Tinción de Ziehl Neelsen

La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, para la identificación de microorganismos patógenos, por ejemplo M. tuberculosis. Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes, Franz Ziehl (1859 a 1926), un bacteriólogo y Friedrich Neelsen (1854 to 1894), un patólogo. 1.- Fundamento Este método se basa en que las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácido graso|ácidos grasos (por ejemplo, el ácido micólico) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistencia|bacilos ácido-alcohol resistentes o BAAR. Las Mycobacterium|micobacterias como Mycobacterium tuberculosis|M. tuberculosis y Mycobacterium marinum|M. marinum y los parásitos coco (bacteria)|coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de ZiehlNeelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. 2.- Técnica Esta técnica puede realizarse tanto en muestras histológicas como citológicas. 2.1 - Variante histológica Para demostrar la presencia de BAAR en cortes de tejido en parafina. Los reactivos necesarios para su realización son los siguientes:  Ácido periódico 5%  Carbol fucsina de Ziehl (fucsina fenicada). Preparar mezclando en el orden dado: a) 0,5 g fucsina básica b) 50 cc agua destilada c) 5 cc etanol absoluto d) 2,5 g cristales de fenol derretidos  Hematoxilina  Alcohol ácido 1%: a) Alcohol de 70º b) Ácido clorhídrico El procedimiento es el siguiente: • Desparafinar e hidratar los cortes • Ácido periódico 5%, 10 min • Lavar con agua destilada • Fucsina fenicada, 15 min • Decolorar en alcohol ácido al 1% • Lavar con agua destilada • Hematoxilina, 10 min • Azulidificar con, por ejemplo, carbonato de litio • Deshidratar, aclarar y montar preparaciones

La fijación al calor asegurará de que el frotis quede adherido al portaobjetos. III. Núcleos: azul.3 . Enjuague con agua una vez más los portaobjetos y quite el exceso de agua. Vuelva a enjuagar con un leve chorro de agua e incline cada portaobjetos hasta drenar el exceso de agua. II. III. Aplique la solución de contraste. Ahora coloquele una pequeñita gota de aceite de inmersión y haga la observación al microscopio con 10 x 100 . 2. tal como alcohol ácido y manténgalo sobre el portaobjetos durante 3 minutos. con el frotis hacia arriba. Cubra cada portaobjetos con la solución decolorante. Lave suavemente de manera que el extendido no se barra del portaobjetos. I.2 .Resultados BAAR: rojo. Utilizando pinzas. Deje que el colorante permanezca sobre los portaobjetos durante 5 minutos. Mantenga el calor durante este período. II.Variante clásica o "en caliente" Ésta y la siguiente variantes son para preparaciones citológicas. 1) Hacer un frotis de la muestra de esputo. No deje que hierva o se seque el colorante. 3) Aplicar fucsina-fenicada. 5) Decolorar con alcohol-ácido. I. durante 1 minuto. coloque los portaobjetos en una gradilla de tinción con los extendidos hacia arriba. Se requiere el tiempo adecuado para que la fucsina fenicada penetre y tiña la pared celular de la bacteria. 4) Calentar con un mechero hasta la emisión de vapores (3-5 minutos). Coloque todos los portaobjetos orientados uniformemente. Lave suavemente el colorante de cada portaobjetos con agua corriente fría hasta que toda la tinción libre quede lavada. 7) Enjuagar con agua I. azul de metileno. Nunca tiña más de 12 portaobjetos a la vez. Si los portaobjetos aún están rosa. aplique una cantidad adicional de la solución decolorante de 1 a 3 minutos. 2) Dejar el frotis sobre el puente de tinción. Un frotis muy delgado puede darle resultados falsamente negativos y un frotis muy grueso puede desprenderse del portaobjetos durante la tinción. II.2. coloque cada portaobjetos en una gradilla a que sequen al aire. Retire el exceso de agua. Si no se decolora suficientemente. Finalmente. el contenido del esputo que no son bacilos TBC puede permanecer teñido. I. 6) Aplicar azul de metileno (1 minuto).

.En "frío" o Hacer un frotis. o Dejar en vasos coplin durante 20 minutos. o Dejarlo en el puente de tinción.5 .Algunos microorganismos ácido-alcohol resistentes Mycobacterium: fuertemente ácido-alcohol resistente. o Lavar con agua del grifo. o Aplicar fucsina-fenicada (solución con fenol y mayor concentración de fucsina). o Decolorar con alcohol acido.2. o Contrastar con azul de metileno 2. Parásitos coccídeos (Cryptosporidium) de muestras [fecales]. Nocardia y Actinomices: débilmente ácido-alcohol resistente.4 .