Tema IV: Fotocolorimetría y Espectrofotometría. Leyes de la Fotocolorimetría.

Aparatos

Objetivos
1. Comprender la importancia del uso de un método colorimétrico para el dosaje
de diferentes metabolitos.
2. Conocer el fundamento del funcionamiento de un fotocolorímetro y de un
espectrofotómetro.
3. Utilizar adecuadamente el instrumental.
4. Determinar la concentración de una sustancia problema empleando una curva
patrón.

Contenidos
Fotocolorimetría y espectrofotometría. Generalidades. Características de la
radiación electromagnética. Espectro electromagnético. Leyes de la absorción. Ley
de Lambert y Beer. Espectroscopía. Espectroscopia infrarroja. Fotocolorímetro y
espectrofotómetro. Análisis colorimétrico. Curva patrón, curva testigo o curva de
calibración.

Actividades
1. Determinación de la máxima absorción espectral de una solución coloreada.
2. Realización de una curva patrón: densidad óptica en función de la concentración
de una solución de dicromato de potasio y de una solución de permanganato
(diferentes diluciones).
3. Determinación de la concentración de una solución problema a partir de la curva
patrón obtenida.
 FOTOCOLORIMETRÍA Y ESPECTROFOTOMETRÍA

Generalidades

La medición de la radiación electromagnética emitida o absorbida por las

sustancias se realiza a través de métodos espectroscópicos. El estudio de la
absorción espectral permite identificar y cuantificar dichas sustancias ya que provee
conocimientos de la estructura, fórmula, estabilidad de algunas especies químicas.

Los métodos espectroscópicos pueden ser:

 de absorción: se fundamentan en la disminución de la potencia de un haz de

radiación electromagnética como consecuencia de su interacción con una
sustancia.
 de emisión: se mide la radiación emitida cuando una sustancia es excitada por
energía eléctrica, radiante o térmica. En los métodos de fluorescencia, la
radiación emitida se produce por exposición de la sustancia a un haz de
radiación originada por una lámpara fluorescente.

En los métodos espectroscópicos se tiene en cuenta la región del espectro

electromagnético que se utiliza.

Características de la Radiación Electromagnética

La radiación electromagnética es una forma de energía que se transmite a

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velocidades muy altas por el espacio como partículas (fotones) de ondas
sinusoidales caracterizadas por su longitud de onda, frecuencia, velocidad y
amplitud. Espectro Electromagnético

Cresta
Longitud de onda Diferentes longitudes de onda de la radiación electromagnética
corresponden a diferentes regiones del espectro. Las regiones del espectro
electromagnético son los rayos gamma, X, ultravioleta, visible, infrarrojo, microondas

Amplitud y radiofrecuencias:

-3 -1 3 5 13
 (nm) 10 10 10 10 10 10
Dirección de
propagación de la Ultravioleta Infrarrojo
onda

Rayos Gamma Rayos X Ondas

Valle Visible de radio

La longitud de onda () corresponde a la distancia que existe, en la

dirección de propagación, en dos puntos que están en fase en dos ondas El ojo humano detecta radiación electromagnética con longitud de onda

adyacentes. Las unidades que se utilizan para su medición son nanómetros (nm), comprendida únicamente en el rango de 780 nm (luz roja) a 390 nm (luz violeta). La
radiación en este rango se denomina luz visible y la frecuencia de la luz determina
Ángstrom (Aº) o micras () de acuerdo a su magnitud.
su color. El sol o las lámparas eléctricas emiten un espectro que abarca numerosas
La frecuencia () se define como el número de ciclos de ondas por
longitudes de onda. Los objetos se ven por la luz que emiten o reflejan. De esta
segundos. La luz monocromática está constituida por una sola frecuencia o una
manera, cuando la luz blanca atraviesa un medio, ya sea una solución química o un
misma longitud de onda.
objeto coloreado, las ondas emitidas que se perciben son las del color
La amplitud es la altura de la onda por sobre la línea central.
complementario al que se absorben. Así, una solución es roja porque absorbe el
La relación entre la energía de los fotones es inversamente proporcional a la
color verde de la radiación blanca que le llega y transmite el componente rojo que no
longitud de onda. Por ejemplo, la radiación infrarroja a 760 nm tiene menor energía
se ha alterado.
que la radiación UV a 200 nm.

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 Regiones del Espectro, Longitudes de Onda y Colores doble enlace conjugado o anillos aromáticos y los iones de metales de transición
son capaces de absorber en la región ultravioleta visible y se pueden determinar
Longitud de onda Nombre de la Color
Color absorbido cuantitativamente midiendo esta absorción.
(nm) región complementario
180-220 UV corto No visible ---- Cuando la longitud de onda es menor a 340 nm el vidrio no es transparente
220-340 UV No visible ---- y por lo tanto, se necesita emplear cubetas, ventanas y prismas y lentes de cuarzo.
340-430 Visible Violeta Amarillo verdoso También se requiere utilizar un foco luminoso distinto para trabajar con longitudes

430-475 Visible Azul Amarillo de onda por debajo de 340-350 nm.

475-495 Visible Verde azul Naranja

495-505 Visible Azul Verde Rojo Leyes de la Absorción
505-555 Visible Verde Púrpura
555-575 Visible Verde Amarillo Violeta Cuando un haz luminoso de intensidad inicial Io atraviesa un cuerpo o
solución transparente, parte de la luz se absorbe (Ia), y parte emerge con una
575-600 Visible Amarillo Azul
intensidad menor que se llama intensidad transmitida It:
600-620 Visible Naranja Azul verde

620-780 Visible Rojo Verde azul Io - Ia = It

donde:
Io = intensidad inicial
Los rayos ultravioleta comprenden el intervalo que va entre 390 nm y 10 nm.
Ia = intensidad absorbida
La zona ultravioleta a su vez se subdivide en ultravioleta cercano (200 nm- 390 nm),
It = intensidad transmitida
ultravioleta lejano (100 nm-200 nm) y ultravioleta extremo o vacío (10 nm-100 nm).
También se puede asociar esta radiación con los efectos sobre la salud, en rayos
La relación entre It e Io es la Transmitancia:
UV-A (315nm -390 nm), rayos UV-B (315 nm-280 nm) y rayos UV-C (10 nm-280
nm). Los rayos UV-A producen el bronceado de la piel y activan la Vitamina D
T= It
presente en el tejido. Son los menos energéticos mientras que los rayos UV-C son
Io
los más perjudiciales pues son capaces de romper los enlaces del ADN de la piel.
La presencia de oxígeno y ozono en la atmósfera absorben la mayor parte de estas La Absorbancia (A) es la energía luminosa absorbida, y se relaciona con la
radiaciones solares. transmitancia a través de la siguiente relación:
La región ultravioleta-visible del espectro electromagnético es la región
espectral de mayor uso en el análisis químico. Los compuestos orgánicos que tienen
92 93
 1
A = log10 donde:
T
AD, DOD y C D: absorbancia, densidad óptica y concentración
respectivamente de la solución problema.
En el agua destilada A = 0, por lo tanto, T = 100.
AC, DOC y CC : absorbancia, densidad óptica y concentración
Los espectrofotómetros son aparatos que miden la densidad óptica (DO),
respectivamente de la solución testigo.
magnitud equivalente a la Absorbancia. Es decir:

De allí:
DO = log 1 DO = log Io
CD = DOD x CC
T It
DOC

Si la solución testigo es estable y la absorbancia es proporcional a su

Ley de Lambert y Beer
Según esta ley, cuando un haz de luz monocromática atraviesa una solución
coloreada homogénea, la absorbancia es proporcional a la concentración de
moléculas absorbentes y al espesor de la solución atravesada. Se establece una
relación lineal entre la concentración de la sustancia y la DO registrada.
La Ley de Lambert y Beer es el fundamento del análisis colorimétrico, el cual
se emplea para conocer la concentración de las soluciones coloreadas. Para ello, se
mide la luz absorbida (DO) por la solución problema de concentración desconocida
(D) y la de la solución standard, patrón o testigo de la misma sustancia pero de
concentración perfectamente conocida (C). De esta manera, la determinación de la
concentración de la solución problema se realiza en forma indirecta. Si la solución
no es coloreada, es necesario acoplarle una reacción de coloración y efectuar las
lecturas a la longitud de onda apropiada.
La relación de proporcionalidad que se aplica es la siguiente:
concentración, en esta relación se resuelve el cociente de esos datos, y los cálculos
posteriores se pueden realizar a partir del factor (f) encontrado:
CC = f
CD = f x DOD
DOC
Para que se cumpla la ley de Lambert y Beer se deben reunir las siguientes
condiciones:
 La radiación que incide sobre la sustancia debe ser monocromática.
 La absorción del solvente debe ser mínima si se compara con la del soluto.
 La concentración del soluto debe mantenerse dentro de la linealidad.
 La sustancia a analizar no debe reaccionar con otro soluto presente en la
solución ni con el solvente.

AD = CD o también DOD = CD Espectroscopía

AC CC DOC CC El estudio de la interacción entre los distintos tipos de radiación y la materia

94 95
se llama espectroscopia, y el gráfico que describe la intensidad de esta interacción asimétrico .Si se produce una modificación en el ángulo de los enlaces se los llama
se llama espectro. De aquellos gráficos puede obtenerse una enorme cantidad de vibraciones de plegado o flexión y suceden moléculas poliatómicas. Los signos + y –
información sobre la estructura de la materia. Así, la absorción y transmisión representan a los movimientos desde el plano del papel hacia el lector y en dirección
selectiva de la luz visible y la radiación ultravioleta son la base de la técnica de contraria.
espectroscopía lo cual permite identificar componentes y determinar su
concentración.
En Química Orgánica dos tipos particulares de espectroscopia son Vibraciones de tensión

especialmente útiles: la de resonancia magnética nuclear y la de infrarrojo.

Simétrica Asimétrica

Espectroscopía Infrarroja
Vibraciones de flexión

Es una técnica que permite identificar moléculas de una muestra

determinando la rigidez de los enlaces que existen entre ellas.
Los enlaces químicos de una molécula son capaces de vibrar a una Balanceo Tijereteo
en plano en plano
determinada frecuencia, que generalmente se localiza en el intervalo de la radiación
infrarroja (longitud de onda alrededor de los 1000 nm que corresponde a una
14
frecuencia de unos 3 x 10 Hz). Cuando una molécula absorbe un fotón pasa a
alcanzar un estado excitado lo que se traduce en vibración. La frecuencia Aleteo fuera Torsión fuera
del plano del plano
vibracional de las moléculas depende de:
 las masas de sus átomos (mA y mB en el caso de un enlace
covalente entre dos átomos A y B)
 la rigidez de sus enlaces (constante de fuerza del enlace k). Se llama “modo normal” a las distintas formas en las que puede una
molécula vibrar. Una molécula no lineal constituida por N átomos vibra 3N – 6
Si está formada por átomos livianos y enlaces rígidos mayor será la formas y una lineal 3N – 5 formas. El agua con N=3 vibra de 3 formas distintas
frecuencia vibracional en comparación con una molécula formada por átomos mientras que el benceno con N=12 puede hacerlo de 30 maneras diferentes.
pesados unidos por enlaces débiles. La molécula de H2O tiene 3 átomos. Por ser no lineal presenta 3 modos
Si los enlaces vibran a medida que un átomo se acerca o se aleja uno de vibracionales, dos son de tensión y uno de flexión.
otro, el movimiento se lo denomina estiramiento o tensión y puede ser simétrico o

96 97

Tensión simétrica
La molécula de CO2 posee también 3 átomos, pero al ser lineal presenta 4
modos normales vibracionales.
esta técnica puede utilizarse para identificar muestras a partir de las bandas de
absorción asociadas con los diferentes grupos.
El espectro manifiesta la intensidad de la absorción. En un espectro
infrarrojo típico se representa en el eje de las abscisas la escala de frecuencias
expresadas en número de onda mientras que en el de ordenadas se encuentran los
porcentajes de absorbancia (Abs) o transmitancia (%T).
En el espectro de un aminoácido se identifican los grupos funcionales que
Tensión asimétrica Vibración de flexión contribuyen a alguno de los picos que se forman en el espectro. Así se puede
registrar las imágenes de un espectro infrarrojo de glicina por absorbancia en
función de número de onda.

Tensión simétrica Tensión asimétrica Vibración Vibración

de flexión de flexión
degenerados

Cada molécula tiene un espectro infrarrojo determinado, es decir, presenta

una serie de absorciones complejas al realizar el barrido de longitudes de onda. Esa
región del espectro se la conoce como “huellas digitales” y permite identificar a una El espectro infrarrojo de glicina por transmitancia en función de número de
sustancia comparando su espectro con los de una biblioteca de espectros. Por ello onda obviamente es diferente.

98 99
 Además del estudio de moléculas orgánicas e inorgánicas, la
espectroscopía de infrarrojo se aplica en el análisis de polímeros y biopolímeros
para laboratorios de control y garantías de calidad en la industria farmacéutica y
alimentaria, en el análisis forense y en la investigación biomédica y bioquímica.

Fotocolorímetría y Espectrofotómetría

La Fotocolorimetría como la Espectrofotometría son métodos físicos

Aplicada esta técnica a compuestos orgánicos como acetona, el espectro
infrarrojo por transmitancia en función de número de onda de revela su perfil
particular.
basados en la medición de la luz absorbida por las partículas que se encuentran en
una solución coloreada, a una determinada longitud de onda, y se expresa como
densidad óptica. Para mantener la linealidad de la reacción, las determinaciones
deben realizarse a una longitud de onda que no concuerde con el máximo de
absorción.
La diferencia entre los instrumentos empleados en ambos casos es el
dispositivo usado para seleccionar el haz de luz de la longitud de onda. El
fotocolorímetro posee filtros de color; el espectrofotómetro, tiene un prisma o una
rejilla. Las longitudes de onda se seleccionan con un prisma de vidrio para la luz
visible y con un prisma de cuarzo o rejilla de difracción para la radiación ultravioleta.
En general, las determinaciones colorimétricas tienen lugar en la zona visible del
espectro, algunas en el ultravioleta y unas pocas en la región infrarroja.
La mayoría de los análisis realizados en el laboratorio son
espectrofotométricos.
Básicamente, estos instrumentos están formados por: una fuente luminosa,
un selector espectral, la celda o cubeta de absorción para colocar la muestra, un
detector de energía lumínica, y un sistema de procesamiento y lectura de la señal.
En los métodos fotocolorimétricos se incluye una célula fotoeléctrica, que al ser
excitada por la luz emitida, produce una corriente eléctrica que incide en un
galvanómetro, y que es proporcional a la cantidad de luz recibida.

100 101
 Las partes del instrumento son: depende la calidad de los datos obtenidos. Es imprescindible que se limpien
bien las cubetas, antes y después de usarlas.
 Detector de la energía lumínica: es un dispositivo que posee células
fotoeléctricas, que al ser alcanzadas por un haz luminoso, desprenden
electrones generando una corriente eléctrica cuya intensidad será proporcional
a la luz recibida. En el fotocolorímetro se registra en un galvanómetro.
 Sistema de procesamiento de señal y lectura: generalmente el procesador de
Fuente Rendija Mono Rendija Tubo con Detector Medidor señales es un dispositivo electrónico que amplifica la señal eléctrica que se
luminosa de cromador de la de
entrada salida muestra energía genera en el detector. Con respecto al dispositivo de lectura, en los
Esquema del Instrumental espectrofotómetros se utilizan medidores digitales y en el fotocolorímetro,
escalas graduadas. En este aparato hay dos escalas: una de 0 a 100, que
corresponde al porcentaje de transmitancia o luz transmitida (T), y otra que va
 Fuente luminosa: puede ser una lámpara ordinaria de tungsteno que genera
de 0 a 2, que representa la absorbancia (DO) en valores logarítmicos. Más
una radiación para una longitud de onda entre 350 y 2500 nm, o una lámpara de
frecuentemente se usa DO que T.
hidrógeno que produce luz UV (ultravioleta) cuyo espectro oscila entre 200 y
400 nm.
 Selector espectral: selecciona las radiaciones útiles para la experiencia, es
Análisis Colorimétrico
decir, las que pueden ser absorbidas. En el fotocolorímetro, son filtros
coloreados de cristal o gelatina, cuyo color se debe a la luz que se transmite. En
Inicialmente, el aparato se ajusta a cero con agua destilada. Se determina la
el espectrofotómetro se usa un prisma de vidrio, cuarzo o cloruro de sodio, el
DO de las soluciones de las muestras problema y testigo, si la sustancia que las
que permite trabajar con un haz de luz monocromática, es decir, a una longitud
compone es coloreada.
de onda definida y no a un rango de longitud de onda. Además, se puede
Si no es coloreada, se debe acoplar una reacción de color, que consiste en
seleccionar la luz monocromática con una rejilla que presenta pequeñas
hacer reaccionar la sustancia contenida en las muestras problema y testigo con
hendiduras ubicadas en un determinado ángulo.
algún reactivo, de modo de obtener un producto coloreado, cuyo color es
 Celda o cubeta de absorción: sirve para colocar la solución en estudio. Se
proporcional a la concentración de la sustancia en ambas muestras. Se debe incluir
fabrican con un material que permite el paso de la radiación. Cuando se trabaja
una tercera muestra denominada blanco de reactivos, que contiene el mismo
en la región comprendida entre 375 y 1000 nm se utiliza el vidrio de silicatos o
volumen que las soluciones problema y testigo pero en agua destilada, adicionado
cuarzo. Los recipientes de plástico también pueden emplearse para la región
de todos los reactivos de coloración. El color desarrollado por el blanco de reactivos,
visible. Del cuidado que se tenga en el uso y mantenimiento de las celdas
que es mínimo, debe ser restado del color desarrollado por las soluciones problema

102 103
y testigo, por cuanto no proviene de la cuantificación de la sustancia que se
determina indirectamente, sino de la reactividad entre algunos de los componentes
de color que permiten evidenciar la reacción.
A partir de la curva patrón o del factor de la solución standard se efectúan
los cálculos correspondientes.
Este método puede presentar los inconvenientes de coloraciones poco
estables, pHs extremos del medio, desplazamiento del equilibrio, contar con los
filtros a utilizar, entre otros.
Curva Patrón, Curva Testigo o Curva de Calibración
concentración de cada dilución se grafica en un sistema de coordenadas. La
Absorbancia o DO se ubican en la ordenada (eje y) y las concentraciones
respectivas en la abscisa (eje x). Al unir los puntos obtenidos, y si se cumple la Ley
de proporcionalidad de Lambert y Beer, se obtiene una recta.
Usando la curva patrón se puede conocer la concentración de la misma
sustancia en la solución problema. Para ello se determina su DO y con ese dato se
entra al gráfico desde la ordenada, se toca la recta, se baja a la abscisa y se
encuentra el valor de la concentración de esa sustancia en la solución problema. Por
ejemplo, si la DO de la muestra problema es 0,30, la concentración correspondiente
es 0,15 g / dl.

La curva patrón, testigo o de calibración se obtiene a partir del color PARTE EXPERIMENTAL
desarrollado por una misma sustancia a diferentes concentraciones. Con ella, y
conociendo la DO de la misma sustancia pero a una concentración desconocida, se A. Curva de Absorción Espectral. Relación entre Longitud de Onda () y
puede determinar indirectamente tal concentración. Absorbancia (A)

DO 1. Preparar soluciones de K2Cr2O7 1% y de KmnO4 0,1%.

0,5 2. Diluir la solución de K2Cr2O7 hasta obtener una concentración 0,5% (1: 2) (una
0,4 parte de K2Cr2O7 1% y una de agua).
0,3
3. Elegir la  menor y llevar la escala de DO del fotocolorímetro a cero con agua
0,2
destilada.
0,1
4. Medir y anotar la DO de la solución de K2Cr2O7 0,5%.
0 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30
5. Repetir este procedimiento con todas las  disponibles, ajustando a cero el
Concentración (g / dl)
aparato en cada caso.
6. Repetir la misma experiencia a partir de la solución de KMnO 4 0,1% y
Para realizar una curva patrón se preparan diluciones de la solución testigo. realizando una dilución 1:4 (una parte de KMnO4 0,1% y tres de agua).
Se determina en el aparato la DO de cada dilución, y con los datos de DO y de 7. Con los datos obtenidos de las dos soluciones, confeccionar dos gráficas en

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 papel milimetrado con los valores de DO en las ordenadas (eje y) y las
longitudes de onda en las abscisas (eje x).
B. Demostración de la Ley de Lambert y Beer

1. Partiendo de la solución de K2Cr2O7 1%, preparar 10 ml de cada una de las

siguientes diluciones: 0,75 - 0,50 - 0,25 - 0,10 - 0,05 %.
2. Utilizando la  en la que se observó mayor absorción, medir la DO de todas las
soluciones preparadas.
3. Realizar la misma práctica seleccionando una longitud de onda alejada de la
anterior.
4. Repetir el mismo procedimiento con la solución de KMnO4 0,1%.
5. Una vez concluida la experiencia, realizar una gráfica para cada solución, con
los datos obtenidos. Escribir las DO en las ordenadas y las concentraciones en
las abscisas.

C. Determinación de la Concentración de una Solución Problema de

K2Cr2O7

1. Medir la DO de una solución problema de K2Cr2O7.

2. Determinar su concentración utilizando la curva patrón.

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