ha mostrado que la cardioprotección de la adenosina se asocia a la activación

de los receptores purinérgicos A1 durante la reperfusión (Fralix y col., 1993, Donnato y
Gelpi, 2003), reduciendo los influjos de Ca2+ al cardiomiocito. Los receptores A1 están
involucrados en los efectos cronotrópico, dromotrópico e inotrópico negativo del

181
Discusión

miocardio, por lo cual pueden participar en la protección que presenta la adenosina frente
a la injuria causada por la isquemia/reperfusión.

Por otro lado, se ha mostrado que ciertas proteínas señalizadoras y quinasas (AKT,
proteínas quinasa C (PKC), glucógeno sintasa quinasa 3β (GSK-3β), óxido nítrico sintasa
(NOS), quinasa regulada extracelularmente (ERK), proteína kinasa G (PKG), guanilato
ciclasa (GC) y el canal de K ATP-dependiente mitocondrial) son activadas como
consecuencia de la unión de la adenosina a su receptor A1, y tienen como destino las
mitocondrias, estando estas últimas involucradas en el efecto cardioprotector (Baines y
col., 2003; Rourke, 2004; Weiss y col., 2003).

2.5.2. Funcionalidad mitocondrial

Debido a que la adición de adenosina al medio de perfusión protegió al miocardio

frente a la injuria por isquemia/reperfusión, se estudió si esta droga revertía la disfunción
mitocondrial observada. Para ello, se evaluó la actividad del complejo I, el único de los
componentes de la cadena de transferencia de electrones que había presentado una
disminución progresiva en su actividad, la actividad de mtNOS, la oxidación a lípidos y la
nitración de tirosinas, en corazones perfundidos en presencia de adenosina. La adición
de adenosina al medio de perfusión logró revertir el patrón de disminución observado en
la actividad del complejo I, logrando un aumento del 30% en los corazones sometidos a
15 min de isquemia y 30 min de reperfusión, respecto al mismo tiempo de
isquemia/reperfusión sin adenosina. Asimismo, la presencia de adenosina permitió
restituir el descenso observado, a los 30 min de reperfusión, en la actividad de mtNOS,
obteniéndose una actividad 19% mayor respecto al mismo tiempo de
isquemia/reperfusión en ausencia de adenosina. De esta forma, la perfusión con
adenosina protegió a las mitocondrias de las alteraciones causadas por la
isquemia/reperfusión llegando a valores semejantes a los obtenidos en mitocondrias
provenientes de corazones control (control 0/0).

Cabe mencionar que los resultados obtenidos en cuanto a las actividades del
complejo I-III y de mtNOS, reperfundiendo los corazones en presencia y ausencia de
adenosina, están de acuerdo con la interacción funcional entre las proteínas del complejo
I y la mtNOS descripta en el capítulo I de este trabajo. Como se discutió previamente, una
disminución en la actividad del complejo I-III, progresiva en cada tiempo de
isquemia/reperfusión, se acompañó de una disminución también progresiva en la
actividad de la mtNOS, alcanzando ambas actividades el mismo porcentaje de
disminución (28%). En presencia de adenosina en el medio, tanto la actividad del

182
Discusión

complejo I-III como la de mtNOS fueron comparables a las actividades obtenidas en

mitocondrias de corazón de animales control.

Debido al aumento en la generación de O2-, H2O2, y ONOO- que ocurre durante la

reperfusión y como consecuencia, al incremento en la oxidación de lípidos y nitración de
tirosinas observados en las mitocondrias de ventrículo izquierdo provenientes de
miocardios sometidos a atontamiento miocárdico, se estudió el efecto protector de la
adenosina frente al daño oxidativo a lípidos (TBARS) y nitrosativo a proteínas
(nitrotirosinas). La suplementación del medio de perfusión con adenosina logró revertir en
un 25% el daño oxidativo a fosfolípidos en mitocondrias a los 15 min de isquemia y 30
min de reperfusión. Los valores alcanzados en presencia de adenosina, fueron
semejantes a los encontrados en las muestras control con o sin la adición de adenosina
al medio de perfusión, logrando una protección del 100% frente al daño oxidativo.
Adicionalmente, la perfusión con adenosina redujo en un 65% la nitración de proteínas,
determinada como nitrotirosinas, que había sido observada luego de 15 min de isquemia
y 30 min de reperfusión. Este resultado está de acuerdo y puede ser explicado con las
observaciones realizadas por Venardos y col. (2009), quienes han descripto que la
mejoría en la respuesta contráctil por la perfusión del corazón en presencia de adenosina
se asocia a una disminución en los niveles de ONOO- y como consecuencia en la
nitración de tirosinas. De esta forma, la adición de adenosina al medio de perfusión
protegió al miocardio (entre 70-100%) respecto de la disminución en el consumo de O2
tisular, y de las alteraciones observadas en cuanto a la reducción en las actividades del
complejo I y de mtNOS, al incremento en la oxidación a lípidos y en la nitración de
residuos tirosina.

Dado que los cambios mitocondriales como consecuencia del atontamiento

miocárdico ocurren gradualmente durante la reperfusión temprana y reperfusión tardía,
alcanzando diferencias significativas a los 30 min de reperfusión, y que la mejora
observada en la funcionalidad ventricular por adición de adenosina comienza en la
reperfusión temprana (15 min), es de esperar que el efecto protector de la adenosina
frente a la isquemia/reperfusión no es una consecuencia de su acción sobre la
mitocondria y la preservación de las concentraciones de ATP en etapas tempranas de la
reperfusión (Ogawa y col., 1996; Hori y col., 1991), sino que, probablemente, el efecto
protector de la adenosina sobre la funcionalidad cardíaca y la reversión del atontamiento
miocárdico ocurra como consecuencia de la inhibición de los influjos de Ca2+ a los
cardiomiocitos, por activación de los receptores purinérgicos A1 (Ogawa y col., 1996;
Cerbai y col., 1988; Marban y col., 1990).

183
Discusión

3. Funcionalidad y biogénesis mitocondrial cardíaca en diabetes inducida por

estreptozotocina

En esta sección se discuten los resultados mostrados en el capítulo III de este

trabajo de Tesis, en cuanto a la función ventricular, la participación de las mitocondrias en
le disfunción cardíaca y la ocurrencia de biogénesis mitocondrial como mecanismo
compensador de las alteraciones observadas como consecuencia de la Diabetes inducida
por estreptozotocina en un modelo animal.

3.1. Función ventricular en Diabetes

La Diabetes es un desorden metabólico que resulta de un incremento crónico en los

niveles de glucosa en sangre. En los pacientes diabéticos, la hiperglucemia prolongada y
no controlada es un factor de riesgo asociado al daño y disfunción de varios órganos y
tejidos, afectando principalmente ojos, riñones, nervios, vasos sanguíneos y corazón
(American Diabetes Association, 2008). El corazón es un órgano insulino-dependiente,
debido a que necesita de la insulina para controlar el ingreso de glucosa al tejido,
permitiendo así la síntesis de ATP por fosforilación oxidativa, en la mitocondria. El ingreso
de glucosa a las células cardíacas ocurre a través de los transportadores de glucosa
GLUT-4, los cuales se unen a la membrana celular como respuesta a la insulina. A su
vez, dicha hormona regula el proceso de glucólisis y la síntesis de glucógeno y de ácidos
grasos.

La hiperglucemia que se produce en la Diabetes lleva al desarrollo de

enfermedades cardiovasculares y a falla cardíaca, siendo las principales causas de
muerte en los pacientes diabéticos (Boudina y Dale Abel, 2007). La diabetes crónica y no
controlada se asocia a una cardiomiopatía primaria denominada "cardiomiopatía
diabética", en la que se observa disfunción contráctil en ausencia de hipertensión o
enfermedades coronarias arteriales (Hambly y col., 1974). Esta disfuncionalidad cardíaca
se asocia a alteraciones en el metabolismo energético, principalmente, al deterioro
progresivo en la funcionalidad mitocondrial. De esta forma, la disminución en la
producción de ATP es una de las causas de la progresión hacia la falla cardíaca (Rolo y
Palemira, 2006). A pesar que la etiopatogenia de la cardiomiopatía diabética no está
totalmente dilucidada, los desbalances en el metabolismo energético cardíaco tienen un
papel central.

Tal como se muestra en el capítulo III de Resultados, la función ventricular sistólica,

estimada por la PDVI y la +dP/dtmax, y la función ventricular diastólica, evaluada a través
del t50, fue similar en corazón de animales diabéticos en comparación con animales

184
Discusión

control, en condiciones basales. Sin embargo, cuando los corazones fueron sometidos a
un aumento en el trabajo cardíaco, inducido por el estímulo β-adrenérgico, resultante de
la perfusión con isoproterenol, se observaron alteraciones en la función ventricular
sistólica y diastólica en ratas diabéticas.

El aumento en el trabajo cardíaco permite evaluar la reserva miocárdica, definida

como la capacidad que posee el corazón de responder ante los requerimientos
metabólicos adicionales o frente a un estímulo extra. La estimulación β-adrenérgica
ejerce efectos inotrópico y lusitrópico positivos, es decir aumento en la fuerza de
contracción y en la velocidad de relajación del miocardio, respectivamente, lo que simula
un incremento del trabajo cardíaco (Sicari y col., 2008). Esto ocurre a través de un
aumento en la biodisponibilidad y en el flujo intracelular de Ca2+, ya que aumenta la
liberación de Ca2+ desde el retículo sarcoplasmático e incrementa, posteriormente, la
velocidad de recaptación por el mismo, durante la relajación.

Los cambios en la contracción cardíaca se evidenciaron, luego de un estímulo

β-adrenérgico, como una disminución en la PDVI (38%) y en la +dP/dtmáx o reserva
inotrópica (37%) en los corazones de los animales diabéticos respecto a los corazones de
los animales control (Figuras 56 A y B). Por otro lado, la administración de isoproterenol
produjo una reducción en la velocidad de relajación en los corazones control
(Δt50C= -26%), debido a su efecto lusitrópico positivo. Dicha reducción fue de menor
magnitud en los corazones de animales diabéticos (Δt50D=-11%). La diferencia en el
tiempo de relajación alcanzado, luego de un estímulo β-adrenérgico, sugiere la presencia
de cambios en la reserva lusitrópica en los animales diabéticos en respuesta a una
sobrecarga de trabajo. Dicha alteración puede explicarse por variaciones en los
transientes de Ca2+ durante la contracción y la relajación cardíaca, impidiendo una
correcta relajación del miocardio frente a un agonista β. Estos resultados están de
acuerdo con el hecho que en animales diabéticos, el incremento máximo en las
concentraciones de Ca2+ intracelulares en respuesta al isoproterenol se encuentran
disminuidas (Yu y col., 1994). Por lo tanto, parte de la menor respuesta del miocardio al
estímulo β-adrenérgico se debe a modificaciones en la regulación de los flujos de Ca2+
intracelulares. Así, cuando se evaluó la reserva miocárdica utilizando un estímulo
β-adrenérgico, se observó una disminución tanto en la reserva inotrópica o fuerza de
contracción, como en la reserva lusitrópica, en los corazones de los animales diabéticos,
es decir que dichos corazones no respondieron adecuadamente frente a un aumento del
trabajo cardíaco.

Adicionalmente, se ha descripto que el NO puede estar involucrado en la respuesta

inotrópica y cronotrópica del miocardio, frente a un estímulo β-adrenérgico (Hare y col.,

185
Discusión

1998; Smith y col., 1997). Los efectos inotrópicos y cronotrópicos negativos del NO frente
a un estímulo con agonistas β-adrenérgicos, es decir, disminución en la amplitud y
velocidad de contracción, están mediados por guanosina 3´,5´-monofosfato cíclico
(GMPc) (Balligand y col., 1993; Tao y McKenna, 1994; Kaye y col., 1996). En un corazón
normal, el GMPc puede causar, simultáneamente, la supresión de las corrientes de Ca2+
tipo L estimuladas por un agonista β (Wahler y Dollinger, 1995), modificar los
mecanismos responsables de la liberación de Ca2+ desde el retículo sarcoplásmico
(Finkel y col., 1995) y reducir la sensibilidad de los miofilamentos al Ca2+ (Shah y col.,
1994). Estos efectos del NO, mediados por GMPc, sobre la contracción cardíaca y sobre
el metabolismo de Ca2+ observados en un corazón normal, son semejantes a las
disfunciones que ocurren en los miocitos de un animal diabético (Yu y col., 1994).
Teniendo en cuenta que aproximadamente un 60% del NO citosólico podría provenir de
la difusión del NO mitocondrial (Valdez y col., 2004; Zaobornyj y col., 2009), es
importante destacar que el NO generado a través de la reacción catalizada por la mtNOS,
tendría un papel importante en el acoplamiento excitación-contracción. En este trabajo,
se observó un aumento en la producción mitocondrial de NO por la mtNOS (~23%) en
corazón de animales diabéticos respecto a los control (Tabla 34), concomitantemente con
una mayor expresión de la enzima en la fracción mitocondrial (Figura 62). El NO
mitocondrial difunde al citosol, donde podría actuar través de las vías NO/GMPc
dependientes, ocasionando la disfunción contráctil observada, en respuesta a un estímulo
β-adrenérgico.

Tal como se mencionó, el corazón es un tejido altamente dependiente de las

concentraciones de O2, debido a que más del 90% del metabolismo cardíaco es aeróbico.
La principal fuente de energía para suplir la demanda metabólica y contráctil del corazón
está dada por la síntesis mitocondrial de ATP. Por ello, las mitocondrias ocupan 30-40%
del volumen celular total en cardiomiocitos (Murphy y Steenbergen, 2007; Duncan, 2011).
En el corazón, la población mitocondrial oscila, en períodos de milisegundos, entre los
estados de respiración pasiva y activa, dependiendo de las condiciones intracelulares
(Navarro y col., 2005; Shiva y col., 2005). Se ha estimado que en condiciones fisiológicas,
68% de la población mitocondrial se hallan principalmente en estado 4, mientras que el
32% restante se encuentran en estado 3 (Boveris y Boveris, 2007). Esto indica que en
condiciones fisiológicas, solo se utiliza un 30-40% de la máxima capacidad de producción
de ATP por las mitocondrias (Navarro y Boveris, 2007). La diferencia entre el estado de
respiración pasiva y de respiración activa se denomina capacidad de reserva
bioenergética mitocondrial, y es lo que le permite a los cardiomiocitos mantener la función
del tejido cuando la demanda energética se incrementa (Hill y col., 2009).

186
Discusión

Los resultados incluidos en el capítulo III muestran que el consumo de O2 tisular

dependiente de la fracción mitocondrial, dado principalmente por mitocondrias respirando
en estado 4, se encontró disminuido en un ~20% en corazón de animales diabéticos,
hecho que se correlaciona con la disfunción ventricular observada. Más aún, se ha
observado que la producción mitocondrial de ATP en corazón de los animales diabéticos
es ~40% menor que la determinada en animales control (Figura 61). De esta forma, la
deficiencia energética afectaría negativamente a la homeostasis del Ca2+ y explicaría, en
parte, la disfunción miocárdica observada en respuesta a un estímulo con isoproterenol.
La disfunción en la respuesta contráctil del corazón frente a la estimulación con agonistas
β, permite reforzar la idea que el miocardio depende de la energía generada en las
mitocondrias para poder desarrollar la fuerza de contracción. De esta forma, la falla en la
función contráctil frente a un aumento del trabajo cardíaco podría tener su origen en una
alteración mitocondrial. Cabe mencionar que en corazones humanos con falla cardíaca
se ha observado un desbalance entre la demanda y el suministro de ATP, impidiendo el
correcto trabajo contráctil (Berr y col., 2002; Neubauer, 2007).

3.2. Función mitocondrial en Diabetes

La disfunción ventricular observada en cuanto a la reserva contráctil y lusitrópica y

en referencia a la reducción en el consumo de O2 cardíaco dependiente de la fracción
mitocondrial en corazón de ratas diabéticas, llevaron al estudio detallado de la función
mitocondrial en corazón.

La respiración mitocondrial fue evaluada experimentalmente en los estados de

respiración activa o estado 3, y de respiración pasiva o estado 4. Se observó que el
consumo de O2 mitocondrial en estado 4 no se modificó ni cuando se utilizó
malato-glutamato ni al utilizar succinato, como dadores de electrones, los cuales ingresan
por los complejos I y II, respectivamente. Contrariamente, se observó una disminución en
el consumo de O2 mitocondrial en estado 3 en corazón de animales diabéticos, que fue
mayor cuando se utilizó malato-glutamato (22%) que cuando se usó succinato (17%)
como sustratos. Asimismo, se observó que la actividades de los complejos I-III, II-III y IV
son menores en mitocondrias de corazón de los animales diabéticos, respecto a los
animales control, indicando que existe una disfunción en la transferencia de electrones,
en correlación con la disfunción respiratoria. La disminución de la respiración mitocondrial
en estado 3, está de acuerdo con resultados mostrados previamente, no sólo en
mitocondrias de corazón de animales diabéticos sino también en mitocondrias de fibras
musculares permeabilizadas provenientes de tejido cardíaco humano, indicando la

187
Discusión

presencia de una disfunción mitocondrial (Pierce y Dhalla, 1985; How y col., 2006;
Heather y Clarke, 2011; Anderson y col., 2009). En el estudio realizado por Anderson y
col. (2009) utilizando fibras permeabilizadas de tejido cardíaco humano, el consumo de
O2 en estado 4 adicionando malato-glutamato como sustratos no se vio modificado. Sin
embargo, el consumo de O2 en estado 3 disminuyó un 20% en las muestras provenientes
de pacientes diabéticos respecto a las muestras control, siendo dicho porcentaje
semejante al obtenido en este trabajo de Tesis. Adicionalmente, dichos autores
observaron que, a pesar de que el consumo de O2 en estado 3 sustentado por succinato
no fue estadísticamente diferente entre grupos, existe una tendencia de disminución en
dicho parámetro en las fibras provenientes de pacientes diabéticos.

De acuerdo a los valores de velocidad de consumo de O2 obtenidos (Tabla 29), se

observó una disminución significativa (27%) en el control respiratorio solamente cuando
los electrones ingresaron a la cadena respiratoria por el complejo I, mostrando, una vez
más, una disfunción en la transferencia de electrones y/o un desacople de la fosforilación
oxidativa. Cuando se utilizó succinato, la disminución en el control respiratorio no fue
estadísticamente significativa entre grupos.

La reducción observada en la respiración en estado 3 en mitocondrias de corazón

de animales diabéticos está en relación directa con la disminución observada en la
fosforilación oxidativa (relación ADP/O) y en la velocidad de producción de ATP. La
relación ADP/O se encontró significativamente disminuida cuando los electrones
ingresaron a la cadena respiratoria por el complejo I (15%), en concordancia con el
menor control respiratorio obtenido utilizando los mismos sustratos (malato-glutamato).
Es sabido que la funcionalidad de las mitocondrias depende de su integridad, y del
gradiente electroquímico de H+ que se establece a través de la membrana interna
mitocondrial, por acción de los complejos de la cadena respiratoria, siendo dicho
gradiente la fuerza impulsora para la síntesis de ATP. Por ello, se estimó el potencial de
membrana mitocondrial, mediante citometría de flujo, como un indicador de la
funcionalidad de dicha organela, observándose una despolarización parcial de la
membrana interna mitocondrial en mitocondrias de corazón de ratas diabéticas en estado
de respiración activa (Figura 59 C y D), tanto con sustratos del complejo I como del
complejo II. Más aún, la síntesis de ATP fue ~40% menor en mitocondrias de corazón de
animales diabéticos respecto a mitocondrias de corazón de animales control.

La disminución del consumo de O2 mitocondrial, la reducción en la actividad de los

complejos I-III, II-III y IV de la cadena respiratoria, la disminución en el potencial de
membrana y la menor producción de ATP observada en mitocondrias de corazón de
animales diabéticos, podrían ser consecuencia de una oxidación deficiente de los

188
Discusión

sustratos por disfunción de la cadena de transferencia de electrones. La reducción en el

gradiente electroquímico por despolarización de la membrana mitocondrial en ratas
diabéticas, podría llevar a una deficiente síntesis de ATP, disminuyendo el aporte de
energía a los cardiomiocitos.

Es posible estimar la velocidad de fosforilación oxidativa (OPR por sus siglas en

inglés: oxidative phosphorylation rate), a partir de las determinaciones de consumo de O2
en estado 3 y de la relación estimada entre los moles equivalentes de fosfato esterificado
por oxígeno consumido (ADP/O) (Pierce y Dhalla, 1985). Los valores de OPR se obtienen
multiplicando la velocidad de consumo de O2 en estado 3 por la relación ADP/O. En la
Tabla 40 se observan los valores estimados para la velocidad de fosforilación oxidativa
en mitocondrias control y diabéticas utilizando malato-glutamato o succinato como
sustratos.

Tabla 40. Estimación de la velocidad de fosforilación oxidativa

Velocidad de fosforilación oxidativa

(nmol ATP. min-1. mg proteína-1)

Grupo Control Diabetes

Sustrato
Malato-Glutamato 588 389
Succinato 470 337

La disminución en el consumo de O2 en estado 3 y en la relación ADP/O hallada en

las mitocondrias de los animales diabéticos se refleja en una menor velocidad de
fosforilación oxidativa, es decir, una menor velocidad de producción de ATP, utilizando
malato-glutamato (34%) o succinato (28%) como sustratos. Las alteraciones en la
actividad respiratoria mitocondrial podrían ser responsables de la disminución de los
niveles de ATP en los cardiomiocitos, teniendo implicancia en el desarrollo de la
cardiomiopatía diabética. Cabe destacar que, a pesar de que existe una diferencia entre
los valores de producción de ATP determinados por el método quimioluminiscente
(Figura 61) y los estimados a partir de los valores de consumo de O 2 (Tablas 29 y 30), los
cambios observados en la producción de ATP entre las mitocondrias provenientes de
corazón de ratas diabéticas y las obtenidas a partir de ratas control, utilizando
malato-glutamato o succinato como sustratos, guardan la misma relación.

189
Discusión

De esta forma, el suministro de ATP por fosforilación oxidativa mitocondrial podría

ser un paso limitante para la correcta función ventricular frente a una sobrecarga de
trabajo cardíaco, en los corazones de los animales diabéticos. Así, las alteraciones en la
función mitocondrial tendrían un impacto sobre la función y contractilidad cardíaca,
posiblemente formando parte de la génesis de la cardiomiopatía diabética.

3.2.1. Estimación de las concentraciones de O2- y de NO en estado estacionario, y

de la velocidad de generación de ONOO-

Cuando las mitocondrias fueron energizadas con sustratos del complejo I, la

producción mitocondrial de H2O2 en corazón de animales diabéticos fue 2 veces mayor a
la observada en mitocondrias de animales control. Más aún, la inhibición de la
transferencia de electrones por adición de rotenona en mitocondrias de corazón de ratas
diabéticas, llevo a una velocidad producción de H2O2 similar a la obtenida en estado 4
(Tabla 32), sugiriendo modificaciones oxidativas y/o nitrosativas en el complejo I,
probablemente disparadas como consecuencia de la hiperglucemia. La disfunción
observada en la actividad del complejo I en mitocondrias de corazón de animales
diabéticos, se refuerza con el incremento descripto en la producción de H2O2 en estado
de respiración pasiva, cuando se utilizaron malato y glutamato como sustratos. Cuando
se utilizó succinato como fuente de electrones, y en las condiciones experimentales
utilizadas, la producción de H2O2 deriva principalmente del O2- generado por auto-
oxidación de la UQH. En esta situación, no se observó diferencia significativa en la
producción de H2O2 en estado 4 entre grupos. Por otro lado, la máxima producción de
H2O2 por el complejo III, dada por la adición de antimicina, fue similar en mitocondrias de
animales control y diabéticos.

La actividad de Mn-SOD que cataliza la dismutación del O2- fue 49% menor en
mitocondrias de corazón de animales diabéticos en comparación con animales control.
Este resultado está de acuerdo con trabajos publicados que muestran que en corazón de
ratones transgénicos OVE26 diabéticos, se evidencia no solo un incremento en la
generación de radicales libres, sino también una reducción en las defensas antioxidantes
(Shen y col., 2006), haciendo del estrés oxidativo una situación involucrada en el inicio, la
progresión y las consecuencias patológicas de la diabetes en el corazón (Cai, 2006). De
esta forma, la dismutación del O2- dentro de la mitocondria estaría reducida, aumentando,
probablemente su concentración en estado estacionario dentro de la matriz mitocondrial,
e incrementando su metabolización a través de la reacción con el NO, generando
ONOO-. Para corroborar dicha hipótesis, se calcularon las concentraciones en estado

190
Discusión

estacionario de O2- y NO, y la velocidad de producción de ONOO-, según la forma

detallada en la sección 2.3.1.de esta discusión:

[O2-]ss = 2 d[H2O2]/dt / (k1 [NO] + k2 [Mn-SOD])

y [NO]ss = d[NO]/dt / (k1 [O2-] + k3 [UQH2] + k4 [Cit a3-Fe2+])

En la Tabla 41 se muestran las concentraciones de O2- y de NO en estado

estacionario estimadas para mitocondrias de corazón de ratas control y diabéticas. La
concentración de NO en estado estacionario aumentó un 20% en mitocondrias de
corazón de animales diabéticos, en concordancia con el aumento observado en la
velocidad de producción mitocondrial de NO (Tabla 34) y con el aumento en la expresión
de la enzima mtNOS (Figura 62).

Tabla 41. Concentraciones en estado estacionario de NO y O2- en la matriz mitocondrial

de corazón de ratas control y diabéticas

Grupo [NO]ss [O2-]ss

(10-9 M) (10-11 M)

Control 9.40 4.71

Diabetes 11.4 21.3

Adicionalmente, los valores de [O2-]ss estimados se incrementaron 4 veces en los

animales diabéticos respecto a los control. De esta forma, a pesar de la disminución
observada en la actividad y concentración de la enzima Mn-SOD, el aumento en la
velocidad de producción de H2O2 determinado en mitocondrias provenientes de corazón de
animales diabéticos (Tabla 32) es consecuencia de una mayor concentración de O2- en
estado estacionario.

Dado que el O2- es capaz de reaccionar con el NO generando ONOO-, ésta podría
ser la vía de metabolización del O2- favorecida en mitocondrias de corazón de ratas
diabéticas. Aunque en situaciones fisiológicas, sólo el 15% del O2- generado en la
mitocondria se metaboliza por esta vía, en situaciones en las que se observa una
reducción de la actividad de Mn-SOD, dicha ruta metabólica podría estar exacerbada. Por
ello, se calculó la velocidad de formación de ONOO- intramitocondrial, teniendo en cuenta
la [NO]ss y la [O2-]ss estimados en la matriz mitocondrial y la constante de velocidad de

191
Discusión

segundo orden de la reacción de formación de ONOO- (k1 = 1.9 x 1010 M-1 s-1; Kissner y
col., 1997), según:

d[ONOO-]/dt = k1 [O2-]ss [NO]ss

Como puede observarse en la Tabla 42, la velocidad de producción de ONOO-, fue 5

veces mayor en las mitocondrias provenientes de los corazones de animales diabéticos
respeto a las mitocondrias de corazón control.

Tabla 42. Velocidad de formación de ONOO- en la matriz mitocondrial de corazón de

rata control y diabéticas

Grupo d[ONOO-]/dt

(nM s-1)

Control 8.40

Diabetes 46.0

Este resultado explica el incremento (58%) observado en la nitración de tirosinas en

mitocondrias de corazón de animales diabéticos (Figura 63) y permite concluir que, en
dichas mitocondrias, estaría exacerbada la vía de metabolización del O2- por reacción con
el NO.

3.3. Biogénesis mitocondrial

Luego de discutir acerca de la disfunción mitocondrial y de los cambios

bioenergéticos observados en corazón de animales diabéticos disparados
probablemente, como consecuencia de la hiperglucemia, fue de interés estudiar si podría
desencadenarse la síntesis de nuevas mitocondrias como mecanismo compensatorio
ante dichas modificaciones. El proceso de biogénesis mitocondrial puede evaluarse a
través de distintos abordajes. En esta Tesis se estudió dicho proceso desde tres
enfoques, determinando (a) la síntesis de novo de proteínas mitocondriales, (b) el análisis
estereológico de mitocondrias de corazón, y (c) la expresión de factores de transcripción.
En cuanto a la síntesis de novo de proteínas mitocondriales, se determinó la relación
entre la actividad de citocromo oxidasa detectada en el homogeneizado total y la
detectada en la fracción mitocondrial de corazón, la cual permite estimar la masa
mitocondrial por gramo de tejido; el análisis estereológico de mitocondrias de corazón se
realizó a través de la observación de cortes longitudinales del tejido cardíaco, por

192
Discusión

microscopía electrónica de trasmisión; y se determinó la expresión de PGC-1α, uno de

los factores de transcripción clave durante las etapas tempranas del proceso de
biogénesis.

Los resultados obtenidos muestran que la masa mitocondrial en corazón de los

animales diabéticos es 47% mayor en comparación con animales control (Figura 64 C),
indicando la existencia de un proceso de biogénesis mitocondrial en dicho tejido. Este
resultado se refuerza con los datos obtenidos a partir del análisis estereológico de las
microfotografías de tejido cardíaco. En dicho análisis se observó un incremento en la
densidad volumétrica (30%) o fracción de volumen citosólico ocupado por mitocondrias
en los corazones diabéticos, a pesar de que el tamaño de cada mitocondria en el corazón
fue menor (23%). Así, la mayor densidad volumétrica observada en los corazones de
animales diabéticos está dada por un mayor número de mitocondrias por unidad de área
(52%). Adicionalmente, la densidad numérica, o número de mitocondrias por unidad de
volumen, mostró un incremento del 66% en los corazones de los animales diabéticos, en
concordancia con el incremento de la masa mitocondrial estimado a partir de la
determinación de la actividad de citocromo oxidasa. Asimismo, se ha observado un
incremento en la expresión del factor de transcripción PGC-1α (76%). Dicho factor es el
principal regulador de la biogénesis mitocondrial en músculo cardíaco, músculo
esquelético y tejido adiposo (Wu y col., 1999; Puigserver y col.,1998; Lehman y col.,
2000). El factor PGC-1α promueve el incremento en la densidad de volumen mitocondrial
en cardiomiocitos. La expresión de este factor de transcripción se ha asociado en forma
positiva a la captación y oxidación de glucosa (Ling y col., 2004), y a una mayor
expresión del transportador de glucosa GLUT-4, presente en músculo estriado, músculo
cardíaco y adipocitos.

En otros modelos experimentales, tales como ante una situación de hipoxia crónica,
se ha mostrado un aumento en el número de mitocondrias (Costa y col., 1988; Friedman
y col., 1973; Lund y Tomanek, 1980) junto con una disminución en el tamaño individual
de cada organela en ventrículo izquierdo. La mayor relación entre la superficie
mitocondrial respecto al volumen citosólico, actúa como un mecanismo de adaptación
que permite incrementar la capacidad de difusión intracelular de las moléculas de O 2 en
un menor período (Ou y Tenney, 1970; Lund y Tomanek, 1980).

De esta forma, los resultados obtenidos indican que, con el fin de aumentar el
número de mitocondrias y suplir la disfunción energética que ocurre como consecuencia
de la hiperglucemia, se desencadena un proceso de biogénesis mitocondrial en el
corazón de animales diabéticos. El proceso de biogénesis tiene como fin restablecer la
función mitocondrial normal y permitir una cooperación inter-mitocondrial a través del

193
Discusión

intercambio de componentes de la membrana o de la matriz (Nakada, y col., 2001; Nisoli

y col., 2004). En condiciones fisiológicas, y estimulando la biogénesis mitocondrial en
líneas celulares utilizando DETA-NO como dador de NO, Nisoli y col. (2004) mostraron
que este proceso genera mitocondrias funcionalmente activas. En este trabajo de Tesis
se muestra la activación del proceso de biogénesis, evidenciada por el incremento en la
expresión del factor de transcripción PGC-1α, el aumento de la masa mitocondrial por
gramo de tejido, y el incremento en la densidad numérica y volumétrica de las
mitocondrias. Sin embargo, dicho proceso no fue acompañado de una recuperación de la
función mitocondrial. Cabe mencionar que el proceso de biogénesis desencadenado in
vivo en un organismo, en situaciones fisiopatológicas, no necesariamente culmina con la
generación de mitocondrias funcionalmente activas. De acuerdo con nuestros resultados,
Bugger y Abel (2010) han observado un aumento en la biogénesis mitocondrial en
cardiomiocitos provenientes de ratones diabéticos, sin aumento en la funcionalidad
mitocondrial. Así, el incremento en el número de mitocondrias en el corazón de un animal
diabético no implica la recuperación en la disponibilidad energética en el tejido. Aunque la
biogénesis ocurre como un mecanismo compensatorio para recuperar la actividad de las
mitocondrias y del tejido afectado, no siempre da como resultado mitocondrias
competentes capaces de suplir los procesos requeridos, principalmente, cuando la
hiperglucemia es sostenida. Si bien el incremento en el factor de transcripción PCG-1α
induce el proceso de biogénesis mitocondrial, el mismo podría ser insuficiente, en el
contexto de un corazón diabético, para compensar la demanda energética del tejido
(Russell y col., 2004). Estudios realizados en ratones transgénicos que sobre-expresan
PCG-1α, muestran que el proceso de biogénesis mitocondrial se encuentra activado, sin
embargo la función mitocondrial no se recupera en igual magnitud (Russell y col., 2004).
En este trabajo de Tesis, las mitocondrias provenientes de los animales diabéticos
mostraron no solo alteraciones estructurales (sweeling mitocondrial, pérdida de crestas y
disrupción de las membranas internas y externas) sino también disminución en la
respiración mitocondrial, en la actividad de los complejos de transferencia de electrones y
en la eficiencia de la fosforilación oxidativa, con una menor producción de ATP, llevando,
de este modo, a alteraciones bioenergéticas cardíacas. Así, las alteraciones en la
funcionalidad mitocondrial como consecuencia de la hiperglucemia, pueden explicar la
disfuncionalidad cardíaca, y concluir que las disfunción mitocondrial precedería al
desarrollo de la cardiomiopatía diabética, una de las complicaciones crónicas más
frecuentes entre los pacientes diabéticos.

194
Discusión

3.3.1. Participación del NO mitocondrial en el proceso de biogénesis

Tal como se discutió anteriormente, en este trabajo se ha observado un aumento

en la producción y en la concentración en estado estacionario del NO mitocondrial y un
incremento en la expresión de mtNOS en tejido cardíaco provenientes de animales
diabéticos, sugiriendo que el NO actuaría como molécula señalizadora difundiendo al
citosol y activando la biogénesis, intentando restituir el balance energético (Figura 74).

Diabetes Glucosa Ac. grasos Vasos sanguíneos

captación Cardiomiocito
Acil-CoA
Piruvato
Auto-oxidación de glucosa
Activación de la vía de los I III
polioles
Formación de AGEs II
IV
Cadena respiratoria
mitocondrial
β-oxidación
mtNOS NO
O2-
Equivalentes
de reducción SOD NO V
Acetil-CoA
H2 O2 PGC-1α
ONOO- ATP
TCA
Alteraciones bioenergéticas
y funcionales Δ Oxidación y Modificación expresión de
nitración de proteínas Biogénesis
Captación Ca2+
Desacoplamiento mitocondrial proteínas y lípidos Daños estructurales
mitocondrial
ATP Daño mtADN

Mitocondrias
disfuncionales
Trabajo cardíaco
Eficiencia cardíaca

Disfunción Cardiomiopatía
contráctil diabética

Figura 74. Esquema que ilustra el metabolismo mitocondrial de O2-, NO y ONOO-, y

participación del NO en la biogénesis mitocondrial que se produce como consecuencia
de la hiperglucemia.

Trabajos previos muestran que modificaciones en las concentraciones en estado

estacionario de NO y de especies reactivas del oxígeno se asocian a cambios en el
número de mitocondrias, en el número de copias del mtADN, y en la expresión de genes
involucrados en la síntesis de proteínas de los complejos de la cadena respiratoria
mitocondrial (Gadaleta y col., 1992; Lee y col., 2000). Nisoli y col. (2003; 2004) han
mostrado que el NO generado por acción de la eNOS es capaz de estimular el proceso
de biogénesis mitocondrial en una serie de tipos celulares, incluyendo el músculo
cardíaco, a través de la activación de la guanilato ciclasa soluble (GCs) y la generación

195
Discusión

de GMPc, activando una cascada de señalización que termina en la activación del factor
PGC-1α. Dichos autores han mostrado que animales transgénicos eNOS-/- presentan una
disminución en el número de mitocondrias, reducción en los niveles de mtADN, menor
cantidad de citocromo oxidasa y de citocromo c y disminución de la reserva energética,
en cerebro, corazón, hígado, riñón, y músculo gastrocnemio, comparado con animales
control.

El reconocimiento de la existencia de una NOS asociada a la membrana

mitocondrial interna (mtNOS) es consistente con la regulación que ejerce el NO sobre la
respiración mitocondrial, la fosforilación oxidativa y la biogénesis. La célula podría
modificar su actividad en forma dinámica, a través de cambios en la concentración en
estado estacionario de NO, el cual, actuando como un sensor de la disponibilidad
metabólica y/o energética de la célula, regula el metabolismo celular a través del control y
activación de la biogénesis mitocondrial (Nisoli y col., 2004). En las células, el NO
contribuye con funciones especializadas de cada tipo celular, tales como,
excitación-contracción en el músculo esquelético (Stamler y Meissner, 2001), liberación
de neurotransmisores en neuronas (Prast y Philippu, 2001), liberación de citoquinas y
mediadores de inflamación en el sistema inmune (Paolucci y col., 2000; Perrota y col.,
2004). Estas funciones celulares fisiológicas, requieren de adaptaciones ante las mayores
demandas energéticas.

De esta forma, perturbaciones del estado redox y energético mitocondrial pueden

transmitirse al núcleo y/o al citosol e inducir una respuesta compensatoria inmediata o
adaptativa. En este proceso, intervendrían segundos mensajeros tales como ATP, H2O2 y
NO, y procesos involucrados en la homeostasis del Ca2+ y en la mantención de la relación
NAD+/NADH (Yin, Boveris y Cadenas, 2014).

4. Relevancia de la asociación entre el complejo I y la mtNOS en fisiología y

patología. Papel del NO mitocondrial y su relación con O2- y ONOO-

Los resultados incluidos en esta Tesis muestran que la enzima mtNOS no solo
genera NO utilizando NADPH como dador de electrones, sino que es capaz de utilizar
electrones provenientes de la cadena respiratoria, cuando la misma actúa de forma
reversa. Esta observación sugiere que la enzima mtNOS estaría interaccionando no solo
funcionalmente sino físicamente con proteínas del complejo I. La relación entre el
complejo I y la mtNOS ha sido asociada al desarrollo de enfermedades
neurodegenerativas (Navarro y Boveris, 2009; Navarro y col., 2010), en las cuales la
reducción en la actividad del complejo I en mitocondrias de áreas cerebrales y la

196
Discusión

disfuncionalidad en la respiración, se acompañan de una disminución y/o de un aumento

en la producción mitocondrial de NO (Valdez y col., 2011b).

En este trabajo de Tesis se ha mostrado que las mitocondrias de corazón de conejo

sometido a atontamiento miocárdico, es decir a una isquemia/reperfusión moderada, son
bioenergéticamente disfuncionales, hallándose reducido el consumo de O2 mitocondrial
en estado 3 sostenido por malato-glutamato, y las actividades de complejo I y de mtNOS.
Asimismo, se observó un incremento en la producción de H2O2, en la oxidación a lípidos y
proteínas y en la nitración de tirosinas de membranas mitocondriales.

Durante la isquemia se acumula succinato en la mitocondria, el cual es responsable

del aumento en la producción de O2- (vía flujo directo y reverso) y, consecuentemente, de
H2O2, durante la reperfusión. Los primeros trabajos que muestran la producción de
especies reactivas del oxígeno han sido llevados a cabo en mitocondrias funcionando en
condiciones de flujo reverso de electrones (Hinkle y col. 1967; Boveris y col., 1976). La
producción de O2-, por parte del complejo I, es mayor cuando la cadena respiratoria
funciona en forma reversa, reduciendo NAD+ a partir de los electrones provenientes de la
oxidación de succinato, en comparación con la producción de O2- que ocurre cuando los
electrones fluyen desde el NADH al O2 (Lambert y Brand, 2004). Se ha publicado que la
producción de H2O2 por mitocondrias de rata provenientes de corazón, cerebro, hígado y
músculo esquelético, en condiciones de flujo reverso, varía entre 0.5 y 3.0
nmol. min-1. mg proteína mitocondrial-1, y está finamente regulada por el potencial de
membrana (Korshunov y col., 1997; Starkov y Fiskum, 2003; Hansford y col. 1997; Hirst y
col., 2008). Aunque hay consenso en cuanto a la producción de O2- por la enzima
NADH-ubiquinona oxidorreductasa, tanto por flujo directo como por flujo reverso, aún
existen controversias en cuanto a los sitios de generación de dicha especie en el
complejo I (Ohnishi y col., 2010). La mayoría de los investigadores (Galkin y Brandt,
2005; Grivennikova y Vinogradov, 2006; Kussmaul y Hirst, 2006) sostienen que el O2- es
generado en el sitio de unión de la flavina, mientras que otros (Genova y col., 2001;
Lambert y Brant, 2004; Ohnishi y col., 2005; Ohnishi y col., 2010; Treberg y col., 2011)
sostienen que el O2- es generado a partir del centro Fe-S N2 y/o del sitio de unión de la
ubiquinona en el complejo I. Más aún, Ohnishi y col. (2010) avalan la hipótesis que la
generación de O2- se da como consecuencia de un balance entre la flavoquinona (FMN)
y la ubisemiquinona (UQH). Cuando el complejo I oxida NADH y la transferencia de
electrones, posterior al sitio de generación de O2-, está total o parcialmente bloqueada, la
producción de O2- ocurre por auto-oxidación de la FMN (Turrens y Boveris, 1980). Sin
embargo, en condiciones de flujo reverso, cuando los electrones provienen de la
oxidación de succinato en el complejo II, la producción de O2- puede explicarse tanto por

197
Discusión

auto-oxidación de la FMN, como por auto-oxidación de UQH en el complejo I (Turrens y

Boveris 1980; Pryde y Hirst, 2011; Treberg y col., 2011; Dröse y col, 2014). Markevich y
Hoek (2015), utilizando un modelo computacional, determinaron que la producción de O2-
en el complejo I vía flujo directo de electrones, utilizando NADH como sustrato y en
presencia de rotenona, es independiente del potencial de membrana. Dicha observación
es compatible con datos experimentales que muestran que la presencia de
desacoplantes no modifican la generación de especies reactivas del oxígeno (Votyakova
y Reynolds, 2001; Vinogradov y Grivennikova, 2005). Sin embargo, la generación de O2-
vía flujo reverso en presencia de succinato es altamente dependiente del gradiente de
protones (ΔpH) a través de la membrana interna, y del desacoplamiento o disminución de
la fuerza protón-motriz (Δp) (Lambert y Brandt, 2004b; Treberg y col., 2011), siendo dicha
producción máxima cuando el potencial de membrana es elevado (Votyakova y Reynolds,
2001).

El O2- generado en el complejo I es principalmente, liberado a la matriz mitocondrial,

mientras que el generado en el sitio Q0 del complejo III es liberado tanto hacia la matriz
como al espacio intermembranas (St-Pierre y col., 2002; Muller y col., 2004; Han y col.,
2001). Por ello, se postula el O2- que deriva del complejo III actúa principalmente como
segundo mensajero, a través de oxidaciones y/o modificaciones reversibles sobre
estructuras del espacio intermembranas o de la membrana externa, mientras que el O 2-
que deriva del complejo I lleva, principalmente, a oxidación y/o modificaciones de
componentes mitocondriales. Bleier y col. (2015) han mostrado que el O2- producido, en
condiciones de flujo reverso, en el complejo I, genera efectos mediados por la oxidación
irreversible de tioles, afectando la actividad de proteínas de la matriz y de la membrana
interna, así como daño oxidativo en el ADN mitocondrial. Las proteínas que forman parte
de la cadena de transferencia de electrones poseen abundante cantidad de grupos tioles
en sus estructuras. Particularmente, el complejo I de células de mamíferos, posee una
gran cantidad de grupos tioles regulatorios capaces de actuar en vías de señalización
redox en la mitocondria y aportando al pool antioxidante intracelular (Chen y Zweier,
2014).

En este contexto, la producción de NO sostenida por flujo reverso, en las cercanías

del centro activo de la NADH-deshidrogenasa, contribuiría con la generación de ONOO-
al reaccionar a velocidades cercanas al límite difusional con el O2-. Se ha mostrado que
en las mitocondrias, el ONOO- tiene una vida media menor que en otras organelas (t½ ~ 3
a 5 ms) debido a que el entorno mitocondrial es especialmente rico en metaloproteínas,
grupos tioles y CO2, con los que el ONOO- puede reaccionar. Valdez y col., (2000) han
estimado que, en condiciones fisiológicas, la concentración en estado estacionario de

198
Discusión

ONOO- es 2-5 nM y se considera que concentraciones del orden de 20-100 nM de

ONOO- llevan a nitración de proteínas y/o nitrosilación de grupos tioles, ocasionando
disfunción mitocondrial y modificación en la homeostasis celular (Pacher y col., 2007).

Por ello, un aumento en la producción de O2- así como una disminución en el

contenido de GSH, estarían involucrados en el pasaje de la regulación fisiológica
reversible ejercida por el NO sobre la respiración mitocondrial, hacia la inhibición
mitocondrial ocasionada por el ONOO- sobre el complejo I, inactivándolo por oxidación,
nitración y/o S-nitrosación, sea esta inhibición reversible o irreversible (Xie y Wolin, 1996;
Xie y col, 1998; Clementi y col., 1998).

Los mecanismos por los cuales el ONOO- puede inhibir al complejo I no están
dilucidados. Sin embargo, se ha propuesto, que el complejo I puede inhibirse
reversiblemente por S-nitrosación, proceso que revierte por exposición a la luz o a grupos
tioles reducidos, tales como GSH o DTT; o irreversiblemente, por nitración de tirosinas
y/u oxidación de centros Fe-S (Brown y col., 2007). La inactivación del complejo I, por
formación de S-nitrosotioles, lleva a un aumento en la producción de O2- generando un
ambiente en el cual se produce daño oxidativo mitocondrial (Hartley y col., 1994), con
importantes consecuencias fisiológicas y fisiopatológicas para la célula. La inhibición del
complejo I por nitración de tirosinas es causado por el ONOO- generado en la cercanía de
dicho complejo (Yamamoto y col., 2002). Riobó y col. (2001) han mostrado, utilizando
mitocondrias aisladas de corazón, de cerebro y de hígado de rata, que dicha inhibición se
evita si se utilizan atrapadores de ONOO-, tales como ácido úrico y GSH (Borutaite y col.,
2000). Por otro lado, se ha observado, utilizando EPR, que elevadas concentraciones de
NO pueden llevar a la oxidación y/o daño de centros Fe-S del complejo I, por unión y
desplazamiento del Fe, ocasionando modificaciones estructurales de dicho complejo así
como su inactivación (Welter y col., 1996; Brown, 2007).

De esta forma, cualquiera fuese el mecanismo, la formación de ONOO - en las

cercanía del complejo I, dado como consecuencia de un aumento en la generación de O2-
y/o de NO, lleva a reducción de la respiración mitocondrial dependiente de malato-
glutamato, reducción de la actividad de NADH-citocromo c reductasa, incremento en los
niveles de oxidación a proteínas y lípidos y aumento en la nitración de proteínas. Así, el
atontamiento miocárdico podría asociarse a la condición de disfuncionalidad mitocondrial
denominada “síndrome del complejo I” (Boveris y col., 2010). No solo estudios realizados
en modelos experimentales de enfermedades neurodegenerativas (Schapira y col., 1990;
Schapira y col., 1990b; Cooper y col., 1992; Carreras y col., 2004; Schapira 2008b;
Navarro y Boveris, 2007; Navarro y col., 2009; Valdez y col., 2011b), sino también en

199
Discusión

envejecimiento (Boveris y Navarro, 2008) y sepsis (Vanasco y col., 2012), muestran

mitocondrias disfuncionales con las características incluidas en dicho síndrome.

Por otro lado, la disfunción cardíaca observada en animales diabéticos fue

acompañada de una disfunción mitocondrial con disminución en el consumo de O2
mitocondrial en estado 3 utilizando tanto malato-glutamato como succinato como
sustratos, reducción en la actividad de los complejos I-III, II-III y IV de la cadena
respiratoria, disminución en el potencial de membrana y en la generación de ATP.
Asimismo, se observó un aumento en la velocidad de producción de H2O2, y en la
concentración de O2- en estado estacionario. Sin embargo, cabe mencionar que en este
modelo, la disfunción mitocondrial fue más severa, y a diferencia del atontamiento
miocárdico, en el modelo crónico de diabetes se encontró una mayor producción y estado
estacionario de NO junto a un aumento en la expresión de mtNOS. El aumento de [O 2-]ss
y de [NO]ss llevan a un aumento de 5 veces en la velocidad de producción de ONOO-, en
mitocondrias de corazón de animales diabéticos respecto a los controles, contribuyendo
con la inactivación del complejo I. El aumento en la producción de NO mitocondrial podría
responder a los cambios bioenergéticos y a la disfunción mitocondrial observada en
corazón de animales diabéticos, a fin activar las cascadas de señalización que culminan
con el proceso de biogénesis mitocondrial, para generar nuevas mitocondrias y suplir las
demandas energéticas del corazón diabético. Es sabido que la mitocondria genera
segundos mensajeros, tales como H2O2 y NO, los cuales están involucrados en vías de
señalización sensibles a cambios redox, o como la relación ADP/ATP, la cual forma parte
de vías sensibles a cambios energéticos (Yin y col., 2014), involucrados en las vías de
señalización celular, coordinando respuestas mitocondriales con otros procesos
celulares, llevando a adaptación, proliferación, diferenciación y/o muerte celular.

Una diferencia a enfatizar entre el modelo de estrés oxidativo “reversible”

ejemplificado con el atontamiento miocárdico y el modelo de estrés oxidativo en diabetes
que lleva a un daño “irreversible”, es que aunque en ambos se observó disfunción
mitocondrial, en el primero, la disfunción es moderada, mientras que en el segundo la
disfunción mitocondrial es severa, probablemente debido a la persistencia de la
hiperglucemia (Figura 75). En el atontamiento miocárdico se afecta la respiración
mitocondrial por disfuncionalidad del complejo I, con incremento en la producción de
H2O2, y reducción en la producción de NO, este ultimo ejerciendo su función regulatoria
sobre la cadena de transferencia de electrones, a través de una menor inhibición sobre la
citocromo oxidasa, de modo de restaurar el balance redox y energético mitocondrial. En
el modelo de diabetes, la disfunción mitocondrial incluye la modificación de la actividad de
todos los complejos mitocondriales, incremento en la producción de H2O2, aumento en la

200
Discusión

producción y estado estacionario de NO (con incrementada expresión de mtNOS) y

reducción en la producción de ATP. En este caso, el aumento de la generación de NO
mitocondrial y su difusión al citosol, sería la señal “distintiva” que activaría al factor
PGC-1α y desencadenaría la síntesis de nuevas mitocondrias.

Para concluir, la expresión y/o actividad de mtNOS en el cardiomiocito es regulada

en situaciones fisiológicas y/o patológicas; y a su vez, el producto de su acción catalítica,
el NO, modula la función mitocondrial, inhibiendo la respiración a través de sus efectos
sobre los complejos IV y III. La asociación funcional entre el complejo I y la mtNOS podría
explicar el papel regulador del NO y/o ONOO- sobre la cadena respiratoria en situaciones
fisiológicas, y la inactivación irreversible del complejo I en situaciones fisiopatológicas. De
esta forma, se regula la eficiencia de la cadena respiratoria mitocondrial, la síntesis de
ATP y la producción de especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno. Perturbaciones
del estado redox y energético mitocondrial pueden transmitirse al núcleo y/o al citosol e
inducir una respuesta compensatoria inmediata o adaptativa. Por lo tanto, modificaciones
en la producción y/o estado estacionario de los segundos mensajeros H2O2 y/o NO,
serían parte del mecanismo bioquímico subyacente a enfermedades cardiovasculares
asociadas a fallas energéticas cardíacas.

Atontamiento miocárdico Diabetes

Corazón

Alteración de la Función ventricular (reversible) Alteración de la Función ventricular

mtNOS
Respiración mitocondrial Respiración mitocondrial

Actividad del complejo I Actividad de los complejos I-III; II-III y IV

Producción de NO NO Producción de NO y [NO]ss

Producción de O2- Producción de O2-

Estrés Daño
Oxidativo Oxidativo
reversible Producción de H2O2 Producción de H2O2

Señalización
Oxidación a lípidos y proteínas +d[ONOO-]/dt
y nitración de proteínas
Producción de ATP

Mitocondria

Síndrome del Complejo I PGC-1α Biogénesis

Citosol

Figura 75. Papel diferencial del NO en atontamiento miocárdico y Diabetes.

201
Conclusiones
Conclusiones

CONCLUSIONES

1. Las partículas ETPH obtenidas a partir de mitocondrias de corazón bovino producen

NO en situaciones fisiológicas. Dicha producción es sostenida por los electrones
cedidos por el NADPH, el clásico dador de electrones de la enzima mtNOS, así como
por los electrones provenientes de la cadena respiratoria funcionando en condiciones
de flujo reverso.

2. La producción de NO fue detectada no solo en mitocondrias y partículas ETPH, sino

también en la fracción enriquecida en complejo I. Las tres preparaciones fueron
reconocidas por anticuerpos anti-nNOS, infiriendo acerca de la presencia de la
mtNOS en la fracción enriquecida en complejo I.

3. La mtNOS podría interaccionar físicamente con proteínas del complejo I, formando

parte de un supercomplejo, pudiendo aceptar electrones provenientes del flujo
reverso de la cadena respiratoria, para su actividad enzimática. La asociación
mtNOS-complejo I podría ser otro de los mecanismos reguladores del NO y/o de
especies derivadas de su metabolismo (ONOO-), sobre la cadena respiratoria
mitocondrial. Asimismo, podría explicar los mecanismos involucrados en la
patogénesis de enfermedades asociadas al “síndrome del complejo I”, en el cual
tanto la actividad del complejo I como la actividad de mtNOS se hallan modificadas.

4. En el modelo de atontamiento miocárdico en corazón de conejo, la

isquemia/reperfusión moderada lleva a una disfunción ventricular reversible
acompañada de disfuncionalidad mitocondrial, con disminución progresiva en cada
tiempo de isquemia/reperfusión, de la respiración mitocondrial en estado 3 sostenida
por malato-glutamato, de la actividad del complejo I, y de la actividad bioquímica y
funcional de la mtNOS; e incremento de la producción de H2O2, oxidación a lípidos y
proteínas y nitración de tirosinas de membranas mitocondriales. Los cambios en la
función mitocondrial observados en el atontamiento miocárdico son compatibles con
los descriptos para el “síndrome del complejo I”, situación previamente observada en
mitocondrias de áreas cerebrales en enfermedades neurodegenerativas.

5. Las actividades de complejo I y de mtNOS en corazón de conejo sometido a

atontamiento miocárdico mostraron el mismo perfil de inhibición. Este hecho refuerza
la idea de la interacción estructural y funcional entre ambas proteínas, así como de la
co-localización en la producción de O2- y NO, generando ONOO-, llevando a

202
Conclusiones

modificaciones reversibles o irreversibles de dicho complejo. En los cardiomiocitos, la

disfuncionalidad mitocondrial lleva a una disminución en la capacidad de generar la
energía suficiente para la contracción cardíaca.

6. La adición de adenosina, previo a la isquemia y durante toda la reperfusión, al medio

de perfusión, atenuó no sólo la disfunción ventricular sino también la disfunción
mitocondrial detectada luego de 15 min de isquemia y 30 min de reperfusión. De esta
forma, la adenosina mostro ser un buen cardioprotector, preservando a las
mitocondrias de la aparición del “síndrome del complejo I” como consecuencia de la
reperfusión.

7. En el modelo de Diabetes inducida por estreptozotocina, considerado como una

situación fisiopatológica que lleva a un daño irreversible, se observaron cambios en
la función ventricular cuando los corazones de los animales diabéticos fueron
sometidos a una sobrecarga de trabajo, simulado por un estímulo β-adrenérgico.
Dicha disfunción se evidencio como una menor reserva contráctil y lusitrópica
respecto a los corazones control.

8. En el modelo de Diabetes se observó disfunción mitocondrial en corazón, la cual

incluye la reducción de la actividad de todos los complejos mitocondriales, el
incremento en la producción de H2O2, el aumento en la producción y estado
estacionario de NO, con incrementada expresión de mtNOS, y la reducción en la
producción de ATP. En este caso, el aumento de la generación de NO mitocondrial y
su difusión al citosol, sería la señal “distintiva” que activaría al factor PGC-1 y
desencadenaría la síntesis de nuevas mitocondrias.

9. Existe un incremento en la biogénesis mitocondrial, con aumento de la masa y

generación de nuevas mitocondrias, en corazón de ratas diabéticas. En este
proceso, el aumento de la generación de NO mitocondrial y su difusión al citosol,
sería la señal “distintiva” que activaría al factor PGC-1 y desencadenaría la síntesis
de nuevas mitocondrias, las cuales no son funcionalmente activas.

10. Las alteraciones mitocondriales observadas en los corazones de ratas diabéticas

podrían preceder a la instauración de la cardiomiopatía diabética, la cual es una de
las complicaciones crónicas más frecuentes y una de las primeras causas de muerte
entre los pacientes diabéticos.

203
Conclusiones

11. La expresión y/o actividad de mtNOS en el cardiomiocito es regulada en situaciones

fisiológicas y patológicas; y a su vez, el NO modula la función mitocondrial,
inhibiendo la respiración mitocondrial a través de sus efectos sobre los complejos IV,
III y I. De esta forma, se regula la eficiencia de la cadena respiratoria mitocondrial, la
síntesis de ATP y la producción y concentración en estado estacionario de especies
reactivas del oxígeno y del nitrógeno. Dentro de éstas, el H2O2 y NO son especies
señalizadores mitocondria-citosol, que actúan coordinando funciones mitocondriales
y otros procesos celulares, tales como la biogénesis mitocondrial.

12. Modificaciones del metabolismo energético mitocondrial pueden ser la base de las
fallas energéticas cardíacas asociadas a enfermedades cardiovasculares. En este
escenario, el NO generado por la propia mitocondria y la enzima generadora, la
mtNOS, tienen un papel central.

204
Bibliografía
Bibliografía

BIBLIOGRAFÍA

Abe K, Hayashi N, Terada H. (1999) Effect of endogenous nitric oxide on energy metabolism of rat
heart mitochondria during ischemia and reperfusion. Free Radical Biol. Med. 26, 779–787.
Åberg F, Appelkvist E, Dallner G, Ernster L. (1992) Distribution and redox state of ubiquinones in
rat and human tissues. Arch. Biochem. Biophys. 295: 230-234.
Aebi H. (1984) Catalase in vitro. Meth. Enzymol. 105: 121-126.
Alderton WK, Cooper CE, Knowles RG. (2001) Nitric oxide synthases: structure, function and
inhibition, Biochem. J. 357: 593–615.
Al-Turk WA, Stohs SJ, el-Rashidy FH, Othman S. (1987) Changes in glutathione and its
metabolizing enzymes in human erythrocytes and lymphocytes with age. J. Pharm. Pharmacol. 39:
13-16.
Alvarez S, Boveris A. (2004) Mitochondrial nitric oxide metabolism in rat muscle during
endotoxemia. Free Radic. Biol. Med. 37: 1472-1478.
Alvarez S, Valdez LB, Zaobornyj T, Boveris A. (2003) Oxygen dependence of mitochondrial nitric
oxide synthase activity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 305: 771–775.
American Diabetes Association (2008) Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Diabetes
Care 31: 555-560.
Anderson EJ, Kypson AP, Rodriguez E, Anderson CA, Lehr EJ, Neufer PD. (2009) Substrate-
specific derangements in mitochondrial metabolism and redox balance in the atrium of the type 2
diabetic human heart. J. Am. Cell Cardiol. 54: 1891–1898.
Antunes F, Boveris A, Cadenas E. (2004) On the mechanism and biology of cytochrome oxidase
inhibition by nitric oxide. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101: 16774–16779.
Antunes F, Boveris A, Cadenas E. (2007) On the biologic role of the reaction of NO with oxidized
cytochrome c oxidase. Antioxid. Redox Signal. 9: 1569–1579.
Aon MA, Tocchetti CG, Bhatt N, Paolocci N, Cortassa S. (2015) Protective Mechanisms of
Mitochondria and Heart Function in Diabetes, Antiox and Redox Sign. Vol 22(17):1563-1586.
Araki M, Nanri H, Ejima K, Murasato Y, Fujiwara T, Nakashima Y, Ikeda M. (1999) Antioxidant
function of the mitochondrial protein SP-22 in the cardiovascular system. J. Biol. Chem. 274: 2271-
2278.
Baines CP, Song CX, Zheng YT, Wang GW, Zhang J, Wang OL, Guo Y, Bolli R, Cardwell EM,
Ping P. (2003) Protein kinase C interacts with and inhibits the permeability transition pore in
cardiac mitochondria. Circ. Res. 92: 873-880.
Balligand JL, Ungureanu D, Kelly RA, Kobzik L, Pimental D, Michel T, Smith TW. (1993) Abnormal
contractile function due to induction of nitric oxide synthesis in rat cardiac myocytes follows
exposure to activated macrophage-conditioned medium. J Clin Invest. 91:2314-2319.
Balsa E, Marco R, Perales-Clemente R, Szklarczyk, Calvo E, Landázuri MO, Enriquez JA. (2012)
NDUFA4 is a subunit of complex IV of the mammalian electron transport chain. Cell Metab. 16:
378-386.
Bates TE, Loesch A, Burnstock G, Clark JB. (1995) Immunocytochemical evidence for a
mitochondrially located nitric oxide synthase in brain and liver. Biochem. Biophys. Res. Commun.
213: 896-900.
Bates TE, Loesch A, Burnstock G, Clark JB. (1996) Mitochondrial nitric oxide synthase: a
ubiquitous regulator of oxidative phosphorylation? Biochem. Biophys. Res. Commun. 218: 40-44.
Beckman JS, Chen J, Ischiropoulos H, Crow JP. (1994) Oxidative chemistry of peroxynitrite. Meth.
Enzymol. 233: 229-240.
Beckman JS. (1990) Ischemic injury mediator. Nature. 345, 27-28.

205
Bibliografía

Beckman JS. (1996) The physiology and pathological chemistry of nitric oxide. En “Nitric Oxide:
Principles and Actions”. (Ed. Lancaster J. Jr.). Academic Press, San Diego, California, USA. Pp: 1-
82.
Belardinelli L, Lindel J, Berne R. (1980) The cardiac effects of adenosine. Prog Cardiov. Dis. 32:
73-97.
Bernier M, Hearse DJ. (1988) Reperfusion-induced arrhythmias: mechanisms of protection by
glucose and mannitol. Am. J. Physiol. 254: H862-H870
Berr M, Seyfarth T, Sandstede J, Landschutz W, Lipke C, Köstler H, von Kienlin M, Harre K, Hahn
D, Neubauer S. (2002) Absolute concentrations of high-energy phosphate metabolites in nirmal,
hypertrophied, and failing human myocardium measured noninvasively with 31P-SLOOP magnetic
resonance spectroscopy. J. Am. Coll. Cardiol. 40: 1267-1274.
Beyer R. (1967) Preparation, Properties, and Conditions for Assay of Phosphorylating Electron
Transport Particles (ETPH) and its Variations. Methods Enzymol. X 186-201.
Blair (1967) The large-scale preparation and properties of heart mitochondria from slaughterhouse
material. Methods Enzymol. X: 78–81.
Bleier L, Wittig I, Heide H, Steger M, Brandt U, Dröse S. (2015) Generator-specific targets of
mitochondrial reactive oxygen species. Free Radic. Biol. Med. 78: 1–10.
Boczkowski J, Lisdero CL, Lanone S, Samb A, Carreras MC, Boveris A, Aubier M, Poderoso JJ.
(1999) Endogenous peroxynitrite mediates mitochondrial dysfunction in rat diaphragm during
endotoxemia. FASEB. 13: 1637-1646.
Bolli R, Zhu W, Thornby J, O’Neill P, Roberts R. (1988) Time course and determinants of recovery
of function after reversible ischemia in conscious dogs. Am J Physiol. 254: H102-H114.
Bolli R. (1990). Mechanism of myocardial "stunning". Circulation. 82: 723-738.
Bolli R. (2001) CardioprotectiveFunction of Inducible Nitric Oxide Synthase and Role of Nitric Oxide
in MyocardialIschemia and Preconditioning: anOverview of a Decade of Research J. Mol. Cell.
Cardiol. 33: 1897–1918.
Bolli R. (2007) Preconditioning: a paradigm shift in the biology of myocardial ischemia. Am J
Physiol Heart Circ Physiol. 292: H19–H2.
Borutaite V, Budriunaite A, Brown GC. (2000) Reversal nitric oxide- peroxinitrite- and S-nitrosothiol-
induced inhibition of mitochondrial respiration or complex I activity by light and thiols. Arch.
Biochem. Biophys. 1459: 405-412.
Boudina S, Dale Abel E. (2007). Diabetic cardiomyopathy Revisited. Circulation 115: 3213- 3223.
Boumans H, Grivell LA and Barden JA. (1998) The respiratory chain in yeast behaves as a single
functional unit. J. Biol. Chem. 273: 4872-4877.
Boveris A. (1977) Mitochondrial production of superoxide radical and hydrogen peroxide, en Tissue
hypoxia and ischemia (Eds. Reivich M, Coburn R, Lahiri S, Chance B) Plenun Publishing
corporation, New York, Pp 67-82.
Boveris A. (1984) Determination of the production of superoxide radicals and hydrogen peroxide in
mitochondria. Meth Enzymol. 105: 429-435.
Boveris A. (1998). Biochemistry of free radicals: from electrons to tissues. Medicina (B Aires), 58:
350-356.
Boveris A, Alvarez S, Navarro A. (2002b) The role of mitochondrial nitric oxide synthase in
inflammation and septic shock. Free Radic. Biol. Med. 33: 1186-1193.
Boveris A, Cadenas E, Stoppani AO. (1976). Role of ubiquinone in the mitochondrial generation of
hydrogen peroxide. Biochem. J. 156: 435-444.
Boveris A, Cadenas E. (1975). Mitochondrial production of superoxide anions and its relationship to
the antimycin insensitive respiration. FEBS Lett. 54(3), 311-314.
Boveris A, Cadenas E. (1982) Production of superoxide radicals and hydrogen peroxide in

206
Bibliografía

mitochondria. En Superoxide dismutase, (Ed. Oberley LW), CRC press, Boca Raton, FL, USA, Pp
15–30.
Boveris A, Cadenas E. (2000b) Mitochondrial production of hydrogen peroxide regulation by nitric
oxide and the role of ubisemiquinone. IUBMB Life. 50: 245-250.
Boveris A, Carreras MC, Poderoso JJ. (2010) The regulation of cell energetics and mitochondrial
signaling by nitric oxide, segunda edición, Elsevier Accademic Press, London Pp: 441-482.
Boveris A, Chance B. (1973). The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. Biochem. J. 134:
617-630.
Boveris A, Costa LE, Cadenas E, Poderoso JJ. (1999b) Regulation of mitochondrial respiration by
adenosine diphosphate, oxygen, and nitric oxide. Meth. Enzymol. 301: 188-198.
Boveris A, Costa LE, Cadenas E. (1999a) The mitochondrial production of oxygen radicals and
cellular aging. En: "Understanding the Process of Aging: the Roles of Mitochondria, Free Radicals,
and Antioxidants" (Antioxidants in Health and Disease (vol. 8), Eds. Cadenas E y Packer L) New
York, Dekker, Pp. 1–16.
Boveris A, D'Amico G, Lores-Arnaiz S, Costa LE. (2003a) Enalapril increases mitochondrial nitric
oxide synthase activity in heart and liver. Antioxid. Redox Signal. 5: 691-697.
Boveris A, Lores Arnaiz S, Bustamante J, Alvarez S, Valdez LB, Boveris AD, Navarro A. (2002a)
Pharmacological regulation of mitochondrial nitric oxide synthase. Meth Enzymol 359: 328-339.
Bovers A, Navarro A. (2008) Brain mitochondrial dysfunction in aging. IUBMB Life. 60: 308-314.
Boveris A, Oshino N, Chance B. (1972) The cellular production of hydrogen peroxide. General
properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochem. J. 128: 707-716.
Boveris A, Oshino R, Erecinska M, Chance B. (1971) Reduction of mitochondrial components by
durohydroquinone. Biochem. Biophys. Acta 245: 1-16.
Boveris A, Poderoso JJ. (2000a) Regulation of oxygen metabolism by nitric oxide. En "Nitric Oxide:
Biology and Pathobiology" (Ed. Ignarro LJ). Academic Press, New York, USA. Capítulo 13, Pp:
355-367.
Boveris A, Stoppani AO. (1970) Inhibition of electron and energy transfer in mitochondria by 19-
nor-ethynyltestosterone acetate.Arch. Biochem. Biophys. 141: 641-655.
Boveris A, Valdez LB, Alvarez S, Zaobornyj T, Boveris AD, Navarro A. (2003b) Kidney
mitochondrial nitric oxide synthase. Antioxid Redox Signal 5: 265-271.
Boveris A, Valdez LB, Zaobornyj T, Bustamante J. (2006) Mitochondrial metabolic states regulate
nitric oxide and hydrogen peroxide diffusion to the cytosol. Biochim. Biophys. Acta. 1757: 535–542.
Boveris DL, Boveris A. (2007) Oxygen delivery to tissues and mitochondrial respiration. Front
Biosci. 12: 1014-1023.
Boyer PD. (1998) ATP synthase-past and future. Biochim. Biophys. Acta 1365: 3-9.
Bredt DS, Snyder SH. (1994) Nitric Oxide: A physiologyc messenger molecule. Annu. Rev.
Biochem. 63: 175-195.
Brown GC, Cooper CE. (1994) Nanomolar concentrations of nitric oxide reversibly inhibit
synaptosomal respiration by competing with oxygen at cytochrome oxidase. FEBS Lett. 356: 295-
298.
Brown GC. (1997) Nitric oxide inhibition of cytochrome oxidase and mitochondrial respiration:
implications for inflammatory, neurodegenerative and ischaemic pathologies. Mol Cell Biochem.
174:189-92.
Brown GC. (2007) Nitric Oxide and mitochondria. Front Biosci 12: 1024-1033.
Bruel C, Brasseur R, Trumpower BL. (1996) Subunit 8 of the Saccharomyces cerevisiae
cytochrome bc1 complex interacts with succinate-ubiquinone reductase complex. J. Bioenerg.
Biomembr. 28: 59-68.

207
Bibliografía

Budinger GR,Chandel N, Shao ZH, Li CQ, Melmed A, Becker LB, Schumacker PT. (1996). Cellular
energy utilization and supply during hypoxia in embryonic cardiac myocytes. Am. J. Physiol. 270:
L44-53.
Bugger H, Abel ED. (2010) Mitochondria in the Diabetic Heart. Cardiov. Res. 88: 229-240.
Bustamante J, Bersier G, Badin RA, Cymeryng C, Parodi A, Boveris A. (2002) Sequential NO
production by mitochondria and endoplasmic reticulum during induced apoptosis. Nitric Oxide. 6:
333-341.
Bustamante J, Di Libero E, Fernandez-Cobo M, Monti N, Cadenas E, Boveris A. (2004) Kinetic
analysis of thapsigargin-induced thymocyte apoptosis. Free Radic. Biol. Med. 37:1490–1498.
Cadenas E, Boveris A, Ragan CI, Stoppani AO. (1977) Production of superoxide radicals and
hydrogen peroxide by NADH-ubiquinone reductase and ubiquinol-cytochrome c reductase from
beef-heart mitochondria. Arch. Biochem. Biophys. 180: 248-257
Cadenas E, Boveris A. (1980) Enhancement of hydrogen peroxide formation by protophores and
ionophores in antimycin-supplemented mitochondria. Biochem J. 188: 31-37.
Cadenas E, Poderoso JJ, Antunes F, Boveris A. (2000) Analysis of the pathways of nitric oxide
utilization in mitochondria. Free Radic. Res. 33: 747-756.
Cai L. (2006) Suppression of nitrative damage by metallothionein in diabetic heartcontributes to the
prevention of cardiomyopathy. Free Radic Biol Med.41:851-861.
Carreras MC, Franco MC, Peralta JG, Poderoso JJ. (2004) Nitric oxide, complex I, and the
modulation of mitochondrial reactive species in biology and disease. Mol. Aspects Med. 25: 125-
139.
Carreras MC, Peralta JG, Converso DP, Finocchietto PV, Rebagliati I, Zaninovich AA. (2001)
Modulation of liver mitochondrial NOS is implicated in thyroid-dependent regulation of O(2) uptake.
Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281: H2282-H2288.
Carreras MC, Poderoso JJ, Cadenas E, Boveris A. (1996) Measurement of nitric oxide and
hydrogen peroxide production from human neutrophils. Meth Enzymol. 269: 65-75.
Carroll J, Fearnley IM, Skehel JM, Shannon RJ, Hirst J, Walker JE. (2006) Bovine complex I is a
complex of 45 different subunits. J. Biol. Chem. 281: 32724-32727.
Carrozza JP Jr, Bentivegna LA, Williams CP, Kuntz RE, Grossman W, Morgan JP. (1992)
Decreased myofilament responsiveness in myocardial stunning follows transient calcium overload
during ischemia and reperfusion. Circ. Res. 71: 1334-1340.
Cave AC. (1995) Preconditioning induced protection against post-ischaemic contractile
dysfunction: characteristics and mechanisms. J. Mol. Cell Cardiol. 27: 969-979.
Cecchini G. (2003) Function and structure of complex II of the respiratory chain. Annu Rev
Biochem 72: 77-109.
Cerbai E, Klockner U, Isenberg G. (1998) Ca-antagonistic effects of adenosine in guinea pig atrial
cells. Am. J. Physiol. 255: H872-H878.
Chance B, Hollunger G. (1961) The interaction of energy and electron transfer reactions in
mitochondria. VI. The efficiency of the reaction. J Biol Chem. 236:1577–1584.
Chance B, Sies H, Boveris A. (1979). Hydroperoxide metabolism in mammalian organs. Physiol
Rev. 59: 527-605.
Chance B, Williams GR, Hollunger G. (1963) Inhibition of electron and energy transfer in
mitochondria. I. Effects of Amytal, thiopental, rotenone, progesterone, and methylene glycol. J Biol.
Chem. 238:418-431.
Chance B, Williams GR. (1956) The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv Enzymol,
17: 65-134.
Chen YR, Zweier JL. (2014) Cardiac mitochondria and reactive oxygen species generation. Circ.
Res. 114(3): 524-537.

208
Bibliografía

Chesnais JM, Fischmeister R, Mery PF. (1999) Positive and negative inotropic effects of NO
donors in atrial and ventricular fibres of the frog heart. J. Physiol. 518: 449-461
Chouchani ET, Pell VR, Gaude E, Aksentijević D, Sundier SY, Robb EL, y col. (2015) Ischaemic
accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS.Nature. 515: 431–
435.
Cleeter MW, Cooper JM, Darley-Usmar VM, Moncada S, Schapira AH. (1994) Reversible inhibition
of cytochrome c oxidase, the terminal enzyme of the mitochondrial respiratory chain, by nitric
oxide. Implications for neurodegenerative diseases. FEBS Lett. 345: 50-54.
Clementi E, Brown GC, Feelisch M, Moncada S. (1998) Persistent inhibition of cell respiration by
nitric oxide: crucial role of S-nitrosylation of mitochondrial complex I and protective action of
glutathione. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 7631-7636.
Clementi E, Brown GC, Foxwell N, Moncada S. (1999) On the mechanism by which vascular
endothelial cells regulate their oxygen consumption. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 96: 1559-1562.
Clementi E, Nisoli E. (2005) Nitric oxide and mitochondrial biogenesis: a key to long-term
regulation of cellular metabolism. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 142(2):102-10.
Cooper JM, Mann VM, Kridge D y Schapira AH. (1992) Human mitochondrial complex I
dysfunction. Biochim. Biophys. Acta. 1101: 198-203.
Costa LE, Boveris A, Koch OR, Taquni AC. (1988). Liver and Heart mitochondria in rats submitted
to chronic hypobaric hypoxia. Am. J. Physiol. 255: C123-C129.
Costa LE, La-Padula P, Lores-Arnaiz S, D'Amico G, Boveris A, Kurnjek ML, Basso N. (2002) Long-
term angiotensin II inhibition increases mitochondrial nitric oxide synthase and not antioxidant
enzyme activities in rat heart. J. Hypertens. 20: 2487-2494.
Crapo JD, McCord JM. (1976) Oxygen-induced changes in pulmonary superoxide dismutase
assayed by antibody titrations. Am. J. Physiol. 231: 1196-1203.
Crofts AR. (2004) The cytochrome bc1 complex: function in the context of structure. Annu Rev
Physiol 66: 689-733.
Czerniczyniec A, Karadayian AG, Bustamante J, Cutrera RA, Lores-Arnaiz S. (2011) Paraquat
induces behavioral changes and cortical and striatal mitochondrial dysfunction. Free Radic. Biol.
Med. 51: 1428-36.
D'Annunzio V, Donato M, Sabán M, Sanguinetti S, Wikinsky R, Gelpi RJ. (2005)
Hypercholesterolemia attenuates postischemic ventricular dysfunction in the isolated rabbit heart.
Mol. Cell Biochem. 273: 137-143.
Dedkova EN, Blatter LA. (2009) Characteristics and function of cardiac mitochondrial nitric oxide
synthase. J. Physiol. 587:851-72.
Degli Espositi M, Lenaz G. (1982) Kinetics of ubiquinol-1-cytochrome c reductase in bovine heart
mitochondria and submitochondrial particles. Biochim. Biophys. Acta. 682: 189-200.
Di Mascio P, Murphy ME, Sies H. (1991) Antioxidant defense systems: the role of carotenoids,
tocopherols, and thiols. Am. J. Clin. Nutr. 53: 194S-200S.
Dionisi O, Galeotti T, Terranova T, Azzi A. (1975) Superoxide radicals and hydrogen peroxide
formation in mitochondria from normal and neoplastic tissues. Biochim Biophys Acta. 403: 292-300.
Donato M, D'Annunzio V, Berg G, Muzzio ML, Miksztowicz V, Wikinsky R, Gelpi RJ. (2007)
Ischemic postconditioning reduces infarct size by activation of A1 receptors and K+(ATP) channels
in both normal and hypercholesterolemic rabbits. J.Cardiovasc. Pharmacol. 49: 287-292.
Donato M, Gelpi RJ. (2003) Adenosine and cardioprotection during reperfusion-an overview. Mol.
Cell Biochem. 251: 153-159.
Drew B, Leeuwenburg C. (2003). Method for measuring ATP production in isolated mitochondria:
ATP production in brain and liver mitochondria of Fischer-344 rats with age and caloric restriction.
Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 285: R1259-R1267.

209
Bibliografía

Dröse S, Brandt U, Wittig I. (2014) Mitochondrial respiratory chain complexes as sources and
targets of thiol-based redox-regulation. Biochim. Biophys. Acta - Proteins Proteomics. 1844: 1344-
1354.
Duncan JG. (2011) Mitochondrial dysfunction in diabetic cardiomyopathy. Biochim Biophys Acta.
1813:1351-1359
Eddy L, Stewart J, Jones H, Yellon D, Mc Cord JM, Downey J. (1986) Xanthine oxidase is detected
in ischemic rat heart but not in human hearts. Physiologist. 29: 166.
Elfering SL, Sarkela TM, Giulivi C. (2002) Biochemistry of mitochondrial nitric oxide synthase. J.
Biol. Chem. 277: 38079-38086.
Engelman RM, Chandra R, Bauman FG. (1972) Myocardial reperfusion, a cause of ischemic injury
during cardiopulmonary bypass. Surgery 80: 266-276.
Ernster L, Dallner G. (1995) Biochemical, physiological and medical aspects of ubiquinone
function. Biochim. Biophys. Acta. 1271: 195-204.
+
Ernster L, Lee C. (1967) Energy-linked reduction of NAD by succinate. Methods Enzym. X: 729–
738.
Estabrook RW. (1967) Mitochondrial respiratory Control and The Polarographic Measurement of
ADP:O ratios. Meth. Enzymol. X. Oxidation and Phosphorilation: 41-47.
Estornell E, Fato R, Pallotti F, Lenaz G. (1993) Assay conditions for the mitochondrial
NADH:coenzyme Q oxidoreductase. FEBS Lett. 332: 127– 131.
Eubel H, Heinemeyer J, Sunderthaus S, Braun HP (2004) Respiratory chain supercomplexes in
plant mitochondria. Plant Physiol. Biochem., 42: 937-942.
Fellet AL, Balaszczuk AM, Arranz C, López-Costa JJ, Boveris A, Bustamante J. (2006) Autonomic
regulation of pacemaker activity: role of heart nitric oxide synthases. Am J Physiol Heart Circ
Physiol. 291: H1246-H1254.
Ferreira R, Llesuy S, Miles J, Scordo D, Hourquebie H, Molteni L, Palma C, Boveris A. (1988)
Assessment of myocardial oxidative stress in patients after myocardial revascularization. Am
HeartJ. 115: 307-312.
Fersht A. (1999) Structure and Mechanism in protein Science. W.H. Freeman & Co., New York,
NY.
Finkel MS, Oddis CV, Mayer OH, Hattler BG, Simmons RL. (1995) Nitric oxide synthase inhibitor
alters papillary muscle force-frequency relationship. J Pharmacol Exp Ther. 272: 945-952.
Finocchietto P, Barreyro F, Holod S, Peralta J, Franco MC, Méndez C, Converso DP, Estévez A,
Carreras MC, Poderoso JJ. (2008) Control of muscle mitochondria by insulin entails activation of
Akt2-mtNOS pathway: Imlpications for the metabolic syndrome, PLoS One. 3:e1749.
Fishbein MC, Meerbaum S, Rit J, Londo U, Kanmatsuse K, Mercier JC, Corday E, Ganz W. (1981)
Early phase acute myocardial infarct size quantification: validation of the triphenyl tetrazolium
chloride tissue enzyme staining technique. Am. Heart J. 101: 593-600.
Flohe L, Brand I. (1969) Kinetics of glutathione peroxidase. Biochim Biophys Acta. 191: 541-549.
Flohe L, Gunzler WA. (1984) Assays of glutathione peroxidase. Meth Enzymol 105: 114-121.
Forman M. Velasco C, Jackson E. (1993) Adenosine attenuates reperfusion injury following
regional myocardial ischaemia. Cardiovasc. Res. 27: 9-17.
Fowler LR, Richardson HS. (1963) Studies on the electron transfer system. J. Biol. Chem. 238:
456-463.
Fraga CG, Leibovitz BE, Tappel AL. (1988) Lipid peroxidation measured as thiobarbituric acid-
reactive substances in tissue slices: characterization and comparison with homogenates and
microsomes. Free Radic. Biol. Med. 4: 155-161.
Fralix TA, Murphy E, London RE, Steenberg C. (1993) Protective effects of adenosine in the
perfused rat heart: Changes in metabolism and intracellular homeostasis. Am. J. Physiol. 264:

210
Bibliografía

C986-C994.
Franco MC, Arciuch VG, Peralta JG, Galli S, Levisman D, Lopez LM, Romorini L, Poderoso JJ,
Carreras MC. (2006). Hypothyroid phenotype is contriibuted by mitochondrial complex I inactivation
due to translocated neuronal nitric-oxide synthase. J. Biol. Chem. 281: 4779-4786.
Fridovich I. (1975) Superoxide dismutases. Annu Rev Biochem. 44: 147-159.
Fridovich I. (1995) Superoxide radical and superoxide dismutases. Annu Rev Biochem 64: 97-112.
Friedman I, Moravec J, Reichart E, Hatt PY. (1973) Subacute myocardial hypoxia in rat. An
electron microscopic study of the left ventricular myocardium. J. Mol. Cell. Cardiol. 5: 125-132.
Fukuto JM, Cho JY, SWitzer CH. (2000) The chemical properties of nitric oxide and related
nitrogen oxides. En: “Nitric Oxide: Biology and Pathobiology” (Ed. Ignarro LJ). Academic Press,
New York Pp: 23-39.
Furchgott RE, Vanhoutte PM. (1989) Endothelium-derived relaxing and contracting factors.
FASEB. 3: 2007-2018.
Gadaleta MN, Rainaldi G, Lezza AM, Milella F, Fracasso F, Cantatore P. (1992) Mitochondrial DNA
copy number and mitochondrial DNA deletion in adult and senescent rats. Mutat Res. 275: 181-
193.
Galkin A, Abramov AY, Frakich N, Duchen MR, Moncada S. (2009) Lack of oxygen deactivates
mitochondrial complex I: implications for ischemic injury? J. Biol. Chem. 284: 36055-36061.
Galkin A, Brandt U. (2005) Superoxide readical formation by pure complex I (NADH: ubiquinone
oxidoreductase)fromYarrowia lipolytica. J. Biol. Chem. 280: 30129-30135.
Galkin A, Moncada S. (2007) S-nitrosation of mitochondrial complex I depends on its structural
conformation. J. Biol. Chem. 282: 37448-37453.
Gao WD, Atar D, Backx PH, Marban E. (1995) Relationship between intracellular calcium and
2+
contractile force in stunned myocardium. Direct evidence for decreased myofilament Ca
responsiveness and altered diastolic function in intact ventricular muscle. Circ. Res. 76: 1036-1040.
Genova MI, Ventura B, Giuliano G, Bovina C, Formiggini G, Parenti Castelli G, Lenaz G. (2001)
The site of production of superoxide radical in mitochondrial complex I is not a bound
ubisemiquinonebut presumably iron-sulfur cluster N2. FEBS Lett. 505: 364-368.
Genova ML, Lenaz G. (2014) Functional role of mitochondrialrespiratorysupercomplexes. Biochim.
Biophys.Acta. 1837: 427-443.
Ghafourifar P, Cadenas E. (2005) Mitochondrial nitric oxide synthase. Trends Pharmacol. Sci.
26:190-195.
Ghafourifar P, Richter C. (1997) Nitric oxide synthase activity in mitochondria, FEBS Lett. 418:
291–296.
Ghosh DK, Stuehr DJ. (1995) Macrophage NO synthase: characterization of isolated oxygenase
and reductase domains reveals a head-to-head subunit interaction. Biochemistry 34: 801-807.
Giacco F, Brownlee M. (2010) Oxidative stress and diabetic complications. Circ Res. 107: 1058-
1070
Giulivi C, Poderoso JJ, Boveris A. (1998) Production of nitric oxide by mitochondria, J. Biol. Chem.
273: 11038–11043.
Godín DV, Shabir B. (1987) Effects of allopurinol on myocardial ischemic injury induced by
coronary artery ligation and reperfusion. Biochem. Pharmacol. 36: 2101-2107.
- ·
Goldstein S, Czapski G. (1995) The reaction of NO with O 2 and HO2 : a pulse radiolysis study.
Free Rad. Biol. Med. 19: 505-510.
Gomez C, Bandez MJ, Navarro A. (2007) Pesticides and impairment of mitochondrial function in
relation with the parkinsonian syndrome.Front. Biosci. 12, Pp: 1079-1093.

Gonzales GF, Chung A, Miranda S, Valdez LB, Zaobornyj T, Boveris A. (2005) Heart mitochondrial

211
Bibliografía

nitric oxide synthase is upregulated in male rats exposed to high altitude (4,340 m). Am J
PhysiolHeart Circ Physiol. 288: H2568-2573.
González GE, Mangas F, Chauvin AD, Monroy S, Donato M, Morales C, Gelpi RJ. (2003) Diastolic
behavior during postischemic hypercontraction phase in rabbit stunned myocardium. Medicina (B
Aires). 63:403-9.
Gonzalez-Flecha B, Cutrin JC, Boveris A. (1993) Time course and mechanism of oxidative stress
and tissue damage in rat liver subjected to ischemia-reperfusion. J. Clin. Invest. 91: 456-464.
Griennikova VG, Vinogradov AD. (2006) Generation of superoxide by the mitochondrial complex I.
Biochim. Biophys. Acta 1757: 553-561-
Griffith OW, Stuehr DJ. (1995) Nitric oxide synthases: properties and catalytic mechanism. Annu.
Rev. Physiol. 57: 707-736.
Hackenbrock CR, Chazotte B, Gupte SS. (1986) The random collision model and a critical
assessment of diffusion and collision in mitochondrial electron transport. J. Bioenerg. Biomembr.
18: 331–368.
Hambly RI, Zoneraich S, Sherman L (1974) Diabetic Cardiomiopathy. Journal of the American
Medical Association 229:1749-1754.
Han D, Williams E, Cadenas E (2001) Mitochondrial respiratory chain-dependent generation of
superoxide anion and its release into the intermembrane space. Biochem J. 353: 411-416
Hansford RG, Hogue BA, Mildaziene V. (1997) Dependence of H2O2 formation by rat heart
mitochondria on substrate availability and donor age. J. Bioenerg. Biomembr. 29: 89-95.
Hardy L, Clark JB, Darley-Usmar VM, Smith DR, Stone D. (1991) Reoxigenation-dependent
decrease in mitochondral NADH-CoQ reductase (Complex I) activity in the hypoxic/reogygenated
rat heart. Biochem J. 274: 133-137.
Hare JM, Givertz MM, Creager MA, Colucci WS. (1998) Increased sensitivity to nitric oxide
synthase inhibition in patients with heart failure: potentiation of beta-adrenergic inotropic
responsiveness. Circulation. 97:161-166.
Hare JM. (2003) Nitric Oxide and excitation-contraction coupling. J. Mol Cell Cardiol. 35: 719-729.
Harmon HJ, Hall IL, Crane FL. (1974) Structure of mitochondrial cristae membrane. Biochim.
Biophys. Acta. 344: 119-155.
Hartley A, Stone JM, Heron C, Cooper JM, Schapira AH. (1994) Complex I inhibitors induce dose-
dependent apoptosis in PC12 cells: relevance to Parkinson's disease. J Neurochem. 63: 1987-
1990.
Hatefi Y, Rieske JS. (1967) The preparation and properties of DNPH-cytochrome c reductase
(complex I-III of the respiratory chain). Methods Enzymol.X Pp: 225-231.
Hatefi Y. (1985) The mitochondrial electron transport and oxidative phosphorylation system. Annu
Rev Biochem. 54: 1015-1069.
Heather LC, Clarke K. (2011) Metabolism, hypoxia and the diabetic heart. J Mol Cell Cardiol. 50:
598-605.
Heldt HW, Jacobs H, Klingenberg M. (1965) Endogenous ADP of Mitochondria, an Early
Phosphate Acceptor of Oxidative Phosphorylation as Disclosed by Kinetic Studies with C14
Labelled ADP and ATP and with Atractyloside. Biochem Biophys Res Commun. 18: 174–179.
Hensley K, Kotake Y, Sang H, Pye QN, Wallis GL, Kolker LM, Tabatabaie T, Stewart CA, Konishi
Y, Nakae D, Floyd RA. (2000) Dietary choline restriction causes complex I dysfunction and
increased H(2)O(2) generation in liver mitochondria.Carcinogenesis 21: 983-989
Heyndrickx GG, Baig H, Nellens P, Leusen I, Fishbein MC, Vatner SF. (1978) Depression of
regional blood flow and wall thickening after brief coronoary occlisions. Am. J. Physiol. 234: H653-
H659.
Hill BG, Dranka BP, Zou L, Chatham JC, Darley-Usmar VM. (2009) Importance of the bioenergetic
reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochem

212
Bibliografía

J.424: 99-107.
Hinkle PC, Butow RA, Racker E, Chance B. (1967) Partial resolution of the enzymes catalyzing
oxidative phosphorylation. XV. Reverse electron transfer in the flavin-cytochrome beta region of the
respiratory chain of beef heart submitochondrial particles. J. Biol. Chem. 242: 5169-5173.
Hirst J, Carroll J, Fearnley IM, Shannon RJ, Walker JE. (2003) The nuclear encoded subunits of
complex I from bovine heart mitochondria. Biochim. Biophys. Acta. 1604: 135-150.
Hirst J, King MS, Pryde KR. (2008) The production of reactive oxygen species by complex I.
Biochemical Society Transactions. Vol. 36, parte 5: 976-980.
Hori M, Kitakaze M. (1991) Adenosine, the heart, and coronary circulation. Hypertension 18: 565-
574.
How OJ, Aasum E, Severson DL, Chan WY, Essop MF, Larsen TS. (2006) Increased myocardial
oxygen consumption reduces cardiac efficiency in diabetic mice. Diabetes. 55:466-73.
Hughes MN, Nicklin HG. (1968) The chemistry of pernitrites. Part I. Kinetics of decomposition of
pernitrous acid. J. Chem. Soc. 450-462.
Huie RE, Padmaja S. (1993) The reaction of nitric oxide with superoxide. Free Rad. Res. Commun.
18: 195-199.
Iglesias DE, yBombicino SS, Valdez LB, Boveris A. (2015) Nitric oxide interacts with mitochondrial
complex III producing antimycin-like effects. Free Rad. Biol. Med. 89: 602-613.
Ignarro LJ, Buga GM, Wood KS, Byrns RE, Chaudhuri G. (1987) Endothelium-derived relaxing
factor produced and released from artery and vein is nitric oxide. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 84:
9265-9269.
Ignarro LJ. (1989) Endothelium-derived nitric oxide: Pharmacology and relationship to the actions
of organic esters. Pharm. Res. 6: 651-659.
Jekabsone A, Ivanoviene L, Brown GC, Borutaite V. (2003) Nitric oxide and calcium together
inactivate mitochondrial complex I and induce cytochrome c release. J. Mol. Cell. Cardiol. 35, 803–
809.
Joffe II, Travers KE, Perreault-Micale CL, Hampton T, Katz SE, Morgan JP, Douglas PS. (1999)
Abnormal cardiac function in the Streptozotocin-Induced, non-insulin-dependent Diabetic rats. J. of
American College of Cardiology. 34: 2111-2119.
Jones DP. (1985) En “Oxidative stress” (Ed. Sies H) Academic Press, San Diego. Pp. 151-189
Kanai AJ, Pearce LL, Clemens PR, a Birder L, VanBibber MM, Choi SY, de Groat WC, Peterson J.
(2001) Identification of a neuronal nitric oxide synthase in isolated cardiac mitochondria using
electrochemical detection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98: 14126–14131
Kaye DM, Wiviott SD, Balligand JL, Simmons WW, Smith TW, Kelly RA. (1996) Frequency-
dependent activation of a constitutive nitric oxide synthase and regulation of contractile function in
adult rat ventricular myocytes. Circ Res. 78: 217-224.
Kembro JM, Aon MA, Winslow RL, O’Rourke B, Cortassa S. (2013) Integrating mitochondrial
energetics, redox and ROS metabolic networks: a two-compartment model. Biophys. J. 104: 332–
343.
Kissner R, Nauser T, Bugnon P, Lye PG, Koppenol WH. (1997) Formation and properties of
peroxynitrite as studied by laser flash photolysis, high-pressure stopped-flow technique and pulse
radiolysis. Chem. Res. Toxicol. 10: 1285-1292.
Knowles RG, Iter M, Moncada S. (1990) Differential induction of brain, lung and liver nitric oxide
synthase by entotoxin in the rat. Biochem. J. 270: 833-836.
Knowles RG, Moncada S. (1993) Nitric oxide as a signal in blood vessels. Trends Biochem. Sci.
17: 399-402.
Knowles RG, Moncada S. (1994) Nitric oxide synthases in mammals. Biochem. J. 298: 249-258.

Koltyar AB, Vinogradov AD. (1990) Slow active/inactive transition of the mitochondrial NADH-

213
Bibliografía

ubiquinone reductase. Biochem. Biophys. Acta. 1019: 151-158.

Koppenol WH, Kissner R, Beckman JS. (1996) Syntheses of peroxynitrite: to go with the flow or on
solid grounds? Meth. Enzymol. 269: 296-302.
Korshunov SS, Skulachev VP, Starkov AA. (1997) High protonic potential actuates a mechanism of
production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Lett. 416: 15-18.
Krause F, Reifschneider NH, Vocke D, Seelert H, Rexroth S, Dencher NA. (2004b) “Respirasome”-
like supercomplexes in green leaf mitochondria of spinach. J. Biol. Chem. 279: 48369-48375.
Krause F, Scheckhuber CQ, Werner A, Rexroth S, Reifschneider NH, Dencher NA, Osiewacz HD.
(2004a) Supramolecular organization of cytochrome c oxidase and alternative oxidase-dependent
respiratoy chains in the filamentous fungus Podospora anserine. J. Biol. Chem. 279: 26453-26461.
Kussmaul L, Hirst J. (2006) The mechanism of superoxide production by NADH: ubiquinone
oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria. PNAS 103. 7607-7612.
Lambert AJ, Brand MD. (2004) Inhibitors of the quinone-binding site allow rapid superoxide
production from mitochondrial NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I). J. Biol. Chem 279:
39414-39420.
Lambert AJ, Brand MD. (2004b) Superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase
(complex I) depends on the pH gradient across the mitochondrial inner membrane. Biochem.J.
382,511–517.
Leach FR, Webster JJ. (1986) Commercially available firefly luciferase reagents. Methods
Enzymol. 133: 51-71.
Lee HC, Yin PH, Lu CY, Chi CW, Wei YH. (2000) Increase of mitochondria and mitochondrial DNA
in response to oxidative stress in human cells. Biochem. J. 348: 425-32.
Lehman JJ, Barger PM, Kovacs A, Saffitz JE, Medeiros DM, Kelly DP. (2000) Peroxisome
proliferator-activated receptor gamma coactivator-1 promotes cardiac mitochondrial biogenesis. J.
Clin. Invest. 106: 847-856.
Lehninger AL. (1965) Control, compartmentation and integration. En: "The mitochondrion:
Molecular Basis of Structure and Function" (Ed. Davies B), W.A. Benjamin, Inc, New York, Pp. 132-
156.
Lenaz G, Genova ML. (2007) Kinetics of integrated electron transfer in the mitochondrial
respiratory chain: random collisions vs. solid state electron channeling. Am. J. Physiol. 292 C:
1221-1239.
Levine RL, Williams JA, Stadtman ER, Shacter E. (1994) Carbonyl assays for determination of
oxidatively modified proteins. Methods Enzymol. 233: 346-357.
Ling C, Poulsen P, Carlsson E, Ridderstrale M, Almgren P, Wojtaszewski J, Beck-Nielsen H, Groop
L, Vaag A. (2004) Multiple environmental and genetic factors influence skeletal muscle PGC-1α
and PGC-1h gene expression in twins. J. Clin. Invest. 114: 1518 – 1526.
Liu GS, Thornton J, Van Winkle DM, Stanley AW, Olsson RA, Downey JM. (1991) Protection
against infarction afforded by preconditioning is mediated by A1 adenosine receptors in rabbit
heart. Circulation. 84: 350-356.
Liu Q, Raina AK, Smith MA, Sayre LM, Perry G. (2003) Hydroxynonenal, toxic carbonyls, and
Alzheimer disease. Mol. Aspects Med. 24: 305-313.
Liu X, Miller MJ, Joshi MS, Thomas DD, Lancaster JR Jr. (1998) Accelerated reaction of nitric
oxide with O2 within the hydrophobic interior of biological membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A
95: 2175-2179.
Lores Arnaiz S, Coronel MF, Boveris A. (1999) Nitric oxide, superoxide, and hydrogen peroxide
production in brain mitochondria after haloperidol treatment. Nitric oxide: Biol. Chem. 3: 235-243.
Lores-Arnaiz S, D'Amico G, Czerniczyniec A, Bustamante J, Boveris A. (2004) Brain mitochondrial
nitric oxide synthase: in vitro and in vivo inhibition by chlorpromazine. Arch Biochem Biophys 430:
170-177.

214
Bibliografía

Loud AV. (1968) A quantitative stereological description of the ultrastructure of normal rat liver
parenchymal cells. J. Cell Biol. 37: 27-46.
Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. (1951) Protein measurement with the Folin
phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275.
Lund DD, Tomanek RJ. (1980). The effect of chronic hypoxia on the myocardial cell of
normotensive and hypertensive rats. Anat. Rec. 196: 421-430.
Manzo-Avalos S, Pérez-Vázquez V, Ramírez J, Aguilera-Aguirre L, González-Hernández JC,
Clemente-Guerrero M, Villalobos-Molina R, Saavedra-Molina A. (2002) Regulation of the rate of
2+
synthesis of nitric oxide by Mg and hypoxia. Studies in rat heart mitochondria, Amino Acids. 4:
381-389.
2+
Marban E, Kitakaze M, Koretsune Y, Yue DT, Chacko VP, Pike MM. (1990) Quantification of [Ca ]
in perfused hearts. Critical evaluation of the 5F-BAPTA and nuclear magnetic resonance method
as applied for the study of ischemia and reperfusion. Circ. Res .66: 1255-1267.
Marchini T, Magnani N, D'Annunzio V, Tasat D, Gelpi RJ, Alvarez S, Evelson P. (2013) Impaired
cardiac mitochondrial function and contractile reserve following an acute exposure to
environmental particulate matter. Biochim Biophys Acta.1830:2545-2552.
Marín-García J, Goldenthal M. (2002) The mitochondrial Organelle and the Heart. Rev.
Esp.Cardiol. 55: 1293:1310.
Markevich NI, Hoek JB (2015) Computational modeling analysis of mitochondrial superoxide
production under varying substrate conditions and upon inhibition of different segments of the
electron transports chain. Biochim. Biophys. Acta. 1847: 656-679.
Masters BS. (2000) Structural variations to accomodate functional thems of the isoforms of NOS.
En: “Nitric Oxide: biology and athobiology” (Èd. Ignarro LJ). Academic Press, New York, USA. Pp:
91-104.
McCord JM, Fridovich I. (1969) Superoxide dismutase. An enzymic function for erythrocuprein
(hemocuprein). J. Biol. Chem. 244(22): 6049-6055.
McMillan K, Masters BS. (1995) Prokaryotic expression of the heme- and flavin-binding domains of
rat neuronal nitric oxide synthase as distinct polypeptides: identification of the heme-binding
proximal thiolate ligand as cysteine-415. Biochemistry 34: 3686-3693.
Medeiros DM. (2008) Assessing mitochondria biogenesis. Methods. 46 (4): 288-294.
Mela I, Seitz S. (1979) Isolation of mitochondria with emphasis on heart mitochondria from small
amounts of tissue. Meth. Enzymol. 55: 39-46.
Michaelis L. (1946) Fundamentals of oxidations and respiration. American Scientist 34: 573-596.
Mitchell P. (1961) Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a
chemiosmotic type of mechanism. Nature 191: 144-148.
Mitchell P. (1975) The protonmotive Q cycle: a general formulation. FEBS Lett 59, Pp: 137-139
Moncada S, Palmer RMJ, Higgs EA. (1991) Nitric Oxide: physiology, phatophysiology and
pharmacology. Pharmacol. Rev. 43: 109-142.
Mora AC, Aragón DM, Ospina LF. (2009) Caracterización del estrés oxidativo en ratas wistar
diabéticas por estreptozotocina. VITAE, Revista de la Facultad de Química Farmacéutica (ISSN:
0121-4004) 16: 311-319.
Muller FL, Liu Y; Van Remmen H. (2004) Complex III releases superoxide to both sides of the inner
mitochondrial membrane. J. Biol. Chem. 279: 49064-49073.
Murphy E, Steenbergen C. (2007) Preconditioning: the mitochondrial conection. Annu. Rev.
Physiol. 65: 51-67.
Murphy ME, Noack E. (1994) Nitric oxide assay using the hemoglobin method. Meth Enzymol 233:
240-250.
Nakada K, Inoue K, Hayashi J. (2001) Interaction theory of mammalian mitochondria. Biochem

215
Bibliografía

Biophys Res Commun. 288(4):743-6.

Navarro A, Bandez MJ, Gomez C, Repetto MG, Boveris A. (2010) Effects of rotenone and
pyridaben on complex I electron transfer and on mitochondrial nitric oxide synthase functional
activity. J. Bioenerg. Biomembr. 42: 405–412.
Navarro A, Bandez MJ, Lopez-Cepero JM, Gomez C, Boveris AD, Cadenas E, Boveris AA. (2011)
High doses of vitemin E improve mitochondrial dysfunction in rat hyppocampus and frontal cortex
upon aging. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 300: R827-R834.
Navarro A, Boveris A, Bández MJ, Sánchez-Pino MJ, Gómez C, Muntané G, Ferrer I. (2009)
Human brain cortex: mitochondrial oxidative damage and adaptative response in Parkinson
disease and in dementia Lewy bodies. Free Rad. Biol. Med. 46: 1574-1580.
Navarro A, Boveris A. (2004) Rat brain and liver mitochondria develop oxidative stress and lose
enzymatic activities on aging. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 287: R1244–1249.
Navarro A, Boveris A. (2007). The mitochondrial energy transduction system and the aging
process. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292: C670-C686.
Navarro A, Boveris A. (2009) Brain mitochondrial dysfunction and oxidative damage in Parkinson’s
disease. J Bioenerg Biomembr. 41: 517–521.
Navarro A, Torrejon R, Bandez MJ, Lopez-Cepero JM, Boveris A. (2005) Mitochondrial function
and mitochondria-induced apoptosis in an overstimulated rat ovarian cycle. Am J Physiol
Endocrinol Metab. 289: E1101-1109.
Nelson DL, Cox MM. (2005). Fosforilación oxidativa y fotofosforilación. En: Lehninger Principios de
Bioquímica, pp 690-750.
Neubauer S. (2007) The failing heart-an engine out of fuel. N. Engl. J. Med. 356: 1140-1151.
Nicholls DG, Ferguson SJ. (2002) Bioenergetics. Tercera edición. Academic Press, San Diego,
Estados Unidos.
Nicholls P. (1974) Cytochrome c binding to enzymes and membranes. Biochim. Biophys Acta, 346:
261-310.
Nisoli E, Carruba MO. (2006) Nitric Oxide and mitochondrial biogenesis. Journal of Cell Science
119: 2855-2862.
Nisoli E, Clementi E, Moncada S, Carruba MO. (2004) Mitochondrial biogenesis as a cellular
signaling framework. Biochem Pharmacol. 67: 1-15.
Nisoli E, Clementi E, Paolucci C, Cozzi V, Tonello C, Sciorati C, Bracale R, Valerio A, Francolini M,
Moncada S, Carruba MO. (2003) Mitochondrial biogenesis in mammals: the role of endogenous
nitric oxide. Science. 299: 896-899.
Noble MA, Munro AW, Rivers SL, Robledo L, Daff SN, Yellowlees LJ, Shimizu T, Sagami I,
Guillemette JG, Chapman SK. (1999) Potentiometric analysis of the flavin cofactors of neuronal
nitric oxide synthase.Biochemistry. 38: 16413–16418.
Ogawa T, Miura T, Kazuaki S, Iimura OJ. (1996) Activation of adenosine receptors before ischemia
enhances tolerance against myocardial stunning in the rabbit heart. J. Am. Coll. Cardiol. 27: 225-
233.
Okado-Matsumoto A, Fridovich I. (2001) Subcellular distribution of superoxide dismutases (SOD) in
rat liver: Cu,Zn-SOD in mitochondria. J. Biol. Chem. 276: 38388-38393.
Oliver CN, Ahn BW, Moerman EJ, Goldstain S, Stadtamn ER. (1987) Age related changes in
oxidation proteins. J. Biol. Chem. 262: 5488-5491.
Olivetti G, Carpasso J, Meggs L, Sonnenblick E, Anversa P. (1991) Cellular basis of chronic
ventricular remodeling after myocardial infarction in rats. Circulation. 68: 856-869.
Onhishi ST, Onhishi T, Muranaka S, Fujita H, Kimura H, Uemura K, Yoshida K, Utsumi K (2005) A
possible site of superoxide generation in the complex I segment of rat heart mitochondria. J.
Bioenerg. Biomembr. 37: 1-15.

216
Bibliografía

Onhishi ST, Shinzawa-Itoh K, Ohta K, Yoshikawa S, Onhishi T. (2010) New insights into the
superoxide generation sites in bovine heart NADH-ubiquinone onidoreductase (Complex I): The
significance of protein-associated ubiquinone and the dynamic shifting of generation sites between
semiflavin and semiquinone readicals. Biochim. Biophys. Acta. 1797: 1901-1909.
Opie L. (1996) The multifarious spectrum of ischemic left ventricular dysfunction: relevance of new
ischemic syndromes. J Mol Cell Cardiol 28: 2403-2414.
Opie LH. (1991) The Heart: Physiology and Metabolism, Raven Press, NY
Ou LC, Tenney SM. (1970). Properties of mitochondria from heart of cattle acclimatized to high
altitude. Respir Physiol. 8: 151-159.
Pacher P, Beckman JS, Liaudet L. (2007) Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease.
Physiol. Rev. 87: 315-424.
Pacher P, Szabó C. (2006) Role of peroxinitrite in the pathogenesis of cardiovascular
complications of diabetes. Curr. Opin. Pharmacol. 136-141.
Palade GE. (1956) Electron microscopy of mitochondria and other cytoplasmic structures. En:
“Enzymes: units of biological structure and function” (Ed. Gaebler OH) Academic Press Inc., New
York, USA. Pp: 185.
Palmer RM, Ashton DS, Moncada S. (1988) Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from
L-arginine. Nature. 333: 664-666.
PaolocciN, Ekelund UE, Isoda T, Ozaki M, Vandegaer K, Georgakopoulos D, Harrison RW, Kass
DA, Hare JM.(2000) cGMP-independent inotropic effects of nitric oxide and peroxinitrite donors:
potential role of nitrosilation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 279: H1982-H1988.
Paolucci C, Rovere P, De Nadai C, Manfredi AA, Clementi E. (2000) Nitric oxide inhibits the tumor
necrosis factor alpha -regulated endocytosis of human dendritic cells in a cyclic GMP-dependent
way. J Biol Chem. 275: 19638-19644.
Paradies G, Petrosillo G, Pistolese M, Di Venosa, N, Federici A, Ruggiero FM. (2004) Decrease in
Mitochondrial Complex I Activity in Ischemic/Reperfused Rat Heart: Involvement of Reactive
Oxygen Species and Cardiolipin. Circ. Res. 94: 53-59.
Parihar MS, Nazarewicz RR, Kincaid E, Bringold U, Ghafourifar P. (2008b). Association of
mitochondrial nitric oxide synthase activity with respiratorty chain complex I. Biochem. Biophys.
Res. Commun. 366: 23-28.
Parihar MS, Parihar A, Villamena FA, Vaccaro PS, Ghafourifar P. (2008a) Inactivation of
mitochondrial respiratory chain complex I leads mitochondrial nitric oxide synthase to become pro-
oxidative. Biochem. Biophys. Res. Commun. 367: 761–767.
Pauling L. (1940) En “Nature of the chemical bond”. Cornell University Press, Ithaca, New York,
USA.
Perrotta C, Falcone S, Capobianco A, Camporeale A, Sciorati C, De Palma C, Pisconti A, Rovere-
Querini P, Bellone M, Manfredi AA, Clementi E. (2004). Nitric oxide confers therapeutic activity to
dendritic cells in a mouse model of melanoma. Cancer Res. 64: 3767-3771.
Persichini T, Mazzone V, Polticelli F, Moreno S, Venturini G, Clementi E, Colasanti M. (2005)
Mitochondrial type I nitric oxide synthase physically interacts with cytochrome c oxidase. Neurosci.
Lett. 384 254–259.
Petit JM, Maftah A, Ratinaud MH, Julien R. (1992) 10-N-nonyl acridine orange interacts with
cardiolipin and allows the quantification of this phospholipid in isolated mitochondria. Eur. J.
Biochem. 209: 267-273.
Petrosillo G, Ruggiero FM, Di Venosa N, Paradies G. (2003) Decreased complex III activity in
mitochondria isolated from rat heart subjected to ischemia and reperfusion: role of reactive oxygen
species and cardiolipin. The FASEB journal: official publication of the Federation of American
Societies for Experimental Biology. 17: 714-716.

Pierce GN, Dhalla NS. (1985) Heart mitochondrial function in chronic experimental diabetes in rats.

217
Bibliografía

The Canadian Journal of Cardiology. 1: 48–54.

Poderoso JJ, Carreras MC, Lisdero C, Riobó N, Schöpfer F, Boveris A. (1996) Nitric oxide inhibits
electron transfer and increases superoxide radical production in rat heart mitochondria and
submitochondrial particles. Arch. Biochem. Biophys. 328: 85-92.
Poderoso JJ, Carreras MC, Schöpfer F, Lisdero C, Riobó N, Giulivi C, Boveris AD, Boveris A,
Cadenas E. (1999) The reaction of nitric oxide with ubiquinol: kinetic properties and biological
significance. Free Rad. Biol. Med. 26: 925-935.
Poderoso JJ, Fernandez S, Carreras MC, Tchercanski D, Acevedo C, Rubio M, Peralta J, Boveris
A. (1994) Liver oxygen uptake dependence and mitochondrial function in septic rats. Circ Shock
44: 175-182
Poderoso JJ, Lisdero C, Schöpfer F, Riobó N, Carreras MC, Cadenas E, Boveris A. (1999b) The
regulation of mitochondrial oxygen uptake by redox reactions involving nitric oxide and ubiquinol. J.
Biol. Chem. 274: 37709-37716.
Poderoso JJ, Peralta JG, Lisdero C, Carreras MC, Radisic M, Schöpfer F, Cadenas E, Boveris A.
(1998) Nitric oxide regulates oxygen uptake and hydrogen peroxide release by the isolated beating
rat heart. Am. J. Physiol. 274 (Cell Physiol. 43): C112-C119.
Prast H, Philippu A. (2001) Nitric oxide as modulator of neuronal function. Prog Neurobiol. 64: 51-
68.
Pryde KR, Hirst J. (2011) Superoxide is produced by the reduced flavin in mitochondrial complex I:
a single, unified mechanism that applies during both forward and reverse electron transfer. J Biol
Chem. 286: 18056–18065.
Pryor WA. (1976) The role of free radical reactions in biological systems. En "Free Radicals in
Biology" Vol. I (Ed. Pryor WA). Academic Press, New York, USA. Pp: 1-49.
Puigserver P, Spiegelman BM, (2003) Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma
coactivator 1 alpha (PGC-1 alpha): transcriptional coactivator and metabolic regulator. Endocr.
Rev. 24: 78-90.
Puigserver P, Wu Z, Park CW, Graves R, Wright M, Spiegelman BM. (1998) A cold-inducible
coactivator of nuclear receptors linked to adaptive thermogenesis. Cell 92: 829-839.
Pullman ME, Penefsky H, Racker E. (1958) A soluble protein fraction required for coupling
phosphorylation to oxidation in submitochondrial fragments of beef heart mitochondria. Arch
Biochem. Biophys. 76: 227-230.
Radi R, Cassina A, Hodara R, Quijano C, Castro L. (2002) Peroxynitrite reactions and formation in
mitochondria. Free Radic. Bio.l Med. 33: 1451-1464.
Radi R, Denicola A, Alvarez B, Ferrer-Sueta G, Rubbo H. (2000) The biological chemistry of
peroxynitrite. En “Nitric Oxide, Biology and Pathobiology” (Ed. Ignarro LJ). Academic Press, San
Diego, California, USA. Pp: 57-82.
Radi R, Turrens JF, Chang LY, Bush KM, Crapo JD, Freeman BA. (1991) Detection of catalase in
rat heart mitochondria. J. Biol. Chem. 266: 22028-22034.
Ragan CI, Heron C. (1978) The interaction between mitochondrial NADH-ubiquinone
oxidoreductase and ubiquinol-cytochrome c oxidorreductasa. Biochem. J. 174: 783-790.
Reifschneider NH, Goto S, Nakamoto H, Takahashi R, Sugawa M, Dencher NA, Krause F. (2006)
Defining the mitochondrial proteome from five rat organs in a physiologically significant context
using 2D Blue-Native/SDS-PAGE. J. Proteome Res. 5: 1117-1132.
Reimer KA, Jennings RB. (1986) Myocardial ischemia, hypoxia and infarction. In The Heart and
Circulatory System (Ed: Fozzard HA, Haber E, Jennings RB, Katz AM y Morgan HE), Raven Press,
NY. Pp. 1133–1201
Rich PR. (1984) Electron and proton transfer trough quinones and cytochrome bc complex.
Biochem. Biophys. Acta. 1364: 271-286.
Riobó NA, Clementi E, Melani M, Boveris A, Cadenas E, Moncada S, Poderoso JJ. (2001), Nitric

218
Bibliografía

oxide inhibits mitochondrial NADH:ubiquinone reductase activity through peroxynitrite formation.

Biochem. J. 359: 139–145.
Roede JR, Go YM, and Jones DP. (2012) Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics.
Methods Mol. Biol. 810: 249– 280.
Rolo A, Palmeira C. (2006) Diabetes and mitochondrial function: Role of hiperglycemia and
oxidative stress. Toxicol. and Applied pharmacol. 212: 167-178.
Rourke B. (2004). Evidence of mitochondrial K+ channels and their role in cardioprotection. Circ.
Res. 94: 420-432.
Rubler S, Dlugash J, Yuceoglu YZ, Kumral T, Branwood AW, Grishman A. (1972) New type of
cardiomyopathy associated with diabetic glomerulosclerosis. Am. J. Cardiol. 30: 595-602.
Russell LK, Mansfield CM, Lehman JJ, Kovacs A, Courtois M, Saffitz JE, Medeiros DM, Valencik
ML, McDonald JA, Kelly DP. (2004) Cardiac-specific induction of the transcriptional coactivator
peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1alpha promotes mitochondrial
biogenesis and reversible cardiomyopathy in a developmental stage-dependent manner. Circ Res.
94:525-533.
Salin ML, Day ED, Jr., Crapo JD. (1978) Isolation and characterization of a manganese-containing
superoxide dismutase from rat liver. Arch. Biochem. Biophys. 187: 223-228.
Sayre LM, Perry G, Smith MA. (1999) In situ methods for detection and localization of markers of
oxidative stress: application in neurodegenerative disorders. Methods Enzymol. 309: 133-152.
Sazanov LA, Walker JE. (2000) Cryo-electron crystallography of two sub-complexes of bovine
complex I reveals the relationship between the membrane and peripheral arms. J Mol. Biol. 302:
455-464.
Schäfer E, Seelert H, Reifschneider NH, Krause F, Dencher NA, Vonck J. (2006) Architecture of
active mammalian respiratory chain supercomplexes. J. Biol. Chem. 281: 15370-15375.
Schapira AH, Cooper JM, Dexter D, Clark JB, Jenner P, Marsden CD. (1990) Mitochondrial
complex I deficiency in Parkinson´s disease. J. Neurochem. 54: 823-827.
Schapira AH, Mann VM, Cooper JM, Dexter D, Daniel SE, Jenner P, Clark JB, Marsden CD.
(1990b) Anatomic and disease specificity of NADH CoQ1 reductase (complex I) deficiency in
Parkinson´s disease. J. Neurochem. 55: 2142-2145.
Schapira AH. (2008b) Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Neurochem. Res.
33: 2502-2509.
Schmith HH, Pollock JS, Nakane M, Gorsky LD, Forstermann U, Murad F. (1991) Purification of a
soluble isoform of guanylyl cylcase-activating-factor synthase. Proc. Nac. Acad. Sci. USA. 88: 365-
369.
Shägger H, de Coo R, Bauer MF, Hormann S, Godinot C, Brandt U. (2004) Significance of
respirasome for the assembly/stability of human respiratory chain complex I. J. Biol. Chem. 279:
36349-36353.
Shägger H, Pfeiffer K. (2000) Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian
mitochondria. EMBO J.19:1777-1783.
Shah AM, Spurgeon HA, Sollott SJ, Talo A, Lakatta EG. (1994) 8-bromo-cGMP reduces the
2+
myofilament response to Ca in intact cardiac myocytes. Circ Res. 74:970-978.
Shen W, Hintze TH, Wolin MS. (1995) Nitric oxide. An important signaling mechanism between
vascular endothelium and parenchymal cells in the regulation of oxygen consumption. Circulation
92: 3505-3512.
Shen X, Zheng S, Metreveli NS, Epstein PN. (2006) Protection of Cardiac Mitochondria by
Overexpression of MnSOD Reduces Diabetic Cardiomyopathy. Diabetes.798-805
Shiva S, Oh JY, Landar AL, Ulasova E, Venkatraman A, Bailey SM, Darley-Usmar VM. (2005).
Nitroxia: the pathological consequence of dysfunction in the nitric oxide-cytochrome c oxidase
signaling pathway. Free Radic. Biol. Med. 38: 297-306.

219
Bibliografía

Sicari R, Nihoyannopoulos P, Evangelista A, Kasprzak J, Lancellotti P, Poldermans D, Voigt JU,

Zamorano JL. (2008) Stress echocardiography expert consensus statement: European Association
of Echocardiography (EAE) (a registered branch of the ESC). Eur J Echocardiogr. 9:415-437.
Sies H, Jones D. (2007) Oxidative stress, Segunda edición, En: G. Fink (Ed.), Encyclopedia of
Stress, 3, Elsevier, Amsterdam. 45–48.
Sies H. (1985) En “Oxidative Stress” (Ed. Sies H). Academic Press, London. Pp: 1-8.
Sjostrand FS. (1955) The ultrastructure of mitochondria; the ultrastructure of the ground substance
of the cytoplasm. En: “Fine Structure of Cells” Inerscience Publishers Inc., New York. Pp: 16-222.
Smith JM, Paulson DJ, Romano FD. (1997) Inhibition of Nitric Oxide Synthase by L-NAME
improves ventricular performance in STZ-diabetic rats. J. Mol Cell Cardiol. 29 2393-2404.
Solaini G, Harris DA. (2005) Biochemical dysfunction in heart mitochondria exposed to ischaemia
and reperfusion Biochem. J. 390: 377-394.
Stamler JS, Meissner G. (2001) Physiology of nitric oxide in skeletal muscle. Physiol Rev. 81:209-
237
Starkov AA, Fiskum G. (2003) Regulation of brain mitochondrial H2O2 production by membrane
potential and NAD(P)H redox state. J. Neurochem. 86: 1101-1107.
Stoppani AOM, Boveris A. (1983a) Fosforilación oxidativa. En: "Bioquímica General" (Ed. Torres,
Carminatti y Cardini), El Ateneo, Pedro García S.A. Buenos Aires, Argentina Pp: 474-493.
Stoppani AOM, Boveris A. (1983b) La mitocondria y la estructura de la cadena de transporte de
electrones. En: "Bioquímica General" (Ed. Torres, Carminatti y Cardini), El Ateneo, Pedro García
S.A. Buenos Aires, Argentina Pp: 453-473.
St-Pierre J, Buckingham JA, Roebuck SJ, Brand MD. (2002) Topology of superoxide production
from different sites in the mitochondrial electron transport chain. J Biol Chem. 277:44784–44790.
Stroh A, Anderca O, Pfeiffer K, Yagi T, Finel B, Ludwing B, Schägger H. (2004) Assembly of
respiratory complexes I, III, and IV into NADH oxidase supercomplex stabilizes complex I in
Paracoccus denitrificans. J. Biol. Chem. 279: 5000-5007.
Stuehr DJ, Griffith OW. (1992) Mammalian nitric oxide synthases. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol.
Biol. 65: 287-346.
Sun KT, Yeatman LA, Buxton DB, Chen K, Johnson JA, Huang SC, Kofoed KF, Weismueller S,
Czernin J, Phelps ME, Schelbert HR. (1998). Simultaneous measurement of myocardial oxygen
consumption and blood flow using [1-carbon-11]acetate. J Nucl Med. 39: 2722-80.
Takehara Y, Nakahara H, Inai Y, Yabuki M, Hamazaki K, Yoshioka T, Inoue M, Horton AA, Utsumi
K. (1996) Oxygen-dependent reversible inhibition of mitochondrial respiration by nitric oxide. Cell
Struct. Funct. 21: 251-258.
Tao S, McKenna TM. (1994) In vitro endotoxin exposure induces contractile dysfunction in adult rat
cardiac myocytes. Am J Physiol. 267: H1745-52.
Tatoyan A, Giulivi C. (1998) Purification and characterization of a nitric-oxide synthase from rat
liver mitochondria.J. Biol. Chem. 273: 11044–11048.
Tomita M, Mukae S, Geshi E, Umetsu K, Nakatani M, Katagiri T. (1996) Mitochondrial respiratory
impairment in Streptozotocin-induced diabetic rat heart. Jpn Circ. J. 60: 673-682.
Traaseth N, Elfering S, Solien J, Haynes V, Giulivi C. (2004) Role of calcium signaling in the
activation of mitochondrial nitric oxide synthase and citric acid cycle. Biochim. Biophys. Acta. 1658:
64-71.
Treberg JR, Quinlan CL, Brand MD. (2011) Evidence for two sites of superoxide production by
mitochondrial NADH-ubiquinone oxidoreductase (complex I). J. Biol. Chem. 286: 27103-27110.
Tsukihara T, Aoyama H, Yamashita E, Tomizaki T, Yamaguchi H, Shinzawa-Itoh K, Nakashima R,
Yaono R, Yoshikawa S. (1996). The whole structure of the 13-subunit oxidized cytochrome c
oxidase at 2.8 A. Science 272: 1136-1144.

220
Bibliografía

Turrens JF, Boveris A. (1980) Generation of superoxide anion by the NADH dehydrogenase of
bovine heart mitochondria. Biochem J. 191: 421-427.
Turrens JF. (2003) Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J. Physiol. 552: 335-344.
Tzagoloff A. (1982) Mitochondria (Ed. Tzagoloff A), Plenum Press, New York, USA.
Uppu RM, Squadrito GL, Cueto R, Pryor WA. (1996) Selecting the most appropriate síntesis of
peroxynitrite. Meth. Enzymol. 269: 285-295.
Valdez LB, Alvarez S, Arnaiz SL, Schöpfer F, Carreras MC, Poderoso JJ, Boveris A. (2000).
Reactions of peroxynitrite in the mitochondrial matrix. Free Radic Biol Med. 29:349-356.
Valdez LB, Bandez MJ, Navarro A, Boveris A. (2011b) Brain mitochondrial dysfunction and
complex I syndrome in Parkinson’s disease. En: Etiol. Pathophysiol. Park. Dis., InTech, Croatia.
Pp. 317–328.
Valdez LB, Boveris A. (2001) Nitric oxide and superoxide radical production by human
mononuclear leukocytes. Antioxid Redox Signal. 3: 505-513.
Valdez LB, Boveris A. (2007) Mitochondrial nitric oxide synthase, a voltage-dependent enzyme, is
responsible for nitric oxide diffusion to cytosol. Front Biosci. 12: 1210–1219.
Valdez LB, Zaobornyj T, Alvarez S, Bustamante J, Costa LE, Boveris A. (2004) Heart mitochondrial
nitric oxide synthase. Effects of hypoxia and aging. Mol. Aspects Med. 25: 49-59.
Valdez LB, Zaobornyj T, Bombicino S, Gonzalez G, Boveris A. (2008) Physiological regulation of
heart mitochondrial nitric oxide synthase. En: "Free Racial Pathophysiology" (Ed. Alvarez S y
Evelson P). Transword Research Network, Kerala, India Capítulo 10, Pp: 177-190.
Valdez LB, Zaobornyj T, Bombicino S, Iglesias DE, Boveris A, Donato M, D´Annunzio V, Buchholz
B, Gelpi RJ. (2011) Complex I syndrome in myocardial stunning and the effect of adenosine, Free
Radic. Biol. Med. 51: 1203–1212.
Valdez LB, Zaobornyj T, Bombicino SS, Iglesias DE, Boveris A. (2011c) Regulation of heart
mitochondrial nitric oxide synthase (mtNOS) by oxygen. En: "Mitochondrial Pathophysiology" (Ed.
S. Cadenas), Transworld Research Network, Kerala, india, Pp. 29–42.
Valdez LB, Zaobornyj T, Boveris A. (2005) Functional activity of mitochondrial nitric oxide synthase.
Methods Enzymol. 396: 444-455
Valdez LB, Zaobornyj T, Boveris A. (2006) Mitochondrial metabolic states and membrane potential
modulate mtNOS activity. Biochim. Biophys. Acta. 1757: 166–172.
Vanasco V, Cimolai MC, Evelson P, Alvarez S. (2008) The oxidative stress and the mitochondrial
dysfunction caused by endotoxemia are prevented by a-lipoic acid. Free Radical Research. 42:
815-823.
Vanasco V, Magnani ND, Cimolai MC, Valdez LB, Evelson P, Boveris A, Alvarez S. (2012)
Endotoxemia impairs heart mitochondrial function by decreasing electron transfer, ATP synthesis
and ATP content without affecting membrane potential. J Bioenerg Biomembr. 44: 243–252.
Vasileios Fotopoulos (2012) "Never say dye: New roles for an old fluorochrome" Plant
SignalBehav. 7: 342–344
Venardos KM, Zatta AJ, Marshall T, Ritchie R, Kaye DM. (2009) Reduced L-arginine transport
contributes to the pathogenesis of myocardial ischemia-reperfusion injury. J. Cell Biochem. 108:
156-168.
Vinogradov AD, Grivennikova VG (2005) Generation of superoxide-radical by the
NADH:ubiquinone oxidoreductase of heart mitochondria. Biochemistry (Mosc) 70: 120-127.
Vinogradov AD, Grivennikova VG. (2001) The mitochondrial complex I: Progress in understanding
of catalytic properties. IUBMB Life. 52: 129-134.
Vinogradov AD. (1998) Catalytic properties of the mitochondrial NADH-ubiquinone oxidoreductase
(Complex I) and the pseudo-reversible active/inactive enzyme transition. Biochim. Biophys. Acta -
Bioenerg. 1364: 169–185.

221
Bibliografía

Vittone L, Mundiña-Weilenmann C, Mattiazzi A, Cingolani HE. (1974) Phisiologic and

Pharmacologic factors that affect myocardial relaxation. J. Pharmacol Toxicol. Methods, 32: 7-18.
Vivez-Bauza C, Yang L, Manfredi G. (2007) Assay of Mitochondrial ATP Synthesis in animal cells
and tissues. En "Methods in Cell Biology: Mitochondria" (Eds. Pon LA, Schon EA), Academic
Press, San Diego, USA, Pp: 155-171.
Votyakova TV, Reynolds IJ (2001) DeltaPsi(m)-Dependent and -independent production of reactive
oxygen species by rat brain mitochondria. J. Neurochem. 79: 266-277.
Wahler GM, Dollinger SJ. (1995) Nitric oxide donor SIN-1 inhibits mammalian cardiac calcium
current through cGMP-dependent protein kinase. Am J Physiol. 268: C45-C54.
Walker JE, Arizmendi JM, Dupuis A, Fearnley IM, Finel M, Medd SM, Pilkington SJ, Runswick MJ,
Skehel JM. (1992) Sequences of 20 subunits of NADH:ubiquinoneoxidoreductase from bovine
heart mitochondria. Application of a novel strategy for sequencing proteins using the polymerase
chain reaction, J. Mol. Biol. 226: 1051-1072.
Walker JE, Collinson IR, Van Raaij MJ, Runswick MJ. (1995) Structural analysis of ATP synthase
from bovine heart mitochondria. Meth Enzymol 260: 163-190.
Walker JE. (1992) The NADH:ubiquinoneoxidoreductase (complex I) of respiratory chains. Q Rev.
Biophys. 25: 253-324.
Watabe S, Hiroi T, Yamamoto Y, Fujioka Y, Hasegawa H, Yago N, Takahashi SY. (1997) SP-22 is
a thioredoxin-dependent peroxide reductase in mitochondria. Eur. J. Biochem. 249: 52-60.
Weibel ER, Stäubli W, Gnägi HR, Hess FA. (1969) Correlated morphometric and biochemical
studies on the liver cell. I. Morphometric Model, Stereologic Methods, and Normal Morphometric
Data for Rat Liver. J. Cell. Biol. 42: 68-91.
Weisiger RA, Fridovich I. (1973) Superoxide Dismutase Organelle specificity. J. Biol. Chem. 248:
3582-3592.
Weiss JN, Korge P, Honda HM, Png P. (2003) Role of the mitochondrial permeability transition in
myocardial disease. Circ. Res. 93: 292-301.
Welter R, Yu L, Yu CA. (1996) The effect of NO on electron transport complexes. Arch Biophys.
Biochem. 331: 9-14.
White R, Crow J, Spear N, Thomas S, Patel R, Green I, Beckman J, darley-Usmar V. (1998)
Making and working with peroxynitrite. En “Methods in Molecular Biology” Vol. 100: Nitric oxide
protocols (Ed. Titheradge MA.). Humana Press Inc., Totowa, New Jersey, USA. Pp: 215-230.
Wibom R, Hagenfeldt L, Von Döbeln U. (2002) Measurement of ATP production and respiratory
chain enzyme activities in mitochondria isolated from small muscle biopsy samples. Annals
Biochem. 311: 139-51.
Wilson DF, Stubbs M, Veech RL, Erecińska M, Krebs HA. (1974) Equilibrium relations between the
oxidation-reduction reactions and the adenosine triphosphate synthesis in suspensions of isolated
liver cells. Biochem J. 140: 57-64.
Wink DA, Mitchell JB. (1998) Chemical biology of nitric oxide: insights into regulatory, cytotoxic,
and cytoprotective mechanisms of nitric oxide. Free Rad. Biol. Med. 25: 434-456.
Wise DL, Houghton G. (1968) Difussion of nitric oxide. Chem. Eng. Sci. 26:453–460.
Wu Z, Puigserver P, Andersson U, Zhang C, Adelmant G, Mootha V, Troy A, Cinti S, Lowell B,
Scarpulla RC, Spiegelman BM. (1999) Mechanisms controlling mitochondrial biogenesis and
respiration through the thermogenic coactivator PGC-1. Cell 98: 115-124.
Xie YW, Kaminski PM, Wolin MS. (1998) Inhibition of rat cardiac muscle contraction and
mitochondrial respiration by endogenous peroxynitrite formation during posthypoxic reoxygenation.
Circ Res. 82:891-7.
Xie YW, Wolin MS. (1996) Role of nitric oxide and its interaction with superoxide in the suppression
of cardiac muscle mitochondrial respiration. Involvement in response to hypoxia/reoxygenation.
Circulation. 94: 2580-2586.

222
Bibliografía

Yagi K. (1976) A simple fluorometric assay for lipoperoxide in blood plasma. Biochem. Med. 15:
212-216.
Yamamoto T, Maruyama W, Kato Y, Yi H, Shamoto-Nagai M, Tanaka M, Sato Y, Naoi M. (2002).
Selective nitration of mitochondrial complex I by peroxynitrite: involvement in mitochondria
dysfunction and cell death of dopaminergic SH-SY5Y cells. J Neural Transm. 109:1-13.
Yin F, Boveris A, Cadenas E. (2014)Mitochondrial Energy Metabolism and Redox Signaling in
Brain Aging and Neurodegeneration. Antiox. & Redox Sign. 20: 353-371.
Yonetani T, Ray GS. (1965) Studies on Cytochrome Oxidase. VI. Kinetics of the aerobic oxidation
of ferrocytochrome c by cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 240: 3392-3398.
Yu Z, Quamme GA, McNeill JH. (1994) Depressed [Ca2]i responses to isoproterenol and cAMP in
isolated cardiomyocytes from experimental diabetic rats. Am. J. Physiol. 266: H2334-H2342.
Zaobornyj T, Gafourifar P. (2012) Strategic localization of heart mitochondrial NOS: a review of the
evidence. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303:H1283-H1293.
Zaobornyj T, Valdez LB, Iglesias DE, Gasco M, Gonzales GF, Boveris A. (2009) Mitochondrial
nitric oxide metabolism during rat heart adaptation to high altitude: effect of sildenafil, L-NAME, and
L-arginine treatments. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 296: H1741-1747.
Zaobornyj T, Valdez LB, La Padula P, Costa LE, Boveris A. (2005) Effect of sustained hypobaric
hypoxia during maturation and aging on rat myocardium. II. mtNOS activity. J. Appl. Physiol. 98:
2370-2375.
Zaobornyj T. (2007) Aspectos regulatorios de la óxido nítrico sintasa mitocondrial. Tesis de
Doctorado de la Universidad de Buenos Aires - Facultad de Farmacia y Bioquímica.
Zenebe WJ, Nazarewicz RR, Parihar MS, Ghafourifar P. (2007). Hypoxia/Reoxygenation of
Isolated Rat Heart Mitochondria Causes Cytochrome c Release and Oxidative Stress; Evidence for
Involvement of Mitochondrial Nitric Oxide Synthase. J. Mol. Cell Cardiol. 43: 411-419.
Zhang M, Mileykovskaya E, Dowhan W. (2002) Gluing the respiratory chain together: Cardiolipin is
required for supercomplex formation in the inner mitochondrial membrane. J. Biol. Chem. 277:
43553-43556.

223
Resumen
Resumen

RESUMEN

El corazón, para poder suplir la demanda metabólica y contráctil, depende de las

concentraciones de O2 y ATP. Las mitocondrias son las organelas encargadas de
producir ATP y son los sitios subcelulares más activos en cuanto a la producción de
especies reactivas derivadas del oxígeno (O2- y H2O2) y del nitrógeno (NO y ONOO-). Por
lo cual, alteraciones en su función pueden llevar a la disfunción bioenergética del corazón
y falla cardiaca. El complejo I es el primer complejo multienzimático de la cadena
respiratoria, con un papel central en la producción de energía celular, siendo, a su vez,
uno de los sitios de generación de O2-. El NO es generado por la óxido nítrico sintasa
mitocondrial (mtNOS), localizada en la membrana interna mitocondrial, cuya actividad y/o
expresión es regulada en situaciones fisiológicas, patológicas y farmacológicas. El NO
modula la función y el metabolismo energético ya que inhibe la actividad de citocromo
oxidasa y la transferencia de electrones entre los citocromos b y c, impactando, de esta
forma, en las concentraciones en estado estacionario del propio NO y de otras especies
reactivas, tales como O2-, H2O2 y ONOO-.

La hipótesis de trabajo sostiene que la mtNOS interacciona física y funcionalmente

con subunidades del complejo I mitocondrial, explicando otro de los mecanismos
reguladores del NO sobre la cadena respiratoria en situaciones fisiológicas, y la
disfunción del complejo I asociada a cambios en la producción mitocondrial de NO,
observada en situaciones fisiopatológicas.

El objetivo fue estudiar la relación funcional entre el complejo I y la mtNOS, en

situaciones fisiológicas y patológicas, desde un aspecto bioenergético y haciendo
hincapié en el metabolismo de especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno, en
mitocondrias de corazón. Se abordó el estudio desde un punto de vista fisiológico
(capítulo I) y a través de dos modelos experimentales, que simulan situaciones
fisiopatológicas de estrés oxidativo: atontamiento miocárdico (capítulo II) y diabetes
(capítulo III).

En el capítulo I se analizó la interacción funcional entre la mtNOS y las proteínas

del complejo I utilizando partículas fosforilantes invertidas (ETPH). Se observó que dichas
partículas producen NO, utilizando tanto los electrones cedidos por el sustrato fisiológico
de las NOS, el NADPH, como los electrones provenientes de la cadena respiratoria
funcionando en condiciones de flujo reverso. Tanto la actividad NAD+ reductasa como la
producción de NO en condiciones de flujo reverso, se inhibieron por el agregado de

224
Resumen

rotenona. Adicionalmente, la actividad de mtNOS fue detectada en la fracción

mitocondrial enriquecida en complejo I, la cual fue reconocida por anticuerpos anti-nNOS.
Estos resultados avalan que la mtNOS y proteínas del complejo I estarían contiguas,
interaccionando funcionalmente, permitiendo a la mtNOS aceptar electrones provenientes
de la cadena respiratoria para su actividad enzimática.

En el capítulo II se estudió la funcionalidad mitocondrial en un modelo de

atontamiento miocárdico. La disfunción ventricular se acompañó de disfunción
mitocondrial, caracterizada por disminución del consumo de O2 en estado 3 sustentado
por malato-glutamato y de las actividades de complejo I y de mtNOS; y por aumento en la
generación de H2O2, en la oxidación a proteínas y lípidos y en la nitración de tirosinas.
Los cambios en la función mitocondrial son compatibles con los descriptos para el
“síndrome del complejo I”, situación previamente observada en mitocondrias de áreas
cerebrales en enfermedades neurodegenerativas. Cabe mencionar que la actividad del
complejo I y las actividades bioquímica y funcional de mtNOS disminuyeron en forma
conjunta y progresiva, alcanzando un máximo de reducción a los 30 min de reperfusión.
Estos resultados refuerzan la idea de la interacción estructural y funcional entre el
complejo I y la mtNOS, así como de la co-localización en la producción de O2- y NO,
generando ONOO-, llevando a modificaciones reversibles o irreversibles de dicho
complejo. Por otro lado, la administración de adenosina revirtió las alteraciones
ventriculares y mitocondriales observadas en el atontamiento miocárdico, preservando a
las mitocondrias de la aparición del “síndrome del complejo I”.

En el capítulo III se evaluó la funcionalidad y biogénesis mitocondrial cardiaca en

diabetes inducida por estreptozotocina. En los corazones de los animales diabéticos se
observó disfunción en la reserva contráctil y lusitrópica ante una sobrecarga de trabajo,
acompañada de una disminución en el consumo de O2 tisular y mitocondrial, en las
actividades de los complejos mitocondriales, en la producción de ATP, y en la eficiencia
de la fosforilación oxidativa; así como de un aumento en la generación de H2O2 y NO.
Asimismo, se evidenció incremento en la masa mitocondrial, en la densidad numérica y
volumétrica y en la expresión del factor PCG-1α, junto con la presencia de daño
mitocondrial.

Una diferencia a enfatizar entre el modelo de atontamiento miocárdico y el de

diabetes es que aunque en ambos se observó disfunción mitocondrial, en el primero, la
disfunción mitocondrial fue acompañada de una reducción en la actividad de mtNOS y en
el estado estacionario de NO, mientras que en el segundo, la disfunción mitocondrial
conlleva a un aumento en la producción y estado estacionario de NO, con incrementada
expresión de mtNOS. Esto explicaría que en el atontamiento miocárdico, en donde la

225
Resumen

disfunción ventricular revierte, el NO podría estar ejerciendo su función regulatoria sobre

la cadena de transferencia de electrones, a través de una menor inhibición sobre la
citocromo oxidasa, de modo de restaurar el balance redox y energético mitocondrial. Por
el contrario, en el modelo de diabetes, el aumento en la generación de NO mitocondrial y
su difusión al citosol, sería la señal “distintiva” que activaría al factor PGC-1 y
desencadenaría la biogénesis mitocondrial. Ante la persistencia de la hiperglucemia, las
nuevas mitocondrias generadas no serían funcionalmente activas, pudiendo explicar el
daño en el metabolismo energético cardíaco observado en la Diabetes.

Para concluir, perturbaciones del estado redox y energético mitocondrial pueden

transmitirse al núcleo y/o al citosol e inducir una respuesta compensatoria inmediata o
adaptativa. En este proceso, modificaciones en la producción y/o estado estacionario de
los segundos mensajeros H2O2 y/o NO, serían parte del mecanismo bioquímico
subyacente a enfermedades cardiovasculares asociadas a fallas energéticas cardíacas.
En este contexto, la asociación funcional entre el complejo I y la mtNOS podría explicar el
papel del NO y/o ONOO- en la regulación fisiológica de la cadena respiratoria, y en la
inactivación irreversible del complejo I en situaciones fisiopatológicas.

226