UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA

FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL

Coloración de bacterias

PRIMER LABORATORIO DEL CURSO MICROBIOLOGÍA SANITARIA - SA323F

CANO FELIX NIELS HENRIK- 20160498A

DOCENTE: ING. JORGE GILBERTO TELLO CEBREROS

Lima, Perú
2018

INDICE:
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniería Ambiental
Resumen 2
Introducción 2
Objetivos 2
Marco Teórico 2
Resultados 8
Discusión de resultados 12
Conclusiones 14
Recomendaciones 14
Cuestionario 14
Fuentes de información 16
Anexos 16
Apéndice 18

RESUMEN:

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Lo que se realizó en el laboratorio ha sido tomar distintas muestras de colonias
de las diferentes placas del laboratorio número 1 “Distribución universal de los
microorganismos”.

Algunos de los resultados fueron bacilos (Gramnegativo), Estreptococos

(Grampositivo) y Estafilococos (Gramnegativo)

INTRODUCCIÓN:

Los microorganismos, excepto las algas, son por lo general incoloros y muy
ligeramente refractantes y por lo tanto son difíciles de estudiarlos tal como se
encuentran en la naturaleza. Para poder hacerlos visibles se los colorea o tiñe
previamente antes de observarlos al microscopio. La coloración hace resaltar
también algunas características morfológicas que de otra manera no son
visibles, porque las distintas partes de una célula tienen afinidad por diferentes
colorantes. Los colorantes más comunes son aquellos derivados de la anilina,
como la fucsina, violeta de genciana, azul de metileno y otros.

El presente laboratorio tiene como finalidad dar a conocer la manera correcta de

diferenciar las bacterias grampositivas y gramnegativas mediante el método de
Tinción Gram.

OBJETIVOS:

GENERALES:

 Distinguir los organismos gran positivo y gran negativo mediante la

coloración de bacterias por el método de Gram.
ESPECIFICOS:

 Identificar el tipo de bacterias mediante el método de tinción de Gram.

 Aprenderemos a conocer el fundamento de las coloraciones en la

práctica microbiológica.

MARCO TEÓRICO:

FIJACIÓN:

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Aunque los microorganismos vivos se pueden examinar directamente con un
microscopio óptico, a menudo hay que fijarlos y teñirlos, deben parecerse lo más
posible a las células vivas. Es un proceso en el que se conservan y fijan en su
posición, las estructuras internas y externas de las células de los
microrganismos. Inactiva las enzimas que podrían alterar la morfología celular y
endurece las estructuras celulares, de esta manera no cambian durante la
tinción, tampoco en su observación. Generalmente durante este proceso se mata
al microorganismo y se fija al portaobjetos.

Existen fundamentalmente dos clases de fijación.

1) Fijación con calor frotis bacterianos:

Los bacteriólogos fijan con este método, calentando suavemente a la llama de

una película de bacterias secada previamente al aire. El uso de este método
conserva adecuadamente la morfología general; pero no las estructuras internas
de la célula.

2) Fijación Química:

Este método se utiliza para proteger su subestructura fina y morfología

general de los microorganismos delicados y de mayor tamaño. Los fijadores
químicos penetran en la célula y reaccionan con componentes celulares
(proteínas, lípidos). Para inactivarlos y convertirlos en insolubles e inmóviles.
Las mezclas más comunes para el uso de este método son: etanol, ácido
acético, cloruro mercúrico, formaldehído, glutaraldehído.

COLORACION Y TINCION SIMPLE:

La gran mayoría de colorantes empleados poseen dos características en común:

 Todos poseen grupos cromóforos, grupos con dobles enlaces

conjugados que dan el color al colorante.
 Pueden unirse a las células mediante enlaces iónicos, covalentes o
hidrófobo. Por ejemplo, un colorante cargado positivamente se une a
estructuras cargadas negativamente de la célula.

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Los colorantes ionizables se pueden dividir en dos clases generales, tomando
como base la naturaleza de su grupo cargado.

- Los colorantes básicos —azul de metileno, fucsina básica, cristal

violeta, safranina, verde malaquita— son catiónicos o tienen grupos
cargados positivamente (normalmente, alguna forma de nitrógeno
pentavalente) y se comercializan generalmente como sales de cloruro.
Los colorantes básicos se unen a moléculas cargadas negativamente,
como ácidos nucleicos y muchas proteínas. Como las superficies de las
células bacterianas están cargadas negativamente, estos colorantes se
emplean a menudo en bacteriología.
- Los colorantes ácidos —eosina, rosa de bengala y fucsina acida— son
amónicos o poseen grupos cargados negativamente, como carboxilos (-
COOH) e hidroxilos fenólicos (-OH). Los colorantes ácidos, debido a su
carga negativa, se unen a estructuras celulares cargadas positivamente.
El pH puede modificar eficazmente la tinción, pues la naturaleza y la carga de los
componentes celulares cambian con los mismos. Debido a esto, los colorantes
ácidos (colorantes amónicos) tiñen mejor en condiciones ácidas, en que las
proteínas y muchas otras moléculas poseen carga positiva. Los colorantes
básicos son muy empleados en condiciones de pH más elevados.

- Tinción Simple —cristal violeta, azul de metileno y carbolfucsina—

colorantes básicos como éstos, se emplean con frecuencia para
determinar el tamaño, la forma y la organización de las bacterias. Los
microorganismos se pueden teñir satisfactoriamente mediante éste
proceso, esto es, utilizando sólo un colorante. El valor de esta clase de
tinción radica en su simplicidad y facilidad de empleo. El frotis,
previamente fijado, se cubre con un colorante durante el tiempo
adecuado, se lava el exceso de colorante con agua y se seca el
portaobjetos.
TINCION DIFERENCIAL:

Los métodos de tinción diferencial clasifican a las bacterias en grupos

diferentes según sus propiedades de tinción. La tinción de Gram, desarrollada

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por el médico danés Christian Gram en 1884, es el método de tinción más

ampliamente utilizado en bacteriología. Se trata de un método de tinción

diferencial porque divide a las bacterias en dos clases —Bacterias Gram

positivas y Gram negativas.

En el primer paso de esta tinción, el frotis se tiñe con el colorante básico cristal
violeta (violeta de genciana), el colorante primario. A continuación, se trata con
una solución yodada que actúa como mordiente. Esto es, el yodo aumenta la
interacción entre la célula y el colorante, de forma que aquélla se tiñe más
intensamente. Luego se decolora el frotis lavándolo con etanol o acetona. Este
paso produce el aspecto diferencial de la tinción de Gram; las bacterias Gram

Figura 1. Método de tinción de

Gram. Observe la importancia de la
decoloración con etanol-acetona
que elimina el cristal violeta de las
células Gram negativas, pero no de
las Gram positivas. Las primeras 5
adquieren un color de rosa a rojo
tras la última tinción con safranina.
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positivas retienen el cristal violeta, mientras que las Gram negativas lo pierden y
aparecen

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incoloras. Finalmente, el frotis se tiñe de nuevo (tinción de contraste) con un
colorante básico de diferente color al cristal violeta. La safranina es el colorante
de contraste más común y tiñe las bacterias Gram negativas de rosa o rojo,
dejando a las Gram positivas de color violeta. Estructura de la pared celular y
mecanismo de la tinción de Gram.

a) b)

c) d)

Figura 2. Ejemplos de tinción de Gram. (a) Clostridium perfringens Gram positivo

(x 800). Algunos bacilos se han teñido de rosa en lugar de morado, como ocurre a
menudo cuando envejecen las células Gram positivas, (b) Staphylococcus aureus.
Tinción de Gram, visto con un microscopio de campo claro (x 1000). Los cocos
Gram positivos se asocian en racimos semejantes a los de uvas, (c) Escherichia
coli, tinción de Gram (x500). (d) Neisseria gonorrhoeae. Los diplococos se
encuentran a menudo dentro de leucocitos (x 1000).
1)
Tinción ácido-alcohol resistencia:

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Es otro método importante de tinción diferencial. Unas pocas especies,
particularmente las del género Mycobacterium no se unen fácilmente a
colorantes simples y hay que teñirlas con un tratamiento más fuerte: calentando
una mezcla de fucsina básica y fenol (método de Ziehl-Neelsen). Una vez que la
fucsina básica ha penetrado en la célula con la ayuda del calor y el fenol, las
células ácido-alcohol resistentes no se decoloran fácilmente con la solución
empleada, permaneciendo de color rojo. Esto se debe al elevado contenido en

Figura3. Tinción de ácido-alcohol resistencia. a) Mycobacterium tuberculosis. b)

Mycobacterium leprae Tinción de ácido-alcohol resistencia (x380). Obsérvense las masas
de bacterias rojas dentro de las células huésped.

lípidos
a) b)
de las
paredes de estas células; en particular, los ácidos micólicos —un grupo de
lípidos hidroxílicos de cadena ramificada— parecen ser los responsables de la
propiedad de ácido-alcohol resistencia. Las bacterias no ácido-alcohol
resistentes se decoloran con la solución acido alcohólica, por lo que se tiñen de
azul con azul de metileno (tinción de contraste). Este método se emplea para
identificar Mycobacterium tuberculosis y M. leprae agentes patógenos
responsables de la tuberculosis y la lepra, respectivamente.

2) Tinción Estructuras Específicas (Tinción Negativa):

Esta técnica revela la presencia de cápsulas difusas alrededor de muchas

bacterias. Se mezclan las bacterias con tinta china o colorante de nigrosina y se

Figura4. Tinción negativa.

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extienden en una capa fina sobre un portaobjetos. Después de secarlo al aire,
las bacterias aparecen como cuerpos más claros en medio de un fondo azul

oscuro, porque la tinta y las partículas de colorante no pueden penetrar ni la

célula bacteriana ni su cápsula. La extensión de la región de luz está
determinada por el tamaño de la cápsula y por la propia célula. Apenas se
produce modificación de la forma bacteriana y la célula se puede teñir
posteriormente para conseguir incluso una mejor visibilidad.

Los flagelos bacterianos son estructuras de locomoción en forma de hilo, tan

delgados (10 a 30 nm de diámetro, aproximadamente) que sólo se pueden
observar directamente con el microscopio electrónico. Para observarlos con el
óptico, se aumenta su grosor cubriéndolos con mordientes, como ácido tánico y
alumbre de potasio, y tiñéndolos con pararosanilina (método de Leifson) o
fucsina básica (método de Gray). Los métodos de tinción de flagelos ofrecen
una información taxonómica importante acerca de su presencia y el modelo de
su distribución.

RESULTADOS:

Grupo 1:

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    Características de la Colonia Forma Agrupación Gram

    Tamaño 4mm      
    Borde Lobular     Gram
  Bibliotec Elevación plana Cocos Estreptococos Negativo
  a placa Caracteres ópticos Opaca      
  1- color blanca      
Grupo (Grupo2)
N°1  
   
             
    Tamaño 1mm   Estreptococos
    Borde Lobular Cocos Gram
   
Bibliotec Elevación plana     Negativo
a placa 1 Caracteres ópticos Opaca    
(Grupo 2) Pigmentación blanca  
 
 
Tabla 1

Grupo 2:

Características de
Agrupación
    la Colonia Forma Gram
    Tamaño 4mm      
    Borde ondulante     Gram
Bibliotec
a placa 1
(Grupo
  2) Elevación concava cocos Estreptococos negativos
    Caracteres ópticos Opaca      
anaranjad
    pigementacion o      
Grupo
 
N°2          
    Tamaño 3 mm    
Estreptobacilo
Borde
    Liso bacilos s Gram
  Bibliotec Elevación plana   positivos
a placa 1
(Grupo

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2)
    Caracteres ópticos Opaca      
    Pigmentación amarillo      
Tabla 2

Grupo 3:

Características de
Agrupación
    la Colonia Forma Gram
    Tamaño 4mm      
    Borde Liso     Gram
En
Centro de formas
estudiante de
s cadena
placa 1 Convex de
  (Grupo 4) Elevación a cocos Estreptococos positivo (+)
Caracteres
    ópticos Opaca      
    pigmentación amarillo      
Grupo
 
N°3          
    Tamaño 1 mm    
En
forma
Borde irregular
de
    Liso cocos Estafilococos Gram
Biblioteca
placa 1 Elevación Convex
  (grupo 2) a   Negativo (-)
Caracteres
    ópticos Opaca      
    Pigmentación Blanco      
Tabla 3

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Grupo 4:

    Características de la Colonia Forma Agrupación Gram

    Tamaño 3mm      
    Borde Liso     Gram
Centro de
estudiante
s
placa 1
  (grupo 4) Elevación Plana cocos Estafilococos negativo (-)
Caracteres
    ópticos Opaca      
    pigmentación Blanco      
Grupo
 
N°4          
    Tamaño 2 mm  
  Borde Liso
Biblioteca Elevación Plana
  placa 1
Caracteres
  (grupo 2)
ópticos  
    Opaca
Estreptobacilo Gram
Pigmentación bacilos s positivo (-)
Amarillo      
Tabla 4

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Grupo 5:

    Características de la Colonia Form Agrupación Gram

  a
    Tamaño 3mm      
    Borde Lobular     Gram
  Centro de Elevación plana En Estreptococo positivo
  estudiantes Caracteres Opaca formas s (+)
Grupo placa 1 ópticos de    
N°5 (Grupo 4) Pigmentación Crema cadena    
      de cocos    
     
   
   
    Tamaño 2 mm   bacilos  
  Borde ondular En   Gram
Centro de Elevación plana forma de   Negativo
estudiantes Caracteres Opaca bacilos (-)
placa 1    
ópticos
(Grupo 4)     
  Pigmentación anaranjad  
o
Tabla 5

DISCUSIÓN DE RESULTADOS:

GRUPO NÚMERO 1:

 Las colonias (en ambas placas) resultaron ser Estreptococos

(Gramnegativos).
 Las colonias utilizadas tuvieron las mismas características de borde,
elevación, caracteres óticos y color; sin embargo, el tamaño de las
colonias difiere en 3 mm.

GRUPO NÚMERO 2:

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 La primera colonia tomada de la placa que corresponde a la biblioteca
resultó ser Estreptococos (Gramnegativos) y tuvieron un tamaño de 4mm,
borde ondulante, elevación cóncava, caracteres ópticos opacos y color
anaranjado.
 La segunda colonia tomada de la placa que corresponde a la biblioteca
resulto ser Estreptobacilo (Grampositivos) y tuvo un tamaño de 3mm,
borde liso, elevación plana, caracteres ópticos opacos y pigmentación
amarillo

GRUPO NUMERO 3:

 La primera colonia tomada de la placa que corresponde al centro de

estudiantes resulto ser una colonia de Estreptobacilo (Grampositivos) y
tuvo un tamaño de 4mm, borde liso, elevación convexa, caracteres
ópticos opacos y pigmentación amarillo.
 La segunda colonia tomada de la placa correspondiente a la biblioteca
resulto ser una colonia de Estafilococos (Gramnegativos) y tuvo un
tamaño de 1mm, borde liso, elevación convexa, caracteres ópticos
opacos y pigmentación blanco.

GRUPO NUMERO 4:

 La primera colonia tomada de la placa correspondiente al centro de

estudiantes resulto ser una colonia de Estafilococos (Gramnegativos) y
tuvo un tamaño de 3mm, borde liso, elevación plana, caracteres ópticos
opacos y pigmentación blanco.
 La segunda colonia tomada de la placa correspondiente a la biblioteca
resulto ser una colonia de Estreptobacilo (Grampositivo) y tuvo un
tamaño de 2mm, borde liso, elevación plana, caracteres ópticos opacos y
pigmentación amarillo.

GRUPO NUMERO 5:

 La primera colonia tomada de la placa correspondiente al centro de

estudiantes resulto ser una colonia de Estreptococos (Grampositivos) y
tuvo un tamaño de 3mm, borde lobular, elevación plana, caracteres
ópticos opacos y pigmentación crema.

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 La segunda colonia de la placa correspondiente al centro de estudiantes
resulto ser una colonia de bacilos (Gramnegativos) y tuvo un tamaño de
2mm, borde ondular, elevación plana, caracteres ópticos opacos y
pigmentación anaranjado.

CONCLUSIONES:

 La placa correspondiente a la biblioteca tiene mayor cantidad de

bacterias Gramnegativas (Estreptococos y Estafilococos).

RECOMENDACIONES:

 Realizar la coloración Gram dentro de las 48 horas de cultivo ya que

pasado ese lapso de tiempo no habrá resultados favorables debido a la
edad de las bacterias.

 Al frotar el cultivo con el inoculador en el portaobjeto, hacerlo con cuidado

de manera que no se desprenda la muestra.
 Pasar los portaobjetos varias veces cortando la llama del mechero de
bunsen, para asegurarse que no haya microorganismos presentes.
 Asegurarse que los materiales con los que se va a trabajar estén en buen
estado.

CUESTIONARIO:

1) Hacer una tabla en relación a enfermedades microbianas que son

transmitidas por el aire, agua y alimentos.

Enfermedades transmitidas por el aire:

ENFERMEDADES AGENTE CAUSANTE MODO DE TRASNMISIÓN

GÉNERO - ESPECIE
Mycobacterium
Tuberculosis suspensión en el aire
tuberculosis

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Tratamiento inadecuado de
potabilización. La bacteria del
cólera puede vivir en el
Cólera Vibrio cholerae
ambiente en ríos salobres y
aguas costeras.

intoxicaciones alimentarias
más comunes causadas por
Salmonelosis Salmonella sp
ingerir agua y alimentos
contaminados
Fuente: Diego Leon Cisneros. (2005). ENFERMEDADES TRANSMITIDAS
POR LOS ALIMENTOS, AIRE Y EL AGUA . 19/09/2018, de PUBLIC
HEALTH Sitio web:
https://www.illinoispoisoncenter.org/ipc_media/pdf/Food_Spa.pdf

2) Responder:
 ¿Existen diferencias entre las paredes celulares de las bacterias
Gram positivas y los gramnegativos?

Bacterias grampositivas Bacterias gramnegativas

Poseen una pared celular interna y Poseen una pared celular más
compleja:
una pared de peptidoglucano.
-pared celular interna
-pared de peptidoglucano
- bicapa lipídica externa.
La red de mureína está muy La red de mureína presenta una sola
desarrollada y llega a tener hasta 40 capa.
capas
Es frecuente la presencia de los Contiene siempre únicamente meso-
aminoácidos L-diaminopimélico o de diaminopimélico.
lisina.
Los aminoácidos implicados varían de La constitución del saco de mureína
una especie a otra. es igual en todas las bacterias Gram
negativas.
Fuente: Jampieer Sanchez Castillo . ( MARTES, 14 DE SEPTIEMBRE DE 2010).
Bacterias Gram Positivas y Gram Negativas. 18/09/2018, de Biología Médica Sitio web:
http://biologiamedica.blogspot.com/2010/09/bacterias-gram-positivas-y-gram.html

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 ¿Afecta la edad del cultivo a la reacción de tinción Gram?

La edad es un factor muy importante en la reacción tinción Gram, ya que los

cultivos viejos de bacterias gram positivas pueden perder capas de
peptidoglucano y teñirse como gram negativos.

Fuente: Luis Benitez. (2014). Observacion de bacterias por medio de Tincion Gram.
19/09/2018, de Universidad Latina de Panamá Sitio web:
https://laboratoriodemicrobiologia.weebly.com/cuestionario3.html

3) Hacer una lista de 5 bacterias gramnegativas y grampositivas con

las enfermedades que provocan.

Bacterias grampositivas Enfermedades que provocan

Streptococcus pneumoniae Neumonía
Clostridium perfringes endometritis
Streptococcus pneumoniae otitis

Bacterias gramnegativas Enfermedades que provocan

Haemophilus influenzae bronconeumonia
Salmonella typhi Fiebre tifoidea
Bordetella pertussis Tos ferina
Fuente: Murray PR, et al. “Microbiología Médica”. Editorial Elsevier Mosby. 6a
Ed.España 2009: 158-159.
FUENTES DE INFORMACIÓN:

 Diego Leon Cisneros. (2005). ENFERMEDADES TRANSMITIDAS

POR LOS ALIMENTOS, AIRE Y EL AGUA . 19/09/2018, de PUBLIC
HEALTH Sitio web:
https://www.illinoispoisoncenter.org/ipc_media/pdf/Food_Spa.pdf
 Jampieer Sanchez Castillo . ( MARTES, 14 DE SEPTIEMBRE DE 2010).
Bacterias Gram Positivas y Gram Negativas. 18/09/2018, de Biología
Médica Sitio web:
http://biologiamedica.blogspot.com/2010/09/bacterias-gram-positivas-
y-gram.html
 Luis Benitez. (2014). Observacion de bacterias por medio de Tincion Gram.
19/09/2018, de Universidad Latina de Panamá Sitio web:
https://laboratoriodemicrobiologia.weebly.com/cuestionario3.html

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 Murray PR, et al. “Microbiología Médica”. Editorial Elsevier Mosby. 6a
Ed.España 2009: 158-159.
ANEXOS:

PROCEDIMIENTO:

Preparación de láminas utilizando el método Gram para la coloración.

 Usar láminas limpias y pasarlas varias veces cortando la llama del

mechero Bunsen. No tocar con los dedos la superficie plana del
portaobjeto.
 Dejar enfriar la lámina y colocar sobre ella una gotita de suero
fisiológico con el inoculador.
 Con inoculador estéril, tocar ligeramente el cultivo que ha de ser
examinado y transferir un poquito de él sobre la gotita de suero
fisiológico.
 Esterilizar el inoculador y dejarlo enfriar.
 Frotar el cultivo con el inoculador hasta extenderlo sobre la parte
central del portaobjeto, cuidando de que se forme una película muy
delgada.
 Dejar que la película seque al aire.
 Fijar la preparación sobre el portaobjeto pasándolo por la llama del
mechero tres veces, manteniendo la película havia arriba de la llama.
Dejar enfriar.
 Cubrir la película con el colorante cristal violeta (Gram #1) y dejar así
cubierto por espacio de 20 segundos.
 Lavar con agua durante 20 segundos.
 Tratar la lámina con la solución Lugol (Gram #2) durante 1 minuto.
 Decolorarla con Alcohol acetona de 95° (Gram #3) durante 15 a 20
segundos.
 Lavar con agua la lámina, durante 2 segundos.
 Contra colorar con Safranina (Gram #4) y dejar que se tiña por
espacio de 20 segundos).
 Lavar la lámina con agua, durante 2 segundos.

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 Dejar secar y examinar al microscopio la preparación. Un organismo
Grampositivo retendrá el cristal violeta y aparecerá teñido de azul o
morado y un organismo Gramnegativo tendrá el color rosado o rojo
de la Safranina.

APÉNDICE:

Colonia de Estafilococos (Gramnegativos), muestra de la placa correspondiente al

centro de estudiantes

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