Universidad Autónoma “Benito Juárez” de

Oaxaca

Facultad de Ciencias Químicas

Lic. En Químico Farmacéutico Biólogo

Caracterización de la expresión de las proteínas contenidas en vesículas

extracelulares obtenidas de células HepG2

Por: Daniel Pacheco García

Director: Dra. Anayetzin Torres

DPTO: DE BIOLOGÍA MOLECULAR

CICIMEBIO
FAC. DE MEDICINA Y CIRUGIA
U.A.B.J.O

1
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN..................................................................................................................................4
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.....................................................................................................5
JUSTIFICACIÓN...................................................................................................................................5
OBJETIVO GENERAL............................................................................................................................6
OBJETIVOS ESPECÍFICOS.....................................................................................................................6
HIPÓTESIS...........................................................................................................................................6
MARCO CONCEPTUAL........................................................................................................................7
COMUNICACIÓN CELULAR.............................................................................................................7
VESÍCULAS EXTRACELULARES........................................................................................................8
CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS.....................................................................................................9
BIOGÉNESIS...................................................................................................................................9
AISLAMIENTO DE EXOSOMAS......................................................................................................12
METODOLOGÍA................................................................................................................................13
DISEÑO DEL ESTUDIO...................................................................................................................13
MATERIALES................................................................................................................................13
CULTIVO CELULAR........................................................................................................................13
AISLAMIENTO DE EXOSOMAS......................................................................................................14
DETERMINACIÓN DE LA CONCENYTRACIÓN DE PROTEÍNAS .......................................................14
WESTERN BLOT............................................................................................................................15
ANALÍSIS ESTADÍSTICO.................................................................................................................16
ASPECTOS ÉTICOS.........................................................................................................................16
REFERENCIAS....................................................................................................................................18
ANEXOS...........................................................................................................................................22

2
ÍNDICE DE FIGURAS Y CUADROS
FIGURA 1 (clasificación de VE según su biogénesis)..................................................................11
CUADRO 1 (VARIABLES CONSIDERADAS).........................................................................................17

3
INTRODUCCIÓN

El concepto de vesículas extracelulares abarca un grupo de estructuras muy heterogéneas

tanto por su tamaño y forma como por su contenido y las funciones que desempeñan.
Generalmente se distinguen tres tipos de vesículas extracelulares: cuerpos apoptóticos,
microvesículas y exosomas. Los cuerpos apoptóticos y las microvesículas, cuyo diámetro
puede variar entre 150-1000 nm y 50-2000 nm respectivamente, representan la parte más
conocida de las vesículas extracelulares que se describen como una forma de transporte del
contenido intracelular destinado al reciclaje de los productos de desecho. Los exosomas son
el grupo de vesículas de más reciente descubrimiento. Fueron descritas por primera vez por
Trams y col en el año 1981 y posteriormente Johnstone y col. (1983). (Johnsen et al.,
2014) acuñaron su nombre y desarrollaron el concepto en profundidad.

Los exosomas son vesículas que miden entre 40-100 nm y derivan de un proceso de
endocitosis de membrana celular que, a su vez, se fusiona con cuerpos intracelulares y son
liberados al medio por exocitosis, tras un proceso de activación celular. Contienen
microARN, ARNm, fragmentos de ADN y proteínas (H. Valadi et al., 2007). Se liberan
tanto de forma constitutiva como regulada mediante exocitosis de cuerpos multivesiculares.
Los exosomas se han caracterizado principalmente en células del sistema inmunitario
(células dendríticas, linfocitos T, linfocitos B, macrófagos), en células epiteliales y en
células tumorales (György et al., 2011). Los mecanismos fundamentales por lo que los
exosomas podrían ejercer sus funciones biológicas en las células son: el contacto directo
entre las moléculas de superficie de los exosomas y de las células, mediante la fusion de la
membrana de las células y de los exosomas y por endocitosis de los exosomas (Raposo and
Stoorvogel, 2013). Los exosomas cuentan con fosfatidilserina en la capa externa de la
membrana e incluyen los marcadores CD63, CD81, CD9, LAMP1 y TSG101 (Lee et al.,
2012).

HepG2 es una línea celular inmortalizada que consiste en células de carcinoma hepático
humano, derivado del tejido hepático de un varón de raza caucásica de 15 años que tenía un
carcinoma Hepatocelular bien diferenciado. La morfología de las células HepG2 es epitelial
y contiene 55 pares de cromosomas. Las células HepG2 se pueden cultivar con éxito a gran
escala, y secretan muchas proteínas plasmáticas, tales como transferrina, fibrinógeno,

4
plasminógeno y albúmina. Son células adherentes, de tipo epitelial, que crecen como
monocapas y en pequeños agregados.

En el presente estudio se pretende caracterizar proteínas contenidas en vesículas

extracelulares obtenidas de células HepG2 y así utilizarlas como biomarcadores para cáncer
de hígado.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El uso de líneas celulares de hígado como modelo in vitro permite contrarrestar los
problemas de trabajar y preservar cultivos primarios, dado que presentan una mayor
estabilidad fenotípica, con una mayor facilidad a la hora de trabajar en laboratorio. El gran
problema de todas las líneas celulares hepáticas es su muy limitada actividad
biotransformadora, debido a la pérdida de los niveles enzimáticos, especialmente las
enzimas referentes al citocromo P450. A pesar de esto, una de las líneas celulares más
utilizadas como modelo hepático es la HepG2, debido a que muestra una gran cantidad de
funciones hepáticas y de expresión enzimática (Gomez-Lechon et al., 2007). Esta línea,
descubierta en 1980, proviene de un adolescente caucásico que sufría de cancer hepático o
hepatocarcinoma y su crecimiento es de tipo epitelial formando pequeños agregados (Sahu,
2007). Por lo que el presente trabajo, caracterizará las proteínas presentes en vesículas
extracelulares contenidas en células HepG2.

¿Qué proteínas están presentes en las vesículas extracelulares de las células HepG2?

JUSTIFICACIÓN

Desde su descubrimiento, las células HepG2 se han utilizado como modelo in vitro en
varias líneas de investigación, de las cuales se pueden destacar: estudios que buscan una
mejor representación de células hepáticas a través del crecimiento en soportes, en
biorreactores o a través de la formación de esteroides (Hoess et al., 2007; Wu et al., 2010);
entendimiento de ciertos procesos que involucren anomalías menores, como fosfolípidos, o

5
de mayor magnitud, como hígado graso o diabetes, caracterizando algunos marcadores que
permitan identificarlas (Thome-Kromer et al., 2003; Atienzar et al., 2007; Liu et al., 2011;
Wang et al., 2011); utilización de estas células para la producción de hígado bioartificiales
(Omasa et al., 2005; Mavri-Damelin et al., 2008 ). La información podrá enriquecer los
programas académicos de la Lic en Q.F.B, así mismo, diversificar las líneas de
investigación tanto en la FMC como en la FCQ.

OBJETIVOS

General

Analizar la expresión de las proteínas contenidas en vesículas extracelulares obtenidas de

células Hep-G2.

Específicos

Caracterizar la expresión de las proteínas contenidas en vesículas extracelulares obtenidas

de células Hep-G2.

Cuantificar la cantidad de proteína presente en las vesículas extracelulares obtenidas de

células Hep-G2.

HIPÓTESIS

Las células HepG2 secretan vesículas extracelulares como medio de comunicación, en

dichas vesículas se expresan gran cantidad de proteínas aún sin caracterizar, por ello, se
considera que de las vesículas extracelulares pueden obtenerse proteínas que serán de
utilidad para el estudio de la progresión del carcinoma Hepatocelular o para su detección
temprana.

6
MARCO CONCEPTUAL

Comunicación celular
La supervivencia de las células está condicionada, entre otros factores, por su capacidad de
intercambiar mensajes con el medio ambiente. Esto pone de manifiesto la relevancia de un
funcionamiento adecuado de la maquinaria celular para emitir y procesar mensajes. En
concreto, cuando el medio ambiente es otra célula, hablamos de comunicación celular. Los
mecanismos que posee la célula para asegurar su comunicación celular son diversos y
pueden distinguirse dos subgrupos (Brücher y Jamall, 2014):
a) directo: en donde el mensaje se transmite por contacto célula-célula pudiendo ser la
célula receptora:
 distinta a la emisora (comunicación justacrina, incluye también a la señal sináptica)
 la misma célula emisora (comunicación autocrina)
b) indirecto: en el cual el mensaje es excretado por la célula emisora al medio ambiente
extracelular y es captado en un siguiente paso por:
 una o varias células cercanas (comunicación paracrina)
 una o varias células a distancia (comunicación endocrina, aunque este término se
acota a la comunicación mediante hormonas)
Dentro del mecanismo de comunicación celular indirecta, se ha incluido a partir de la
última década (tomando como referencia el trabajo de Valadi et al., 2007) el mediado por
vesículas extracelulares (VE) definidas como partículas cubiertas de membrana celular
originadas en el interior de la célula emisora o por evaginación de su membrana plasmática
y excretadas al medio extracelular para ser captadas posteriormente por células receptoras
(cercanas o a distancia). Desde entonces, las VE y su condición de transportadores de
información intercelular han sido objeto de estudio en el campo biomédico, emergiendo así
interesantes líneas de investigación.

7
Vesículas extracelulares
El concepto de vesículas extracelulares abarca un grupo de estructuras muy heterogéneas
tanto por su tamaño y forma como por su contenido y las funciones que desempeñan.
Generalmente se distinguen tres tipos de vesículas extracelulares: cuerpos apoptóticos,
microvesículas y exosomas. Los cuerpos apoptóticos y las microvesículas, cuyo diámetro
puede variar entre 150-1000 nm y 50-2000 nm respectivamente, representan la parte más
conocida de las vesículas extracelulares que se describen como una forma de transporte del
contenido intracelular destinado al reciclaje de los productos de desecho. Los exosomas son
el grupo de vesículas de más reciente descubrimiento. Fueron descritas por primera vez por
Trams y col. en el año 1981 (Johnsen et al., 2014) y posteriormente Johnstone y col. en el
año 1983 acuñaron su nombre y desarrollan el concepto en profundidad. A diferencia del
resto de las vesículas extracelulares, los exosomas están directamente implicados en la
comunicación intercelular y están ganando protagonismo en todo tipo de procesos tanto
fisiológicos como patológicos.
Los exosomas son vesículas constituidas por una bicapa lipídica con un diámetro entre 40-
120 nm y una densidad entre 1.15-1.19 g/ml (Théry et al., 2006), que han sido detectadas
en la mayoría de los líquidos biológicos incluyendo sangre, orina, líquido cefalorraquídeo,
linfa, líquido sinovial, leche materna, saliva, entre otros (Tang et al., 2015), cuya principal
característica es su función como mensajeros intercelulares. Son un grupo de vesículas muy
diverso en la composición de su bicapa lipídica y en su contenido, lo que les confiere una
alta selectividad de interacción con la célula diana y capacidad de modificación del
metabolismo celular gracias a las proteínas y los ácidos nucleicos que transportan, sobre
todo mediante los mRNAs y los miRNAs. Como resultado de su alta selectividad y su
capacidad de llevar mensajes entre distintos tipos celulares, junto con su pequeño diámetro
y su baja inmunogenicidad se ha convertido en objeto de estudio como agentes terapéuticos
en enfermedades neurodegenerativas y carcinomas o como posibles vectores endógenos
para el transporte de medicamentos (Théry et al., 2006).

8
Características biológicas

Las VE son partículas rodeadas de membrana plasmática provenientes del interior de la

célula o formadas directamente desde su membrana y excretadas al medio extracelular.
Llevan información desde la célula de origen a la célula diana (Vlassov et al., 2012),
participando en numerosas funciones biológicas como por ejemplo presentación de
antígenos sin contacto celular (Zitvogel et al., 1998), modificación del microambiente y
“educación” celular a distancia (Peinado et al., 2012), funciones que han sido agrupadas
bajo el término “comunicación celular sin contacto directo” (comunicación celular
indirecta). A su vez, estos roles biológicos han sido relacionados a una amplia variedad de
procesos fisiopatológicos siendo estudiados con mayor profundidad en cáncer
enfermedades mediadas por el sistema inmune (Robbins y Morelli, 2014) y enfermedades
cardiovasculares (Fleury et al., 2014). Se ha visto que tanto en condiciones patológicas
como fisiológicas, estas vesículas pueden ser liberadas tras la activación, apoptosis o estrés
celular (Simons y Raposo, 2009).

Específicamente, las VE pueden transportar proteínas, lípidos, glucolípidos y material

genético como DNA y RNA mediante los que producirá modificaciones fenotípicas (Mause
y Weber, 2010) y genotípicas (Waldenström et al., 2012), en las células receptoras. Este
proceso está facilitado por las moléculas en la superficie de la membrana vesicular que le
permite ser identificada y captada por la célula diana e interactuar con ella.

Biogénesis
Aunque hay varias formas de clasificar las VE, la principal división en la nomenclatura está
basada en su biogénesis. Así se describen 3 tipos de VE (Figura 1):

 Aquellas formadas dentro de los cuerpos multivesiculares y excretados

extracelularmente luego de la fusión de estos cuerpos con la membrana plasmática
son denominados exosomas. Su principal característica es tener un tamaño uniforme
en un rango comprendido entre 30 a 150 nm, siendo las VE más pequeñas (Théry et
al., 2001).

9
  Por otro lado, las vesículas denominadas micropartículas (MP), microvesículas
(MV) o ectosomas (resumidas aquí como MP/MV), derivan de la modificación de la
membrana celular luego de recibir un estímulo externo o interno que conduce al
reblandecimiento de las estructuras adyacentes de la membrana permitiendo la
evaginación y formación de la vesícula hasta su desprendimiento completo (Frey y
Gaipl, 2011). Estas MP/MV varían ampliamente en tamaño desde 300 a 1000 nm de
diámetro.
 Por último, los cuerpos apoptóticos están incluidos dentro de la categoría de VE,
siendo los de mayor tamaño (hasta 5 μm) y más diversos respecto a morfología,
tamaño y composición aunque los menos estudiados dentro del conjunto de VE
(Yánez-Mó et al., 2015).

A pesar de esta clasificación biológica, en términos prácticos cuando se aíslan VE según su

tamaño, se observa un solapamiento entre los 3 tipos, encontrándose por ejemplo gran
cantidad de MP/MV con tamaños alrededor de 150 nm así como pequeños cuerpos
apoptóticos que rondan los 500 nm y son indistinguibles de las MP/. Debido a esto entre
otros factores, la tendencia actual es denominar el conjunto entero como VE, término
acuñado por la ISEV10 (Raposo y Stoorvogel, 2013).

10
 A

11
Figura 1: A) clasificación de VE según su biogénesis. B) comparativa de tamaños de
subtipos de VE. Tomado de György et al (2011).

Aislamiento de exosomas
Las técnicas de aislamiento de los exosomas más frecuentemente utilizadas en los estudios
realizados en el laboratorio están basados en la separación por ultracentrifugación (Théry et
al., 2006), de la muestra con el fin de precipitar restos celulares y otras interferencias del
medio. Uno de los inconvenientes de la ultracentrifugación es la presencia de agregados
proteicos en el pellet final. Para mejorar los resultados de la purificación, se puede recurrir
al uso de gradientes de sacarosa para separar los exosomas por su densidad característica.

Otro método de aislamiento rápido y eficaz está basado en la inmunocaptura de los

exosomas en la superficie de unas bolitas magnéticas recubiertas con anticuerpos frente a
una de las proteínas expresadas en la superficie de los exosomas lo que permite un fácil
manejo de los exosomas. Las técnicas usadas normalmente para la caracterización e
identificación de exosomas consisten en el estudio morfológico mediante microscopia
12
electrónica y en la inmunodetección con anticuerpos específicos de proteínas características
de los exosomas (“Western Blot”). También se pueden estudiar sus características
aplicando citometría de flujo sobre los exosomas fijados en las bolitas de inmunocaptura;
ya que debido al pequeño tamaño de los exosomas libres, no es posible analizarlos (Théry
et al., 2006).

METODOLOGÍA

Diseño del estudio

Se realizará un estudio experimental en el Departamento de Biología Molecular CIMEBIO

de la Facultad de Medicina y Cirugía, UABJO, de septiembre 2017 a mayo del 2018.

Material

 Micropipetas esterilizadas, equipo de electroforesis Bio RadTM, ultracentrífuga,

centrifuga, incubadora con atmosfera controlada, campana de flujo laminar,
espectrofotómetro, filtros de 0.22 y 0.45 micrómetros, botella para cultivo de 25
mL, vortex, tubo Falcón de 15 y 50 mL, Eppendorf, picetas.

13
  Medio de tampón fosfato (PBS) de pH 7.4, suero fetal bovino (FBS), antibiótico,
tipsina, etanol, Glicina, Tris 0.5 M pH 8.8, Tris 1.5 pH 6.8,
acrilamida/bisacrilamida, TEMED, Glicerol, reactivo Bradford.
 Línea celular Hep-62 de carcinoma Hepatocelular.

Antes de iniciar la manipulación se procederá a la limpieza y desinfección de todo el

material que se va a usar y de la campana de flujo laminar con etanol al 70%.

CULTIVO CELULAR

Se realizará el cultivo celular de la línea celular HepG2 en el medio de cultivo DMEM

suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS), que aporta los nutrientes necesarios
para el desarrollo celular y 1 % de antibiótico, para evitar la contaminación microbiana. Las
células se mantendrán a 37 °C y en atmósfera de 95 % de oxígeno y 5 % de CO 2 en
incubadora.

Cada dos o tres días se procederá a cambiar el medio de cultivo para retirar productos de
desecho celular, evitando de este modo, efectos tóxicos sobre las células cultivadas, además
de renovar las fuentes de nutrientes necesarios para el crecimiento celular.

AISLAMIENTO DE LOS EXOSOMAS

Para proceder con el aislamiento de los exosomas, es necesario incubar previamente los
cultivos en un medio sin exosomas durante 72 horas para evitar la contaminación con los
procedentes del suero FBS. El medio sin exosomas se preparará mediante dos
ultracentrifugaciones de medio completo a 25.000 rpm y 4°C, durante 6 horas,
recogiéndose el sobrenadante. Después de la incubación, con dicho medio, se obtendrá un
medio extracelular con exosomas de células Hep62. Para aislarlos se someterá el medio a
centrifugación a 1500 rpm y 4°C, durante 4 minutos, para precipitar las células presentes. A
continuación, se recogerá el sobrenadante y se volverá a someter a una ultracentrifugación a
9.500 rpm, 4°C durante 25 min. para precipitar los cuerpos apoptóticos y restos celulares
del medio. El sobrenadante obtenido se pasará a través de un filtro de 0.22 micrómetros
para eliminar las partículas de mayor diámetro del medio, se obtendrá un pellet de
exosomas procedentes de células HepG2 que se resuspenderá cuidadosamente con 50

14
microlitros del medio sin exosomas. La disolución final se conservará a -20°C hasta su uso
posterior.

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO

BRADFORD

En primer lugar, se realizará una curva patrón utilizando albumina sérica bovina (BSA) a 1
microgramo/mL como patrón que se diluye con agua destilada, preparando seis muestras
con rango de concentración creciente, desde 0 microgramos/mL hasta 1 microgramo/mL,
de BSA. Por otro lado, se realizará una dilución 1:5 de reactivo de Bradford, que contiene
colorante azul de Coomassie G-250 y se procederá a la preparación de una placa de 6
pocillos para la realización de la curva de calibrado. Para ello, el análisis de cada muestra se
realizará por triplicado con concentraciones conocidas de BSA; y por otro lado con la
muestra de exosomas sin diluir y diluida 1:1 por duplicado. Se agitará la placa para
favorecer la reacción de colorante entre reactivo de Bradford y las proteínas, obteniendo
una coloración azul que corresponde a la presencia de proteínas, que se medirá mediante la
valoración de la absorbancia de las muestras en un espectrofotómetro a 595 nm.

Con las concentraciones conocidas y las absorbancias obtenidas de BSA se realizará una
curva patrón, donde se interpolarán los resultados de las muestras para calcular su
concentración.

WESTERN BLOT

Antes de comenzar con la electroforesis, se procederá a lisar el concentrado de exosomas

con tapón de lisis: 20 mM Tris-HCl (pH=7.5), 1 mM EDTA, 0.5 M NaCl, 2mM PMSF y 5
microgramos/mL de inhibidores durante 30 min y 4°C. Tras la lisis se añadirá el tampón de
carga y se someterá a 95°C durante 5 minutos para desnaturalizar las proteínas de los
exosomas. Por otro lado, se prepararán los geles que se montarán uno por encima del otro
para levar a cabo la electroforesis.

Para preparar el gel separador al 10% en tubo Falcon de 15 mL se adicionará 2500

microlitros de acrilamida, 3000 microlitros de agua destilada, 1875 microlitros de Tris 0.5
M pH 8.8, 75 microlitros de SDS 10%, 37.5 microlitros de Persulfato de amonio y 10

15
microlitros de TEMED, se homogenizará y se coloca en la cámara de electroforesis
posteriormente se adicionará agua destilada para eliminar burbujas que quedaron presentes.
Para preparar el gel concentrador al 10% es un tubo Falcon de 15 mL se adicionará 225
microlitros de acrilamida, 2275 microlitros de agua destilada, 400 microlitros de TRIS pH
6.8, 31.50 microlitros de SDS, 15 microlitros de persulfato de amonio y 10 microlitros de
TEMED, se homogenizará, se retirará el agua destilada que se colocó en el gel separador y
se adicionara rápidamente, posterior a ellos se colocara el peine. Al polimerizar, se retirará
el casete y se colocará dentro del tanque de carga. Una vez preparado el gel en el cassette
del equipo de electroforesis se añadirán las muestras, del lisado de exosomas y el marcador
de peso molecular. Se pondrá en marcha la electroforesis, a 120V en presencia de tampón
de electroforesis compuesto por Tris 50 mM, Glicina 0.4 M, SDS 0.1%, metanol 20% y
agua durante una hora.

Transcurrido este tiempo se realizará la transferencia de las proteínas del gel a una
membrana de nitrocelulosa, durante toda la noche a 25 V y 4°C. De esta manera, las
proteínas separadas en el gel se transferirán a la membrana de nitrocelulosa. A
continuación, la membrana se incubará con el tampón de bloqueo durante 1 hora para
prevenir unión inespecífica de anticuerpos a la membrana.

El siguiente paso consistrá en incubar la membrana con una dilución del anticuerpo CD63
1:100 en el tampón de bloqueo, durante toda la noche a 4°C. Transcurrido el tiempo se
recoge la dilución del anticuerpo y se congela para su reutilización. A continuación, se
lavará la membrana 3 veces con PBS, para eliminar el exceso de anticuerpos.

Posteriormente se procederá a incubar el anticuerpo secundario poniendo en contacto la

membrana con revelador constituido por ECL y H2O2 durante 3 min. Se secará y se
introducirá en una cámara junto con la película fotográfica, que se revelará en el equipo de
revelado CP1000.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

La información se analizará mediante tablas de distribución de frecuencias, medidas de

frecuencia central, medidas de varianza y se presentara los resultados por medio de gráficas
para ello se utilizara el programa Excel.

16
ASPECTOS ÉTICOS

Es necesaria la existencia de normas efectivas para la descontaminación de todos los

materiales utilizados en relación con los cultivos celulares y fluidos de desecho. Los
procedimientos de descontaminación deberán ser capaces de inactivar virus y otros agentes
contaminantes aun en presencia de fluidos con una elevada carga de material orgánico. La
descontaminación química es por esta causa menos efectiva que la que se obtiene por calor
(Beltrán, 2016).

Cuadro 1. Variables consideradas

variable tipo Unidad

Concentración de células Cuantitativa continua Cél./mL
HepG2

Concentración de Cuantitativa continua Cél./mL

Exosomas obtenidos de
células HepG2
Concentración de Cuantitativa continua Cél/mL
proteínas presentes en los
exosomas

17
Tiempo de incubación Cuantitativa discreta Horas

REFERENCIAS

Atienzar F, Gerets H, Dufrane S, Tilmant K, Cornet M, Dhalluin S, Ruty B, Rose G y

Canning M (2007). Determination of phospholipidosis potential based on gene expression
analysis in HepG2 cells. Toxicol Sci 96(1): 101-14.

B. Févier, G. Raposo. (2004). Exosomes: endosomal-derived vesicles shipping extracellular

messages. Curr Opin Cell Biol. 16, pp. 415-421.

Beltrán V. N.E. Técnicas de cultivos celulares e ingeniería de tejidos (2016). Universidad

Autónoma Metropolitana, Unidad Cuajimalpa. Disponible en

18
http://www.cua.uam.mx/pdfs/conoce/libroselec/15Tecnicas_de_Cultivos_Celulares_e_Inge
nieria_de_Tejidos.pdf.

Brücher, B. L. D. M. & Jamall, I. S. (2014). Cell-Cell Communication in the Tumor

Microenvironment, Carcinogenesis, and Anticancer Treatment. Cell. Physiol. Biochem. 34,
213–243.
Fleury, A., Martinez, M. C. & Le Lay, S. (2014). Extracellular vesicles as therapeutic tools
in cardiovascular diseases. Front. Immunol. 5, 370.
Frey, B. & Gaipl, U. S. (2011). The immune functions of phosphatidylserine in membranes
of dying cells and microvesicles. Semin Immunopathol 33, 497–516.
Gomez-Lechon M.j, Donato M. T, Martínez-Romero A, Jiménez N, Castell JV y O
´Connor JE. (2007). “A human hepatocellular in vitro model to investigate steatosis.” Chem
Biol Interact 165(2): 106-16.

György B, Szabó TG, Pásztói M, Pál Z, Misják P, Aradi B, Lászlo V, Pállinger E, Pap E,
Kittel A, Nagy G, Falus A, Buzás E. (2011). Membrane vesicles, current state-of-the-
art:emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68(16):2667-88.

György B, Szabó TG, Pásztói M, Pál Z, Misják P, Aradi B, László V, Pállinger E, Pap E,
Kittel A, Nagy G, Falus A y Buzás E .(2011). Membrane vesicles, current state-of-the-art:
emerging role of extracellular vesicles. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2667–2688.
H. Valadi, K. Ekström, A. Bossios, M. Sjöstrand, J.J. Lee, J.O. Lötvall. (2007). Exosome-
mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic Exchange
between cells. Nat Cell Biol., 9, pp. 654-659

Hoess A, Teuscher N,Thormann A, Aurich A y Heilmann . (2007). “Cultivation of

hepatoma cell line HepG2 on nanoporous aluminium oxide membranes. “Acta Biomater
3(1): 43-50.

Johnsen KB, Gudbergsson JM, Skov MN, Pilgaard L, Moos T, Duroux M. A

comprehnsive overview of exosomes as drug delivery vehicles- Endogenous nanocarriers
for targeted cancer therapy. Biochim Biophys Acta-Rev Cancer 2014;1846:75-87.

19
Johnsen KB, Gudbergsson JM, Skov MN, Pilgaard L, Moos T, Duroux M.A (2014).
Comprehensive overview of exosomes as drug delivery vehicles- Endogenous nanocarriers
for targeted cancer therapy. Biochim Biophys Acta- Rev Cancer 2014;1846:75-87.

Lee Y, E. Andalousii S, Wood MJ. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for
genetic Information transfer and gene therapy. Hum Mol Genet. 15;21(R1):R125-34.

Liu Y, Wang D, Zhang D, Lv Y, Wei Y, Wu W, Zhou F, Tang M, Mao T, Li M y Ji B.

(2011). Inhibitory effect of blueberry polyphenolic compounds on oleica cid-induced
hepatic steatosis in vitro. J Agric Food Chem 59(22): 12254-63.

Mause, S. F. & Weber, C.(2010). Microparticles: protagonists of a novel communication

network for intercellular information exchange. Circ. Res. 107, 1047–57.
Nibourg GA, Huisman MT, van der Hoeven TV, van Gulik TM, Chamuleau RA y
Hoekstra R. (2010). Stable overexpression of pregnane X receptor in HepG2 cells
increases its potential for bioartificial liver application. Liver Transpl 16(9): 1075-85.

Omasa T, Kim K, Hiramatsu S, Katakura Y, Kishimoto M, Enosawa S y Ohtake H. (2005).

Construction and Evaluation of drug-metabolizing cell line for bioartificial liver support
System. Biotechnol Prog 21(1): 161-7.

Peinado H, Aléckovic M, Lavotshkin S, Matei I, Costa-Silva B, Moreno-Bueno G,

Hergueta-Redondo M y Williams C. (2012). Melanoma exosomes educate bone marrow
progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat. Med. 18, 883–891.
Raposo G, Stoorvogel W. (2013). Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles and
Friends. J Cell Biol. 18;200(4):373-83.

Raposo, G. & Stoorvogel, W.(2013). Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and

friends. J. Cell Biol. 200, 373–83.
Robbins, P. D. & Morelli, A. E. (2014). Regulation of immune responses by extracellular
vesicles. Nat Rev Immunol 14, 195–208.
Sahu, S. C. (2007). Hepatotoxicity: From Genomics to in vitro in vivo Models. England.

Simons, M. & Raposo, G. (2009). Exosomes--vesicular carriers for intercellular

communication. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 575–581.

20
Tang X-J, Sun X-Y, Huang K-M, Zhang L, Yang Z-S, Zou D-D. Therapeutic potential of
CAR-T cell-dericed exosomes: a cell-free modality for targeted cancer therapy. Oncotarget
2015; 6:44179-90.
Théry C, Amigorena S, Raposo G, Clayton A.( 2006). Isolation and characterizacion of
exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol,
Chapter 3: Unit 3.22.
Théry C, Boussac M, Véron P, Ricciardi-Castagnoli P, Raposo G, Garin J y Amigorena S
(2001). Proteomic analysis of dendritic cell-derived exosomes: a secreted subcellular
compartment distinct from apoptotic vesicles. J. Immunol. 166, 7309–18.
Thome-Kromer B, Bonk I, Klatt M, Nebrich G, Taufmann M, Bryant S, Wacker U y Köpke
A. (2003). “Toward the identification of liver tocicity markers: a proteome study in human
cell culture and rats. “Proteomics 3(10): 1835-62

Valadi H, Ekström K, Bossios A, Sjöstrand M, Lee JJ y Lötvall JO . (2007). Exosome-

mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange
between cells. Nat Cell Biol 9, 654–659.
Vlassov, A. V, Magdaleno, S., Setterquist, R. & Conrad, R.(2012). Exosomes: current
knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic
potentials. Biochim. Biophys. Acta 1820, 940–8.
Waldenström, A., Gennebäck, N., Hellman, U. & Ronquist, G. (2012). Cardiomyocyte
microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells. PLoS
One 7, e34653.
Wu M, Yang Z, Liu Y, Liu B y Zhao X. (2010). “The 3-D Culture and In vivo Growth of
the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2 IN A Self-Assembling Peptide
Nanofiber Scaffold. “Nanomaterials 2010:1-7.

Yáñez-Mó M, Siljander PR, Andreu Z, Zavec AB, Borras FE, Buzas E, Casal E, Cappello F
y Graner M. (2015). Biological properties of extracellular vesicles and their physiological
functions. J. Extracell. Vesicles 4, 1–60.
Zitvogel L, Regnault A, Lozier A, Wolfers J, Flament C, Tenza D, Ricciardi-Castagnoli P,
Raposo G y Amigorena S .(1998). Eradication of established murine tumors using a novel
cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes. Nat. Med. 4, 594–600.

21
ANEXOS

RECURSOS FINANCIEROS

Actividad Costo
Cultivo celular 41,260
Electroforesis 5,100
Anticuerpos 9,000
Western Blot 12,000
imprevistos 8,000
Total $ 75,360

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CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Actividad SEP OCT NOV DIC ENE FEB MAR ABR MAY
Redacción de protocolo de X
investigación
Cultivo de células Hep-G2 en X X X
botella de 75 ml
Aislamiento de Vesículas X X
extracelulares
Determinación de concentración X
de proteínas por método de
Bradford
Separación de proteínas por X X
electroforesis en gel de
poliacrilamida
Western Blot X
Análisis estadístico de datos X
obtenidos
Discusión de resultados X
Redacción de tesis X
Entrega de borrador de tesis X
Corrección de borrador de tesis X
Entrega final de tesis X

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