CINÉTICA DE LA REDUCCIÓN DE SULFATO BACTERIANO EN UNA PLANTA DE

LODO ACTIVADO

RESUMEN
La cinética de la reducción de sulfato y las densidades celulares de las bacterias reductoras de
sulfato (SRB) se determinaron en lodos activados en la Planta de tratamiento de aguas residuales
se Aalborg East, una moderna planta equivalente a 100000 personas, donde los SRB se somete a
ciclos alternos de oxígeno y condiciones anóxicas.
 El número de SRB fue relativamente constante a lo largo del año, variando de 2.1*10 5 a
1.1*10 6 células ml-1 según lo determinado por 35 S-radiotrazador número más probable (NMP)
en un medio de crecimiento preparado a partir de lodo esterilizado y anaeróbico. 
En estas condiciones anoxicas, la producción de sulfuro en el lodo activado siguió un patrón
bifásico, siendo lineal durante aproximadamente 5 h, seguida de una fase exponencial con
tiempos de duplicación de la producción de sulfuro de 4.2 -12.6 h. 
La reducción de sulfato comenzó inmediatamente después del inicio del ciclo anóxico. La adición
de antibióticos (cloranfenicol y estreptomicina) al lodo activado impidió la fase exponencial de la
reducción de sulfato durante hasta 100 horas y se encontró que este tratamiento produce
estimaciones precisas de las tasas potenciales de reducción de sulfato.
La adición de sulfato, ditionito de sodio o compuestos de un solo carbono (lactato, acetato y
glucosa) no disminuyó la duración de la fase lineal de reducción de sulfato, ni afectó la tasa de
reducción de sulfato.

Nuestros resultados indican un acoplamiento metabólico fuerte y eficiente entre

poblaciones de SRB y bacterias fermentadoras en lodos activados y una alta capacidad de
reducción de sulfato en lodos almacenados en tanques de sedimentación. Por lo tanto,la reducción
de sulfato bacteriano puede ser un proceso importante en la desestabilización de la estructura del
flóculo cuando el lodo activado se almacena anaeróbicamente durante varios días antes de la
deshidratación.

INTRODUCCIÓN
Las bacterias reductoras de sulfato (SRB) son funcionalmente importantes en muchos ambientes
anóxicos, especialmente en los sedimentos marinos y estuarinos, donde desempeñan un papel
importante en la degradación anaeróbica de la materia orgánica [1 ^ 3]. La SRB también puede
contribuir significativamente a la mineralización anaeróbica de carbono en ambientes con bajo
contenido de sulfatos, como los hábitats de agua dulce [4, 10], pero hay poca información
disponible sobre su actividad en los lodos activados.
Recientemente, varios estudios han informado sobre la presencia de un número bastante alto de
SRB en los lodos activados de las plantas de tratamiento de aguas residuales (EDAR), que se
someten a ciclos óxicos y anóxicos [11 ^ 13]. Schramm et al. [13] no pudieron detectar la
reducción de sulfato en los lodos activados de cuatro EDAR por medio de incubaciones de lotes,
utilizando la técnica del trazador 35S o las mediciones de microsensores.
De acuerdo con estos autores, los SRB no pudieron crecer y multiplicarse en lodos activados
aireados, y su presencia dependió de una reinoculación continua de varias fuentes, como la
alcantarilla, la bioquímica de la pared o el lodo de retorno de los tanques de sedimentación y los
digestores anaeróbicos. En el mismo estudio, los SRB se detectaron en las cuatro EDAR por
hibridación in situ fluorescente (FISH) en densidades correspondientes al 3 ^ 5% de las células
totales de 4,6-diamino-2-fenilindol (DAPI). Sin embargo, la amplificación de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) de los fragmentos del gen disimilator de la reductasa (DSR) de las
mismas muestras solo detectó la presencia de SRB en dos de las cuatro PTAR investigadas.
Utilizando un rango de sondas de direccionamiento de ARNr 16S, Manz et al. [12] detectaron y
diferenciaron SRB de las dos familias Desulfovibrionaceae y Desulfobacteriaceae dentro de las
zonas anaeróbica y aeróbica del proceso de tratamiento de lodos activados y estimaron que SRB
constituía entre el 0,5 y el 8% del total de recuentos celulares. Las tasas de reducción de sulfato
no se midieron en este estudio.
Aunque Lens et al. [11] detectaron tanto la reducción de sulfato como la presencia de SRB y
bacterias metanogénicas en algunos sistemas de lodos activados, De Beer y colaboradores [14] no
pudieron detectar la reducción de sulfato con la técnica 35S-trazador en lodos activados de
EDAR en Alemania y República Checa, a pesar de la presencia de un bajo número de SRB como
lo demuestra FISH.

Como se informó anteriormente, la actividad metabólica de las bacterias reductoras de Fe (III) y

SRB puede causar la desintegración de los lodos y la liberación de fósforo en el agua a granel [15
^ 17]. El sulfato producido por SRB puede causar una desestabilización de las partículas de lodo
debido a la reducción química de Fe (III) a Fe (II) por el sulfato. La destrucción es altamente
indeseable ya que puede afectar seriamente la eficiencia de tratamiento y la economía de la
operación de la planta. El sulfato producido por la reducción de sulfato también puede causar
corrosión dentro de la planta cuando posteriormente se oxida a ácido sulfúrico mediante procesos
químicos y biológicos [18]. El conocimiento actual sobre la actividad metabólica y las
interacciones de SRB en lodos activados es escaso. Debido a los ciclos de aireación aplicados, los
lodos activados probablemente no sean un entorno favorable para SRB. Sin embargo, estudios
recientes han demostrado que muchos SRB son muy tolerantes al oxígeno, que incluso puede ser
usado por algunas cepas como aceptor de electrones para la generación de trifosfato de adenosina
(ATP) [19 ^ 21]. La tolerancia al oxígeno de la SRB y su capacidad para obtener energía
mediante reacciones de fermentación y mediante la reducción de una amplia gama de aceptadores
de electrones alternativos (incluidos NO3 3 y Fe (III)) en teoría deberían mejorar su capacidad
ecológica en los sistemas de lodos activados.
El presente estudio se realizó con el fin de investigar la cinética de la reducción de sulfato en una
EDAR moderna durante la exposición a corto y largo plazo a condiciones anóxicas. Uno de los
principales objetivos fue determinar si la SRB sería metabólicamente activa durante los períodos
relativamente cortos de anoxia durante la operación de la planta. Además, se desarrolló y probó
un método mejorado para estimar las tasas iniciales del potencial reductor de sulfato de los lodos
activados.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Muestras de lodos activados.
Las muestras de lodo activado se recolectaron en los tanques de aireación de la planta de
tratamiento de agua de Aalborg East (AE), una planta avanzada de lodo activado, que recibe
principalmente aguas residuales domésticas. Esta planta equivalente a 100000 personas funciona
de acuerdo con el método BioDeniPho para la eliminación biológica de N y P, con la eliminación
de P químico adicional mediante la adición de FeSO4. La edad del lodo varía de 25 a 30 días. El
sistema funciona con un período anaeróbico inicial de 3 h, seguido de ciclos alternos oxic (3 ^ 4
h) y anóxico (2 ^ 3 h).

Los lodos activados se recolectaron durante los ciclos óxicos para asegurar una mezcla adecuada
de los lodos y se almacenaron
en botellas de plástico estériles de 1 litro ¢ llenas hasta su capacidad. Se recogieron lodos
activados frescos antes de cada experimento y se transportaron (menos de 1,5 h) al laboratorio en
hielo. Las muestras de lodo se agitaron vigorosamente con la mano para resuspender las células
antes de ser sometidas a un submuestreo para experimentos (ver más abajo). El pH de los lodos
activados fue 7.0 +-0.1.
2.2. Medición por radiotrazador de las tasas de reducción de sulfato en muestras de
lodo(SO42)
Las tasas potenciales de actividad reductora de sulfato en muestras de lodo se midieron utilizando
la técnica del radiotrazador 35SO23 4 esencialmente como lo describen Vester e Ingvorsen [22].
Se mantuvieron condiciones estrictamente anaeróbicas y asépticas a lo largo de los experimentos
con marcadores. Las técnicas anaeróbicas utilizadas fueron los métodos de jeringa de Macy et al.
[23], aplicando gas nitrógeno libre de oxígeno. Las soluciones madre concentradas se prepararon,
esterilizaron y almacenaron en viales de suero con una fase gaseosa N2.
Para los experimentos con trazadores, se dispensaron alícuotas (generalmente 40 ^ 60 ml) de lodo
activado resuspendido en botellas de infusión de 100 ml de capacidad durante la gasificación
constante con N2. Las botellas de infusión se taparon con tapones de caucho butílico y el espacio
de cabeza se cubrió con gas nitrógeno libre de oxígeno. Las botellas se preincubaron
posteriormente a 20 ºC durante 1 h en la oscuridad, con agitación a 100 rpm para asegurar el
equilibrio de la temperatura y completar las condiciones anóxicas. Las incubaciones con
trazadores se iniciaron, a menos que se indique lo contrario, inyectando 35SO23 4 sin soporte
(Isotope Laboratory, RisS, Dinamarca) a una concentración central de 120 kBq por ml de lodo, y
se incubaron a 20 ºC en la oscuridad a 100 rpm. Durante la incubación, las submuestras (0,3 ml)
se retiraron anaeróbicamente de cada botella con una jeringa e inmediatamente se inyectaron en
tubos de plástico que contenían 2 ml de acetato de zinc al 20% (peso / volumen) y 0,1 ml de ZnS
50 mM para detener la actividad biológica. y conserva el contenido reducido del sur. Las botellas
experimentales se agitaron vigorosamente con la mano para asegurar una mezcla completa antes
del muestreo. Las muestras fijas se almacenaron a 320 ‡ C hasta que se utilizaron para la
recuperación de azufre 35S reducido por destilación (ver más abajo).
Para cada incubación del marcador, la concentración inicial de sulfato se determinó en
submuestras de lodo sin marcador. Las muestras se centrifugaron durante 10 min a 13000 rpm
(11340 Ug) y, posteriormente, los sobrenadantes se filtraron (0,2 Wm) y se almacenaron a 320 ºC
hasta el análisis. El análisis de sulfato se realizó en sobrenadantes filtrados y descongelados
mediante cromatografía iónica suprimida, tal como describen Bak et al. [24]. Algunos
experimentos (Fig. 4) se realizaron con lodo concentrado (aproximadamente 1: 1 vol: vol). El
lodo activado concentrado se preparó por sedimentación por gravedad en un cilindro de vidrio
graduado.
2.3. Efectos de los parámetros fisicoquímicos.
Los efectos de diversos parámetros fisicoquímicos sobre la actividad de reducción de sulfato en
lodos se estudiaron en una serie de experimentos. A menos que se indique lo contrario, los
experimentos se realizaron con una muestra de lodo de 60 ml en botellas de infusión de 100 ml
de capacidad. Todas las incubaciones (Secciones 2.3.1 ^ 2.3.4) se modificaron con K2SO4 1 mM
para evitar la limitación de sulfato de la reducción de sulfato durante los primeros días de
incubación. Todos los tratamientos y controles se incubaron por triplicado o por duplicado
durante 100 h.

2.3.1. Efectos de temperatura y concentración de lodos.

Los efectos de la temperatura y la concentración de lodos en la tasa de reducción de sulfato se

estudiaron incubando lodos nativos a 5 y 20 ° C y lodos concentrados (aproximadamente 1: 1 vol:
vol) a 20 ° C.
2.3.2. Efectos de añadir ditionito, antibióticos y mezcla de fuentes de carbono.
Se añadió ditionito sódico (Na2S2O4) a una concentración final de 500 WM. Los antibióticos
cloranfenicol y estreptomicina se agregaron a concentraciones centrales de 20 y 100 mg l31,
respectivamente. Finalmente, las muestras de lodo activado se complementaron con una mezcla
de carbono que contenía acetato, formato, lactato, piruvato (todos como sales de sodio) y etanol a
una concentración central de 2 mM cada uno. Todas las incubaciones se llevaron a cabo por
triplicado, incluidos los controles (lodo no modificado).

2.3.3. Efectos de añadir fuentes de carbono únicas.

Este experimento se realizó utilizando lodo concentrado (1: 1 vol: vol). Se agregaron fuentes de
carbono individuales (D-glucosa, lactato de sodio y acetato de sodio) a una concentración de 20
mM, respectivamente.
2.3.4. Efectos de añadir diferentes concentraciones de glucosa.
Se añadió glucosa en cuatro concentraciones (1, 5, 10 y 20 mM) a 50 ml de lodo activado en
botellas de infusión. Dos inyecciones experimentales adicionales que contenían el trazador 35S se
inyectaron con glucosa 20 mM después de 24 h de incubación. El pH se midió en el tiempo
mediante el muestreo de dos botellas de control (sin 35S-trazador). Una de estas botellas se
inyectó con glucosa 20 mM en t = 0 h y la otra en t = 24 h (es decir, 24 h después del comienzo
de incubación). La incubación se realizó a 30 ºC en la oscuridad durante 50 h con agitación (50
rpm).

2.4. Enumeración del número más probable (MPN) 35S-trazador de SRB en lodos
activados.
El medio de lodo para la enumeración 35S-trazador de SRB se preparó según lo descrito por
Vester e Ingvorsen [22], a excepción de unas pocas modificaciones. Las modificaciones
incluyeron el uso de lodo concentrado (aproximadamente 1: 1 vol: vol) como medio de
enumeración y el aumento de la concentración central de ditionito de sodio a 460 WM. La
enumeración de SRB en muestras de lodo activado se llevó a cabo haciendo diluciones de MPN
triplicadas 10 veces en medio de lodo. En un intento por aumentar la recuperación de SRB,
otra enumeración de MPN de la misma muestra se llevó a cabo en medio de lodo modificado con
una mezcla de donantes de electrones comunes utilizados por SRB. Los tubos de MPN
subestatendidos contenían 2 mM de cada una de las siguientes fuentes de carbono: acetato,
formiato, piruvato, lactato (agregado como sales de sodio) y etanol. Todos los tubos se incubaron
a 20 ° C en posición invertida para reducir el intercambio de gases de difusión a través de los
tapones. Después de 54 días de incubación, se extrajeron submuestras (0,5 ml) de cada tubo con
una jeringa y se inyectaron en 2 ml de acetato de zinc al 20% (p / v) como se describe
anteriormente.
La cantidad de 35S-azufre reducido en las submuestras de los tubos de MPN se determinó
mediante el método de reducción de cromo en un solo paso descrito por Fossing y JSrgensen
[25]. El límite de detección para la reducción de sulfato y, por lo tanto, para la presencia de SRB
en un tubo NMP se estableció en un 0,1% de Tris [22]. Las densidades de población como
"NMP" y niveles de confianza se determinaron utilizando tablas estadísticas de NMP [26].
2.5. Sólidos en suspensión (SS) y sólidos en suspensión volátiles (VSS)
SS y VSS se determinaron de acuerdo con los métodos estándar (APHA) [26]. El SS varió de
5.80 a 1.10 g l31, y el VSS varió de 21 a 66% de SS.
2.6. Estadística
Los análisis estadísticos se realizaron en los tratamientos y controles mediante ANOVA de una
vía (análisis de varianza).
3. Resultados
3.1. Enumeración de SRB en el lodo activado utilizando la MPN 35S-tracer.
Los recuentos viables de SRB estimados por el método de MPN 35S-trazador variaron entre
2.1U105 células ml31 (2.5U104 células por g VSS) y 1.1U106 células ml31 (1.3U105 células por
g VSS). La adición de la mezcla de carbono al medio de lodo no tuvo ningún efecto sobre la
recuperación (es decir, los valores de MPN) de SRB durante los 54 días de incubación. A pesar
de que la reducción de sulfato bacteriano en los tubos de MPN se evaluó mediante un método
sensible del radiotrazador 35S, fue necesario un período de incubación de aproximadamente 2
meses para obtener puntuaciones positivas (es decir, Tris% s0.1) en las diluciones más altas.

3.2. Reducción de sulfato en el lodo activado medida mediante incubaciones con 35S-
sulfato.
3.2.1. Respuesta a las adiciones de sulfato y antibióticos.
La concentración in situ de sulfato en el lodo activado de la PTAR AE varió entre 0.7 y 0.9 mM.
Suplementación de lodos activados con 1, 5 y 10 mM. de sulfato no tuvo efecto sobre la tasa
inicial de reducción de sulfato (0 ^ 6 h) (Yde Nielsen e Ingvorsen, datos no publicados).
En lodos modificados con cloranfenicol y estreptomicina, la reducción de sulfato fue lineal
durante el período de incubación de 100 h. En contraste, se observó un patrón bifásico de
reducción de sulfato en los controles como se muestra en la Fig. 1. Por lo tanto, en ausencia de
antibióticos, la reducción de sulfato bacteriano se desarrolló linealmente durante las primeras 4 ^
5 h de incubación, seguida de una fase exponencial . El análisis estadístico de los datos
experimentales verificó que las tasas iniciales (0 ^ 5 h) de reducción de sulfato en los controles y
lodos modificados con antibióticos fueron similares. Suponiendo que el aumento exponencial
observado en la reducción de sulfato después de 5 ^ 6 h de incubación se deba al crecimiento de
células SRB, "aparente"
Se pueden calcular tasas de crecimiento in situ (W) de 0.06 ^ 0.17 h31 y tiempos de duplicación
(Td) de 4.2 ^ 12.6 h para la SRB que responde en el lodo.

Fig. 1. Cursos en el tiempo de reducción de sulfato en los lodos activados de la EDAR AE en

presencia (a) y ausencia (b) de antibióticos. A: Reducción de sulfato durante las primeras 10 h
de incubación. B: reducción de sulfato durante todo el período de incubación de 110 h. Los
puntos de datos representan los medios de las incubaciones por triplicado, con desviaciones
estándar representadas como barras de error. El tiempo de duplicación (Td) calculado para la
producción de dosis en los controles (b) fue de 4.2 h (r2 = 0.95; 5 ^ 30 h). Concentraciones de
antibióticos añadidos: cloranfenicol 20 mg l31, estreptomicina 100 mg l31. La concentración
inicial de sulfato fue de 0,70 mM.
3.2.2. Adición de agente reductor y donadores de electrones.
Como se muestra en la Fig. 1, la reducción de sulfato comenzó casi inmediatamente y se
desarrolló a una velocidad constante durante las primeras 5 ^ 6 h de incubación hasta el inicio de
la fase exponencial. Este patrón bifásico de producción de sulfuros se observó generalmente con
lodos activados de otras EDAR y también en muestras de lodos de la EDAR AE, que se
preincubaron durante 0,5 h en condiciones aeróbicas (datos no publicados).
Se llevaron a cabo varios experimentos para probar si la fase lineal relativamente larga de
reducción de sulfato podría deberse a un potencial redox bajo o a concentraciones bajas y
limitantes de donantes de electrones en el lodo, que siempre se tomaron muestras durante los
ciclos óxicos de El proceso de lodos activados. La adición del agente reductor ditionito de sodio
no redujo la duración de la fase lineal, lo que indica que un potencial redox alto y desfavorable
probablemente no fue la causa de la fase exponencial retardada observada (Fig. 1). La respuesta
metabólica de la SRB en el lodo activado a las adiciones de diferentes donantes de electrones
potenciales varió considerablemente. La adición de lactato y acetato no tuvo ningún efecto
significativo en la actividad reductora de sulfato inicial de los lodos en comparación con los
controles (Fig. 2)
Anteriormente, observamos que la adición de hidrógeno no tenía un efecto estadísticamente
significativo en la reducción de sulfato (datos no mostrados). En contraste, la adición de la
mezcla de carbono (que contiene lactato y acetato y cuatro donantes de electrones adicionales
utilizados por muchos SRB (ver arriba)) causó un aumento del 18% en la tasa de reducción de
sulfato durante las primeras 5 h de incubación (resultados no mostrados) . Además, la adición de
la mezcla de carbono dio como resultado un inicio más temprano (aproximadamente 3 h) de la
fase de reducción exponencial de sulfato, pero los tiempos de duplicación calculados (intervalo
de tiempo de 5 ^ 30 h) no fueron significativamente diferentes (datos no mostrados). ). Como se
muestra en la Fig. 2, la reducción de sulfato en el lodo activado fue fuertemente inhibida por la
adición de glucosa 20 mM (ver más abajo).
Fig. 2. Los ciclos de tiempo de la reducción de sulfato en el lodo activado enmendados con
diferentes donantes de electrones potenciales: 20 mM lactato (R), 20 mM acetato (a), 20 mM
glucosa (O), sin adición, control (b). La concentración de isótopos fue de 30 kBq 35SO23 4 por
ml de lodo.
Durante las primeras 6 h de incubación, la tasa de reducción de sulfato no se vio afectada por
adiciones de glucosa de 1, 5 o 10 mM (Fig. 3). Si bien solo unas pocas especies descritas de la
SRB pueden usar la glucosa como donante de electrones, un amplio rango de posibles sustratos
de la SRB se produce fácilmente a partir de la glucosa por el metabolismo de las bacterias
fermentativas en el lodo. Sin embargo, la adición de glucosa 20 mM causó una rápida inhibición
de la reducción de sulfato (Fig. 3A), como también se observó en un experimento previo (Fig. 2).
Cuando las muestras de lodo se modificaron con glucosa 5 mM, el inicio de la fase de reducción
exponencial del sulfato se prolongó a aproximadamente 20 h. La reducción de sulfato en las
muestras de lodo modificada con glucosa 10 mM aún aumentó linealmente después de 50 h de
incubación y no entró en la fase exponencial durante las 100 h de incubación (Fig. 3). La
reducción de sulfato se inhibió por completo en unas pocas horas cuando se añadió glucosa 20
mM después de 24 h de incubación y no se reanudó durante las 26 h restantes de incubación (Fig.
3A). La adición de 20 mM de glucosa a los lodos activados causó una disminución marcada del
pH a aproximadamente 5,5 después de 50 h de incubación; los valores de pH menos disminuidos
(pH aproximadamente 6,0) se midieron en lodos suplementados con glucosa 10 mM.
Fig. 3. Efectos de las adiciones de glucosa en la reducción de sulfato en los lodos activados. A:
adición de 20 mM de glucosa al inicio de la incubación (R) y después de 24 h de incubación (O).
Control sin adición de glucosa (b). B: Adición de diferentes cantidades de glucosa al inicio de la
incubación: 1 mM (E), 5 mM (a) y 10 mM (F). Los lodos no modificados sirvieron como control
(b). Los tiempos de duplicación calculados (Td) para la producción de dosis en el intervalo de
tiempo de 24 ^ 50 h fueron 9.9 h (r2 = 0.99; 1 mM de glucosa), 9.9 h (r2 = 0.99; control) y 12.6
h (r2 = 0.99; 5 glucosa mM), respectivamente. La concentración inicial de sulfato fue de 0.73
mM. Todas las muestras fueron incubadas a 30 ° C.
Fig. 4. Efecto de la temperatura sobre la reducción de sulfato en los lodos activados. A:
Reducción de sulfato en los lodos activados incubados a 5 ° C (R) y a 20 ° C (b). Lodo activado
concentrado (1: 1 vol: vol) incubado a 20 ‡ C (O). B: Reducción de sulfato en el lodo activado a
5 ‡ C (R); (el mismo experimento que se muestra en A). Note las diferentes escalas en los ejes Y.
Los datos son el medio de tres incubaciones independientes. Las barras de error representan la
desviación estándar. La concentración inicial de sulfato fue de 0,93 mM. Las muestras de lodos
se recogieron en noviembre.
Los controles y las muestras modificadas con 1 y 5 mM de glucosa tenían valores de pH
alrededor de 7 al final del experimento, como se muestra en la Fig. 3. Las incubaciones de lodo,
que recibieron 10 y 20 mM de glucosa, cambiaron gradualmente de color de negro a amarillo
marrón durante la incubación, probablemente debido a una disolución del sulfato de hierro negro
inducida por el pH inicialmente presente en el lodo.
3.2.3. Respuesta a la temperatura.
El efecto de la temperatura en la reducción de sulfato en los lodos activados de la ATP WWTP se
investigó mediante la incubación de muestras de lodos a 5 y 20 ‡ C (Fig. 4). A 20 ° C, la
reducción de sulfato entró en la fase exponencial después de aproximadamente 6 h de incubación.
Como se esperaba, la tasa de reducción fue mayor (aproximadamente 41%) en lodos
concentrados (aproximadamente 1: 1 vol: vol) incubados a la misma temperatura. Sin embargo,
los tiempos de duplicación calculados a partir de las curvas de reducción de sulfato exponencial
obtenidas más adelante en este experimento no difirieron significativamente (Fig. 4A). La tasa de
reducción de sulfato medida a 5 ‡ C fue baja (la temperatura in situ fluctúa anualmente entre
aproximadamente 3 y 20 ‡ C), pero la reducción de sulfato a esta baja temperatura se hizo
exponencial después de aproximadamente 20 h de incubación, lo que indica la presencia de un
frío. Población SRB adaptada en el lodo. Después de 100 h de incubación, el 4% del conjunto de
sulfato se había reducido a sulfuro de hidrógeno (Fig. 4B).
3.2.4. Tasas específicas de células de reducción de sulfato en lodos activados.
Usando tasas de reducción de sulfato medidas en varios controles durante las primeras 5 h de
incubación y un recuento de MPN de SRB de 7.5U105 células ml31 (media de tres
enumeraciones de MPN independientes), los valores promedio de reducción de sulfato
específicos oscilaron entre 6.4U10315 y 7.7U10314 mol SO23 4 cell31 day31 se calcularon para
la población mixta de SRB en lodos activados de la ATP WWTP.
4. Discusión.
En los lodos activados recién aireados de la PTAR AE, la reducción de sulfato se produjo casi
inmediatamente después de la incubación anaeróbica, siguiendo un patrón bifásico (Figs. 1, 3 y
4). Aparentemente, la baja tasa inicial de reducción de sulfato (la fase lineal) no fue causada por
un potencial redox alto y desfavorable establecido durante el período de aireación anterior, ya que
la adición del compuesto reductor ditionato de sodio no acortó la duración de la fase lineal. En la
PTAR AE, tanto el oxígeno como el nitrato se consumen completamente en menos de 1 h
después del cese de la aireación. Por lo tanto, tampoco es probable que la causa sea la
competencia del sustrato con bacterias aeróbicas y denitrificantes, ya que la fase lineal de baja
reducción de sulfato normalmente duró al menos 5 h. La competencia del sustrato con bacterias
reductoras de Fe (III) que son abundantes en algunos sistemas de lodos activados podría ser otra
explicación.
[27,28]. El azufre elemental y otros compuestos de azufre inorgánico oxidado podrían estar
presentes en el lodo anóxico como resultado de los procesos de oxidación químicos y biológicos
que tienen lugar durante los períodos óxicos. Estos aceptadores de electrones pueden ser
utilizados de manera preferencial o simultánea con sulfato por SRB, lo que resulta en una
disminución en la tasa de reducción inicial de sulfato. Además, un gran número de anaerobios
que no son SRB son capaces de reducir, p. tiosulfato, y estas bacterias en teoría podrían competir
con SRB tanto para los donantes de electrones como para los aceptadores de electrones.
La mayoría de los SRB son incapaces de degradar compuestos de alto peso molecular y dependen
de los productos de fermentación para su metabolismo [1,18,29]. Es probable que la
concentración de productos de fermentación se conduzca considerablemente en lodos activados,
siendo la más baja al final del período óxico. Estudios recientes han demostrado que la SRB
oxidante de acetato y lactato es numéricamente importante en algunos sistemas de aguas
residuales [11,30,31]. Dado que la reducción de sulfato no fue afectada por la adición de lactato
ni por acetato y solo se estimuló levemente mediante la adición de una mezcla de carbono, la
limitación del sustrato probablemente no sea la causa principal de las bajas tasas iniciales de
reducción de sulfato observadas después del cese de la aireación. La adición de hidrógeno,
aunque un sustrato importante para SRB, no aumentó la reducción de sulfato.
La adición de 20 mM de glucosa redujo fuertemente la reducción de sulfato (Figs. 2 y 3A) y
estuvo acompañada por una caída del pH de 7.0 a aproximadamente 5.5, un inhibidor del pH para
la mayoría de los SRB [29]. Aunque la glucosa no es metabolizada por la mayoría de los SRB
conocidos [1,29], se puede fermentar para producir hidrógeno y una amplia gama de compuestos
de bajo peso molecular, que podrían servir como donantes de electrones para los SRB. El
agrietamiento del lodo indica la presencia de poblaciones activas de bacterias fermentadoras, que
producen metabolitos ácidos a una tasa que supera su tasa de consumo de SRB, reductores de Fe
(III) y metanógenos. Los cálculos muestran que los SRB en el lodo AE WWTP constituyen solo
alrededor de 0.03.1% de la población bacteriana total (ver más abajo) y por lo tanto,
aparentemente, se sobrecargan fácilmente con sustratos ácidos cuando la población
(presumiblemente mucho más grande) de bacterias fermentadoras es estimulada por La adición
de glucosa.
La tasa de reducción de sulfato en la PTAR AE no se estimuló cuando se incrementó la
concentración de sulfato in situ (resultados no mostrados). Esta definición concuerda con las
obtenidas en otros estudios, que emplean incubaciones in vitro de sedimentos de lodo activado o
agua dulce y bio-lms [4,7,11,32,33] y con constantes de media saturación publicadas (Km) para
la absorción de sulfato de 5 ^ 30 WM, determinado para las cepas de SRB [5,9,34] en agua dulce.
Los recuentos de MPN indicaron una población bastante constante de SRB (2.1U105 a 1.1U106
células ml31) en el lodo activado por AE a lo largo del año (Tabla 1). A pesar del uso de un
medio natural que mejora la recuperación de SRB a partir de muestras ambientales [22,35], el
tamaño real de la población de SRB se subestima intrínsecamente mediante técnicas de conteo de
MPN, debido al agrupamiento de las células y la agregación en los lodos.
Se obtuvieron estimaciones más altas de MPN (5 ^ 9 veces) después de la homogeneización por
rotura de la jeringa [36] o en un molinillo de tejido de vidrio (tubo de Potter), pero las muestras
así tratadas todavía contenían grandes cantidades de libras (aproximadamente 100 ^ 300 Wm en
longitud / diámetro ; Stobbe, Urup Kjeldsen e Ingvorsen; resultados no publicados) y
presumiblemente algunas microcolonias. Nielsen y Nielsen [37], utilizando los recuentos DAPI,
informaron un número total de bacterias de 2.4U109 ml31 en los lodos activados de la EDAR de
AE, lo que indica que los SRB constituyen al menos el 0,03% (utilizando nuestra estimación más
alta de MPN) de la población bacteriana total. Suponiendo una subestimación de 20 veces debido
a la acumulación de células y la agregación de las partículas de lodo, las densidades de SRB
podrían constituir aproximadamente el 1% de la comunidad bacteriana total. Esto está de acuerdo
con los valores del 0,5% a 8% reportados por Manz et al. [12], utilizando FISH. En un estudio
reciente realizado en la WWP de AE, se determinaron densidades de SRB de 3 ^ 6U106 células
ml31 utilizando diferentes técnicas moleculares cuantitativas (Joulian et al., En preparación).
Tabla 1 Densidades de SRB y tasas de reducción de sulfato notificadas desde sistemas de lodos
activados Densidad de SRB [método utilizado] Tasa de reducción de sulfato [método utilizado]
Referencia 3 ^ 5% del total de células (DAPI) [FISH] no detectable [microsensor y trazador 35S
método] Schramm et al. (1999) [13]
‘Números bajos '[FISH] no detectable [microsensor y método 35S-trazador] de Beer et al. (1998)
[14]
4.1U104 ^ 5.1U105 CFU g VSS31 [recuentos en placa] 4 ^ 32 Wmol SO23 4 g VSS31 h31
[análisis de SO23 4] Lens et al. (1995) [11] a
107 células ml31 (aproximadamente el 1% de la población total) [FISH]
2 ^ 5 Wmol SO23 4 g VSS31 h31 [medidas de SO23 4 y H2S]
P.H. Nielsen (comunicación personal) b
7.5U106 ^ 2.4U107 células ml31 [MPN 35S-trazador en medio natural]
ND Nygaard Jensen e Ingvorsen (no publicado) c
107 células ml31 [MPN 35S-trazador en medio natural] ND Stobbe, Kjeldsen e Ingvorsen (sin
publicar) d
2.1U105 ^ 1.1U106 células ml31 o 2.5U104 ^ 1.1U105 células g VSS31 [MPN 35S-trazador en
medio natural]
0.07 ^ 0.8 Wmol SO23 4 g VSS31 h31 o 0.2 ^ 2.4 Wmol l31 SO23 4 h31 [método del trazador
35S, tasas lineales iniciales]
estudio actual
ND, no determinado. aSRB no detectable en todas las muestras. Las mediciones de las tasas de
reducción de sulfato se realizaron a 37 ° C en medio mineral inoculado con lodo. EDAR de la
EDAR, Jutlandia, Dinamarca. cMarselisborg WWTP, Jutlandia, Dinamarca. dOdder WWTP,
Jutlandia, Dinamarca.

Las tasas de reducción de sulfato específico de la célula alcanzaron valores de 6.4U10315 a

7.7U10314 mol SO23 4 cell31 day31, que son iguales o superiores a los medidos en cultivos
puros de SRB durante el crecimiento exponencial (0.2U10315 a 50U10315 mol SO23 4 cell31
day31) [22,38] y los medidos en sedimentos marinos (3 ^ 16U10315 mol SO23 4 cell31 day31),
según lo referenciado por Teske et al. [39]. Sahm et al. Hallaron tasas de reducción de sulfato
específicas significativamente menores (0.01 ^ 0.09U10315 mol SO23 4 cell31 day31). [40] En
un sedimento marino costero. Sin embargo, la comparación de las tasas de reducción de sulfato
específicas de células calculadas con las obtenidas a partir de cultivos puros de crecimiento
exponencial puede no ser siempre informativa debido a grandes errores en la estimación
Densidades celulares en muestras ambientales. Además, es poco probable que una gran fracción
de la población total de SRB en una comunidad microbiana compleja exprese actividad
metabólica exponencial.

El presente estudio muestra que las tasas iniciales de reducción de sulfato en lodos activados (es
decir, la tasa constante inicial de reducción de sulfato expresada inmediatamente después de un
cambio de condiciones óxicas a anóxicas) son bajas (Tabla 1) y solo se pueden estimar con
precisión usando un 35S sensible Técnica de radiotrazadores y no mediante mediciones químicas
de cambios en concentraciones de sulfatos o sulfuros. La adición de antibióticos inhibidores de la
síntesis de proteínas al fango alarga la fase lineal de la reducción de sulfato (Fig. 1), un efecto
que también se observa en otras plantas de fango activado (Urup Kjeldsen e Ingvorsen, no
publicados). El mecanismo (s) detrás de tales cinéticas no está claro. Suponiendo una inhibición
completa de la síntesis de proteínas, la cinética de orden cero de la reducción de sulfato
observada (Fig. 1B) indica una actividad específica constante de las enzimas involucradas en la
reducción de sulfato de asimilación (es decir, sin degradación endógena de las enzimas), un
evento improbable dentro de las 100 h periodo de incubación.
El desarrollo exponencial de la producción de sulfuros en incubaciones sin antibióticos se puede
atribuir a varios mecanismos: (1) un aumento en el número total de células, (2) un aumento en el
contenido ribosomal de células individuales, (3) reactivación de algunas vías bioquímicas dañado
durante la fase de aireación, o (4) reactivación de células 'inactivas'. Los tiempos de duplicación
de la producción de azufre variaron de 4 a 13 horas y son comparables a los tiempos de
duplicación medidos en cultivos puros de SRB [9,41,42]. Sin embargo, queda por demostrar que
los SRB pueden expresar el crecimiento exponencial in situ en lodos activados.
Sin embargo, el aumento exponencial en la producción de sulfuros indica un acoplamiento
metabólico estricto y eficiente entre las bacterias fermentadoras y SRB en el lodo activado.
Suponiendo un coeficiente de rendimiento celular YSO4 de 4 g de peso de células secas (cdw)
por mol de sulfato consumido según lo informado para Desulfovibrio [43,44] y una masa celular
promedio de 2.8U10313 g cdw por célula SRB, un consumo completo de 1 El sulfato mM
(concentración in situ en la PTAR AE) podría dar lugar teóricamente a una producción máxima
de novo de 1U107 células ml31. Esto corresponde aproximadamente a una duplicación de la
población inicial, un aumento que sería imposible de detectar mediante el conteo de MPN o
técnicas moleculares. Los coeficientes de rendimiento celular varían enormemente [44] y, por lo
tanto, el aumento teórico en el número de células, tal como se calculó anteriormente, representa
un rendimiento celular demasiado alto para SRB expuesta a estrés de oxígeno en lodos activados.

Varios estudios han demostrado que la estabilidad de los lodos de lodo disminuye durante las
condiciones anóxicas y está altamente correlacionada con el contenido de hierro oxidado. La
reducción de Fe (III) a Fe (II), directamente por procesos respiratorios microbianos o
indirectamente por reacción con sulfuro, demostró tener un fuerte efecto negativo en la fuerza de
lodo £ ocs [15 ^ 17,45 ]. La reducción de la estabilidad de los océanos da como resultado la
destrucción y el deterioro de las propiedades de sedimentación y deshidratación de los lodos. De
acuerdo con estudios de laboratorio, las concentraciones de concentración s1 mM son necesarias
para efectuar una desintegración significativa de lodos (16). Debido a las bajas cantidades de
sulfuro producidas durante las primeras 5 ^ 10 h de anoxia (véanse las figuras 1, 2 y 4), es poco
probable que el SRB desempeñe un papel importante en la destrucción de partículas de lodo en el
Tanques de aireación en la PTAR AE, operando con ciclos anóxicos de 2 ^ 4 h. Sin embargo, el
lodo activado a menudo se almacena en tanques de sedimentación durante varios días antes de la
deshidratación. En lodos sedimentados, la producción de concentraciones milimolares de sulfuro
podría ocurrir en menos de 48 h. El almacenamiento de lodo en los tanques de sedimentación
durante un par de días podría afectar la significación de las partículas de lodo.
Agradecimientos
Agradecemos a Per HalkjXr Nielsen y Kasper Urup Kjeldsen por las discusiones útiles. Tove
Wiegers es reconocida por su asistencia técnica. El estudio fue apoyado por el Consejo de
Investigación Técnica Danés (STVF) como parte del programa de investigación "Actividad y
Diversidad en Sistemas Microbianos Complejos".
Referencias
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