ESPECTROMETRÍA

BIOFÍSICA
INTRODUCCIÓN

 La fluorescencia y la
fosforescencia se parecen en
que la excitación se consigue
mediante la absorción de
fotones.
 Por lo tanto se les conoce como
fenómenos de
Fotoluminiscencia.
 En la fluorescencia no conlleva
el cambio del espín de un
electrón, por lo tanto presenta
un tiempo de vida corta (˃10-5
s).

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 En la fosforescencia las emisión de
la radiación, van a acompañados
en un cambio de espín en el
electrón.
 Origina que la radiación se
mantenga durante un tiempo
fácilmente detectable.
 Después de acabar la irradiación, a
veces segundos después.
 La radiación emitida en estos
fenómenos es de mayor longitud de
onda que la utilizada para su
excitación.
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 El tercer tipo de luminiscencia, la
quimioluminiscencia.
 Se basa en el espectro de emisión de
una especie excitada que se forma en
el curso de una reacción química.
 Son producto de la reacción entre el
analito y un reactivo adecuado
(normalmente un oxidante fuerte)
como el ozono y peróxido de
hidrógeno.
 El resultado es el espectro
característico del producto de
oxidación del analito del reactivo, en
lugar del propio analito.
 Analito efecto de la inhibición.

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Quimioluminiscencia, se basa en el espectro de emisión de una
especie excitada que se forma en el curso de una reacción química.

Esto es logrado por la acción de un oxidante fuerte (O3 o H2O2).

El analito no participa directamente en la reacción.

Pero es el que ocasiona efecto de inhibición o el efecto catalítico.

 Es una técnica muy sensible, los
limites de detección van tres
ordenes por debajo de los limites
de los encontrados en
espectroscopia de absorción.
 Una concentración de partes por
billón (μg/L).
 El número de especies
fotoluminiscentes es muy limitado.
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 El desplazamiento hacia longitudes
de onda mas larga se denomina
desplazamiento Stokes.
 Cuando uno de los electrones de
una molécula es excitado a un
estado superior se forma un estado
singulete o triplete.
 En el estado singulete el electrón
continua apareado con el electrón
del estado fundamental.
 En el triplete se desaparean.
Procesos de desactivación

 Una molécula excitada puede

regresar a su estado basal
mediante la combinación de
procesos.
 Para poder presentar un tiempo de
Relajación
fotoluminiscencia prolongado
deben de presentarse procesos de
Conversión
relajación lentos. Vibracional interna y
Cruce de
sistemas
Fosforescencia
externa
 Relajación vibracional.- La energía absorbida se pierde como consecuencia
de las colisiones de moléculas del analito y el disolvente.

 Conversión interna.- Describe el proceso intermolecular por los cuales una

molécula pasa de a un estado de baja energía sin emitir radiación.

 A veces puede ocasionar rupturas de enlaces.

 Conversión externa .- La desactivación puede ocurrir mediante la
transferencia de energía de la molécula excitada al disolvente.

 También se le conoce como amortiguación colisional.

 Cruce de sistemas.- Se invierte el espín del electrón excitado. Es común en

las átomos pesados (I, Br).
Variables que afectan la fluorescencia

 Rendimiento cuántico. Relación de

moléculas fluorescentes y las no
fluorescentes.
 Tipos de transiciones en
fluorescencia.
 Fluorescencia y estructura- Es mayor
en grupos aromáticos.
 Efecto de la rigidez estructural.
Mayor rigidez, mayor fluorescencia.
 Temperatura. Disminuye al aumentar
temperatura.
 Ph.
 Oxígeno disuelto. Reduce
fluorescencia.
Aplicaciones fluorescencia

 Técnicas analíticas mas sensibles

que hay.
 Determinación de especies
inorgánicas.
 Determinación de especies
orgánicas.
 Análisis de productos:
 Alimentarios
 Farmacéuticos
 Muestras clínicas.
 Las luciérnagas producen una
reacción química que les permite
producir luz.
 Esta ocurre por la reacción entre el
ATP, calcio y luciferina.
 En presencia de la enzima
luciferasa se produce la luz.
 Óxido nítrico.
Espectroscopia infrarrojo

 El espectro Infrarrojo va desde números de onda desde 12 800 a 10 cm-1.

 Se divide el infrarrojo en tres regiones cercano, medio y lejano.
 Tiene una longitud de onda mayor a
la visible.
 El fundamento teórico se basa en que
tras la absorción de la energía IR los
cambios producidos las moléculas,
principalmente rotacionales y
vibracionales.

 Para poder absorber el espectro IR

una molécula debe sufrir un cambio
en el momento dipolar.
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 El momento dipolar esta
determinado por las diferencias de
carga.
 Los movimientos vibracionales se
distinguen por el tipo de
desplazamiento generado en los
enlaces, conociéndose como
vibraciones de tensión o flexión.
 Las tensiones provocan un
estiramiento o estrechamiento del
enlace y las flexiones generan una
deformación del enlace (figura 1).
 Una vibración de tensión supone un
cambio continuo en la distancia de
enlace de dos átomos.
 Las vibraciones de flexión se
caracterizan por un cambio en el
ángulo de enlace.
 Todas las moléculas pueden manifestar una serie de bandas de absorción, cada banda corresponde
con un movimiento de vibración de un enlace específico dentro de la molécula, a este conjunto de
señales se les conoce como la “huella dactilar” del compuesto.
Aplicaciones
RAYOS X

 En 1895 Wilhelm Conrad Rontgen

descubrió que provenía de su
generador de rayos catódicos.
 Proyectado mas allá de el rango
posible de los rayos catódicos.
 Investigaciones posteriores
mostraron que esos rayos se
generaban en el punto de contacto
del rayo producido por el cátodo,
dentro del tubo al vacío.

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 Estos rayos no eran desviados por campos magnéticos y
que penetraban distintos tipos de materia.
 Rontgen tomo una fotografía de la mano de su esposa
con los rayos X.
 La cual mostró su anillo y sus huesos.
 Este suceso atrajo la atención de la comunidad
científica por esta nueva forma de radiación.

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 Rontgen nombró a esta radiación,
como radiación X (X significando
desconocido).
 WilliamCoolidge inventó el tubo
de rayos X.
 Su invención revolucionó la
generación de los rayos X y a partir
de este modelo fue que se crearon
los instrumentos que se utilizan en
aplicaciones médicas.

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RAYOS X

 Los rayos X son capaces de

penetrar la materia.
 Para aplicaciones medicas
estos rayos son producidos
permitiendo que un flujo de
electrones se detengan
súbitamente en una placa de
metal.
 Las imágenes producidas por
los rayos X se deben a los
diferentes índices de
absorción de los tejidos.
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 Con fines analíticos los rayos X se obtienen de diferentes maneras.
 Bombardeo de un blanco metálico con un haz de electrones de elevada energía.
 Por exposición de una sustancia a un haz primario de rayos X con el objetivo de
generar un haz secundario de fluorescencia de rayos X.
 Utilizando una fuente radioactiva cuyo proceso de desintegración da lugar a la
emisión de rayos X.
 A partir de una fuente de radiación sincrotrón.
 Pueden producir espectros continuos de líneas.
 La radiación continua se denomina también radiación blanca o Bremsstrahlung,
que significa radiación que surge del frenado de particulas.
 El calcio de los huesos absorbe la
mayoría de esta radiación, debido
a su alto número atómico.
 Produciendo un contraste.
 Es por eso que los huesos se ven
blancos en la película de
grabación, llamada radiografía.

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¿Cómo funcionan?

 Para crear una radiografía, el

paciente es posicionado de tal
manera que la parte del cuerpo a
ser capturada.
 Se localiza entre a fuente de rayos
X y el detector.
 Cuando la máquina se enciende,
los rayos X viajan a través del
cuerpo y son absorbidos por los
tejidos.
APLICACIONES

 Detecta fracturas en huesos,

ciertos tumores y masas
anormales, pneumonia, algunos
tipos de heridas, calcificaciones,
objetos extraños.
 Tomografía computarizada:
Combina la tecnología de los rayos
X con el procesamiento de una
computadora. Pudiendo generar
imágenes en tres dimensiones.
 Ver estructuras en diferentes
ángulos. This Photo by Unknown Author is licensed under CC BY-SA
 Fluoroscopia. Usa rayos X y un
compuesto fluorescente para
obtener imágenes en tiempo real
del movimiento de este compuesto
dentro del cuerpo.
 Este agente puede ser inyectado o
ingerido.
 Ver el movimiento del corazón
latiendo.
 Con la ayuda de compuestos de
contraste se puede ver el flujo de
sangre.
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 La Imagenología por resonancia
magnética es una tecnología no
invasiva que produce imágenes
anatómicas en tres dimensiones.
 Se utiliza en monitoreos detección,
diagnóstico y tratamiento.
 Este instrumento excita y detecta
el cambio en la dirección del eje
rotacional de los protones que se
encuentran en el agua de los
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tejidos.
¿Cómo funciona?

 RM emplea poderosos imanes

que producen un fuerte campo
magnético que forza a los
protones en el cuerpo a
alinearse con ese campo.
 Cuando la corriente de
radiofrecuencia incide en el
paciente.
 Cuando el campo es apagado los
sensores de RM detectan la
energía liberada por los
protones regresando a su estado
basal.

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 Para obtener una imagen el
paciente debe ser colocado dentro
de un gran imán y debe
permanecer quieto.
 Para no obtener una imagen
borrosa.
 Se suministra Gadolinio de forma
intravenosa antes o durante el This Photo by Unknown Author is licensed under CC BY-ND
procedimiento.
 Para agilizar el alineamiento de los
protones con el campo magnético.
 Entre mas rápido se alineen será
mejor la imagen.
Aplicaciones

 Se utiliza para observar partes no

óseas del cuerpo como tejidos.
 No utiliza la radiación ionizante de
los rayos X.
 El cerebro, la espina dorsal,
músculos, ligamentos, tendones se
pueden apreciar mas claramente
por medio de este instrumento.
 Detección de tumores.
 Observar la actividad cerebral.
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Cromatografía

 La cromatografía moderna se
originó a finales del siglo XX.
 Por los trabajos independientes de
David T. Day y Mikhail Tsvet.
 Day desarrolló métodos para
fraccionar el petróleo crudo
pasándolo a través de ciertos
materiales.
 Tsvet separó los pigmentos de una
hoja.
CROMATROGRAFÍA

 La cromatografía es el conjunto de
técnicas de separación basadas en
la partición de una muestra entre
la fase móvil y la fase estacionaria.
 Puede ser vista como una serie de
equilibrios entre la fase
estacionaria y la fase móvil.

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 La interacción relativa del soluto con estas dos fases es descrita por (k) la
partición o coeficiente de distribución.
 La fase móvil puede ser un gas o un líquido o un fluido supercrítico.
 La fase estacionaria suele ser sólida y a veces líquida.
Mecanismo

 Permite separar componentes

estrechamente relacionados en
mezclas complejas.
 La muestra se desplaza en una fase
móvil, que puede ser un gas un
líquido o un fluido supercrítico.
 La fase móvil se hace pasar a
través de una fase estacionaria
con la que es inmiscible y que se
fija a una columna o superficie
sólida.
 Los componentes que son más fuertemente retenidos por la fase
estacionaria, se mueven lentamente.
 Mientras que los componentes que no tienen interacción con la fase
estacionaria se mueven más rápido.
 Cómo consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra
se separan en bandas que se pueden analizar.
 Cromatografía

Fluídos
Gases Líquidos
supercríticos

Gas/Líquido Papel Columna Capa fina

Líquido/Líquido Puede ser L/L ó

Gas/Sólido L/L ó L/S
(L/L) L/S
Cromatografía en papel

 Fue introducida en 1944.

 La fase estacionaria y la fase móvil son
líquidos.
 El papel funciona como soporte de la fase
estacionaria líquida.
 La muestra es aplicada en un punto
pequeño a cierta distancia de la orilla de
la columna.
 Se deja eluir la muestra en un contenedor
cerrado
 La atmósfera de la misma se satura con la
fase móvil y se forma el cromatograma.
 El extremo mas próximo a la muestra se
pone en contacto con el disolvente y este
asciende o desciende por el papel por
acción de la capilaridad.
Cromatografía en capa fina

 Fue descrita en 1938, es mas

rápida y sensible que la
cromatografía en papel.
 Las partículas en la placa de vidrio
(20 x 20 cm) son mas pequeñas.
 Las condiciones se pueden
modificar de manera sencilla.
 Los disolventes se eligen según las
características de la muestra.
Cromatografía en columna

 Es el método mas utilizado para

separar los componentes de una
muestra.
 El fraccionamiento ocurre por la
diferencia en la migración a través
de un tubo empacado con la fase
estacionaria.
 Los analitos pueden ser monitoreados
mientras migran por la columna.
 La fase estacionaria por lo general es
una resina, gel o material empacado.
 La FE es hidratada por la fase móvil.
 En tamaño y anchura de las columnas
favorecen la resolución y separación
de las mezclas.
 Cromatografía
de gases
 En la cromatografía de gases la
fase móvil es un gas y la fase
móvil puede ser un líquido
inmovilizado o un sólido
empacado en un tubo cerrado.
 Se utiliza para separar
componentes volátiles
térmicamente estables en una
mezcla.
 La CG involucra la vaporización de la muestra y se inyecta a una columna.
 Bajo un gradiente de temperatura controlado.
 La muestra es transportada a través de la columna por el flujo de un gas
inerte (Nitrógeno).
 Los compuestos volátiles son separados por propiedades como: punto de
ebullición, tamaño de partícula o polaridad.
cROMATOGRAMA
Referencias

 Douglas, S. A., Holler, J. F., & Nieman, T. A. (2001). Principios de análisis

instrumental. Madrid: McGraw Hill.
 Nelson, L. D., & Michael, C. M. (2013). Principios de bioquímica. New York.