Tinción de Ziehl Neelsen

La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, para la identificación de microorganismos patógenos, por ejemplo M. tuberculosis. Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes, Franz Ziehl (1859 a 1926), un bacteriólogo y Friedrich Neelsen (1854 to 1894), un patólogo. 1.- Fundamento Este método se basa en que las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácido graso|ácidos grasos (por ejemplo, el ácido micólico) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistencia|bacilos ácido-alcohol resistentes o BAAR. Las Mycobacterium|micobacterias como Mycobacterium tuberculosis|M. tuberculosis y Mycobacterium marinum|M. marinum y los parásitos coco (bacteria)|coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de ZiehlNeelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. 2.- Técnica Esta técnica puede realizarse tanto en muestras histológicas como citológicas. 2.1 - Variante histológica Para demostrar la presencia de BAAR en cortes de tejido en parafina. Los reactivos necesarios para su realización son los siguientes:  Ácido periódico 5%  Carbol fucsina de Ziehl (fucsina fenicada). Preparar mezclando en el orden dado: a) 0,5 g fucsina básica b) 50 cc agua destilada c) 5 cc etanol absoluto d) 2,5 g cristales de fenol derretidos  Hematoxilina  Alcohol ácido 1%: a) Alcohol de 70º b) Ácido clorhídrico El procedimiento es el siguiente: • Desparafinar e hidratar los cortes • Ácido periódico 5%, 10 min • Lavar con agua destilada • Fucsina fenicada, 15 min • Decolorar en alcohol ácido al 1% • Lavar con agua destilada • Hematoxilina, 10 min • Azulidificar con, por ejemplo, carbonato de litio • Deshidratar, aclarar y montar preparaciones

II. 7) Enjuagar con agua I. azul de metileno. 3) Aplicar fucsina-fenicada. Núcleos: azul. Lave suavemente de manera que el extendido no se barra del portaobjetos. 4) Calentar con un mechero hasta la emisión de vapores (3-5 minutos). coloque cada portaobjetos en una gradilla a que sequen al aire. Un frotis muy delgado puede darle resultados falsamente negativos y un frotis muy grueso puede desprenderse del portaobjetos durante la tinción. Ahora coloquele una pequeñita gota de aceite de inmersión y haga la observación al microscopio con 10 x 100 . Mantenga el calor durante este período. Lave suavemente el colorante de cada portaobjetos con agua corriente fría hasta que toda la tinción libre quede lavada. tal como alcohol ácido y manténgalo sobre el portaobjetos durante 3 minutos. Cubra cada portaobjetos con la solución decolorante. Deje que el colorante permanezca sobre los portaobjetos durante 5 minutos. con el frotis hacia arriba. durante 1 minuto. II. 2) Dejar el frotis sobre el puente de tinción. 2. III. 6) Aplicar azul de metileno (1 minuto). Vuelva a enjuagar con un leve chorro de agua e incline cada portaobjetos hasta drenar el exceso de agua. el contenido del esputo que no son bacilos TBC puede permanecer teñido. I.3 . II.2. Si no se decolora suficientemente. aplique una cantidad adicional de la solución decolorante de 1 a 3 minutos. Si los portaobjetos aún están rosa. III. Coloque todos los portaobjetos orientados uniformemente.Variante clásica o "en caliente" Ésta y la siguiente variantes son para preparaciones citológicas. Se requiere el tiempo adecuado para que la fucsina fenicada penetre y tiña la pared celular de la bacteria. La fijación al calor asegurará de que el frotis quede adherido al portaobjetos. Aplique la solución de contraste. Finalmente. 5) Decolorar con alcohol-ácido. coloque los portaobjetos en una gradilla de tinción con los extendidos hacia arriba. I. 1) Hacer un frotis de la muestra de esputo. No deje que hierva o se seque el colorante.2 . Enjuague con agua una vez más los portaobjetos y quite el exceso de agua. I. Nunca tiña más de 12 portaobjetos a la vez.Resultados BAAR: rojo. Retire el exceso de agua. Utilizando pinzas.

o Contrastar con azul de metileno 2. o Decolorar con alcohol acido. . o Dejar en vasos coplin durante 20 minutos. o Aplicar fucsina-fenicada (solución con fenol y mayor concentración de fucsina).4 . Parásitos coccídeos (Cryptosporidium) de muestras [fecales].2. o Dejarlo en el puente de tinción. Nocardia y Actinomices: débilmente ácido-alcohol resistente. o Lavar con agua del grifo.Algunos microorganismos ácido-alcohol resistentes Mycobacterium: fuertemente ácido-alcohol resistente.5 .En "frío" o Hacer un frotis.

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