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Tinción de Ziehl Neelsen

La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial


rápida y económica, para la identificación de microorganismos patógenos, por
ejemplo M. tuberculosis.
Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes, Franz Ziehl (1859 a
1926), un bacteriólogo y Friedrich Neelsen (1854 to 1894), un patólogo.

1.- Fundamento
Este método se basa en que las paredes celulares de ciertos parásitos y
bacterias contienen ácido graso|ácidos grasos (por ejemplo, el ácido micólico)
de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de
resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes
básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistencia|bacilos ácido-alcohol
resistentes o BAAR. Las Mycobacterium|micobacterias como Mycobacterium
tuberculosis|M. tuberculosis y Mycobacterium marinum|M. marinum y los
parásitos coco (bacteria)|coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por
sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-
Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared
bacteriana que contiene ceras.

2.- Técnica
Esta técnica puede realizarse tanto en muestras histológicas como citológicas.

2.1 - Variante histológica


Para demostrar la presencia de BAAR en cortes de tejido en parafina. Los
reactivos necesarios para su realización son los siguientes:
 Ácido periódico 5%
 Carbol fucsina de Ziehl (fucsina fenicada). Preparar mezclando en el
orden dado:
a) 0,5 g fucsina básica
b) 50 cc agua destilada
c) 5 cc etanol absoluto
d) 2,5 g cristales de fenol derretidos
 Hematoxilina
 Alcohol ácido 1%:
a) Alcohol de 70º
b) Ácido clorhídrico
El procedimiento es el siguiente:
• Desparafinar e hidratar los cortes
• Ácido periódico 5%, 10 min
• Lavar con agua destilada
• Fucsina fenicada, 15 min
• Decolorar en alcohol ácido al 1%
• Lavar con agua destilada
• Hematoxilina, 10 min
• Azulidificar con, por ejemplo, carbonato de litio
• Deshidratar, aclarar y montar preparaciones
2.2 - Resultados
BAAR: rojo.
Núcleos: azul.

2.3 - Variante clásica o "en caliente"


Ésta y la siguiente variantes son para preparaciones citológicas.
1) Hacer un frotis de la muestra de esputo.
I. La fijación al calor asegurará de que el frotis quede adherido al
portaobjetos. Un frotis muy delgado puede darle resultados
falsamente negativos y un frotis muy grueso puede desprenderse
del portaobjetos durante la tinción.
II. Utilizando pinzas, coloque los portaobjetos en una gradilla de
tinción con los extendidos hacia arriba. Coloque todos los
portaobjetos orientados uniformemente, con el frotis hacia arriba.
Nunca tiña más de 12 portaobjetos a la vez.
2) Dejar el frotis sobre el puente de tinción.
3) Aplicar fucsina-fenicada.
III. Deje que el colorante permanezca sobre los portaobjetos durante 5
minutos. Mantenga el calor durante este período.
4) Calentar con un mechero hasta la emisión de vapores (3-5 minutos).
I. Se requiere el tiempo adecuado para que la fucsina fenicada
penetre y tiña la pared celular de la bacteria. No deje que hierva o
se seque el colorante.
II. Lave suavemente el colorante de cada portaobjetos con agua
corriente fría hasta que toda la tinción libre quede lavada. Lave
suavemente de manera que el extendido no se barra del
portaobjetos. Retire el exceso de agua.
5) Decolorar con alcohol-ácido.
III. Cubra cada portaobjetos con la solución decolorante, tal como
alcohol ácido y manténgalo sobre el portaobjetos durante 3
minutos. Si no se decolora suficientemente, el contenido del esputo
que no son bacilos TBC puede permanecer teñido. Enjuague con
agua una vez más los portaobjetos y quite el exceso de agua. Si los
portaobjetos aún están rosa, aplique una cantidad adicional de la
solución decolorante de 1 a 3 minutos.
6) Aplicar azul de metileno (1 minuto).
I. Aplique la solución de contraste, azul de metileno, durante 1
minuto.
7) Enjuagar con agua
I. Vuelva a enjuagar con un leve chorro de agua e incline cada
portaobjetos hasta drenar el exceso de agua. Finalmente, coloque
cada portaobjetos en una gradilla a que sequen al aire.
II. Ahora coloquele una pequeñita gota de aceite de inmersión y haga
la observación al microscopio con 10 x 100
2.4 - En "frío"
o Hacer un frotis.
o Dejarlo en el puente de tinción.
o Aplicar fucsina-fenicada (solución con fenol y mayor concentración de
fucsina).
o Dejar en vasos coplin durante 20 minutos.
o Decolorar con alcohol acido.
o Lavar con agua del grifo.
o Contrastar con azul de metileno

2.5 - Algunos microorganismos ácido-alcohol resistentes


Mycobacterium: fuertemente ácido-alcohol resistente.
Nocardia y Actinomices: débilmente ácido-alcohol resistente.
Parásitos coccídeos (Cryptosporidium) de muestras [fecales].

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