Manual de producción de semillas en

laboratorio de Spondylus limbatus

Este documento debe citarse de la siguiente manera:
MAGAP (2016). Manual de producción de semillas de Spondylus limbatus. Subsecretaría
de Acuacultura-ESPOL TECH E.P, CENAIM-ESPOL

Este documento fue elaborado por el Centro Nacional de Acuicultura e Investigaciones

Marinas, Escuela Superior Politécnica del Litoral dentro del contrato CENAIM-ESPOL
“Servicios de Investigación Profesional y Exámenes de Laboratorio, Spondylus y
pepino de Mar” suscrito entre la Subsecretaría de Acuacultura del Ministerio de
Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca y la Empresa Pública ESPOL-TECH E.P.
Elaboración

Autores:
 Alfredo Loor 1
 Adrian Márquez 1
 César Lodeiros 1 2
 Daniel Rodríguez 1
 Stanislaus Sonnenholzner 1

1. Escuela Superior Politécnica del Litoral, ESPOL, Centro Nacional de Acuicultura e

Investigaciones Marinas, CENAIM, Campus Gustavo Galindo km 30,5 vía perimetral, Guayaquil
Ecuador.
2. Secretaría de Educación, Ciencia y Tecnología, SENESCYT, Programa Prometeo, Ecuador

Agradecimientos

A los departamentos de Moluscos y Fitoplancton del CENAIM-ESPOL por la contribución

técnica en la realización de los experimentos, al programa Prometeo-de la SENESCYT por
permitir la vinculación del Dr. César Lodeiros al CEANIM-ESPOL, a la empresa de servicios
públicos ESPOL-TECH por la administración del proyecto, a la Subsecretaría de Acuacultura
del Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca, a la comunidad de Ayangue en
especial a los buzos Ángel Apolinario Carlo Rodríguez por la colaboración en la toma de
especímenes para los experimentos, al Dr. Paul Valentich-Scott por permitir usar el set de
fotos y establecimiento de la taxonomía de la especie, y todas las personas que de una u otra
forma colaboraron con generación de la información que conforman de este Manual.

Todas las fotografías del manual han sido realizadas por los autores, salvo indicación
contrario.

1
 Prólogo

El cultivo de organismos marinos es una actividad que puede ser desarrollada y

acoplada fácilmente por comunidades costeras y usuarios tradicionales de estos
recursos, ya que está acorde con su forma de vida, constituyendo a su vez una
impronta importante de su dieta. El desarrollo de esta actividad productiva genera sin
dudas una fuente de ingresos para estas comunidades, pero lo más relevante de
destacar en su implementación es la potencial reducción de la extracción y captura de
los recursos naturales, calificando a la acuicultura como una herramienta eficaz para
la conservación de los recursos pesqueros y de la biodiversidad marino costera.

El Manual de producción de semillas en laboratorio de Spondylus limbatus, tiene como

finalidad generar una herramienta certera y de aplicación voluntaria para la
producción y especial mitigación de los efectos de la sobrepesca y a la inexistencia de
alternativas para la producción sostenible de las distintas especies de Spondylus que
existen en las costas Ecuatorianas, evidenciado principalmente en la alarmante
disminución de las poblaciones naturales, las cuales se encuentran en veda
permanente desde el 2009, hasta que existan estudios científicos de población y
aprovechamiento que sustenten las medidas de ordenamiento para establecer una
pesca responsable (Acuerdo Ministerial 136-2006, la Subsecretaría de Recursos
Pesqueros del Ministerio de Agricultura, Ganadería, Pesca y Acuicultura de Ecuador,
MAGAP), justo donde la producción de esta especie por actividades de acuacultura en
ambientes controlados, permite develar las características fisiológicas tempranas de
la especie y su implicación para la acuicultura, en concordancia con el Acuerdo
ministerial las investigaciones llevadas a cabo en Ecuador, producto del Contrato de
régimen especial para la prestación de los “Servicios de Investigación Profesional y
Exámenes de Laboratorio, Spondylus y Pepino de Mar” entre la Subsecretaría de
Acuacultura y la Empresa Pública ESPOL-TECH E.P han permitido desarrollar un
paquete tecnológico de producción de semillas de Spondylus limbatus en condiciones
de laboratorio para la recuperación de los bancos naturales diezmados por la
sobreexplotación de este icónico recurso marino y de esta manera, sentar las bases de
un manual de cultivo de producción de semillas de Spondylus limbatus.

El lenguaje empleado en el manual es técnico, sencillo de leer y comprender. El texto

se encuentra enriquecido con tablas, diagramas y fotografías, para mejorar el
entendimiento de protocolos y metodologías, proveyendo además referencias de
trabajos similares de producción larvaria de moluscos bivalvos, para comprender el
enfoque científico del documento, convirtiendo este manual en material didáctico que
podrá ser utilizado por estudiantes, académicos, científicos y profesionales en general
en áreas de acuicultura, manejo y conservación de recursos marino costeros y
conservación de recursos naturales, así como también por funcionarios
gubernamentales responsables en direccionar políticas pesqueras, sociales
productivas y ambientales.

2
 Presentación

Los moluscos y en particular los bivalvos suponen un grupo muy importante a nivel
ecológico, social y económico. En el 2012, de acuerdo con los datos estadísticos
suministrados por la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la
Alimentación (FAO), se han producido aproximadamente 15,2 millones de toneladas
(FAO, 2014) y suponen una alternativa para coadyuvar a responder la demanda de
alimentos dada la creciente población humana, donde la acuicultura surge como la
actividad principal para solventar dichas demandas, no solamente para la producción
hacia el consumo humano, sino como estrategia de restauración ecológica de los
bancos naturales sobreexplotados (Lodeiros, 2013).

El interés por cultivar una variedad de especies de bivalvos de importancia comercial

está aumentando entre los industriales del sector de la acuicultura en Latinoamérica,
en lo particular porque suponen una fuente relativamente económica de proteína
animal saludable y su producción deja menor huella ecológica comparada con peces y
crustáceos, por ser consumidores primarios (Lovatelli, 2007).

El desarrollo de la acuicultura de especies no alimentadas con piensos, en particular

de bivalvos marinos, aún no se ha investigado plenamente en América Latina y el
Caribe y el desarrollo del gran potencial que estas regiones tienen en la producción de
moluscos bivalvos pasa por establecer capacidades de producción de semillas (FAO
2014). En Ecuador el Centro Nacional de Acuicultura e Investigaciones Marinas
(CENAIM) de la Escuela Superior Politécnica del Litoral (ESPOL) se encuentra
atendiendo estas necesidades, en particular para el desarrollo de tecnologías de
producción de semillas de especies nativas, con una visión para el consumo directo y
la restauración ecológica, en función del desarrollo socio-económico del Ecuador.

En el caso de las especies de Spondylus, la puesta en práctica de una tecnología de

producción de semillas, ha sido un gran reto para el CENAIM-ESPOL y la Subsecretaría
de Acuacultura. El CENAIM-ESPOL, desde el año 2007 ha realizado investigaciones
para poner a punto dicha técnica de producción. Los estudios se iniciaron en un
principio financiado por el Banco Interamericano de Desarrollo, en el proyecto
“Cultivo de Moluscos con usuarios Tradicionales de Salango” consiguiéndose un
conocimiento básico de la reproducción en condiciones naturales y controladas
(Álvarez et al. 2008, Cobo et al. 2008) donde se lograron producir un centenar de
semillas, más sin embargo, no hubo un éxito en la producción masiva. Este
conocimiento junto con el obtenido en la presente propuesta financiada por la
Subsecretaria de Acuacultura, dentro del marco del proyecto de Maricultura y
Piscicultura para el Fomento Acuícola en el Ecuador bajo el contrato Servicios de
Investigación Profesional y Exámenes de Laboratorio, Spondylus y pepino de mar, con
el apoyo del proyecto Prometeo de la SENESCYT, ha permitido la optimización de la
tecnología de producción de semillas de Spondylus limbatus en condiciones de
laboratorio, del cual no tenemos la menor duda que es un importante logro para el
inicio de la producción y recuperación de los bancos naturales de esta especie tan
importante en el Ecuador y las costas tropicales y subtropicales del pacifico Este.

3
Contenido
Prólogo ....................................................................................................................................................... 2
Presentación............................................................................................................................................. 3
Índice Figuras........................................................................................................................................... 5
Glosario ...................................................................................................................................................... 7
Introducción ...........................................................................................................................................10
Taxonomía, clasificación, hábitat y distribución de Spondylus...........................................12
1,1. Anatomía adulta ...................................................................................................................................... 14
1,,2. Anatomía larvaria .................................................................................................................................. 15

Alimentación y nutrición ...................................................................................................................16

Reproducción .........................................................................................................................................18

Ciclo de vida ............................................................................................................................................19

Producción de semillas.......................................................................................................................23

Mínimos requerimientos de infraestructura .............................................................................23

6,1. Sala de cultivo de microalgas ............................................................................................................. 25
6,2. Sala de acondicionamiento de reproductores y desove ......................................................... 27
6,3. Sala de desarrollo larvario .................................................................................................................. 28
6,4. Sala de cría postlarvaria o precría ................................................................................................... 29
6,5. Laboratorio seco...................................................................................................................................... 30

Acondicionamiento de reproductores de Spondylus limbatus.............................................30

7,1. Traslado y limpieza de los organismos .......................................................................................... 30
7,8. Acondicionamiento para la reproducción .................................................................................... 31

Desove o expulsión de gametos de Spondylus limbatus .........................................................31

Fertilización y desarrollo embrionario de Spondylus limbatus ...........................................33

Desarrollo larvario de Spondylus limbatus .................................................................................34

Metamorfosis y asentamiento de Spondylus limbatus ............................................................36

Crecimiento postlarvario y juveniles de Spondylus limbatus ...............................................37

Fijación y crecimiento de juveniles................................................................................................38

Referencias .............................................................................................................................................39
Anexos
Protocolo de producción de alimento y alimentación de moluscos bivalvos en hatchery.
.......................................................................................................................................................... 41
Protocolo para el acondicionamiento, desove y desarrollo larvario ................................. 45
Protocolo para el recuento ovocitos y larvas.......................................................................... 52

4
 Índice Figuras
Figura 1. Especies de Spondylus del Pacífico Este y sus características de la concha:
A=Exterior de la valva izquierda, B= Exterior de la valva derecha, mostrando el área de
cementación, C= zonas laterales de los dientes de la valva izquierda (escala de la barra = 1
cm), D= Interior de la valva izquierda, E= interior de la valva derecha. Composición
realizada con permiso de autoría, libro de Coan y Valentich-Scott, 2012……………….....…… Pág.11

Figura 2. Distribución de la especie Spondylus limbatus …………………………………………… Pág.11

Figura 3. Anatomía interna general de Spondylus limbatus. 1: valva derecha; 2: valva

izquierda; P: pie, B: branquias; MA: musculo aductor; M: manto; G: gónada……………………. Pág.13

Figura 4. Anatomía interna de un Pectinoide. Imagen modificada. Author: K.D. Schroeder

(Scallop Diagram2.svg de Wikimedia Common; Licencia: CC-BY-SA 3.0)………. Pág.13

Figura 5. Esquema de la anatomía de la trocófora (fase final de la embriogénesis) y de la

larva veliger umbonada de un molusco bivalvo. Fotografía microscópica de la larva veliger
de Spondylus limbatus, mostrando el velo, estructuras internas y contenido
estomacal………………………………………………………………………………………………………………………. Pág.14

Figura 6. Diferentes estadios de desarrollo gonádico a Macho desovado/ b Macho post

desove/ c Hembra desovada/ d Hembra post-desove/ e Ejemplar indiferenciado/ f
Hembra en desarrollo…………………………………………………………………………………………………….. Pág.16

Figura 7. Simplificación del estado reproductivo de Spondylus limbatus en Ayangue,

provincia de Santa Elena, Ecuador según resultados en Mackensen et al. (2011), tomando
el diámetro de los ovocitos, clasificándolos en alto (>50 µm), medio (45-50 µm) y bajo
(<45 µm)………………………………………………………………………………………………………………………… Pág.17

Figura 8. Ciclo de vida de Spondylus limbatus: A)Etapa de vida Pelágica (Larvas) a Ovocito
viable/b ovocito fecundado/c primera división celular/d segunda división celular/e
tercera división/f cuarta división/g mórula/h gástrula ciliada/i larva trocófora/j larva
“D”/k veliger /l veliger umbonada /m veliger con ojo/ n pediveliger. B) Etapa de vida
Bentónica (Postlarvas) a post-larva sin fijar/ b juvenil sin fijar/ c juveniles sin fijar en
sustrato duro/ d juvenil recién fijado / e juvenil fijado de más de 3 meses f y g juveniles
fijados de más de un año. ……………………………………………………………………………………………….. Pág.20

Figura 9. A) Sistema de bombeo y filtracion adaptado para la produccion de Spondylus

limbatus B: Bombas/FA: Filtros de Arena (40-10 micras)/FC: Filtros de Cartucho (10-1
micras)/ TRC: Tanque Reservorio/RC: Recirculacion/ CA: Calentador de Agua/EA:
Enfriador de Agua/FM: Micro Filtro (1-0,45 micras)/UV: Esterilizadora Luz Ultra Violeta,
B) Esquema generalizado de la infraestructura necesaria para la producción de semillas de
moluscos bivalvos, adaptada a la producción de Spondylus limbatus /TCC: Tanques cilindro
conicos(500 y 200 L), distribucion de las areas de trabajo necesarias para la produccion de
semillas 1 Aspiración del mar/ 2 Reproductores y semillas: filtrado con materiales
microporosos a 10 micras tanques rectangulares de 400 L (reproductores) y 200 L
(semillas)/ 3 Larvas y post larvas: filtrado con materiales microporosos a 0,45 m/ 4
Fitoplancton: filtrado con materiales microporosos a 0.45 µm/ 5 Cepario/ 6 Almacen/ 7
Sala de Reactivos/ 8 Laboratorio Seco/9 Oficina. …………………………………………………………. Pág.22

Figura 10. Diferentes fases del cultivo escalonado de microalgas en el CENAIM-ESPOL. a Pág.25

5
cultivo en placas/ b tubos de ensayo 10 ml/ c erlenmeyer 250 ml/ d botellones 4 L/e
carboys 50 y 100 L/ f tanques exteriores de cultivos masivos 1000L………………………………..

Figura 11. Tanques de gran volumen para el acondicionamiento de Spondylus limbatus… Pág.26

Figura 12. Tanques de cultivo sala de larvas tanques de 500L cilindro cónicos a y tanques
de fondo plano de 1000L de capacidad b…………………………………………………………………………. Pág.27

Figura 13. a Faena de limpieza/ b disposición de Spondylus limbatus en el CENAIM-ESPOL

para el acondicionamiento para el desove…………………………………………………………… Pág.30

Figura 14. a Preparación para inducción a desove de Spondylus limbatus en contenedores

de 25-30 L, en función de obtener gametos masculinos y femeninos separados, previos a la
fecundación controlada/ b Gametos femeninos de color rojizo/ c gametos masculinos de
color blanquecino……………………………………………………………………………………. Pág.30

Figura 15. Ciclo de vida de Spondylus limbatus: a huevo liberado por desove/ b expulsión
del cuerpo polar/ c primer clivaje/ d segundo clivaje/ e tercer clivaje/ f mórula/ g
gástrula ciliada/ h larva trocófora/ i larva “D”/ j larva veliger/ k larva umbonada/ l larva
con mancha ocular/ m pediveliger/ n postlarva libre/ o juvenil libre/ p juvenil
cementado……. Pág.32

Figura 16. Larvas “D” veliger de Spondylus limbatus………………………………………………………… Pág.33

Figura 17. Faena de recambio de agua y alimentación en el desarrollo larvario de

Spondylus limbatus en el CENAIM-ESPOL………………………………………………………………………… Pág.33

Figura 19. Bioensayos experimentales para determinar el mejor sustrato de asentamiento

y fijación de postlarvas y juveniles de Spondylus limbatus. a sacos de confinamiento de los
sustratos/ b malla sombra/ c concha de Crassostrea gigas/ d sustratos en suspensión/ e
tanques de sustratos de fondo/ f distintos tipos de sustratos
probados………………………………………………………………………………………………………………………… Pág.35

Figura 20. a Juveniles de Spondylus limbatus fijos a diferentes sustratos/ b concha de

adultos de Spondylus / c piedras de cemento/ d lijas de color rojo…………………………………
Pág.36

6
Glosario

Algas: plantas acuáticas que se reproducen por esporas

Altura de la concha: de la distancia en línea recta desde el umbo hasta el margen
ventral de la concha
Axis dorso-ventral (Alto): distancia máxima medida desde la posición de entrada de
alimento (anterior) y la salida tanto del flujo de agua como de productos de excreción
y pseudoheces (posterior)
Axis antero-posterior (Largo): distancia medida desde la zona del umbo (posterior)
hasta la zona terminal de la concha opuesto al umbo (anterior)
Distancia Máxima entre valvas: es la mayor distancia medida entre las dos valvas de
un molusco bivalvo.
Axénico: cultivo de especies en condiciones de esterilidad
Biso: filamentos que los bivalvos utilizan para adherirse a un sustrato
Bivalvo: molusco pelecípodo con concha de dos valvas unidas por una charnela
Branquia: apéndice en forma de hoja que sirve para la respiración y filtración de
alimentos en el agua (también llamado ctenidio)
Cigoto: célula resultante de la unión de los gametos masculino y femenino
Cilios: filamentos cuyo movimiento rítmico produce una corriente de agua en los
bivalvos
Ctenidios: apéndices en forma de hoja que respiran y filtran alimentos en el agua
(también se utiliza el término «branquias»)
Cuerpo polar: células diminutas liberadas durante la división meiótica del óvulo
después de la penetración del espermatozoide. Contienen el exceso de material
cromosómico para formar un óvulo haploide
Charnela: zona dorsal de la concha de los bivalvos donde se unen las dos valvas
Detrito: material orgánico procedente de la descomposición de restos animales o
vegetales
Diatomea: alga unicelular bacilariofícea; las células están encerradas en un caparazón
silíceo o frústula y pueden formar cadenas
Dioico: organismo en el que se producen los gametos masculinos y femeninos
en diferentes individuos
Diploide: número normal de cromosomas (2n) en una célula
División meiótica: proceso en el que un número normal de cromosomas (2n) se
reduce al número haploide (n)
Embrión: organismo en las primeras fases de desarrollo; en los bivalvos, antes de la
etapa larvaria
Engorde: proceso de cultivo de semilla producida en criadero hasta alcanzar la talla
comercial
Exhalante: zona del bivalvo desde la que el agua fluye hacia el exterior
Exótico: proveniente de otro país o región geográfica
Fecundación: unión del óvulo y el espermatozoide fertilización
Fijación: proceso de comportamiento de las larvas maduras que consiste en buscar
un sustrato adecuado donde adherirse
Flagelados: grupo de algas unicelulares caracterizadas por disponer de un órgano
locomotor o flagelo

7
Gameto: célula sexual madura, haploide y funcional capaz de unirse a la del sexo
contrario para formar un cigoto
Gametogénesis: proceso por el que se forman óvulos y espermatozoides
Inhalante: zona de los bivalvos donde el agua fluye hacia el interior
Lámina branquial: lámina u hoja de la branquia de un bivalvo
Larva de charnela o larva D: la fase veliger inicial de los bivalvos, posterior a la larva
trocófora.
Larva veliger: la fase larvaria de la mayoría de los moluscos, caracterizada por la
presencia de un velo
Larva: fase del desarrollo de los bivalvos desde el embrión hasta la
metamorfosis
Ligamento: material fibroso elástico que une las dos valvas de un bivalvo a través de
la charnela
Línea paleal: ligera línea circular sobre la superficie interior de la concha de los
bivalvos, que señala la adherencia del manto a la concha
Longitud de la distancia en línea recta desde el margen anterior al margen posterior
concha de la concha
Mancha ocular: órgano fotosensible que se desarrolla cerca del centro de la larva
madura de algunos bivalvos
Manto: pliegue blando segregado por la concha que encierra el cuerpo del bivalvo
Material de fijación: material utilizado para recolectar semilla de bivalvos
Metamorfosis: en los bivalvos, el período de transformación entre la fase larvaria y la
fase juvenil
Microalgas: pequeñas algas del tamaño de una célula, diatomeas unicelulares o en
cadena, cultivadas en los criaderos como alimento para larvas y semilla
Microlitro (μl): la millonésima parte de un litro o la milésima parte de un ml
Micrómetro (μm): la millonésima parte de un metro o la milésima parte de un mm
Monoico: organismo que produce tanto los gametos masculinos como femeninos en
el mismo individuo
Monomiario: bivalvos con un músculo aductor, p. ej. ostras y vieiras
Músculo aductor: músculo grande que ejecuta movimientos de cierre entre las dos
valvas
Palpo: apéndice sensorial que acompaña el aparato bucal, facilitando la introducción
de alimentos
pH: medida de acidez o alcalinidad
Plancton: organismo acuático flotante o con escasa autonomía en el agua, puede ser
fitoplancton (plantas) o zooplancton (animales)
Planctotrófico: organismo que se alimenta de plancton
Posterior: trasero, alejado de la cabeza
Pseudoheces: heces falsas, material residual no absorbido por el aparato digestivo
PSU: unidades prácticas de salinidad. Una medida de salinidad, equivalente a partes
por mil
PUFAs: ácidos grasos poliinsaturados
Resilio, ligamento: parte interna del ligamento localizado a lo largo de la charnela de
interno un bivalvo que produce la apertura de las valvas cuando se relaja el músculo
aductor

8
Salinidad: el contenido en sales del agua de mar, normalmente medido en partes por
mil (ppt) o en unidades prácticas de salinidad (PSU)
Semilla: en bivalvos es un término técnico referido a la talla manipulable, y de (poca
mortalidad) en cultivo en el exterior. En un criadero, son juveniles de tamaño
comercial.
Tentáculo: protuberancia sin segmentaciones que sobresale del borde del manto con
una función sensorial especializada
Trocófora: fase planctónica en el embrión del bivalvo
Umbo: proyecciones picudas en la parte dorsal de la concha. Es la parte más vieja de
la concha
Valva: una de las dos partes de la concha de un bivalvo, una concha está compuesta de
dos valvas
Velo: órgano ciliado locomotor de las larvas
Ventral: perteneciente a la parte inferior de un animal
Seston: agregado de partículas y microorganismos que flotan o precipitan en agua,
compuesto de los detritos orgánicos (tripton) y organismos vivos en suspensión
(plancton) y las partículas que precipitan en calma (senton)
Sestotróficos: organismo que se alimentan del seston
Gonocórica: organismos unisexuados o de sexos separados.
Prodisoconcha: concha secretada por la glándula de la concha en la larva de bivalvos.
Disoconcha: concha secretada después de la metamorfosis de la larva; difiere en
escultura y forma de la prodisoconcha y la prodisoconcha 2.
Provínculo: precursor de la charnela en larvas, en adultos consiste en dientes
pequeños a lo largo de la parte media del margen de la charnela.
Ctenolium: formación de pequeños dientes en la muesca bisal de bivalvos
pectinoides.

9
 Introducción

Los Spondylus en las costas del Pacífico Latinoamericano han jugado un papel muy
importante en términos económicos, políticos, culturales y religiosos. El uso del
Spondylus, principalmente de sus conchas, alcanzó gran importancia en distintas fases
del poblamiento americano, especialmente, en las antiguas civilizaciones andinas y de
la costa pacífica de Sudamérica (Carter, 2011). Estas conchas fueron elementos
significativos del comercio a larga distancia entre los pueblos de la costa del pacífico
americano y las tierras altas andinas de Sudamérica (Paulsen, 1974). No obstante, ya
en décadas pasadas, valorizado por su carácter ornamental y atractivo de su carne, ha
sido considerado un recurso pesquero con alto valor comercial para fines de consumo
humano, siendo un fuerte atractivo para incluirse en programas de maricultura
(Villalejo y Muñeton 2002, Soria et al. 2010).

En Ecuador a inicios de los 90’s, la extracción de Spondylus surgió nuevamente como

recurso de importancia comercial como fuente de alimento y fabricación de
artesanías, resultando en un alto decrecimiento poblacional a lo largo de la costa
Ecuatoriana (Mackensen et al. 2011). Por esta razón, en octubre del 2009, mediante el
Acuerdo Ministerial 136, la Subsecretaría de Recursos Pesqueros del Ministerio de
Agricultura, Ganadería, Pesca y Acuicultura de Ecuador (MAGAP), declara la veda
permanente las especies de Spondylus de las costas ecuatorianas, sobre cualquier
forma de captura, transporte, comercialización y consumo, hasta que no existan
estudios científicos de población y aprovechamiento que sustenten las medidas de
ordenamiento para establecer una pesca responsable. Esta situación sugiere que la
especie está en peligro de extinción, al menos como ítem pesquero, tal como se le ha
caracterizado en las costas de Baja California Sur (Baqueiro et al. 1982), siendo
protegida también en México donde la extracción no está permitida, a no ser por
autorización de la Secretaría del Medio Ambiente a través de permisos especiales
(Norma Oficial Mexicana-059 ECOL, 1994).

Dada esta inquietud de sobreexplotación del recurso Spondylus, la Subsecretaría de

Acuicultura del MAGAP, en conjunto con el CENAIM-ESPOL, tras la búsqueda de
soluciones para la recuperación de los bancos naturales, establecen estudios
conducentes a la elaboración de una tecnología de producción de semillas de la
especie Spondylus limbatus, dentro de la actividad de sistemas de cultivo para la
producción de peces, ostras, conchas prietas, y especies de Spondylus del componente
3 de producción de cultivos acuícolas marinos del proyecto maricultura y piscicultura
para el fomento acuícola del Ecuador.

El presente manual de producción de semillas de Spondylus limbatus, es producto de

esta iniciativa y representa de forma esquematizada los resultados obtenidos de
ensayos sobre acondicionamiento de reproductores, evaluación de métodos de
inducción a desove, desoves, larviculturas, diseño de dietas para larvas, pruebas de
tipos de sustratos para mejorar el asentamiento y dietas para optimizar el crecimiento
de post-larvas y juveniles. Todos estas investigaciones, han permitido establecer la
descripción del desarrollo embrionario, larvario y post-larvario, comportamiento

10
durante el asentamiento, las características fisiológicas de la especie y su implicación
para la acuicultura, y de esta manera, sentar las bases de un manual de cultivo de
producción de semillas de Spondylus limbatus. El cual se divide en varios capítulos, el
mismo fue escrito con el aporte de investigadores y técnicos del laboratorio de cultivo
de moluscos bivalvos, bajo la guía del investigador Dr. Cesar Lodeiros, vinculado al
CENAIM-ESPOL a través del programa Prometeo auspiciado por la Secretaría de
Educación, Ciencia y Tecnología del Ecuador (SENESCYT). En cada capítulo se provee
el conocimiento científico, experiencia y metodología utilizada para el mantenimiento
y maduración de reproductores, y cultivo larvario y juveniles de Spondylus limbatus.
En los primeros capítulos se provee información taxonómica, especies de Spondylus
reportados en aguas continentales de la costa ecuatoriana, características del habitad
y distribución. Se incluyen los rasgos anatómicos completos de la especie tanto de
ejemplares adultos como de larvas y juveniles. El capítulo siguiente se describe
brevemente los requerimientos alimenticios y nutricionales para la maduración,
reproducción y cultivo larvario de los moluscos con énfasis en las experiencias
obtenidas para el cultivo de Spondylus. La etapa de reptación de postlarvas de S.
limbatus es descrita por primera vez en el ciclo de vida de la fase larvaria de
Spondylus. En este último capítulo se detallan los requerimientos de infraestructura,
las técnicas para el acondicionamiento, maduración y desove de reproductores
silvestres, así como protocolos zootécnicos empleados en el cultivo larvario y
postlarvario para la producción de semillas competentes de Spondylus limbatus.

11
 Taxonomía, clasificación, hábitat y distribución de Spondylus

En la Clase bivalvia, las especies del único género Spondylus pertenecen a la Familia
Spondylidae (Gray, 1826) ubicado en el Orden Pectinoidea Rafinesque, 1815 de la
Subclase Pteriomorphia Berlen, 1944.

En las costas ecuatorianas según Mackensen (2011), solo se pueden encontrar 3

especies de Spondylus, denominadas como Spondylus princeps (Broderip, 1833),
Spondylus leucacanthus (Broderip, 1833) y Spondylus calcifer (Carpenter, 1857); no
obstante, estudios taxonómicos recientes del género Spondylus (Coan y Valentich-
Scott, 2012) desarrollan una reclasificación, donde se infiere que en las costas
ecuatorianas pueden encontrase 4 especies, incluyendo a Spondylus gloriosus Dall,
Bartsch, & Rehder, 1938 (sinónimos: Spondylus nicobaricus, Spondylus tenebrosus y
Spondylus linguaefelis) además de las 3 nombradas por Mackensen (2011) las cuales
pasan a renombrase como Spondylus crassisquama Lamarck, 1819 (sinónimos:
Spondylus princeps, Spondylus dubius, Spondylus basilicus y Spondylus princeps
unicolor), Spondylus leucacanthus Broderip, 1833 (sinónimos: Spondylus ursipes,
Spondylus pictorum, Spondylus princeps y Spondylus victoriae) y Spondylus limbatus G.
B. Sowerby II, 1847 (sinónimos: Spondylus calcifer, Spondylus rádula, Spondylus smithi
y Spondylus lamarckii).

Para el presente manual hemos tomado la nomenclatura y clasificación reciente de

Coan y Valentich-Scott (2012), donde se expone que las especies del género Spondylus
pueden ser clasificadas por la extensión de la cementación, normalmente en la valva
derecha, como lo hace los individuos de Spondylus limbatus, los cuales se fijan al
sustrato con más de la mitad de la valva derecha. Otra característica distintiva de estas
especies, es la coloración de las zonas laterales de los dientes de la valva izquierda,
blancos como en Spondylus leucacanthus y marrón como en Spondylus crassisquama,
así como el largo y tipo de espinas, como las características espinas pequeñas tipo
agujas de Spondylus gloriosus. Estas características en las diferentes especies se
presentan en la Figura 1.

Spondylus limbatus es la especie más grande de los Spondylus, generalmente mide

unos 150 mm de talla máxima de la concha, pero puede llegar a tallas de 250 mm,
habita en fondos rocosos o pedregosos, y aunque se le puede encontrar en la zona
intermareal baja, frecuentemente se encuentra en la zona submareal, hasta 40-55 m
de profundidad. Su distribución abarca desde Rocas Alijos en la costa del pacífico de
baja california Sur, Golfo de California hasta el Norte en Bahía Choza, Sonora, México y
hasta Tumbes, Perú (Coan y Valentich-Scott, 2012) (Fig. 2).

12
Figura 1. Especies de Spondylus del Pacífico Este y sus características de la concha: A=Exterior de
la valva izquierda, B= Exterior de la valva derecha, mostrando el área de cementación, C= zonas
laterales de los dientes de la valva izquierda (escala de la barra = 1 cm), D= Interior de la valva
izquierda, E= interior de la valva derecha. Composición realizada con permiso de autoría, libro de
Coan y Valentich-Scott, 2012.

Figura 2. Distribución de la especie Spondylus limbatus

13
Los ejemplares de Spondylus limbatus poseen una cocha irregular y redondeada,
cambiando con el crecimiento a tosca, pesada y distorsionada, son de un color exterior
amarillo, naranja o rojo purpura (nunca blanco), que hace juego con una banda ancha
de color interior en todo el margen de la concha. Aunque en los organismos grandes
frecuentemente no se pueden diferenciar mucho las espinas, poseen espinas
irregulares, con espinas tipo sable o espada curvada (espátula), su valva derecha
posee un área de fijación o cementación de moderada a grande. La zona de la bisagra
al lado de los dientes en la valva izquierda (superior) es de color marrón.

1,1. Anatomía adulta

Los Spondylus poseen una anatomía interna similar a la de los pectínidos, dado su
parentesco en el orden Pectinoidea. De esta manera la familia Spondylidae es
cercanamente relacionada con la Pectinidae, ellos poseen ojos complejos alrededor
del manto y un sistema nervioso bien desarrollado (Mackensen et al. 2011).

Al hacer una disección, y al retirar una de las valvas, se aprecian los órganos y tejidos
internos embebidos en un manto, con 2 lóbulos fusionados en la parte dorsal. En su
borde se ubican los tentáculos sensoriales y los ojos paleales, lo cual junto con un
sistema nervioso bien desarrollado, son componentes claves que los emparenta con
los pectínidos. El músculo aductor es el tejido más representativo, por ser una especie
monomiaria, carece de músculo aductor posterior; el músculo en los Spondylus ocupa
sobre el 50% en peso de toda la masa del tejido, evidenciando su función de cerrar las
grandes y pesadas valvas. Las gónadas durante la gametogénesis son conspicuas,
sobre todo cuando éstas alcanzan un elevado grado de madurez, cargadas de ovocitos
en que el dan un color rojizo-anaranjado en las hembras, y cremoso-blanquecino por
los espermatozoides en los machos, alcanzando un gran porcentaje del contorno
muscular, extendiéndose hasta el borde ventral de las valvas. Otro órgano conspicuo
lo conforman los ctenidios o branquias, que cumplen con la función de respiración y
selección de partículas para la alimentación, las cuales serán encaminadas a los palpos
labiales, que son estructuras carnosas de extensión de la boca de los bivalvos y donde
se hace una segunda selección de partículas para ser aceptadas al tracto digestivo o
bien rechazadas y envueltas en un mucus para expulsarlas (pseudoeses). La glándula
digestiva o hepatopáncreas, se observa como una masa globosa de color parduzco,
muchas veces camuflada por tejido reproductivo que se extiende sobre ella, se
encuentra en la parte dorsal-anterior, entre el umbo y el músculo aductor. El riñón se
presenta como un órgano de color marrón oscuro ubicado en el lado anterior del
músculo en contacto con la gónada. El pie, que es de color naranja y se encuentra
localizado en el margen anterior de la masa visceral, todos estos órganos y tejidos se
pueden apreciar en la Figura 3 de un organismo de Spondylus limbatus mantenido en
el laboratorio del CENAIM, y en un esquema general de un pectinoide presentado en el
presente manual (Fig. 4).

14
 Figura 3. Anatomía interna general de Spondylus limbatus. 1: valva derecha; 2: valva izquierda; P:
pie, B: branquias; MA: musculo aductor; M: manto; G: gónada.

Figura 4. Anatomía interna de un Pectinoide. Imagen modificada. Author: K.D. Schroeder (Scallop
Diagram2.svg de Wikimedia Common; Licencia: CC-BY-SA 3.0).

1,,2. Anatomía larvaria

Luego de la fertilización, los ovocitos sufren una división meiótica, reduciéndose el
número de cromosomas a un número haploide, antes de la fusión de los pronúcleos
masculinos y femeninos para formar el cigoto. Durante la división meiótica se liberan
dos cuerpos polares, los cuales al hacerse visibles indican que se ha conseguido la
fecundación. La división celular comienza, comúnmente antes de 30 min, el huevo se

15
divide en dos células, continuando las divisiones para el proceso de embriogénesis,
este proceso junto con el larvario varía según la especie y factores ambientales
presentes, particularmente temperatura. En general, en los moluscos bivalvos en las
24h luego de la fecundación, se desarrollan fases multicelulares de blástula y gástrula,
convirtiéndose en una trocófora con motilidad. Las trocóforas son de forma ovalada,
de un tamaño de 60-80 µm y disponen de una fila de cilios alrededor del centro con un
largo flagelo apical que facilita la natación. Luego de la trocófora, se inicia el desarrollo
larvario la larva de charnela recta, “D” o Prodisoconcha I, éstas miden generalmente
de 80-100 µm. Las larvas “D” tiene dos valvas, un sistema digestivo completo y un
velo, órgano circular ubicado en la zona ventral sobresaliendo de las valvas, posee una
serie de cilios a lo largo del margen exterior, lo cual les permite nadar y atraer
partículas para la alimentación. En varios días, las larvas desarrollan unas
protuberancias en la parte dorsal, llamadas umbos, en la concha cerca de la charnela,
avanzando el crecimiento se desarrolla más el umbo generando la larva umbonada
umbonada y comienza a depositarse la prodisoconcha II. La figura 5 muestra un
esquema morfológico de la fase final de la embriogénesis-trocófora y larva
pediveliger, acompañada de una larva pediveliger de Spondylus limbatus producida en
el CENAIM-ESPOL. Esta identificación, junto con la aparición de la macha ocular (cerca
del centro de cada valva en algunas especies) y el desarrollo del pie ha sido utilizada
para indicar que las larvas se encuentran competentes para la metamorfosis y fijación
o asentamiento, para incurrir en el desarrollo de postlarvas.

Figura 5. Esquema de la anatomía de la trocófora (fase final de la embriogénesis) y de la larva

veliger umbonada de un molusco bivalvo. Fotografía microscópica de la larva veliger de Spondylus
limbatus, mostrando el velo, estructuras internas y contenido estomacal.

Alimentación y nutrición

La alimentación y nutrición es uno de los aspectos fundamentales para comprender la

biología de las especies, su papel en los ecosistemas es fundamental. Los pectinoides
son filtradores suspensívoros, ya que obtienen su alimento de las partículas en
suspendidas en el agua circundante de su habita. El fitoplancton es la principal fuente
de alimentos, por lo que se consideran herbívoros. Sin embargo, dada la capacidad de
ingerir tanto las partículas vivas como las inertes del seston, también se ha propuesto
considerarlos sestotróficos (Lucas 1982).

16
En el cultivo de moluscos el alimento utilizado lo componen las microalgas. Aunque
algunos estudios han ensayado formulaciones para ser sustitutos o aditivos tales
como algas secas, pastas de algas, microencapsulados, dietas a base de levaduras
(Coutteau y Sorgeloos 1992), las investigaciones hasta ahora realizadas no muestran
que dichas formulaciones puedan lograr ser sustitutos nutricionales adecuados del
alimento vivo compuesto por microalgas, aparte de no ser, por ahora,
económicamente viables. De estas formulaciones, las emulsiones lipídicas
enriquecidas en ácidos grasos altamente insaturados (HUFA n-3) constituyen una
fuente interesante para estudiar la complementación y substitución de las dietas
microalgales y su efecto en la nutrición de bivalvos (Farías 2001).

En los moluscos bivalvos, la alimentación comienza cuando la larva forma su concha,

larvas D, y han desarrollado su aparato digestivo. La energía para los procesos
metabólicos en los estadios previos a la larva D, provienen de las reservas depositadas
durante la ovogénesis cuando las hembras se hacen competentes para la
reproducción. Es por ello que durante la embriogénesis hasta larva D en cultivo no se
le acostumbra suministrar alimento, aunque en muchas laboratorios de cultivo
larvario se le adiciona alimento ya que se ha comprobado que puede incorporarse
nutrientes orgánicos disueltos en el agua, los cuales podrían incrementar su calidad
nutricional (García-Pámanes et al. 2011).

El velo desarrollado en las larvas “D” les permite, además del movimiento natatorio,
alimentarse, creando corrientes que atraen las partículas en suspensión a la boca para
la ingesta. A partir de este momento las dietas microalgales utilizadas como alimento
en el cultivo son muy importantes tanto en la cantidad como en la calidad.

El valor alimenticio de un alga en particular viene determinado no sólo por su

composición bioquímica sino también por su ingestibilidad y digestibilidad. Las
microalgas son muy variadas y su efecto en la alimentación y nutrición de larvas de
moluscos bivalvos es variado. Las especies de microalgas con espinas largas como
algunas diatomeas (Phaeodactylum spp.) son inapropiadas de ingerir por las larvas,
otras microalgas tienen paredes celulares gruesas (Chlamydomonas coccoides) que
limitan su ingestión, o bien existen microalgas con excelentes condiciones de ingestión
(Dunaliella tertiolecta) pero poseen una composición bioquímica que aporta un bajo
valor nutricional a las larvas (Helm et al. 2006).

Como todos los organismos, los moluscos bivalvos requieren de una dieta balanceada
en macronutrientes (lípidos, proteínas y carbohidratos) y micronutrientes (minerales,
vitaminas, pigmentos, etc.), los cuales son suministrados por las dietas microalgales;
no obstante, los requerimientos lipidicos de los bivalvos, son la clave para la
escogencia de microalgas. En este sentido, los ácidos grasos altamente insaturados
(PUFAs) del tipo omega 3, principalmente los ácidos eicosapentaenóico (20:5n-3) y
docosahexaenoico (22:6:n-3) constituyen nutrientes esenciales para larvas y juveniles
de pectínidos (García-Pámanes et al. 2011). En vista de ello, se hace necesario la
selección de microalgas como dietas que cumplan los requerimientos macro y

17
micromoleculares, y posean constituyentes lipídicos adecuados, aparte de ser
fácilmente ingeribles y digeribles, para la producción de semillas en las laboratorios
de cultivo larvario de moluscos, las cuales por la logística de producción utilizan una
especie de microalgas o la combinación de 2 o en raras ocasiones 3 microalgas. En el
caso de Spondylus limbatus nuestras investigaciones indican que las microalgas
Chaetoceros gracilis e Isochrysis galbana son especies adecuadas para la dietas tanto
de acondicionamiento de los reproductores como para el desarrollo larvario (Loor et
al. 2015 a,b). Mientras que una combinación de Chaetoceros muelleri y Pavlova lutheri
muestran rendimientos superiores a los de otras microalgas en la fases post-larvaria
al compararlas con las clásicas Chaetoceros gracilis e Isochrysis galbana.

Reproducción

La especie Spondylus limbatus es de sexos separados, gonocórica o dioca (Villalejo-

Fuerte et al. 2002) con fecundación externa, aunque no hay estudios exhaustivos y
específicos que puedan indicar hermafroditismo en la especie, Mackensen et al.
(2011) reporta algunos ejemplares con signos de hermafroditismo (hembras con la
gónada naranja debido a ovocitos con puntos blancos debido a gametos masculinos).
En nuestros estudios algunos organismos utilizados para la reproducción que han
desovado como hembras, han resultado ser machos al ser reutilizados luego de un
tiempo (4-6 meses), lo cual sugiere que hay cierto hermafroditismo por alternancia de
sexos. A pesar de ello, las investigaciones realizadas sobre reproducción de esta
especie en el medio natural muestra que la proporción Hembra: Macho es de 1:1,
aunque existe una tendencia de mayor abundancia de machos. En la naturaleza y
mediante el análisis de cortes histológicos (Fig. 6), la talla mínima de reproducción, ha
sido estimada en 86-113 mm y la fecundidad, en número de huevos se encuentra
entre 3-35 millones de huevos (Villalejo-Fuerte et al. 2002, Mackensen et al. 2011),
Soria et al. (2010) estimó una media de 48,9 –SD 13,2 millones de huevos expulsados
tras la inducción del desove, con una correlación del número de huevos según la talla
de los organismo. La liberación de ovocitos, en los bioensayos para la realización del
presente manual, ha sido en un intervalo de 1,5 a 30 millones.

Figura 6. Diferentes estadios de desarrollo gonádico a Macho desovado/ b Macho post desove/ c
Hembra desovada/ d Hembra post-desove/ e Ejemplar indiferenciado/ f Hembra en desarrollo

18
En general, los ciclos reproductivos de los invertebrados marinos, están regulados por
factores endógenos que responden a cambios en el medio ambiente, por lo cual la
periodicidad con que se reproducen los organismos depende de factores ambientales
asociados a la latitud y la zona donde habitan, tales como el fotoperiodo, la
temperatura, la salinidad y la disponibilidad de alimento en el agua, entre otros. En
zonas aledañas a la Playa de Ayangue, Provincia de Santa Elena, Spondylus limbatus
muestra actividad reproductiva todo el año, con mayor sincronismo en el período
octubre-diciembre, cuando la temperatura superficial del mar disminuye y la biomasa
fitoplanctónica es alta, sugiriendo a estos dos factores como moduladores de la
reproducción (Mackensen et al. 2011). Este comportamiento es similar a los
observados en otras latitudes de la distribución de Spondylus limbatus, sugiriendo a la
temperatura como el factor preponderante en la modulación de la reproducción
(Villalejo-Fuerte et al. 1998, Cota 2011). En el presente manual se ha construido un
modelo, simple y de uso práctico, del estado reproductivo de Spondylus limbatus (Fig.
7) siguiendo los datos expuestos por Mackensen et al. (2011); no obstante, es
importante indicar que los factores ambientales de las aguas de la costa ecuatoriana
son muy variables dado su enclave en el trópico y los diferentes fenómenos que
confluyen en ella, particularmente eventos de surgencia e interacción entre corrientes,
lo cual sugiere comportamientos diferentes del estado reproductivo de Spondylus
limbatus en diferentes zonas de la costa ecuatoriana, y hasta posiblemente en una
misma localidad.

Figura 7. Simplificación del estado reproductivo de Spondylus limbatus en Ayangue, provincia de

Santa Elena, Ecuador según resultados en Mackensen et al. (2011), tomando el diámetro de los
ovocitos, clasificándolos en alto (>50 µm), medio (45-50 µm) y bajo (<45 µm).

Ciclo de vida

Los Spondylus, al alcanzar la madurez sexual, liberan los gametos al mar, donde ocurre
la fertilización. Los estudios en nuestro laboratorio muestran a los ovocitos
fecundados de forma casi esférica, midiendo unas 60 µm, apareciendo el cuerpo polar
a los 10-15 min; posteriormente una serie de divisiones y segmentaciones que
comienzan a los 30-40 min luego de la fecundación concluyen en una mórula (3 h),
luego en blástula (5 h) y gástrula (6h) durante el desarrollo embrionario, hasta que se
convierte en trocófora temprana ya con actividad motora, debido al desarrollo de

19
cilios a las 9 h. A las 12 h, la trocófora se encuentra bien desarrollada, aún con
dimensiones similares al ovocito fecundado. A las 18 h las trocóforas evolucionan
hacia la típica forma D, alcanzando tallas de unas 80 µm, y a las 26 h ya se convierte en
una larva veliger en forma D con una prodisoconcha I formada, alcanzando unos 98
µm; 4 h más tarde (30 h luego de la fertilización) se evidencia la prodisoconcha II, y a
los 3 días la concha muestra un provínculo, alcanzando tallas de unos 120 µm. A los 8
días las larvas son umbonadas y miden unas 150 µm. Las manchas oculares que
muestran la preparación hacia ser fisiológicamente competentes para el desarrollo de
la metamorfosis aparecen en larvas con unas 165 µm, y cuando alcanzan las 185 µm
en el día 12, las larvas desarrollan el pie y comienzan a hacer movimientos reptantes
en el fondo, formándose las larvas pediveliger con la presencia de marcas a manera de
doble anillo alrededor de la concha, mostrando que pueden realizar el asentamiento o
fijación y la metamorfosis; esta etapa, en todos los bivalvos marinos, es el proceso
final del desarrollo larvario y supone un momento crítico para el cultivo, debido a que
se conjugan situaciones que influyen en la sobrevivencia de las organismos. El
momento crítico es reflejo de la alta actividad metabólica que se desarrolla, dado los
cambios ontogénicos hacia la forma juvenil, la larva pasa de un estado móvil a sésil y
debe segregar un biso o bien cementarse, para determinar la fijación y dar paso a la
metamorfosis. Durante este proceso la larva no se alimenta (por lo que todos los
cambios metabólicos se desarrollan con la energía acumulada en sus tejidos).
Adicionalmente, la larva al dejar su etapa planctónica permanece en el fondo del
tanque con un comportamiento de reptación con nados esporádicos para buscar un
sustrato adecuado para su fijación. En el fondo del tanque se reúne con una serie de
material depositado que induce una proliferación bacteriana y parásitos que puede
conducir a invasiones dentro de las larvas, por lo que se producen notables
mortalidades.

Asentada la larva, comienza la metamorfosis donde ocurren una serie de cambios

metabólicos y morfológicos, de esta manera pierden el velo y su capacidad natatoria, y
se comienza a producir la disoconcha, convirtiéndose en postlarva. Normalmente las
larvas se asientan o fijan mediante cementación (ostreidos) o la segregación de biso
(pectínidos, mitílidos, ostras perleras, etc.), a la par con el proceso de la metamorfosis.
No obstante, en el caso de Spondylus limbatus nuestras observaciones sugieren un
comportamiento atípico del clásico de los moluscos bivalvos antes señalado,
particularmente en la etapa postmetamórfica como lo evidencia los distintos
desarrollos larvarios estudiados por Soria et al. 2010 y particularmente por Loor et al.
2015a,b, cuyos conocimientos, junto con una serie de investigaciones prácticas
conforman la base del presente manual. Las primeras postlarvas con la morfología de
adultos se observan al día 16 con tallas de unas 200 µm y producción evidente de
disoconcha pero desarrolla la metamorfosis sin ningún proceso de cementación o
fijación mediante biso, ya que las postlarvas se mantienen libres, con movimientos
reptantes con la ayuda de un pie bien desarrollado durante al menos 2 meses (a
diferencia de las larvas metamorfizadas que acortan la longitud del pie), cuando
comienzan a cementarse a una talla de unos 2 mm en sustratos duros. Un
comportamiento similar lo tiene el pectínido de roca Crassadoma gigantea,
cementándose a sustratos duros, luego de ser juvenil; no obstante, esta especie se fija

20
inicialmente a un sustrato mediante el biso, para luego soltarse y pasar a etapa libre.

En varios desarrollos larvarios, no hemos observado producción de biso, aunque en

Spondylus limbatus, a nivel de postlarva y juvenil hemos observado muesca bisal
(estructura de la concha por donde se genera el biso), no obstante, en ésta especie,
como en otros Spondylus, en etapa postlarvaria-juvenil, no se ha observado ctenolium
(Waller 1984), una estructura adaptativa a manera de canales o dientes de la muesca
bisal para direccionar el biso. Estas observaciones sugieren que la muesca bisal, en
Spondylus es vestigial.

Las postlarvas cementadas llegan a unos 6 mm a los 3 meses y unos 15 mm en 6

meses. Estudios realizados en el laboratorio indican que juveniles de 1,5 años pueden
llegar a medir unos 70-80 mm. En la naturaleza, Spondylus limbatus obtiene su talla de
madurez sexual a partir de los 85 mm, un proceso que se estima que ocurra entre 2-
4,5 años y se estima que la especie puede vivir hasta unos 12 años (Cudney-Bueno y
Rowell 2008). En la figura 7, se establece una secuencia del ciclo de vida de Spondylus
limbatus, en sus diferentes etapas ontogénicas tempranas, hasta juveniles de 40 mm,
producto de las investigaciones realizadas en el CENAIM-ESPOL (Loor et al. 2015
a,b)(Fig. 8).

21
 d e

1mm 5 mm

Figura 8. Ciclo de vida de Spondylus limbatus: A)Etapa de vida Pelágica (Larvas) a Ovocito viable/b
ovocito fecundado/c primera división celular/d segunda división celular/e tercera división/f
cuarta división/g mórula/h gástrula ciliada/i larva trocófora/j larva “D”/k veliger /l veliger
umbonada /m veliger con ojo/ n pediveliger. B) Etapa de vida Bentónica (Postlarvas) a post-larva
sin fijar/ b juvenil sin fijar/ c juveniles sin fijar en sustrato duro/ d juvenil recién fijado / e juvenil
fijado de más de 3 meses f y g juveniles fijados de más de un año.

22
 Producción de semillas

Existen 3 alternativas para la obtención de juveniles o semillas de moluscos bivalvos,

la primera de ellas es la recolección directamente de los bancos naturales, la segunda
es mediante la captación en el medio natural utilizando colectores artificiales
específicos como “trampas” de larvas en la columna de agua, y la tercera mediante la
producción masiva en laboratorio o condiciones controladas (Laboratorio de Cultivo
Larvario). La colecta natural, sea de los bancos naturales o por captación con
colectores artificiales, para las especies de Spondylus, parece no ser el método
adecuado, dado la dificultad de extracción por ser organismos cementados y la
prácticamente nula captación natural en materiales suspendidos en el mar;
adicionalmente la poca abundancia de las especies en la naturaleza, lógicamente
limitan la incidencia de larvas en el ambiente y minimizan el reclutamiento. Debido a
ello, la producción de semillas bajo condiciones controladas o laboratorio de cultivo
larvario es la alternativa para las especies de Spondylus.

Para la producción masiva de semillas en condiciones controladas, se requiere de un

diseño y procedimientos específicos adaptados a la especie a cultivar. En vista de ello,
las subsiguientes descripciones reúnen información que pretenden ser una guía, luego
de la realización de varios bioensayos que conducen a la mayor optimización
tecnológica posible, contando con las herramientas del CENAIM-ESPOL.

Mínimos requerimientos de infraestructura

Para una producción adecuada de semillas de Spondylus limbatus, se requiere de una

infraestructura adaptada para realizar diferentes actividades. Aunque la
infraestructura para un laboratorio de producción de semillas es condicionada tanto a
la especie como a la cantidad de semillas a producir, en el presente manual
presentamos un esquema generalizado de la infraestructura necesaria para la
producción de semillas de moluscos bivalvos, adaptada a la producción de Spondylus
limbatus (Fig. 9).

23
 Mar Tanques recomendados

Mar

TCC

B
B
1
FA

RC
FC

FA

FC
RC

TRC
2
TRC

CA EA
TRC
5 FM

UV
9

3
CA

4
EA
TCC
8
FM

UV TCC 6 7
4 5

TCC

2 3

Figura 9. A) Sistema de bombeo y filtracion adaptado para la produccion de Spondylus limbatus B:

Bombas/FA: Filtros de Arena (40-10 micras)/FC: Filtros de Cartucho (10-1 micras)/ TRC: Tanque
Reservorio/RC: Recirculacion/ CA: Calentador de Agua/EA: Enfriador de Agua/FM: Micro Filtro
(1-0,45 micras)/UV: Esterilizadora Luz Ultra Violeta, B) Esquema generalizado de la
infraestructura necesaria para la producción de semillas de moluscos bivalvos, adaptada a la

24
producción de Spondylus limbatus /TCC: Tanques cilindro conicos(500 y 200 L), distribucion de las
areas de trabajo necesarias para la produccion de semillas 1 Aspiración del mar/ 2 Reproductores
y semillas: filtrado con materiales microporosos a 10 micras tanques rectangulares de 400 L
(reproductores) y 200 L (semillas)/ 3 Larvas y post larvas: filtrado con materiales microporosos a
0,45 micras/ 4 Fitoplancton: filtrado con materiales microporosos a 0.45 µm/ 5 Cepario/ 6
Almacen/ 7 Sala de Reactivos/ 8 Laboratorio Seco/9 Oficina.

En todas las secciones del laboratorio de producción, se debe tener suficiente energía
eléctrica, correcta ventilación e instalaciones de aire acondicionado para ayudar a
temperar el ambiente tanto para la producción de organismos como el laboral
(algunos generadores eléctricos deben ser instalados para minimizar el riesgo de cese
en el suministro de electricidad que puedan paralizar los sistemas de bombeo,
aireación, etc.). Todas las instalaciones, menos el laboratorio o sala seca, deben tener
disposición continua agua dulce y de mar libre de contaminantes (orgánicos e
inorgánicos), por ello el establecimiento de la infraestructura debe ser en un lugar
libre de contaminación. En todo caso, para evitar contaminación interna, , el agua de
mar debe ser tratada, preferiblemente filtrada a través de filtros de grava, arena y
diatomeas, y luego a través de una serie de filtros, si es posible hasta el mínimo
tamaño de poro (0,45-1 µm) y posteriormente tratada con luz ultravioleta, en función
de esterilizar el agua y minimizar el desarrollo bacteriano en los cultivos,
particularmente larvarios. Se hace imprescindible el suministro continuo de un flujo
de aireación, el cual debe pasar por unas serie de filtros (hasta 0,25-0,45µm) para
evitar la contaminación.

La infraestructura para la producción de semillas de Spondylus limbatus básicamente

debe contener secciones separadas o aisladas, aunque contiguas, de cultivo de
microalgas, acondicionamiento de reproductores y de desove, desarrollo larvario,
crecimiento postlarvario y de juveniles hasta semilla y un laboratorio seco, dotado con
equipos como Microscopio óptico, lupa estereoscópicas, dotados con micrómetros
oculares, estufa, nevera, pipetas, contenedores volumétricos, y una serie de reactivos
para la tinción y conservación de larvas (lugol, hematoxilina-eosina, etanol, etc.). Todo
esto teniendo en cuenta la infraestructura necesaria para el suministro de agua y
aireación (sala de bombas, aireadores, etc.). En dichas salas se deben tener tanques,
envases y utensilios para la práctica normal del cultivo. La amplitud de esta
infraestructura, sus tanques, utensilios, entre otros, deben ir acorde con las demandas
de producción de semillas.

6,1. Sala de cultivo de microalgas

Gran parte del éxito de un criadero de moluscos bivalvos proviene de la producción de

microalgas, de igual modo, el cultivo de microalgas supone sobre el 30% de los gastos
de producción (Coutteau y Sorgeloos, 1992), por lo que es de suma importancia
poseer una sala de producción de microalgas de acorde con las demandas en cuanto a
cantidad y sobre todo calidad de los cultivos microalgales que se establecen tanto para
las dietas de los organismos adultos para acondicionarlos para la reproducción, como
para el cultivo de larvas, postlarvas y juveniles-semillas, antes de que salgan al mar

25
para su crecimiento en los diferentes sistemas de cultivo. Para ello se requiere contar
con un banco de o cepario de microalgas, el mismo que se mantiene generalmente en
una cámara de cultivo comercial, dentro de una sala aséptica con control ambiental,
particularmente de temperatura (aire acondicionado) e iluminación (temporizador
con lámparas de iluminación fría), donde se cultivaran los repiques para obtener los
cultivos unialgales axénicos, a los que se le irán aumentando progresivamente sus
volúmenes hasta alcanzar la producción requerida o acorde a la demanda de lo que se
desea alimentar. En esta etapa es muy importante la asepsia, para lo cual es necesario
contar con una cámara de siembra con filtros y luz ultravioleta para el agua y aire, y
un autoclave para la esterilización de utensilios, material de vidrio, medios de cultivos,
y el agua de mar empleado para el cultivo.

En cuanto a las condiciones ambientales requeridas para garantizar el éxito de una

producción sostenida de las microalgas, será necesario el control de varios factores,
principalmente la temperatura, iluminación artificial, nutrientes (medios de cultivo) y
tanques de CO2. En el caso de la alimentación de los organismos adultos, se requiere
de producciones en volúmenes mayores que se establecen en el exterior, en función
de aprovechar la iluminación natural (Protocolo para el acondicionamiento, desove y
desarrollo larvario).

El tamaño de la zona de cultivo principal de microalgas depende del número de

especies que se cultivan y la cantidad de algas que se requiere. El espacio necesario
para el cultivo de algas dependerá en parte de los niveles de producción, los métodos
de cultivo a mediano volumen de 20 a 100 L (tanques, bolsas plásticas, acuarios,
cilindros plásticos, etc.) y si las algas se van a cultivar dentro del criadero con
iluminación artificial, o si se van a cultivar en el exterior con luz natural, o una
combinación de los dos métodos. En la figura 10 se muestras imágenes de las
diferentes fases del cultivo escalonado hasta llegar a la producción masiva de
microalgas en el CENAIM-ESPOL.

Las especies de microalgas a utilizar deben tener crecimiento rápido, alcanzar

elevadas concentraciones y poseer una composición química equilibrada de lípidos,
carbohidratos y proteínas, además de una alta digestibilidad para la especie que se
quiere alimentar (Uriarte et al., 2001). La cantidad y composición de las dietas con las
que se alimenta a los reproductores, durante su acondicionamiento, tiene gran
influencia en la calidad de los huevos obtenidos, así como las microalgas usadas para
la alimentación larvaria y postlarvaria, siendo primordial que el laboratorio cuente
con la capacidad de producir microalgas en forma masiva y óptima, convirtiéndose en
la actividad más costosa dentro de todo el proceso (Utting y Millican, 1997). Las
especies de diatomeas como Chaetoceros gracilis (=Chaetoceros mulleri), Chaetoceros
calcitrans, Thalasiossira pseudonana, Skeletonema costatum y los flagelados como
Isochrysis galbana, Paulova lutherii, Tetraselmis suecica y Tetraselmis chuii son de
comprobada utilidad para la alimentación en moluscos bivalvos (Helm et al. 2006).

26
 a e

c
f

Figura 10. Diferentes fases del cultivo escalonado de microalgas en el CENAIM-ESPOL. a cultivo en
placas/ b tubos de ensayo 10 ml/ c erlenmeyer 250 ml/ d botellones 4 L/e carboys 50 y 100 L/ f
tanques exteriores de cultivos masivos 1000L.

6,2. Sala de acondicionamiento de reproductores y desove

La cantidad de espacio necesario para mantener y acondicionar los reproductores,

depende en parte de la cantidad de organismos que se van reproducir. En el caso del
acondicionamiento de Spondylus limbatus, por su gran tamaño, demanda más espacio
que las demás especies de bivalvos. Aunque el acondicionamiento para la
reproducción puede hacerse en condiciones controladas, nuestra experiencia en
Spondylus limbatus muestra que se podría hacer en un entorno semicontrolado. En
todo caso, es necesario contar con un suministro de agua de mar con un sistema de
renovación del volumen del tanque semicerrado o abierto, donde el agua de mar
puede ser calentada o refrigerada dependiendo de las exigencias específicas de la
especie para la gametogénesis y maduración y la temperatura del ambiente exterior.
Es conveniente aislar los tanques de modo que se puede evitar perturbaciones y el
fotoperiodo, ya que se ha demostrado que los períodos de luz y oscuridad podrían
afectar a la maduración gonadal. En el caso de Spondylus limbatus nuestra experiencia
indica que los organismos maduran adecuadamente en tanques negros de forma
circular y de gran volumen 10000 L (Fig. 11), evitando la iluminación y con una dieta

27
de Chaetoceros gracilis e Isochrysis galbana en una proporción del 70 y 30%
respectivamente.

El desove debe ser inducido bajo condiciones ambientales controladas, con estricto
control de limpieza y asepsia, para evitar la contaminación de los gametos (ovocitos y
espermatozoides) durante la fecundación y en los ovocitos ya fecundados, que
posteriormente serán colocados en los tanques destinados para el cultivo larvario. El
tamaño de esta sala depende de los requerimientos de producción, y debería ser de al
menos 4x4 m, ubicando un mesón o bandeja que pueda contener agua de mar ya
tratada y donde serán colocados los reproductores a los cuales se le realizarán los
diferentes tratamientos de inducción al desove; una vez que comience el proceso de
expulsión de gametos, los organismos serán aislados en envases adecuados. Es
necesario contar dentro de la sala con una toma de agua de mar filtrada hasta 0,45 µm
e irradiada con luz ultravioleta. También es recomendable contar con suficientes
envases para el mantenimiento por separado de los reproductores en función de
separar los gametos. Además de esto, es necesario contar con tamices con tamaños
adecuados para separar los ovocitos ya fecundados de los espermatozoides sobrantes
y material conectivo presente, así como contenedores adecuados para reunir los
gametos y hacer la fertilización.

Figura 11. Tanques de gran volumen para el acondicionamiento de Spondylus limbatus.

6,3. Sala de desarrollo larvario

La sala de desarrollo larvario es el centro de cría de larvas y un componente

importante del laboratorio de larvas. El tamaño depende directamente de la escala de
producción, y de los parámetros de cultivo de la especie (densidad larvaria óptima,
duración de vida de las larvas y la frecuencia de desove). Dado el desarrollo
relativamente corto de Spondylus limbatus (12-16 días), esta sala puede ser pequeña
dado que no es necesario esperar mucho tiempo para que salga un lote de larvas y dar
comienzo con el siguiente. El tamaño de los tanques utilizados para los cultivos
larvarios dependería de la densidad óptima larvaria en relación a la escala de
producción, con tanques que van desde 500 L hasta 10.000 L (Fig. 12). Los tanques de
cría de larvas se hacen generalmente de fibra de vidrio, con fondo cónico o plano,
dependiendo del volumen de los mismos (normalmente los fondos cónicos son
adecuados para los de pequeño volumen (500 L) a mediano volumen (2000-4000 L).
Estos deben ser pintados interiormente con un producto no toxico (pintura epóxica

28
grado nutricional), siendo curados posteriormente con agua de mar conteniendo
microalgas por unos 10 días.

a b

Figura 12. Tanques de cultivo sala de larvas tanques de 500L cilindro cónicos a y tanques de fondo
plano de 1000L de capacidad b.

6,4. Sala de cría postlarvaria o precría

La sala de cría postlarvaria, o de levantamiento de semillas puede incluir tanto la fase

de asentamiento larvario y la crianza de postlarvas hasta alcanzar tallas consideradas
como de juvenil temprano o semilla. La definición de semillas no es general en cuanto
a la talla (dimensión y peso) y obedece a la talla en la cual el animal pueda ser
fácilmente manipulado y que tenga resistencia, medida en supervivencia, en cuanto el
impacto del paso de su salida de condiciones controladas o semicontroladas al cultivo
al exterior. La disposición de las postlarvas y las características de los tanques y de los
sustratos de fijación, la hidrodinámica, la tasa de recambio del agua de mar en los
tanques, el método de para administrar el alimento, puede llevarse a cabo de diversas
maneras que dependerían de los requisitos de la especie. Es probable que en esta
etapa pueda ser utilizado agua de mar cruda o filtrada a través de tamices de poro
mayor a los 200 µm, que permitan el paso de las microalgas y retenga posibles
competidores, y que puede ser complementado con alimento producido en el
laboratorio. En este punto, por lo general son transferidos al medio ambiente natural,
puesto que las exigencias de las semillas por el espacio y alimento son cada vez más
costosas. El tamaño mínimo de transferencia de la semilla al mar depende de la
especie y de las condiciones ambientales donde serán trasladadas (disponibilidad de
alimento, temperatura, oxígeno, seston, salinidad, corrientes, mareas, etc.). Al igual
que el área de cultivo de larvas, sus dimensiones dependerían del nivel de producción
de semillas. Nuestra experiencia con Spondylus limbatus, dado su comportamiento
atípico del ciclo de vida temprana, ocurriendo la metamorfosis sin un asentamiento
por biso o cementación, siendo postlarvas libres por un periodo prolongado de tiempo
(mayor de 1 mes) cuando se cementan, induce a modificaciones importantes en la sala
de levantamiento de semillas. Dado que este proceso de crecimiento postlarvario está
en fase de evaluación, una justa indicación de la infraestructura necesaria, no es

29
posible. No obstante, se estima que se necesite una sala bajo condiciones
semicontroladas, cuando las postlarvas alcancen tallas mayores a 1 mm, las cuales
deben ser expuestas a una serie de sustratos que más adelante se señalan.

6,5. Laboratorio seco

En un laboratorio de larvas de producción es necesario disponer de un espacio donde

se pueda determinar la condición de las larvas y realizar la medición y recuento de los
organismos., incluido su comportamiento (desarrollo y actividad del velum, contenido
estomacal, desarrollo del pie, etc.). Toda esta actividad implica el uso de equipo que
incluye micropipetas, microscopio óptico, lupas, envases, frascos de tinción de las
larvas, muflas, estufas etc. Además, esta área requiere de armarios y estanterías para
el almacenamiento de equipo cuando no esté en uso. Es necesario que este recinto
cuente con un ambiente adecuado para trabajo laboral.

A continuación, luego de diversas investigaciones realizadas en el CENAIM-ESPOL

para la producción de postlarvas de Spondylus limbatus, se muestra un protocolo para
la producción de semillas a gran escala.

Acondicionamiento de reproductores de Spondylus limbatus

7,1. Traslado y limpieza de los organismos

Los organismos deben ser recolectados en su medio natural lo menos

traumáticamente posible. El hecho de que Spondylus limbatus se encuentra cementado
a sustratos duros con más de la mitad de la superficie de su concha izquierda, limita
evitar el traumatismo. En vista de ello, la colecta debe hacerse con Equipo de
Respiración Subacuática Autónoma (SCUBA), con la ayuda de utensilios adecuados
para la extracción, tratando de romper el sustrato y no la concha. Este traumatismo,
de por sí, podría provocar la expulsión de gametos, como una estrategia adaptativa de
la especie.

Los organismos recolectados deben ser cuidadosamente transportados en

contenedores isotérmicos con humedad a temperaturas de 3-4 oC por debajo de la
temperatura del agua en el ambiente, para la reducción del metabolismo y evitar
desoves. Los organismos deben permanecer el menor tiempo posible fuera del agua.

A la llegada al laboratorio los organismos deben ser inspeccionados para determinar

el estado gonádico. Esta inspección se ve limitada en Spondylus limbatus, dado que no
es posible lograr una apertura adecuada de las valvas, como en otros pectíninoides,
para observar las gónadas. Debido a ello, la condición reproductiva solo podrá
estimarse según los estudios reproductivos previos (Mackensen et al. 2011), teniendo
en cuenta que la mayor frecuencia de organismos en estado reproductivo elevado
acontece de octubre a diciembre en las costas ecuatorianas (Fig. 7). Obtener
organismos de en este periodo podría disminuir el periodo de acondicionamiento.

30
Los organismos en laboratorio deben limpiarse con ayuda de espátulas, cepillos y
pinzas para remover todo tipo de epibiontes adheridos a la concha con la finalidad de
evitar fuentes de contaminación a los gametos. Esta actividad en Spondylus limbatus
debe ser minuciosa y requiere de tiempo, por lo que los animales deben ser limpiados
en días, y mantenidos en observación, siempre con alimentación, por la ocurrencia de
desoves espontáneos.

7,8. Acondicionamiento para la reproducción

El acondicionamiento reproductivo de Spondylus limbatus puede realizarse con

microalgas Chaetoceros gracilis e Isochrysis galbana en una ración de 2:1
correspondiente al 5% de la masa seca del tejido de los organismos. Para establecer
esta relación, es necesario considerar que el peso promedio del tejido húmedo de los
organismos trabajados en el CENAIM-ESPOL corresponde a un 10% del peso total
aproximadamente, y que la masa seca representa un 20% del tejido húmedo.

La densidad de los reproductores en el tanque aconsejada para el acondicionamiento

es de aproximadamente de 1Kg de masa total/100 l de agua del tanque, con recambios
del agua de un 25%/día, previa remoción de heces y material acumulado en el fondo
del tanque. El proceso de maduración y/o acondicionamiento para el desove puede
durar de 1 a 3 meses, dependiendo del desarrollo gonádico inicial, temperatura,
cantidad y calidad de alimento. Nuestra experiencia con la alimentación antes
señalada y temperaturas de 24-27, es que Spondylus limbatus puede estar
fisiológicamente competente para el desove en un periodo de unos 30 días.

Desove o expulsión de gametos de Spondylus limbatus

Para el desove los organismos se deben limpiar nuevamente y dejar a desecación por
al menos 30 min y mantener en tanques con agua filtrada y tratada con luz UV (Fig.
13). Estos dos tratamientos (desecación y limpieza) han sido 2 factores importantes
con los cuales se han logrado desoves exitosos en Spondylus limbatus. De igual manera
se han utilizado estímulos con la adición de microalgas. Alternativamente se pueden
usar choques térmicos (Soria et al. 2010) manteniendo los organismos en agua fría
20°C durante un periodo prolongado 30-60 min, pasando a ambiente con agua de mar
de 30°C durante otros 30-60 min; si no hay respuesta repetir el proceso.

31
 a b

Figura 13. a Faena de limpieza/ b disposición de Spondylus limbatus en el CENAIM-ESPOL para el

acondicionamiento para el desove.

Para el desove se aconseja disponer del mayor número de animales posible, en

función de obtener gametos de diversos organismos para mantener una variabilidad
genética adecuada (Helm et al. 2006), de lo contrario pueden existir malformaciones y
una menor condición en crecimiento y desarrollo en general.

Durante el proceso de desove, es necesario estar alerta a la primera expulsión de

gametos, para identificar el sexo y separar los organismos en contenedores (dado el
tamaño de los Spondylus, se aconseja contenedores cilíndricos con 20-30 L) para que
continúen expulsando gametos individualmente. En Spondylus limbatus es muy
frecuente que los primeros organismos en desovar sean machos, siendo identificados
al liberar un líquido blanco, mientras que el desove de las hembras tiene un aspecto
granular y presenta una coloración anaranjada a rojiza (Fig.14). Parte de una solución
de gametos masculinos deben ser esparcidos en los contenedores o tanques de
desove, ya que es uno de los factores que induce a la liberación de gametos femeninos.

a b

Figura 14. a Preparación para inducción a desove de Spondylus limbatus en contenedores de 25-30
L, en función de obtener gametos masculinos y femeninos separados, previos a la fecundación
controlada/ b Gametos femeninos de color rojizo/ c gametos masculinos de color blanquecino.

32
 Fertilización y desarrollo embrionario de Spondylus limbatus

Los gametos masculinos obtenidos en los contenedores son mezclados y agrupados en

un solo contenedor para obtener un pool de gametos. Los ovocitos obtenidos también
deben ser contabilizados, ya sea en cada uno de los contenedores por cada hembra o
haciendo mezcla de ellos. Tanto los espermatozoides como los ovocitos (60 µm)
liberados deben ser pasados a través de una malla de 80-90 µm para que retenga
cualquier tipo de materia orgánica (tejidos, heces, pseudoheces, etc.) que puedan
contaminar y afectar el desarrollo embrionario. Con el objetivo de limpiar los ovocitos
del exceso de tejido presente, se los lava suavemente con agua de mar reteniéndolos
en un tamiz de 20-30 µm de ojo de malla.

Para el recuento de gametos, se homogeniza el volumen de los contendores con la

ayuda de un disco de plexiglás de diámetro cercano al contendor, perforado con
agujeros de 1 cm y sostenido centralmente de un mango. Al homogenizar se toma 3
muestras de 0,1 ml para gametos masculinos, contabilizados en una cámara Nuebauer
en microscopio óptico a 400X y para los ovocitos de 1ml, contabilizándolas en Cámara
Bogorov, Sedgwick-Rafter o vidrio de reloj en lupa estereoscópica a 40X, en función de
calcular una relación 10:1 (espermatozoide:ovocito) para inducir la fertilización. Una
relación mayor, podía generar efectos de poliespermia y con ello malformaciones o
incapacidad de embriogénesis (Anexo 2).

Al verificar la fecundación, por la aparición del primer cuerpo polar a los 10-15 min
(Fig. 15), luego de dos horas los ovocitos son transferidos cuidadosamente a tanques
(preferiblemente cilindro cónicos), aunque el volumen dependerá de la densidad de
los mismos, tanto para el desarrollo embrionario como para el larvario. Se recomienda
trabajar con un volúmenes elevados, siendo lo mínimo a utilizar 1 m3. El agua
contenida en el tanque debe estar filtrada (al menos 1 µm), tratada con UV y provista
de aeración leve y constante. Un estudio exhaustivo del efecto de la temperatura sobre
el desarrollo embrionario y larvario de Spondylus limbatus, aún no ha sido realizado;
sin embargo, basados en nuestra experiencia de cultivos larvarios realizados en
diferentes épocas del año las larvas poseen un mejor crecimiento a temperaturas
cercanas a los 26 °C con salinidades de 34-36 UPS. Debe evitarse densidades mayores
de 15 embriones/ml.

Luego de las 18h aparece la última fase del proceso embrionario, la trocófora, y a las
24-26 h la larva “D”. Para la embriogénesis no es necesario alimentación, ya que los
embriones se desarrollan de la energía almacenada en el vitelo, aunque algunas
investigaciones muestran, que puede haber una absorción de moléculas a través de
los embriones, las cuales pueden ser expuestas a través de los exudados de las
microalgas, y en muchos laboratorios de larvas se suministra alimento con microalgas
en el proceso de embriogénesis. Esta práctica no es recomendada para Spondylus
limbatus, dada la observación de que la misma puede contribuir a un aumento de la
carga bacteriana del cultivo.

33
Figura 15. Ciclo de vida de Spondylus limbatus: a huevo liberado por desove/ b expulsión del
cuerpo polar/ c primer clivaje/ d segundo clivaje/ e tercer clivaje/ f mórula/ g gástrula ciliada/ h
larva trocófora/ i larva “D”/ j larva veliger/ k larva umbonada/ l larva con mancha ocular/ m
pediveliger/ n postlarva libre/ o juvenil libre/ p juvenil cementado.

Desarrollo larvario de Spondylus limbatus

El final de la embriogénesis, previa fase trocófora, lo marca la formación de larvas D a

las 24-26h, las cuales miden aproximadamente 100 µm y comienzan alimentase.
Debido a ello, es necesario suministrar alimento, el cual se ha establecido a razón de
10,000-15.000 cél/ml. El agua de los tanques conteniendo las larvas “D" al segundo
día (Fig. 16) es vaciado, filtrando las larvas con tamices 40 µm, para luego
contabilizarlas como se indicó para los ovocitos. Las larvas en esta etapa son
dispuestas en taques limpios (tratados previamente con cloro 4-5% y neutralizado)
conteniendo agua filtrada y tratada con UV, a una densidad no mayor de 4 larvas/ml.

34
Figura 16. Larvas “D” veliger de Spondylus limbatus.

El procedimiento de recambio posteriormente es el mismo, haciendo recambios de

agua diarios, cuando las larvas pasan por las etapas veliger, umbonada y pediveliger
(Fig. 17). En la medida que aparecen estas etapas, normalmente a los 4, 8 y 12 días,
respectivamente pueden, de igual modo, retenerse con tamices de 80, 120 y 150 µm.
La ración de alimento dependerá de la densidad larvaria, nuestros resultados sugieren
una densidad larvaria de 4, 2 y 1 larva/ml, con el uso de la dieta microalgal establecida
(Chaetoceros gracilis e Isochrysis galbana combinación 3:1), incrementando la
densidad de microalgas suministradas en 3000 cél/ml cada día, hasta llegar a larvas
competentes (Protocolo para el acondicionamiento, desove y desarrollo larvario).

Figura 17. Faena de recambio de agua y alimentación en el desarrollo larvario de Spondylus

limbatus en el CENAIM-ESPOL.

Cuando la concentración larvaria es elevada (4-6 larvas/ml), se recomienda distribuir

la dosis de microalgas en 2 o 3 raciones durante el día, con el fin de evitar una
acumulación de microalgas. La sobrealimentación puede conducir a estados de
enfermedades bacterianas, dado que las larvas pueden estar estresadas por efecto de
una elevada densidad. Una alternativa de alimentación que no cause
sobrealimentación es la alimentación continua por goteo. Para realizar este tipo de
técnica es necesario un estudio de ingesta y demanda de las microalgas por larvas de
Spondylus limbatus.

35
En todos los recambios, a partir de las muestras de recuento de larvas, debe llevarse
un registro de las larvas muertas (conchas vacías), así como de realizar medidas de la
altura y longitud de la larva (micrómetro en 400X) en al menos 30 larvas y anotar
cualquier anomalía, como la observación de larvas moribundas o necrosadas, así como
movimientos atípicos, que puedan inferir sobre el estado o la salud de las larvas, como
lo observado en nuestros experimentos, donde hemos detectado una gran mortalidad
en el desarrollo larvario, ocasionado posiblemente por una elevada carga de bacterias
tipo Vibrio, por lo que en ocasiones se ha optado por utilizar antibióticos permitidos
en acuicultura, para reducir la carga bacteriana en los tanques de cultivo, siendo el
antibiótico Florfenicol en dosis 1-2 ppm el que mejores resultados ha mostrado,
permitiendo mejorar significativamente la supervivencia de Spondylus limbatus
durante el desarrollo larvario. Luego de la observación del comportamiento larvario, a
las muestras se le puede adicionar lugol diluido (1%) en función de inmovilizar la
larvas, y realizar los recuentos respectivos.

Metamorfosis y asentamiento de Spondylus limbatus

A partir del día 12 las larvas comienzan a estar competentes para el proceso de la
metamorfosis (Fig. 15 o y p). La observación de mancha ocular es indicativo de ello,
así como su estado de pediveliger con la formación de un doble anillo de crecimiento.
En esta fase las larvas competentes poseen movimientos de nado intermitentes y se
desarrolla un pie que les permite reptar para buscar un sitio adecuado para realizar la
metamorfosis. Para este periodo de cultivo, dada la elevada sensibilidad a la invasión
bacteriana de Spondylus limbatus, y que las larvas se depositan en el fondo y pueden
reunirse con elevado material orgánico y bacterias, se recomienda usar tanques de
tipo cilindro cónico y recambios en flujo continuo intradiarios hasta superada la etapa
postmetamórfica (Fig. 15 o).

Las larvas competentes son suministradas a los tanques con sustratos de fijación.
Nuestros ensayos indican que, en un principio el asentamiento ocurre en cualquier
sustrato, pero preferiblemente de superficie rugosa (trozos de concha rugosa, piedras
de cemento, lijas entre otros), donde luego ocurrirá la fijación por cementación, pero
no en mallas o netlón como suele ocurrir con otros pectinoides. Aunque se requiere
realizar más investigación en este aspecto, los mejores resultados se han obtenido al
utilizar cuadros de cemento en primer orden, en trozos de la concha de Spondylus
adultos de 2 a 3 cm y sobre lijas con tamaño de grano de entre 34 y 40, también se ha
observado que las postlarvas prefieren fijarse en sustratos de orientación vertical
mucho más que de forma horizontal, tecnología que permite optimizar esta etapa
atípica en estos organismos (Fig. 19).

36
 a d e f

Figura 19. Bioensayos experimentales para determinar el mejor sustrato de asentamiento y

fijación de postlarvas y juveniles de Spondylus limbatus. a sacos de confinamiento de los sustratos/
b malla sombra/ c concha de Crassostrea gigas/ d sustratos en suspensión/ e tanques de sustratos
de fondo/ f distintos tipos de sustratos probados.

También se ha evidenciado que durante el periodo de metamorfosis los bivalvos

disminuyen la tasa de filtración, por lo que no es necesario la adición de elevadas
cantidades de microalgas, esto colaborará a mantener los sustratos con menos
deposición orgánica y con ello menor riesgo de formación de bacterias patógenas.
Posterior a cada recambio realizado por flujo continuo, se recogen las larvas que no se
han depositado en los sustratos con mallas de 180 µm y se regresadas al tanque, para
promover su deposición en los sustratos y posterior fijación. La ración de alimento
puede subirse a 70.000 cél/l al día. Si bien es necesario la colecta de las larvas no
adheridas a los sustratos, es aconsejable no perturbar en lo posible a las larvas y
postlarvas en el periodo de metamorfosis e inicio del crecimiento postlarvario, por
ello, se aconseja para estos periodos el recambio de agua con flujo continuo, en
función de proporcionar en los primeros días postmetamórficos (durante una semana
aproximadamente) al flujo saliente de agua con un tamiz de 180 µm para prevenir el
escape de alguna postlarva.

Crecimiento postlarvario y juveniles de Spondylus limbatus

Las larvas metamórficas convertidas en postlarvas y luego en juveniles, se mantienen

libres hasta que se cementa a un sustrato duro ya de juvenil (1-2 meses luego de la
metamorfosis), alcanzando los 2-3 mm. Organismos menores de 2 mm fijados no han
sido observados, aunque si asentados con la ayuda de un pie bien desarrollado (Fig.
19).

Una gran cantidad de postlarvas quedarán adheridas a los sustratos y algunas de ellas
al mes se cementarán. Se sugiere el cambio de tanques circulares a tanques o bandejas
con mayor superficie de área provistas de los sustratos con las postlarvas o juveniles.

37
En esta etapa no se ha realizado pruebas de alimentación con dietas, pero una dieta
con mezcla de las microalgas Chaetoceros gracilis e Isochrysis galbana en una densidad
de 40.000 cél/ml muestran buenos niveles de crecimiento y supervivencia .

Fijación y crecimiento de juveniles

Si bien nunca en el cultivo postlarvario de Spondylus limbatus se ha observado fijación

en el primer mes luego de la metamorfosis, las postlarvas permanecen muchas veces
adheridas de alguna forma con su pie aún bien desarrollado, el cual pierde proporción
al cementarse.

Las postlarvas o juveniles deben ser mantenidos en los sustratos en los cuales se
fijaron. Los juveniles fijados a sustratos duros como concha del propio Spondylus, se
fijan contiguos, por lo que existe una interacción de espacio competitiva, lo cual
induce menor crecimiento, en general. En vista de ello, se debe tratar de separar los
juveniles, o en su defecto eliminar algunos para dar espacio al crecimiento. En otros
sustratos como la lija, la separación de los organismos se facilita, ya que la lija puede
seccionarse con una tijera (Fig. 20).

Para la alimentación en esta etapa las dietas bialgales con las especies Chaetoceros
muelleri y Pavlova lutheri en concentraciones de 160.000 cél/ml por día con una
proporción de 50% de cada una, muestran rendimientos superiores a los de otras
combinaciones microalgales microalgas en la fases post-larvaria como Chaetoceros
gracilis e Isochrysis galbana y Chaetoceros muelleri e Isochrysis galbana.

Figura 20. a Juveniles de Spondylus limbatus fijos a diferentes sustratos/ b concha de adultos de
Spondylus / c piedras de cemento/ d lijas de color rojo.

38
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40
Protocolo de producción de alimento y alimentación de
moluscos bivalvos en hatchery.
Producción de microalgas
CEPA EN ERLENMEYER DE 200 ml.
Llenar los erlenmeyer con agua de mar filtrada hasta 0,45 y esterilizada mediante luz
ultra violeta obtenida a un flujo de 5 litros/min, luego enriquecer en la botella de
250ml con los nutrientes necesarios para alcanzar densidades de cultivo optimas
(tabla 1)

Tabla 1. Preparación de soluciones nutritivas para el cultivo de microalgas medio Guillard hasta
4L.

Guillard (F/2)
Compuesto Cantidad Volumen (L)
Solución 1 Nitrato de Sodio 75g 1
Fosfato de Sodio 5g 1
Solución 2 Metasilicato de sodio 30g 1
Solución 3 EDTA 4,4g 1
Cloruro férrico 3,2g 1
Metales traza 1ml 1
Solución 4 Vitaminas (solución primaria) 10ml 1
*Las vitaminas deben ser almacenadas en la nevera y resguardadas de la luz.
*Agregar silicatos solo a las especies de diatomeas a cultivar.

Las muestras deben ser agitadas diariamente después de enriquecer, para

homogeneizar el medio de cultivo y al final repartir el medio enriquecido en
erlenmeyers de 250 ml con 200 ml de agua de mar en cada uno de ellos. Todas estas
operaciones han de realizarse ante el mechero Bunsen o de alcohol (o en cabina de
flujo laminar si la empresa dispone de este equipo), y teniendo en cuenta que se ha de
flamear cuidadosamente (cuando se trabaje en la cabina de flujo se obvia el flameado),
tanto el papel de aluminio que tapa el matraz erlenmeyer, como el tapón de rosca de la
botella.

Se debe examinar al microscopio las cepas "antiguas" para utilizar como inóculo,
comprobando que no haya grumos y que esté limpia de cualquier resto. Ha de
descartarse la contaminación con otras especies, así como la presencia de protozoos.

En caso de que no se cumplan estas condiciones habrá que observar otras cepas hasta
encontrar un inóculo en óptimas condiciones para “arrancar” el cultivo, ya que una
optima condición inicial es esencial para obtener buenos rendimientos en los cultivos.
Inocular con la especie objetivo, añadiendo un volumen predeterminado de inóculo
extraído de cepa en tubo de ensayo(10ml). Se pueden utilizar 20 ml cuando se
pretenda acortar los tiempos de cultivo en esta fase; 10 ml en caso de que se utilicen
tiempos estándar a densidad "normal" (correspondientes a los previamente

41
establecidos en función de la especie y las condiciones de cultivo utilizadas y teniendo
en cuenta el momento en el que la población ha alcanzado la fase exponencial de
crecimiento).

En cualquier caso, habremos de tener en cuenta que se ha de homogeneizar

cuidadosamente el inóculo antes de contar, y de nuevo, antes de tomar el volumen que
servirá para inocular cada una de las cepas.

Comprobar que los matraces están perfectamente tapados, y que no hay deterioro en
el papel de aluminio que actúa como cubierta, proporcionar iluminación constante al
cultivo y asegurarse de que se mantiene en el interior de la cámara una temperatura
constante de 18ºC.

BOTELLÓN DE 3 LITROS
Esterilizar con cloro de 40 (al 40%), añadiendo 0,75 ml al botellón lleno de agua
filtrada a 0,45 micrómetros y esterilizada con luz ultravioleta, se debe suministrar una
agitación fuerte durante unos minutos y dejar actuar sin aireación durante 2 horas,
para luego neutralizar con tiosulfato sódico al 5%, añadiendo 0,75 ml al medio de
cultivo. A continuación suministrar agitación intensa durante unos 10 min. para que la
neutralización sea completa, se comprueba que la neutralización ha sido total con el
test de orto-toluidina, recordando que el color amarillo, aún cuando sea poco intenso
indica presencia de hipoclorito y no se podrá continuar con las demás operaciones
hasta que se haya neutralizado completamente.

Enriquecer con los nutrientes necesarios para alcanzar densidades de cultivo de la

siguiente forma calculado según el volumen a utilizar en este caso 3 L (Tabla 1)

Inocular con la especie objeto de cultivo, añadiendo 200 ml de inóculo (extraído de

cepa en erlenmeyer), teniendo presente que debemos homogeneizar cuidadosamente
la cepa agitando antes de verterla y delante un mechero Bunsen/mechero de
alcohol/cabina de flujo laminar, en el interior del recipiente. Una vez instalada la
aireación se debe suministrar el caudal de aireación correcto para la especie de que se
trate, recordando que es fundamental evitar la sedimentación.

CARBOYS 50 LITROS
Esterilizar con hipoclorito sódico al 40 %, añadiendo 6,25 ml a cada lado del carboy y
suministrando una fuerte agitación durante unos minutos y dejar actuar sin aireación
durante 2 horas, luego neutralizar con tiosulfato sódico al 5%, añadiendo 6,25 ml a
cada lado del carboy y suministrando agitación intensa durante unos 10 min
favoreciendo la neutralización. Comprobar que la neutralización ha sido total con el
test de orto-toluidina, recordando que el color amarillo, aún cuando sea poco intenso
indica presencia de hipoclorito y no se podrá continuar con las demás operaciones
hasta que se haya neutralizado completamente.
Enriquecer los carboys con los nutrientes necesarios para alcanzar densidades de
cultivo en base a la siguiente tabla 2.

42
Tabla 2. Preparación de soluciones nutritivas para el cultivo de microalgas medio Guillard hasta
50L.
Fitobloom
Compuesto Cantidad Volumen (L)
Solución 1 Fitobloom 160g 1
Fosfato de Sodio 7,8g 1
Solución 2 Metasilicato de sodio 120g 1
Solución 3 EDTA 17,6g 1
Cloruro férrico 12,8g 1
Metales traza 4ml 1
Solución 4 Vitaminas (solución primaria) 40ml 1
*Las vitaminas deben ser almacenadas en la nevera y resguardadas de la luz.
*Agregar silicatos solo a las especies de diatomeas a cultivar.

Inocular con la especie objeto de cultivo, añadiendo 2 litros de inóculo (extraído de

botellón), en cada lado del carboy, siempre asegurándose de suministrar el caudal de
aireación correcto para la especie de que se trate.

Todo el material utilizado para el cultivo, trasvase y muestreo debe estar libre de
bacterias y material orgánico, por lo que al se deben dejar en tinas con cloro (4-5%),
lavándolas con agua dulce y enjuagándolas, previo su uso, con agua de mar filtrada y
tratada con UV.

3L
250ml 50 L

Figura 1. Secuencia de cultivo de microalgas para diferentes niveles de desarrollo del

cultivo de Spondylus limbatus.
Alimentación
Esta se inicia a las 24 h post fertilización, en el momento en el que se comienzan a
observar larvas veliger con forma “D”, las concentraciones a utilizar van relacionadas
con las densidades de siembra, en condiciones recomendadas de (2 a 4 larvas/ml) las
densidades iniciales comienzan para Spondylus limbatus con 15.0000 cél/ml al día de
la especie de microalga más pequeña (Isochrysis galbana), progresivamente en la

43
medida que las larvas crecen se va aumentando la ración a una tasa de 3000
cél/ml/día, hasta el día 12, momento en el cual la concentración se mantiene hasta el
final del ciclo larvario (tabla 3). Estas tablas están basadas en análisis publicados en
Loor et al. 2015 y 2016.

Tabla 3. Alimentación de larvas según el día de cultivo, densidad bialgal y porcentaje de la cada
especie.
Día Densidad (cél./ml) ISO G (%) CHA G (%)
0 15000 50 50
1 18000 50 50
2 21000 50 50
3 24000 40 60
4 27000 35 65
5 30000 30 70
6 33000 25 75
7 36000 25 75
8 39000 25 75
9 42000 25 75
10 45000 25 75
11 48000 25 75
12 50000 25 75
13 50000 25 75
14 50000 25 75
15 50000 25 75
16 55000 25 75

44
Protocolo para el acondicionamiento, desove y desarrollo larvario

Acondicionamiento:
Posterior a la captura de los organismos silvestres, estos deben ser manipulados con
cuidado y transportados en cavas isotérmicas, en un ambiente húmedo y sin agua de
mar (para evitar que los niveles de oxígeno caigan y mueran los organismos durante
el transporte), se recomienda que no deben pasar más de 40 min en desecación los
organismos, ya que esto aumenta el riesgo de desoves descontrolados, en caso de que
el tiempo de transporte sea mayor a 40 min estos deben ir en cavas isotérmicas
(capacidad recomendada 60 L) con una densidad de 1 organismo por cada 10 L como
máximo, en agua de mar a temperatura ambiente y aireadores, procurando
estremecer lo menos posible a los organismos.

Una vez los organismos se encuentren en las instalaciones de cultivo, deben ser
limpiados mediante la remoción de todos los epibiontes que suelen estar sobre o
adheridos a su concha, y que podrían interferir con el proceso de inducción a desove.

Inducción a desove:
Previo a la inducción, los organismos deben mantenerse sin alimento 24-48 horas
antes (lo que reduce la carga de heces y pseudoheces durante el proceso) y deben ser
limpiados mediante la remoción de todos los epibiontes que suelen estar sobre o
adheridos a su concha, y que podrían interferir con el proceso de inducción a desove.

Los estímulos mecánicos realizados para inducir los desoves en Spondylus limbatus
más efectivos consisten en:

Inducción 1:
1. Limpieza de los animales (remoción de organismos de la epifauna)
2. Desecación (40-60 minutos).
3. Recambios de agua limpia (100%) filtrada (0,45 µm) y tratada con UV a temperatura
cercana a la del ambiente y mantenidos durante 1 hora.
4. Recambio de agua limpia (100%) filtrada (0,45 µm) y tratada con UV con 5-8C más
alta que la temperatura ambiente (temperatura máxima probada 31C), mantenidos
hasta el desove.
5. Supervisión constante, se han observado los primeros desoves entre 4 a 5 horas
posteriores a este proceso.

Inducción 2 shock térmico:

1. Limpieza de los animales (remoción de organismos de la epifauna)
2. Desecación (40-60 minutos).
3. Recambios de agua limpia (100%) filtrada (0,45 µm) y tratada con UV a temperatura
cercana a la del ambiente y mantenidos durante 1 hora.

45
 4. Recambio de agua limpia (100%) filtrada (0,45 µm) y tratada con UV con 5-8C más
alta que la temperatura ambiente (temperatura máxima probada 31C), mantenidos
durante 40 min.
5. Recambios de agua limpia (100%) filtrada (0,45 µm) y tratada con UV con 5-10C
menos que la temperatura alta (temperatura mínima probada 20C), mantenidos
durante 40 min.
6. Recambios de agua limpia (100%) filtrada (0,45 µm) y tratada con UV a temperatura
cercana a la del ambiente y mantenidos hasta observar desoves.
7. Supervisión constante, se han observado los primeros desoves entre 2 a 4 horas
posteriores a este proceso.

Al realizar la inducción de forma controlada y observarse los primeros desoves, tanto

los machos como las hembras deben ser separados e individualizados, en
contenedores (recomendados de 30 L), al observarse la finalización de los pulsos de
desoves, se debe retirar a los reproductores e incorporarlos a un tanque masivo para
su recuperación(fig. 2).

Debido a la sensibilidad observada a la luz de durante los procesos de inducción y

desoves de los adultos de Spondylus limbatus, estos procesos se llevan a cabo en salas
con baja iluminación.

Fertilización:
Para el posterior proceso de fertilización, se debe verificar la condición de los huevos
al microscopio (esperando aproximadamente unos 20 min hasta que los huevos
estuvieran totalmente hidratados y viables).

1. Se verifica el volumen de agua del contenedor.

2. Se homogeniza tanto los huevos como el esperma (con la ayuda de un homogenizador
figura 2)
3. Se toman 3 muestras de cada producto de desove (Esperma o huevos) por
contenedor, cada muestra de 100 m es colocada en una cámara de conteo, llevada al
microscopio y contada la cantidad de ovocitos total y la cantidad de ovocitos redondos
(viables) y periesféricos (no viables) (fig. 3)(ver Protocolo de conteo de ovocitos y
larvas), esto permite determinar la fecundidad de cada individuo y la relación
esperma/ovocito para la fertilización.
4. La fertilización consiste en la adición controlada y seleccionada del esperma (machos
con mayor densidad de esperma y mayor motilidad), la dosificación resulta de obtener
una relación de 10 espermas por cada ovocito (aproximadamente 1 ml de suspensión
de espermatozoides por litro de suspensión de ovocitos), es necesario homogenizar la
muestras antes de trasvasar la alícuota de esperma al contenedor de los ovocitos.

46
 5. Posterior a la fertilización (20-30 post fertilización), se toman 3 muestras de cada
producto de desove fertilizado por contenedor, cada muestra de 100 m es colocada
en una cámara de conteo, llevada al microscopio y contada la cantidad de ovocitos
fecundados (aparición del corpúsculo polar) y la cantidad de ovocitos no fecundados
(Protocolo de conteo de ovocitos y larvas), esto permite determinar el porcentaje de
fecundación y estimar la cantidad de larvas a obtener por cada contenedor (la
densidad de siembra en tanques para desarrollo recomendada es de 2-4 larvas/ml).

*La relación de 10:1 espermatozoide-ovocito se utiliza para evitar problemas asociados a la poliespermia.

Esfèrico Periesfèrico
Figura 3. Forma básica de post-desove, ovocito esférico viable y periesférico no viable.

Ovocito fecundado Ovocito sin fecundar

Figura 4. Forma básica de para identificar ovocitos fecundados (presencia de corpúsculo polar) y
ovocito sin fecundar.

Desarrollo Larvario:
Posterior a la siembra de los óvulos fecundados, y finalizado el ciclo embrionario
aparece posterior a las 9 horas las primeras larvas trocóforas (fig. 1 h), y dentro de las
primeras 24 horas aparecen las larvas veliger o larva “D”(fig. 1 i), momento a partir
del cual las larvas comienzan a alimentarse (ver Protocolo de producción de alimento
y alimentación de moluscos bivalvos en hatchery) y se realiza el primer recambio total
del agua de mar del tanque contenedor de las larvas, este recambio se realiza cada
48h hasta el día 6, momento en el cual los recambios se recomiendan realizar cada
24h. Los recambios se realizan con tamices de varios tamaños de poro (tabla 1), según
el tamaño de las larvas, con la intención de retenerlas y separarlas de las microalgas y
resto de materia orgánica que puedan estar presentes.

Las larvas retenidas en los tamices son lavadas con agua de mar esterilizada y
trasvasados a contenedores de volúmenes conocidos donde serán acumulados para su
conteo y revisión(ver Protocolo para el recuento ovocitos y larvas) (Tabla 2), el
tiempo de contención de larvas concentradas en contenedores pequeños debe ser
menor a 40min, los tanques de cultivos deben estar llenos con agua de mar

47
esterilizada y con la ración de alimento correspondiente al día del desarrollo (ver
Protocolo de producción de alimento y alimentación de moluscos bivalvos en
hatchery). Este procedimiento se repite con cada recambio de agua de mar (fig. 4).

El agua de mar utilizada durante los recambios debe ser filtrada y esterilizada con luz
UV (sistema de filtración recomendado: filtro mecánico de 5, 1 y 0,45µ, esterilizado
por luz UV 2 lámparas de 65 watts y un flujo de 5 L/min), los tanques deben ser
limpiados y desinfectados con cloro para cada vez que sean utilizados. La temperatura
y salinidad se han determinados como rangos óptimos entre 24 y 26 °C y 33-34 UPS,
respectivamente. La tabla 1 presenta los tiempos de aparición de los diferentes
estadios del desarrollo larvario, los tamaños correspondientes por día y los tamices
recomendados para los recambios de agua.

Tabla 1. Desarrollo embrionario y larvario, talla por día de desarrollo y tamices utilizados durante
los recambios.
Desarrollo embrionario Tamaño (µm) Tiempo Tamiz utilizado (µm)
Ovocitos 60.2 ± 1.3 0 Ninguno
Primer cuerpo polar 60.2 ± 1.3 10 - 15 min Ninguno
Divisiones 61 - 63 40 min Ninguno
Mórula 63.6 ± 2.5 3h Ninguno
Blástula 62.4 ± 2.4 5h Ninguno
Gástrula temprana 59.4 ± 2.4 6h Ninguno
Trocófora temprana 62.5 ± 2.5 9h Ninguno
Trocófora tardía 79.9 ± 4.0 18 h Ninguno
Larva-D 98.0 ± 2.2 26 h 30, 60 y 120
Longitud de valva
Desarrollo larvario (µm) Día
Umbonada temprana 119.4 ± 3.7 2 60, 100 y 120
Umbonada temprana 131,2 ± 3.7 3 100, 120 y 200
Umbonada temprana 143 ± 3.7 4 120, 150 y 200
Umbonada tardía 154.7 ± 7.0 8 120, 150 y 250
Umbonada tardía 160,5 ± 7.0 9 150, 180 y 250
Larvas con mancha ocular 166.3 ± 8.2 10 150, 180 y 250
Larvas con mancha ocular 174,3 ± 8.2 11 150, 180 y 250
Larvas con pie 185.2 ± 3.9 12 180 y 250

48
 (A) Ovocito
(B) Ovulo fertilizado
(C) Primera división
(D) Segunda división
(E) Tercera división
(F) Mórula
(G) Gástrula
(H) Larva trocófora
(D) Larva D
(J) Larva día 3
(K) Larva día 7
(L) Larva día 10
(M) Larva día 14
(N) Postlarva sin fijar
(P) Postlarva fija
(Q) Juveniles.

Figura 1. Desarrollo embrionario, larvario y postlarvario de Spondylus limbatus.

Tabla 2. Control de las muestras, factores a considerar de la condición larvaria.

Control muestras de larvas
Larvas nadando Larvas muertas
Alimento presente Alimento ausente
Presencia de otros organismos (protozoarios, Ausencia de otros organismos (protozoarios,
copépodos, etc.). copépodos, etc.).
Tallas homogéneas Disparidad de tallas

Tabla 3. Control diario de los cultivos

Control diario cultivo larvario
Temperatura C.
Salinidad UPS.
pH
Presencia o ausencia de larvas en el fondo de La presencia de larvas en el fondo, puede dar
los tanques indicios de problemas como enfermedad en
las larvas, alta densidad o mortalidad.
Color de los tanques antes del comenzar el Tanques sin coloración puede significar que
recambio de agua los organismos están quedando sin alimento,
tanques con coloración fuerte puede implicar
que se está colocando mucho alimento o las
larvas no se están alimentando.

49
 Tanque cilindro conico Tanque cilindro cónico
con larvas con agua de mar estéril
e inoculado con
microalgas

Tamiz 1
d
Tamiz 2 Tamiz 2 Contenedor
larvas
Contenedor concentradas

Tamiz 3

b
Contenedor
c

a
Figura 4. a Recambio y tamizado de larvas/ b tamiz con larvas concentradas/ c contenedor con larvas
concentradas para conteo y revisión/ d tanque preparado para recibir larvas

Fijación de post-larvas:
Una vez determinado le final de la etapa larvaria pelágica, con la aparición de larvas
con mancha ocular y doble anillo, denominadas también larvas competentes(fig. 1 m),
se procede a pasar las larvas competentes a un sistema de cultivo con sustratos,
Spondylus limbatus posee un ciclo de vida atípico dentro de los moluscos bivalvos, por
lo que se ha determinado que los mejores sustratos para la fijación de los organismos
son sustratos dispuestos de forma vertical con superficie rugosa, también es de
destacar la elevada sensibilidad que poseen las larvas en esta etapa determinada
como critica, por lo que controlar la carga orgánica del sistema de cultivo es esencial.

Las larvas competentes cuando están previas al proceso de metamorfosis, reducen su

metabolismo, por lo que se debe reducir la ración a 100000 cél/ml de dieta bialgal,
durante los primeros 7 días de fijación, posterior a esto se incrementa la ración a
50000 cél/ml de dieta bialgal hasta alcanzar 2mm de longitud anterior-posterior y ser
consideradas como semillas o juveniles.

La fijación se realiza en tanques cilindro cónicos con un sistema de sujeción de

sustratos, los recambios que se realizan son del 30% con agua filtrada y esterilizada
de forma continua, se coloca un tamiz de 250 µm para retener las postlarvas que no se
encuentren fijadas y reintroducirlas al tanque (fig. 5)

El sistema de fijación está conformado por lijas con nivel de rugosidad 34, del tipo de
lija determinadas como de agua, curadas con agua de mar por 15 días al igual que los

50
cuadros de cemento, estos sustratos son sujetados a una estructura circular de malla
plástica que permite disminuir la deposición de materia orgánica en los sustratos,
instalados de la forma como se puede observar en la figura 5, se recomienda sembrar
al momento de fijación con una densidad de 0,25 larvas/ml, y las postlarvas pueden
pasar entre 20 y 90 días, por lo que es recomendable sacar las postlarvas fijadas a los
sustratos.

1mm

a b c
Figura 5. a tanques para fijación de postlarvas/ b postlarvas fijas en lijas y cuadros de cemento/ c
sistemas de sujeción de los sustratos.

juveniles:

Los juveniles fijos a sustratos pueden ser llevadas a tanques de 400 L y mantenidas a
una densidad de 5 juveniles/L para ser mantenidas con agua de mar filtrada hasta
5µm, la ración de alimentación es una mezcla de 75% de Chaetoceros mullieri y 25%
Pavlova lutheri a una densidad de 120000 cél/ml.

Para la medición se toma una muestra cada 8 días de 50 organismos por tanque y a
cada juvenil se le mide la altura de la concha en milímetros, el monitoreo debe hacerse
cada 8 días hasta que la post-larva alcanza un tamaño de 2cm momento en el cual se le
denomina pre-semilla y se puede trasladar a al medio natural.

51
Protocolo para el recuento ovocitos y larvas
Contenidos los ovocitos o larvas concentrados en un recipiente , se procede como sigue:

Recuento de ovocitos:
1. Se toman 5 muestras de 100µL por recipiente.
2. La muestra se vierte en una cámara Sedgwick Rafter de 1 mL completando el volumen
con 900 µL de agua de mar estéril.
3. Se cuentan los ovocitos (Nt)
4. Se multiplica Nt por el factor de dilución (x10) por el número de litros de agua del
contenedor de ovocitos (Vc) Ntx 10xVc=ovocitos totales (Lt).
5. Se determina la densidad deseada de larvas en el sistema de cultivo, según el número
de litros del tanque de cultivo.
6. Para determinar volumen de ovocitos concentrados a trasvasar para obtener la
concentración deseada se calcula de la siguiente manera
7. concentración deseada se calcula de la siguiente manera

• Fórmula: C1xV1=C2xV2 = V1=(C2xC2)/C1

donde:
C1= Concentración ovocitos/ml en el contenedor concentrado (Lt)
V1= volumen a tomar del contenedor concentrado para obtener la concentración deseada
C2=Concentración en ovocitos/ml del tanques a sembrar
V2=Volumen en ml del tanque de cultivo

Conteo de larvas:
8. Se toman 3 muestras de 1ml por (recipiente de 30L)
9. A la muestra se le aplica una gota de solución de lugol para inmovilizar la larva.
10. Luego se cuenta el número de larvas por en una cámara Sedgwick Rafter
11. Se calcula la Nt total (Total de larvas).
12. Se multiplica Lc por el número de litros de agua del contenedor de larvas
concentradas(Vc) Nt*Vc=larvas totales (Lt).
13. Se determina la densidad deseada de larvas en el sistema de cultivo, según el número
de litros del tanque de cultivo.
14. Para determinar volumen de larvas concentradas a trasvasar para obtener la
concentración deseada se calcula de la siguiente manera

• Fórmula: C1xV1=C2xV2 = V1=(C2xC2)/C1

donde:
C1= Concentración en larvas/ml en el contenedor concentrado (Lt)
V1= volumen a tomar del contenedor concentrado para obtener la concentración deseada
C2=Concentración en larvas/ml del tanques a sembrar
V2=Volumen en ml del tanque de cultivo

52