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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO


FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
ESCUELA DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

A
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“IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LAS

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SAPONINAS CONTENIDAS EN EL FRUTO DE LA ESPECIE

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BI
Cucumis dipsaceus POR CROMATOGRAFÍA DE
Y
IA

LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)”


AC
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PROYECTO DE INVESTIGACIÓN TIPO II


INFORME PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE
DE

BACHILLER EN FARMACIA Y BIOQUÍMICA


CA
TE

ASESOR
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BI

M.Sc .Q.F. Miranda Leyva, Segundo Manuel

AUTORES

Paredes Mariños, Hugo Fernando.


Solar Armas, Mary Ann.

TRUJILLO – PERÚ
2007

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DEDICATORIA

A DIOS MI GUÍA ESPIRITUAL Y


A LA VIRGEN DE LA PUERTA MÍ
PROTECTORA, QUIENES SIEMPRE HAN
ESTADO CONMIGO ILUMINANDO MIS ACTOS
PARA SER UNA MEJOR PERSONA, HIJA, HERMANA Y AMIGA
MARY ANN.

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Y
A MIS PADRES EDGARDO Y SABINA FUENTE DE
IA

MI INSPIRACIÓN ETERNA DE SUPERACIÓN, CARIÑO, FE


AC

CRISTIANA Y UNIDAD FAMILIAR.


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MARY ANN.
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UN PROFUNDO AGRADECIMIENTO A MI
HERMANA CATHERINE QUE SIEMPRE
ME APOYÓ Y MOTIVÓ A NO
DESFALLECER Y SEGUIR

MARY ANN.
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MI ETERNO AGRADECIMIENTO
A LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE
TRUJILLO POR APOYAR MI SUPERACIÓN
PROFESIONAL Y A TODOS LOS PROFESORES
QUE EN LOS DIFERENTES CURSOS APORTARON SUS
CONOCIMIENTOS PARA MI DESARROLLO PROFESIONAL

MARY ANN.

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AL COMITÉ DE TESIS POR SU ANUENCIA Y
IA

COLABORACIÓN AL ÉXITO DE ESTE TRABAJO DE INVESTIGACIÓN.


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MARY ANN
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BI

AL DOCTOR SEGUNDO MANUEL


MIRANDA LEYVA, POR SUS SABIOS
CONSEJOS, DEDICACIÓN Y COMPRESIÓN
PARA MI PERSONA, COMO TAMBIÉN POR SU AMISTAD,
HERMANDAD Y CONFIANZA EN MI, POR SU GUÍA PROFESIONAL Y
DOCENTE.

MARY ANN
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AL PROFESOR Y AMIGO ROGER


RENGIJO PENALILLO, POR SUS CONSEJOS
Y APORTES PROFESIONALES AL DESARROLLO DEL PROYECTO.

MARY ANN
.

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AL EQUIPO DE TRABAJO DEL
LABORATORIO DE TECNOLOGÍA FARMACÉUTICA BI
Y
Y LABORATORIO MULTIFUNCIONAL POR EL APOYO BRINDADO.
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MARY ANN
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BI

A MIS COMPAÑEROS DE
CLASES, QUE CON EL INTERCAMBIO
DE CONOCIMIENTOS FORTALECIERON EN
MI LA ACTITUD POSITIVA. EN ESPECIAL A LITA,
JULISA, ANALÍ, YURI, MELVA, MILI, BERNARDO, IVÁN,
MIGUELITO, QUIENES NO SÓLO FUERON COMPAÑEROS DE
CLASES SINO ME BRINDARON SU AMISTAD EN TODO MOMENTO.

MARY ANN.

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A DIOS POR LA VIDA


QUE ME HA DADO,
A MIS PADRES:
MODESTO Y PETRONILA
POR HABERME TRAIDO AL MUNDO Y
CRIARME, Y QUE SIN LA AYUDA DE ELLOS
NO HUBIERA PODIDO LLEGAR HASTA DONDE ESTOY,
GRACIAS A ELLOS POR SU COMPRESIÓN, POR SU AMOR,
POR SUS CONSEJOS, POR TODO SU SACRIFICIO, POR DARME
UNA BUENA EDUCACIÓN, POR INCULCARME EL ESTUDIO, LOS
BUENOS VALORES Y ENSEÑARME A LUCHAR POR LO QUE QUIERO.
VA PARA USTEDES QUE SON LOS PILARES DE MI VIDA, LOS QUIERO
MUCHO VIEJITOS LINDOS.

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HUGO.

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IA

A MI HERMANO JUAN POR SER TAN COMPRENSIVO.


AC

Y PACIENTE EN ESTOS ULTIMOS DIAS DE LA CULMIMACION


RM

DEL PRESENTE TRABAJO, POR TODO LO QUE HEMOS VIVIDO


POR QUERERME TANTO COMO YO A EL, Y POR SER TAN INCONDICIONAL
FA

CONMIGO.
DE

HUGO.
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TE
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BI

A MI HERMANO RENZO QUE A LA


DISTANCIA SIEMPRE HA ESTADO CONMIGO
Y QUE CON TODAS SUS OCURRENCIAS PASAMOS UNA
LINDA NIÑEZ Y ADOLESCENCIA JUNTOS.

HUGO.

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A MIS SOBRINOS:
ALEJANDRO Y BRUNELLA
QUE SON EL FUTURO DE MI FAMILIA.
Y POR LOS NIÑOS MAS LINDOS DEL MUNDO.

HUGO.

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A LA MEMORIA DE MIS CUATRO ABUELOS:

Q
JUAN PAREDES, ELOISA POLO,

O
JUAN MARIÑOS Y DE MANERA
ESPECIAL A MI ABUELITA BI
Y
PAULA GARCÍA, QUE DIOS
IA

LOS TENGA EN LA GLORIA.


AC

HUGO.
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FA
DE
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BI

A MIS TIAS:
MARGA, NATALIA, ESPERANZA
GRACIAS POR TODOS SUS CONSEJOS,
SU AMOR Y CARIÑO, LAS QUIERO MUCHO
A MIS TIOS:
MÁXIMO, COCO, DEMETRIO, GABRIEL, LUCHO
QUE SUPIERON GUIARME POR BUEN CAMINO CON
TODOS SUS CONSEJOS, QUE SIEMPRE TENGO PRESENTE
EN CADA COSA QUE HAGO. GRACIAS MIS QUERIDOS TIOS.

HUGO

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A MIS PRIMOS:
CESAR, MILAGROS, HILDA, MARIA,
MANUEL, EDWIN POLO, POR TODAS
LAS COSAS VIVIDAS EN EL TRASCURRIR DE MI VIDA,

HUGO

A
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Q
A MIS AMIGOS:

O
BERNARDO, YURI, JULISA,
POR ESTAR CONMIGO EN LAS BI
BUENAS Y EN LAS MALAS, SIEMPRE LOS TENGO PRESENTE.
Y
A MIS AMIGOS MARIO Y JUAN CARLOS POR
IA

TODOS SUS CONSEJOS Y A TODOS MIS AMIGOS


AC

DE MI PROMOCION: IVAN, MILY, LAURA, LITA, MIGUEL,


RM

PASHIA, PATACHA, GLADYS, MELVA COMO OLVIDAR TODO LO VIVIDO


DURANTE NUSTRA ESTANCIA EN LA UNIVERSIDAD. Y A TODOS MIS
FA

AMIGOS DEL INTERNADO EN EL LAZARTE.


DE

HUGO
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BI

A LA PERSONA MÁS IMPORTANTE


EN MI VIDA, PARA TI MI SUE, GRACIAS
POR ESTAR CONMIGO, POR ACOMPAÑARME
EN LA CULMINACION DE ESTE INFORME, POR
TU COMPRESION, PACIENCIA, POR ESTAR SIEMPRE
A MI LADO Y SOBRE TOOD POR TODO EL AMOR QUE ME
TIENES, SIN TI NO HUBIERA PODIDO TERMINAR ESTE TRABAJO.
MIL GRACIAS MI PRINCESITA.

HUGO

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JURADO DICTAMINADOR

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PRESIDENTE……Mg. Jesús Gallardo Meléndez

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MIEMBRO………..Mg. Yuri Curo Vallejos
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MIEMBRO………..Mg. Manuel Miranda Leiva


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PRESENTACIÓN

Señores miembros del jurado dictaminador:

Dando cumplimiento a lo establecido por el reglamento de grados y títulos

de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo,

sometemos a vuestra consideración y elevado criterio profesional el presente

A
Informe de Investigación tipo II intitulado: “Identificación y Cuantificación de las

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M
Saponinas contenidas en el fruto de la especie Cucumis dipsaceus por

UI
Q
Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC)”.

O
BI
Y
Es propicia esta oportunidad para manifestarle nuestro más sincero
IA
AC

reconocimiento a nuestra alma mater y toda su plana docente, que con su capacidad
RM

y buena voluntad contribuyeron a nuestra formación profesional.


FA
DE

Dejamos a vuestro criterio señores miembros del jurado dictaminador la


CA

calificación del presente trabajo de investigación científica.


TE
IO
BL

Trujillo, 22 de agosto del 2007.


BI

Paredes Mariños, Hugo Fernando Solar Armas, Mary Ann

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RESUMEN

El presente trabajo consistió en identificar el tipo de saponina por


reacciones cualitativas y a la vez cuantificar la saponina de la especie Cucumis
dipsaceus “jaboncillo de campo” por cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC); para lo cual se diseñó un método de trabajo de tal manera que fue posible
alcanzar los objetivos.

En primer lugar, se extrajeron las saponinas por maceración en hexano y


luego en agua. Posteriormente se sometió a una extracción sucesiva usando

A
solventes de polaridad creciente; cloroformo, acetato de etilo y n-butanol,

IC
M
obteniéndose un producto pulverulento y blanquecino. La hidrólisis fue realizada

UI
con ácido clorhídrico concentrado. La mezcla se reflujó en baño María entre 68 –

Q
70 ºC por 20 minutos. Las sapogeninas liberadas fueron extraídas con cloroformo.

O
BI
Y
IA

Se preparó soluciones de saponinas patrones experimentales mediante las


AC

cuales se obtuvo la curva de calibración; que sirvió para cuantificar por HPLC las
RM

saponinas del Cucumis dipsaceus. El análisis cromatográfico se realizó con un


FA

Cromatógrafo HPLC HP1050 equipado con una columna Lichrospher 100 RP – 8, 5


DE

µm, 125 x 4 mm HP, con detección a 264 nm, a 2 mL/min y fase móvil metanol
grado HPLC.
CA
TE
IO

El análisis químico permite concluir que en el producto extraído y


BL

purificado de Cucumis dipsaceus existen saponinas triterpénicas pentacíclicas a la


BI

concentración del 67%. Los azúcares del hidrolizado no son glucosa ni fructosa.

Palabras claves: Cucumis dipsaceus, saponinas, sapogeninas, HPLC.

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ABSTRACT

The present work consisted of to identify the type of saponins using


qualitative reactions and at the same time to quantify the saponins from Cucumis
dipsaceus species, “soap land” by Chromatography of Liquids of High Resolution
(HPLC). In this way, we decided to adopt a new approach in order to achieve the
objectives.

First, the saponins were extracted by maceration, the first time in hexan and
the second time in water. Then it suffered consecutive extractions using increasing

A
IC
solvent polarity; chloroform, ethyl acetate and n-butanol, as a result we obtained a

M
pulverulent and off-white product. The hydrolyzes was done with hydrochlorate

UI
Q
acid. The mixture was refluxed in a Maria bath between 68-70ºC for 20 minutes.

O
The sapogenins released were extracted with chloroform.
BI
Y
IA

It was prepared solutions of experimental patron saponins by means of


AC

which the calibration curve was obtained; that it was good to quantify for HPLC the
RM

saponins of the Cucumis dipsaceus. The analysis cromatographic was carried out
FA

with a cromatographo HPLC HP1050 equipped with a column Lichrospher 100 RP


- 8, 5 µm, 125 x 4 mm HP, with detection to 264 nm, to 2 mL/min and mobile
DE

phase methanol grade HPLC.


CA
TE

The chemical analysis allows to conclude that in the extracted product and
IO

purified of Cucumis dipsaceus saponins triterpenids pentacycle exists to the


BL

concentration of 67%. The sugars of the hydrolized are not glucose and fructose
BI

neither.

Keys words: Cucumis dipsaceus, saponins, sapogenins, HPLC

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INDICE

DEDICATORIA………………………………................ i

JURADO………………………………………………. vii

PRESENTACIÓN…………………………….............. viii

RESUMEN…………………………………………..…. ix

A
ABSTRACT…………………………………………….. x

IC
M
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Q
INTRODUCCIÓN……………………………………... 1

O
MATERIAL Y MÉTODO…………………………..… 6
BI
Y
IA
AC

RESULTADOS……………………………………….. 13
RM

DISCUSIÓN…………………………………………... 16
FA
DE

CONCLUSIONES……………………………………. 20
CA

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………… 21
TE
IO

ANEXOS
BL
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I. INTRODUCCION

La especie Cucumis dipsaceus comúnmente llamado “jaboncillo de campo”

o “jaboncillo de monte”, es una especie originaria de Arabia y África tropical y

adventicia en América. Es una hierba extendida, trepadora, con flores amarillas,

frutos valvados y amarillos, cubiertos de pelos espiniformes, se desarrolla en toda la

costa peruana, donde frecuenta suelos salitrosos, húmedos, campos de cultivo,

A
bordes de acequias, campos abonados y cercos ubicados entre los 10 a 800 m.s.n.m.

IC
M
en los departamentos de La Libertad, Lambayeque, Cajamarca y Piura. Se usa para

UI
Q
lavar por su alto contenido en saponinas, estas son sustancias tensoactivas, que al

O
BI
interactuar con el agua produce fácilmente burbujas por agitación mecánica. Se les
Y
atribuye propiedades contra la caspa 1.
IA
AC

Las saponinas son compuestos naturales, metabolitos secundarios,


RM

caracterizados desde el punto de vista estructural por presentar enlaces glicosídos


FA

y/o éster entre una genina poco polar y restos glusídicos2.


DE

Desde el punto de vista de su actividad se caracterizan por formar espuma en


CA

soluciones acuosas, hecho que dio origen etimológicamente, al nombre genérico de


TE
IO

estas sustancias provenientes del latín sapon (jabón); y por hemolizar los glóbulos
BL

rojos3.
BI

Las saponinas o saponósidos, son heterósidos que se definen en función

tanto de su química como de sus propiedades físicas. Su genina es de naturaleza

esteroide (triterpénica tetracíclica) o triterpénica pentacíclica, por tanto de carácter

poco polar. Las de naturaleza esteroide más frecuentes son las derivadas del

espirostano y del furostano; mientras que, dentro de las triterpénicas pentacíclicas,

destacan las derivadas del oleanano, ursano y dammarano. Según el número de

posiciones de sustitución de los azúcares, pueden clasificarse en monodesmosídicos

MARY ANN SOLAR ARMAS 1 HUGO PAREDES MARIÑOS


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y bidesmosídicos. En las primeras una de dichas uniones a los azúcares se encuentra

en el hidroxilo del carbono 3, mientras que en las segundas, se localiza en el

carbono 16 para furostanos y en el carbono 6 ó 20 para dammaranos. Otro tipo de

unión muy característica tiene lugar sobre el carboxilo del carbono 28 mediante la

formación de ésteres de osas4, 5, 6.

La solubilidad en agua de estos compuestos está facilitada por su alto peso

molecular y la presencia de los residuos de monosacáridos y de otros grupos polares

A
en la aglicona.6, 7,8.

IC
M
Las saponinas se pueden encontrar en órganos vegetales muy diversos. Los

UI
Q
de carácter monodesmosídico se dan con preferencia en raíces, cortezas y semillas,

O
BI
mientras que los bidesmosídicos, más hidrosolubles, muestran preferencia por los
Y
tejidos de asimilación como hojas y ramas tiernas3, 6.
IA
AC

En cuanto a su distribución taxonómica, los esteroídicos se dan


RM

preferentemente en el orden Liliales (Monocotiledóneas) y los triterpénicos en


FA

muchas familias de Dicotiledóneas, como Cariophyllacea, Rosaceae, Fabaceae,


DE

Apiaceae y Astereceae, han sido tradicionalmente consideradas exentas de


CA

saponósidos, sin embargo dicho criterio se ha revelado como no estricto, debido


TE
IO

entre otros, a casos como los géneros Aster y Bellis3,6,9,11.


BL

Las saponinas son producidas por el metabolismo secundario de las plantas,


BI

las cuales son utilizadas para formar compuestos fosfolípidos usados principalmente

en la industria farmacológica, cosmética y dermatológica por su calidad

emulsionante3, 6.

Para la identificación de saponinas se han desarrollado diversos ensayos,

como el índice de hemólisis, propuesto por R. Kobert en 1912 8. En este método

una suspensión de glóbulos rojos, lavados con anticipación, se mezcla con la

saponina. Este método a pesar de ser muy utilizado, tiene la desventaja de depender

MARY ANN SOLAR ARMAS 2 HUGO PAREDES MARIÑOS


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de la naturaleza de la saponina y de la especie animal de donde se obtuvieron los

eritrocitos. Otro ensayo de uso común en la identificación de saponinas, es el

número o índice de espuma formada por una solución de saponinas mediante

agitación 8, 9, 10.

En la detección cuantitativa de saponinas, también se ha aplicado el método

denominado índice de pescado que consiste en la observación del grado de

toxicidad de las saponinas en peces11. Por último, uno de los ensayos más

A
empleados en la determinación de saponinas es la cromatografía en capa fina

IC
M
(CCF). Para la cuantificación de saponinas, se ha ideado diversos métodos, la

UI
Q
mayoría de éstos basados en reacciones colorimétricas como el propuesto por Hiai,

O
BI
quien propone el uso de vainillina y ácido sulfúrico para la generación de grupos
Y
cromóforos, con características espectrales entre de 455 a 460 nm. Sin embargo,
IA
AC

pese a que se sabe que los cromóforos producidos mediante esta reacción son
RM

característicos, éstos no se absorben a la misma longitud de onda, además hay


FA

interferencias muy marcadas, por lo que el método es poco repetible9.


DE

La cuantificación de saponinas se ha realizado por diferentes técnicas


CA

espectrofotométricas, pero la falta de estándares es una limitante. La mayoría de


TE
IO

métodos últimamente desarrollados se basan en el uso de la cromatografía de


BL

líquidos de alta resolución (HPLC), a partir de saponinas purificadas mediante


BI

largos procesos 9. La HPLC, también conocida como de alta eficiencia, ha resultado

ser la técnica más útil y, en la actualidad, la más usada para la identificación y la

determinación cuantitativa de saponinas y azúcares 8.

El presente trabajo pretende aportar más información sobre el tema a través

de la identificación y cuantificación de las saponinas del Cucumis dipsaceus

“jaboncillo de campo” por medio de un método confiable y rápido, para lo cual se

consideró su extracción, purificación, hidrólisis y cuantificación.

MARY ANN SOLAR ARMAS 3 HUGO PAREDES MARIÑOS


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El problema planteado fue ¿Será posible identificar y cuantificar las

saponinas contenidas en el fruto de la especie Cucumis dipsaceus por cromatografía

de líquidos de alta resolución (HPLC)?

La hipótesis de trabajo fue “Siendo la cromatografía de líquidos de alta

resolución (HPLC) una sofisticada técnica separativa que acoplada a sistemas de

detección de última generación, permite identificar cada una de las especies

constituyentes de una mezcla. Tal potencia analítica puede ser utilizada para

A
identificar y cuantificar los constituyentes del material saponínico extraído del fruto

IC
M
de la especie Cucumis dipsaceus.

UI
Q
Se plantearon los siguientes objetivos:

O
 BI
Extraer y purificar las saponinas de la especie Cucumis dipsaceus
Y

IA

Identificar el tipo de saponinas de la especie Cucumis dipsaceus.


AC

 Hidrolizar las saponinas de la especie Cucumis dipsaceus.


RM

 Identificar la sapogenina de las saponinas de la especie Cucumis


FA

dipsaceus.
DE

 Identificar los azúcares obtenidos por la hidrólisis de las saponinas de la


CA
TE

especie Cucumis dipsaceus.


IO

 Cuantificar las saponinas de la especie Cucumis dipsaceus


BL
BI

Para la ejecución de los objetivos, se diseñó y construyó un equipo de

fraccionamiento de espuma para mejorar la pureza y concentración de las saponinas

extraídas por maceración en agua y a temperatura ambiente; el producto se sometió

a purificación mediante sucesivas extracciones con disolventes.

MARY ANN SOLAR ARMAS 4 HUGO PAREDES MARIÑOS


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Con el producto seco se ha realizado las pruebas de identificación de

saponinas y azúcares reductores. La cromatografía de líquidos de alta resolución

(HPLC) ha permitido desarrollar un método de identificación de las saponinas,

sapogeninas y azúcares; y de cuantificación de las saponinas de Cucumis

dipsaceus.

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IA
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FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI

MARY ANN SOLAR ARMAS 5 HUGO PAREDES MARIÑOS


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II. MATERIAL Y MÉTODO

1. MATERIAL

A) MUESTRA:

Se recolectó aproximadamente 1 Kg. de frutos maduros de la especie Cucumis

dipsaceus “jaboncillo de campo” de las acequias aledañas a los sembríos de

caña de azúcar de la localidad Cartavio, departamento de La Libertad. Una vez

en el laboratorio de Análisis Instrumental, dichos frutos fueron secados a

A
temperatura ambiente hasta el momento de su muestreo.

IC
M
B) REACTIVOS:

UI
Q
 Metanol Lichroslov Grado HPLC.

O
 Agua HPLC. BI
Y
 Agua destilada y bidestilada.
IA
AC

 Hidróxido de sodio al 1% y 30%.


RM

 Hexano.
FA

 Cloroformo.
DE

 Acetato de etilo.
CA

 n - butanol.
TE
IO

 Hidróxido de potasio al 0.5%.


BL

 Acido clorhídrico 11 N.
BI

 Acetato de plomo al 30%.

 Reactivo de Lierbermann- Burchard.

 Reactivo de Rosenthaler.

MARY ANN SOLAR ARMAS 6 HUGO PAREDES MARIÑOS


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C) MATERIALES:

 Saponina Patrón Experimental

 Vasos de precipitación de 250 y 1000 mL.

 Bureta de 50 mL.

 Pipetas de 1 y 5 mL.

 Matraces Erlenmeyer de 250 mL.

 Probeta graduada de 250 mL.

A
IC
 Fiolas de 10, 25 y 100 mL.

M
UI
 Membranas filtrante GH POLYPRO, 0.45 um y 47 mm de diámetro para

Q
O
fase móvil
BI
 Filtros descartables GH POLYPRO para jeringa, 0.45 um y 13 mm de
Y
IA

diámetro para muestras.


AC
RM

D) EQUIPOS:
FA

 Cromatógrafo Líquido de Alta Resolución (HPLC). Marca: HEWLETT


DE

PACKARD. Modelo: 1050. Columna Lichrospher 100 RP – 8, 5 um, 125


CA

x 4 mm Hp. Modelo 79925 MO – 564 Hp.


TE
IO

 Balanza Analítica. Marca: METTLER TOLEDO. Modelo: AB 2004-5.


BL

Sensibilidad 0.1 mg.


BI

 Estufa. Marca: L-C OVEM. Modelo: 3511-1.

 Baño Maria. Marca: MEMMERT.

 Bomba de Vacío. Marca: VACUUBRAND. Modelo: MZ26

 pH-Metro. Marca: METTLER TOLEDO.

 Equipo Sonificador. Marca: BRANSON. Modelo: 3510.

 Equipo de fraccionamiento de espuma: El equipo estuvo conformado

por un balón Claisen por cuya boca y cuello principal se hizo ingresar un

MARY ANN SOLAR ARMAS 7 HUGO PAREDES MARIÑOS


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tubo burbujeador. Al tubo burbujeador se le unió una manguera conectada

a una bomba de aire para pecera (Junior Air Pump) de 10 x 6.5 x 4 cm.

Por otro lado, por el cuello lateral del balón se le unió una columna

adicional construida con materiales de PVC (tubos y codos de 1 y 0.5

pulgadas) para configurar una columna de 70 cm. de altura y salida

horizontal de 23 cm. (ver anexos Fig. 3)

2. MÉTODOS

A
IC
M
2.1 Extracción de saponinas por maceración:

UI
Se tomaron 4 frutos secos sin semillas de la especie Cucumis dipsaceus y

Q
O
BI
fueron pesadas en una balanza sensible al 0.01 g, se maceró en hexano por 24
Y
horas, una vez escurrido el disolvente se dejó secar por 24 horas. Finalmente,
IA
AC

se los maceró en 500 mL de agua destilada por 24 horas. El extracto se filtró


RM

por torunda de algodón, este filtrado se depositó en el balón de burbujeo del


FA

Equipo de Fraccionamiento de espuma hasta obtener una muestra de 200 mL


DE

de escurrido.
CA
TE

2.2 Aislamiento de las Saponinas:


IO

El escurrido obtenido se llevó a un embudo separador y se sometió a una


BL

extracción sucesiva con diferentes disolventes, se empleó primero 90 mL de


BI

cloroformo (se realizaron tres extracciones sucesivas de 30 mL), se separaron

las dos fases (ver anexos Fig. 5), se eliminó la fracción clorofórmica y la

fracción acuosa se sometió a una nueva extracción con 90 mL de acetato de

etilo (se realizaron tres extracciones de 30 mL cada una), de éstas, se eliminó

la fracción del acetato de etilo (ver anexos Fig. 6) y la fracción acuosa fue

sometida nuevamente a extracción con 90 mL de n-butanol (tres extracciones

de 30 mL cada una) (ver anexos Fig. 7). A continuación, la fracción

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butanólica que contiene las saponinas se llevó a estufa a 90 ºC por 48 horas

para evaporar el disolvente, se obtuvo un residuo seco. Posteriormente este

residuo seco se redisolvió con hidróxido de sodio al 1%; luego, de esta

solución se extrajo las saponinas con 90 mL n-butanol (tres extracciones de 30

mL cada una). Por último la fracción butanólica fue llevada a estufa bajo las

condiciones antes indicadas, para evaporar el disolvente. Se obtuvo así un

producto pulverulento blanquesino saponinas de aproximadamente 140 mg.

A
(ver anexos Fig. 8)

IC
M
UI
3. IDENTIFICACIÓN DE SAPONINAS

Q
O
BI
a) Prueba de identificación del núcleo esteroideo. Reacción de Lierbermann
Y
IA

Burchard: se trabajó con una pequeña porción del extracto seco de saponinas
AC

a la cual se le agregó III gotas ácido acético, luego de III gotas de anhidrico
RM

acético, y finalmente I gota de ácido sulfúrico.


FA
DE

b) Prueba de Rosenthaler: se trabajó con una cantidad pequeña del extracto


CA

seco de saponinas, que luego fue tratada con II - III gotas de una solución
TE

etanólica de vainillina al 1% y I - II gotas de ácido sulfúrico.


IO
BL

c) Cromatografía HPLC: se prepararon dos tipos de soluciones:


BI

1. Saponinas Patrón Experimental. Se pesó muestras de 5 mg, 10mg y 20

mg, y se transfirieron a fiola de 10 mL llevando a volumen con metanol, se

disolvió por agitación, de esta manera se obtuvo soluciones cuyas

concentraciones fueron 0.5, 1 y 2 mg/mL respectivamente. Estas soluciones

fueron inyectadas en el HPLC, a flujo de 2 mL/min y a una absorbancia de

264 nm., siendo la fase móvil metanol grado HPLC. De esta muestra se

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determinó los tR (tiempo de retencion) y las áreas de pico para el análisis

cuantitativo.

2. Saponinas ensayo. De las saponinas purificadas del jaboncillo de campo,

se pesó 10 mg y se transfirió a fiola de 10 mL llevando a volumen con

metanol, de esta manera obtuvimos una solución a concentración de 1

ug/mL. Luego la solución fue inyectada al HPLC en las mismas condiciones

que las saponinas patrón experimental. Se determinó los tR y áreas de pico.

A
IC
M
4. HIDRÓLISIS DE SAPONINAS

UI
Q
O
4.1 Hidrólisis con hidróxido de potasio 0.5%: De las saponinas purificadas
BI
Y
se tomaron tres porciones de 10 mg cada una y se los depositó en matraces
IA

Erlenmeyer, adicionándoles 6 ml de agua destilada. Los matraces se


AC
RM

colocaron a baño maría hasta que alcanzaron los 38 ºC, enseguida se les
FA

agregó 3 mL de hidróxido de potasio 0.5% a cada matraz, y se


DE

mantuvieron las condiciones durante 3 horas.


CA

4.2 Hidrólisis con ácido clorhídrico: De las saponinas purificadas se


TE

tomaron tres porciones de 10 mg cada una y se los depositó en matraces


IO
BL

Erlenmeyer, adicionándoles 6 ml de agua destilada. Los matraces se


BI

colocaron a baño maría hasta que alcanzaron los 70ºC, enseguida se les

agregó 3 mL de ácido clorhídrico concentrado, manteniendo a reflujo

durante 20 minutos. Se detuvo la reacción en baño de hielo y se ajustó el

pH con hidróxido de sodio al 30% a 6.5-7.2 (ver anexos Fig. 11)

4.3 Extracción de la sapogenina: Luego de ajustar el pH, se trasvasó la

muestra a una pera de decantación y se extrajeron las sapogeninas con

cloroformo (3 extracciones sucesivas). Se llevó a estufa a 60 ºC la fase

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clorofórmica hasta la evaporación del solvente, obtuviéndose un producto

seco (sapogeninas) que fue utilizado para el análisis por HPLC.

4.4 Separación de azúcares del hidrolizado. En la extracción de

sapogeninas, se separó las 3 porciones acuosas (que contienen los

azucares) en recipientes debidamente rotulados.

5. CROMATOGRAFÍA HPLC PARA SAPOGENINAS

A
De las sapogeninas extraídas se pesó una muestra de 25 mg y se trasfirió a fiola

IC
M
de 25 mL llevando a volumen con metanol. Se obtuvo una solución de 1 mg/mL

UI
Q
de concentración. Esta solución fue inyectada en el cromatógrafo HPLC a flujo

O
BI
de 2 ml/min y a una absorbancia de 264 nm, siendo la fase móvil metanol grado
Y
IA

HPLC y se determinó los tR y área pico.


AC
RM

6. CROMATOGRAFÍA HPLC PARA LOS AZÚCARES PATRONES


FA

Se pesó 10 mg de glucosa y fructosa patrones experimentales, transfiriéndose a


DE

fiolas de 10 mL y se llevó a volumen con agua bidestilada, obteniéndose


CA

soluciones de 1 ug/mL de concentración. Estas soluciones fueron inyectadas en


TE
IO

el cromatógrafo HPLC, a flujo de0.5 mL/min y a una absorbancia de190 nm,


BL

siendo la fase móvil agua bidestilada y se determinó los tR y áreas de pico.


BI

7. CROMATOGRAFÍA HPLC PARA AZÚCARES DEL HIDROLIZADO

Se transfirió 0.1 mL de hidrolizado a una fiola de 10 mL y se llevó a volumen

con agua bidestilada, luego de ésta solución se trasfirió 0.3 mL a una fiola de

10 mL llevando a volumen con agua bidestilada, se siguió el mismo

procedimiento para los otros hidrolizados, obteniéndose 3 soluciones rotuladas

como hidrolizados Nº 1, 2 y 3. Éstas soluciones fueron inyectadas al

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cromatógrafo HPLC a flujo de 0.5 mL/min, con detección a 190 nm., siendo la

fase móvil agua bidestilada y se determinó los tR y áreas de pico.

A
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
IA
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI

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II. RESULTADOS

Cuadro Nº 1: Resultados de las pruebas cualitativas. Pruebas de coloración

para la identificación de saponinas

Reacción Coloración Resultado

Liebermann- Presencia de saponinas triterpénicas


Rojo café
Burchard pentacíclicas

A
Presencia de saponinas triterpénicas

IC
Rosenthaler Violeta

M
pentacíclicas

UI
Q
O
BI
Cuadro Nº 2: Datos para la curva de calibración de las saponinas patrón
Y
IA

experimental
AC
RM

Saponina Patrón Experimental


FA

(264 nm)
DE

Area Pico
CA

mg/mL AREA PICO 1 2 3


TE
IO

0,5 30,33466667 30,7394 29,5295 30,7351


BL

1 57,01411333 57,0311 57,02724 56,984


BI

2 78,82372667 78,872 78,8156 78,78358

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80

70

60

50
AREA PICO

40 y = 26,137x + 17,211
2
R = 0,9497
30

20

10

A
IC
0

M
0 0,5 1 1,5 2 2,5

m g /m L

UI
A R E A P IC O L in eal (A R E A P IC O )

Q
O
BI
Gráfico 1. Curva de calibración para la cuantificación de saponinas triterpénicas
Y
IA

pentacíclicas.
AC

y = 26,137x + 17,211
RM

R2 = 0,9497
FA

Cuadro Nº 3: Concentración de saponinas del Cucumis dipsaceus


DE
CA

Área Pico
TE

mg/mL Área promedio 1 2 mg/mL cal


IO

1 34,359275 29,07669 39,64186 0,67


BL
BI

Cuadro Nº 4: Tiempos de retención (tR) de la saponina patrón experimental y de

saponinas del Cucumis dipsaceus

Muestra tR

Saponina patrón experimental 0,582

Saponina del Cucumis dipsaceus 0,571

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Cuadro Nº 5: Tiempo de Retención (tR) de las sapogeninas del Cucumis dipsaceus

Muestra tR (min)

1 0.570

2 0.569

3 0.565

Cuadro Nº 06: Tiempo de Retención (tR) de la muestra de azúcar patrón y de los

A
azúcares del hidrolizado de saponinas

IC
M
UI
Analito tR (min)

Q
O
Glucosa
1.110
Fructosa BI
Y
1.128
IA

Azúcares Ensayo
0.658
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI

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IV. DISCUSIÓN

Para la extracción de saponinas se maceraron los frutos usando como

disolvente al hexano, con la finalidad de eliminar material no polar soluble en el

hexano o compuestos no deseados presentes en el fruto. Posteriormente se utilizó

agua para extraer las saponinas por maceración durante 24 horas.

El extracto obtenido fue sometido a un proceso de aislamiento y purificación

mediante el empleo de disolventes orgánicos de polaridad creciente. En general, las

A
IC
saponinas son solubles en mezclas hidroalcohólicas e insolubles en disolventes

M
UI
orgánicos de mediana y baja polaridad, los cuales se suelen emplear para precipitar

Q
O
a partir de extractos complejos6. La estructura química de las saponinas presenta
BI
Y
sitios apolares o liposolubles y polares o hidrosolubles. Los primeros están dados
IA

por la estructura anillada, la cual predomina en las sapogeninas, siendo solubles en


AC
RM

solventes orgánicos como cloroformo. Las estructuras polares están determinadas


FA

por los azúcares y los grupos carboxilos e hidroxilos, las cuales están presentes en
DE

las saponinas que poseen en su estructura ácido oleanólico, conformando así estas
CA

saponinas una estructura polar intermedia.


TE
IO

La purificación de las saponinas o eliminación de materiales no saponínicos


BL

contenidas en el escurrido de espuma13, empezó con el empleo de cloroformo;


BI

luego se usó acetato de etilo. Las saponinas (o saponósidos) fueron recuperadas

desde la fase acuosa con n-butanol6. La capa butanólica, que contiene las saponinas,

se llevó a estufa a 90º C por 48 horas. El producto seco se disolvió y se eliminaron

los compuestos fenólicos mediante tratamiento con hidróxido de sodio al 1 %12. Las

saponinas se recuperaron con n-butanol y se llevó nuevamente a estufa a 90º C por

24 horas. De esta manera se obtuvo un producto pulverulento y blanquesino que

fue sometido al análisis cuali-cuantitativo.

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La identificación de las saponinas del jaboncillo de campo se realizó

mediante reacciones de coloración. La reacción de Liebermann- Burchard, la cual

se realiza generalmente en medio ácido fuerte constituido por ácido sulfúrico, ácido

acético y anhídrido acético y en ausencia de agua. La etapa inicial de la reacción

consiste en la protonación del grupo OH del C3 de la saponina obteniéndose un ión

y con la consiguiente pérdida de una molécula de agua lo que constituye el primer

paso de la reacción de color. La oxidación secuencial de este ión por el SO2-

A
produce un compuesto cromóforo con máximos de absorbancia a 620 nm. En la

IC
M
mayoría de los casos pueden observarse dos colores: azul-verdoso (para saponinas

UI
Q
esteroidales) y rojo/café (para saponinas triterpénicas pentacíclicas) 14.

O
BI
Y
La obtención de sapogeninas a partir de la hidrólisis consistió primero en
IA

realizar hidrólisis alcalina suave con KOH 0.5 %, para eliminar restos éster-
AC
RM

azucarados, si los hubiese6 .Se reflujó la mezcla en baño maría a 37º C por 3 horas.
FA

Para aislar la genina se realizó la hidrólisis ácida (ácido clorhídrico), con


DE

objeto de determinar posteriormente por Cromatografía de Líquidos de Alta


CA

Resolución (HPLC) previo ajuste de pH a 6.5-7.2 con NaOH al 30 %. Las


TE
IO

sapogeninas resultantes fueron extraídas en un embudo de separación con tres


BL

porciones de cloroformo. El residuo acuoso fue recolectado en un vaso de


BI

precipitación. Pasando los extractos clorofórmicos a otro recipiente, luego por

evaporación del cloroformo, se obtuvo las sapogeninas.

En el Cuadro Nº 1 se registra el color rojizo para la reacción de Liebermann

- Burchard y el color violeta para la reacción de Rosenthaler ambos resultados

indican la presencia de saponinas triterpénicas pentaciclicas 14,15.

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Los resultados presentados en el Cuadro Nº 2 corresponden a la curva de

calibración de las saponinas patrón realizado con el equipo HPLC 1050 para la

cuantificación de la saponina ensayo. La curva de calibración que se muestra en el

Gráfico 1. El análisis de regresión lineal permitió establecer la ecuación

experimental para la cuantificación de saponinas:

y  26,137 x  17,211

donde: x; mg/mL

A
IC
El análisis de datos del Cuadro Nº 3 indica que la concentración encontrada

M
UI
de las saponinas purificadas de Cucumis dipsaceus fue de 0.67 mg/mL.

Q
O
BI
La identificación de las saponinas ensayo mediante el cromatógrafo HPLC
Y
IA

se realizó por comparación de sus tR. Lamentablemente no nos fue posible usar un
AC

estándar comercial de saponina ya que la obtención de tal es muy difícil, por ello se
RM

trabajó con las saponinas patrón experimental (triterpénica pentacíclica) obtenidas


FA

del Laboratorio de Farmacognosia de la Facultad de Farmacia y Bioquímica;


DE

versus la saponina en estudio (Cucumis dipsaceus). En el Cuadro Nº 4 se observa


CA

que el tR de la saponina patrón experimental fue de 0,582 min. mientras que el tR de


TE
IO

la saponina de Cucumis dipsaceus fue de 0,571min, por lo que tomando como


BL

referencia estos datos podemos presumir que la estructura química de la saponina


BI

en estudio corresponde a una saponina triterpénica pentacíclica.

En el Cuadro Nº 5 se muestran los tR de las sapogeninas del Cucumis

dipsaceus en el HPLC, sin embrago no se pudo cuantificar las sapogeninas debido a

que no se contó con una muestra patrón.

En el Cuadro Nº 6 se muestra los tRs de las muestras azúcares patrones de

glucosa, fructosa y de los azúcares del hidrolizado de saponinas. Y al comparar

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estos tRs experimentalmente se demuestra que los azúcares unidos a la genina de

Cucumis dipsaceus no corresponde a la glucosa ni a la fructosa.

A
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
IA
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI

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V. CONCLUSIONES

De los ensayos realizados se concluye:

1. Mediante la metodología planteada se pudo extraer y purificar las saponinas

de la especie Cucumis dipsaceus.

2. El tipo de saponinas encontrado en la especie Cucumis dipsaceus

corresponden a la familia de las saponinas triterpénicas pentacíclicas.

A
3. Se logró separar los componentes de las saponinas del Cucumis dipsaceus

IC
M
mediante la hidrólisis de la misma, mediante el cual resulto un extracto de

UI
Q
sapogenina y un hidrolizado de azúcares.

O
BI
4. No se logró identificar por HPLC el tipo de sapogenina presentes en la
Y
IA

especie Cucumis dipsaceus.


AC

5. Se descarta la presencia de azúcares como la glucosa y fructosa, unidos a la


RM

genina de la especie Cucumis dipsaceus por ser diferentes sus tRs con los del
FA

hidrolizado de azúcares.
DE

6. La concentración de saponinas en el producto obtenido fue de 67 %.


CA
TE
IO
BL
BI

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Revisado en agosto del 2007

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A
IC
M
UI
Q
O
BI

ANEXOS
Y
IA
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI

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(a) (b)
Figura 1. Macerado en de los frutos de jaboncillo de campo a) hexano y b) agua

A
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
IA
AC
RM

Figura 2. Extracto acuoso de saponinas del jaboncillo de campo


FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI

Figura 3. Equipo de fraccionamiento de espuma

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CLOROFORMO

ACETATO DE
ETILO n-BUTANOL

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Figura 4. Reactivos utilizados en el aislamiento de las saponinas

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Q
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EXTRACTO
ACUOSO
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CLOROFORMO
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DE

Figura 5. Extracción de las saponinas con cloroformo


CA
TE
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ACETATO DE
ETILO

EXTRACTO
ACUOSO

Figura 6. Extracción de las saponinas con acetato de etilo

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EXTRACTO
ACUOSO

n-BUTANOL

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Figura 7. Extracción de las saponinas con n-butanol

Q
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IA
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RM
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Figura 8. Extracto seco de saponinas purificadas


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Figura 9. Reacción de Lierbermann – Burchard

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Figura 10. Reacción de Rosenthaler

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Figura 11. Hidrólisis de las saponinas

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Figura 14. Reporte de los tr de la saponina de la especie Cucumis dipsaceus


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Figura 15. Reporte de los tr de la sapogenina de la especie Cucumis dipsaceus

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Figura 16. Reporte de los tr de la muestra patrón de glucosa


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Figura 17. Reporte de los tr del hidrolizado de azúcares de la especie Cucumis dipsaceus

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