Selección de un consorcio microbiano lignocelulolítico a partir de poblaciones de

bacterias ácido lácticas como estrategia para el mejoramiento de un proceso de

ensilaje de forrajes

Dayanne Chaparro, Laura Díaz-García, Diego Javier Jiménez1

Grupo de investigación Microbiomas y Bioenergía (MicroBio)1, Departamento de Ciencias Biológicas,

Universidad de los Andes

Resumen

En este estudio se seleccionó un consorcio microbiano con capacidad lignocelulolítica a

partir de un inóculo de bacterias ácido lácticas epífitas obtenidas de la biomasa de
Megathyrsus maximus (forraje). Para la selección de este consorcio se utilizó la aproximación
dilution-to-stimulation. En la estrategia de enriquecimiento, el medio de cultivo MRS (i.e.
Man, Rogosa and Sharpe) fue modificado a lo largo de las transferencias y se utilizó el forraje
como única fuente de carbono. Dentro del proceso se cuantificó el crecimiento celular
mediante densidad óptica y conteos de unidades formadoras de colonias (UFC) en los medios
de MRS (sin modificar) y R2A, y el porcentaje de degradación del sustrato. Interesantemente,
una disminución tanto en la densidad óptica como en el conteo de UFC a lo largo de las
transferencias fue obtenida, mostrando una mayor diferencia estadística entre la transferencia
1 y 6. Adicionalmente, durante las transferencias 1 y 5 se observó crecimiento en el control
negativo, el cual no contenía sustrato. Esto indicó que los microorganismos seleccionados
estaban usando otras fuentes de carbono diferentes al forraje. Así mismo, se observó un
mayor porcentaje de degradación del forraje en las transferencias de la 6 a la 10 con respecto
a las transferencias de la 1 a la 5. Lo anterior indicó que a partir de la transferencia 6, las
comunidades microbianas aumentaron la capacidad para degradar el material vegetal. Se
concluye que el comportamiento evidenciado en los resultados de crecimiento y actividad
lignocelulolítica se deben a las modificaciones realizadas en el medio MRS durante las
transferencias. Nuestra estrategia permitió la selección de un consorcio microbiano
lignocelulítico a partir de poblaciones de bacterias ácido lácticas. Finalmente, se espera poder
confirmar la presencia de bacterias ácido lácticas con actividad lignocelulolítica mediante el
análisis de secuenciación del gen ribosomal 16S.

1. Introducción

Las arduas condiciones climáticas que sufren los forrajes utilizados como alimento de ganado
vacuno a lo largo del año, principalmente sequias, ha llevado a la búsqueda de alternativas
como el ensilaje que permiten tener completa disponibilidad de este alimento. El ensilaje es
un proceso fermentativo (i.e. anaerobio), en donde los carbohidratos solubles del forraje son
convertidos a ácido láctico por acción bacteriana. Esto permite conservar gran volumen de
alimento en tiempo de escasez y/o incrementar el número de nutrientes, conservando calidad
y palatabilidad (Vanegas & Codero-Ahiman, 2019). Esto se debe a que el ácido láctico
producido confiere una acción de inhibición de microorganismos indeseables evitando el
deterioro del forraje y que este se almacene por un tiempo prolongado (Fabiszewska &
Zielińska & Wróbel, 2019). En la industria ganadera es altamente usado este proceso con el
objetivo de agregar aditivos biológicos a los forrajes que podrían mejoran la calidad
nutricional mientras se conserva el alimento durante las épocas de sequía (Díaz-Monroy et
al., 2014). En Colombia, el ensilaje se realiza utilizando varios tipos de material vegetal que
van desde arbustos y legumbres hasta residuos de cultivos como el café y el maíz, entre otros
(Villa et al., 2010). En este caso, además de querer preservar el alimento para los rumiantes,
se busca mejorar la producción de leche y carne como consecuencia del incremento de la
calidad nutricional debido a la suplementación microbiana. Por lo tanto, un factor
fundamental para el proceso de ensilaje es la selección de un forraje adecuado.

Dicho forraje debe ser accesible, aportar gran cantidad de azucares, con una facilidad de
degradación y digestión (González, 2018). Es decir, el forraje debe contener un alto
contenido de azucares, los cuales se obtienen de romper los componentes de la pared celular
(celulosa, hemicelulosas y lignina). Siendo entonces, que la facilidad de romper estos
componentes se define como la facilidad de degradar el forraje y la capacidad de digerir estos
azucares obtenidos en su totalidad será la digestión de este. Sin embargo, gran parte del
material vegetal no es fácilmente degradable lo que dificulta su digestión y por ende la
liberación de azucares. Esto se debe a que dentro de su composición muchos de los forrajes
tropicales tienen un gran porcentaje de polisacáridos insolubles (Combatt et al., 2015). La
pared celular de las plantas está compuesta principalmente por celulosa, hemicelulosa,
proteínas (digeribles entre el 40 – 90%) y lignina. Debido a su composición, los rumiantes
únicamente son capaces de digerir entre el 20 y 70% de la celulosa (Freer & Dove & Nolan,
2007), lo que ocasiona que, de toda la energía consumida, únicamente entre el 10 y 35% pasa
a ser energía neta.

La celulosa es el polisacárido más abundante de la naturaleza. Se compone de largas cadenas

lineales de D-glucosa entrelazadas por enlaces β-1,4-glucosil. Estas cadenas toman una
posición paralela y forman enlaces extensos de hidrogeno entre las cadenas individuales. A
causa de esto, se cristalizan dichas cadenas formando microfibrillas (Taylor, 2008). Por otro
lado, la hemicelulosa es un heteropolisacárido compuesto por xilano, manano, enlaces mixtos
de β-glucanos y xiloglucano (Ebringerová et al., 2005). Sin embargo, la hemicelulosa no
forma una estructura establecida como la celulosa. Por el contrario, su estructura polimérica
la hace amorfa (Pauly et al., 2013). A su vez, la hemicelulosa está unida por enlaces
covalentes a la lignina. Este último componente es un heteropolímero aromático amorfo, que
confiere apoyo estructural y resistencia contra el ataque microbiano y el estrés oxidativo a la
pared celular de los tejidos vegetales (Pérez et al., 2002). Este heteropolímero se forma
mediante la combinación de alcohol p-coumaryl, alcohol coniferyl y alcohol sinapyl. La
unión de estos monómeros por enlaces éter, protege a la célula vegetal de la hidrolisis
enzimática y conforman una estructura compleja provocando que la lignina sea recalcitrante
(i e. Difícil de depolimerizar) (Datta et al., 2017).

El valor nutricional y energético de los forrajes depende de la digestibilidad de la pared

celular. Por ende, la composición vegetal del forraje es un aspecto importante al momento de
escogerlo. Megathyrsus maximus, más conocido como pasto guineo, es una especie originaria
de África del Este (de la C. Milera et al., 2017) que contiene aproximadamente 33% de
celulosa, 28.3% de hemicelulosa y 4.3% de lignina por cada 100g de material seco
(Hernández et al., 2020). Dicha composición le confiere a este forraje un alto potencial en
producción de biomasa de alta calidad (Pérez et al., 2002). Sin embargo, aun cuando el forraje
posea un alto potencial nutricional, existe un cuello de botella durante la degradación dada
la complejidad y recalcitrancia de algunos componentes como la lignina, el cual afecta el
ataque enzimático durante la sacarificación. Actualmente el uso de alternativas como
consorcios microbianos buscan incrementar la eficiencia del ensilaje, mejorando la
disponibilidad nutricional y por ende aprovechando casi en su totalidad todos los
componentes presentes en el forraje.

Los consorcios microbianos se definen como una asociación de dos o más poblaciones
microbianas, que actúan conjuntamente en un sistema complejo (Ochoa & Montoya, 2010).
En los ensilajes, los consorcios de bacterias ácido lácticas pueden ser muy útiles, dado que
el ácido láctico producido va a generar una disminución de pH rápidamente mejorando el
proceso de fermentación (Díaz-Monroy et al., 2014). En este orden de ideas, el uso de
microorganismos lignocelulolíticos durante el proceso de ensilaje puede conferir una ventaja
al proceso. Esto se debe a que dichos microorganismos son capaces de producir enzimas
lignocelulolíticas, las cuales degradan la celulosa, hemicelulosa y la lignina permitiendo un
mayor acceso a los componentes de este material. Estas enzimas consisten principalmente en
celulasas, hemicelulasas y ligninasas (Sánchez et al., 2014). Estudios previos demuestran que
el uso de consorcios con actividad lignocelulolítica mejora la sacarificación durante la
producción de compuestos biológicos renovables usando material vegetal como fuente de
biomasa (Jiménez, et al., 2017). Estos consorcios tienen gran importancia en la agroindustria,
y se ha evidenciado que la diversidad enzimática en un consorcio esta correlacionada con
tasas de degradación más altas (de Lima Brossi, et al., 2016). El enriquecimiento de
comunidades microbianas puede realizarse usando la aproximación dilution-to-stimulation.
Esta consiste en realizar transferencias (pases) secuenciales de la comunidad inicial que se
cultiva en un medio liquido compuesto por sales y con una sola fuente disponible de carbono,
lo que proporciona una fuerza de selección que favorece los microorganismos capaces de
crecer en estas condiciones (Ho et al., 2012). Por esta razón, el objetivo de este estudio fue
seleccionar un consorcio microbiano lignocelulolítico a partir de poblaciones epifitas de
bacterias acido lácticas obtenidas de la planta Megathyrsus maximus (forraje) mediante el
uso de la estrategia de enriquecimiento dilution-to-stimulation.
 2. Métodos

2.1 Construcción de un consorcio microbiano lignocelulolítico de bacterias ácido lácticas.

Para el diseño del consorcio microbiano lignocelulolítico de bacterias ácido lácticas se utilizó
como inóculo inicial la comunidad microbiana epífita de Megathyrsus maximus cv Agrosavia
Sabanera (forraje). Para hacer uso del pasto como forraje, este fue sometido a un proceso de
limpieza luego de que se cortó y se pasó por un knife mill con la intención de obtener un
tamaño de partícula <1mm. El proceso de limpieza de dichas partículas consistió en un lavado
con etanol para eliminar los azucares solubles que pudieran estar en la superficie del forraje.
El forraje fue inicialmente incorporado a medio liquido MRS e incubado durante dos días
hasta observar turbidez. Posteriormente se inocularon 250 µl del cultivo en 25 ml de medio
MRS modificado (sin glucosa) que contenía forraje al 1% como única fuente de carbono. Los
cultivos microbianos fueron incubados durante 4 días en agitación constante (130 rpm) a una
temperatura de 28°C por triplicado (3 réplicas por transferencia). Se procedió a realizar
trasferencias secuenciales siguiendo la aproximación dilution-to-stimulation descrita por
Jiménez et al. (2017). Los controles negativos fueron dos, uno fue el medio con inóculo
microbiano sin el forraje (A) y el otro el medio con el forraje, pero sin inóculo microbiano
(B). Debido a que se observó crecimiento en el control A se procedió a realizar
modificaciones al medio MRS, es decir, dichos cambios se realizaron con la intención de
evitar que las bacterias presentes en el consorcio no usarán una fuente de carbono distinta al
sustrato (forraje). En la primera transferencia, se usó el medio MRS modificado, mientras
que para las transferencias 2, 3, 4, 5 y 6 se redujo la concentración o eliminación de algunos
componentes (Figura. 1).

Figura 1. Componentes del medio MRS utilizado en la selección del consorcio microbiano y los cambios
realizados a lo largo de las transferencias
2.2 Evaluación del crecimiento celular a lo largo de la selección del consorcio

La determinación del crecimiento celular se realizó por densidad óptica a una longitud de
onda de 600nm (OD600), así mismo el conteo de células viables se realizó por recuento en
placa (UFC/mL) en agar MRS y R2A. Se realizaron tres repeticiones a la medición de
densidad óptica de cada réplica y a ambos controles en cada transferencia. Para poder realizar
el análisis de los datos de cada réplica se usó la siguiente formula (promedio OD600 réplica –
promedio OD600 control B). Así mismo para el análisis de datos del control A se usó la
formula (promedio OD600 control B - OD600 blanco), en donde el blanco es el medio MRS sin
inóculo y sin sustrato. Por otro lado, el recuento en placa en agar MRS se realizó en todas las
transferencias excepto la 7 y 9, mientras que el recuento en placa en agar R2A se realizó en
las transferencias 2, 4, 6, 8 y 10. Las muestras fueron almacenadas en 20% de glicerol a -
20ºC.

Degradación del forraje

Para determinar la degradación del forraje, se filtró el sustrato para separarlo del medio;
posteriormente se ubicó el sustrato filtrado en una bandeja para realizar secado en una
incubadora a 40°C por 1 día y se pesó. La medida a usar fue el porcentaje de pérdida de peso
seco empleando la fórmula propuesta por de Lima Brossi et al. (2016) (%=[(a−b)/c] × 100);
donde a corresponde al peso del sustrato en el control, b al peso del sustrato al finalizar los
tratamientos y c al peso total inicial del sustrato.

2.3 Análisis estadístico.

Para establecer diferencias significativas (valor p <0.05) entre las variables medidas durante
cada transferencia se realizó un análisis de varianza (ANOVA unidireccional) y una prueba
post hoc de tipo Tukey-Kramer empleando el software R (R Core Team, 2008) con un
intervalo de confianza del 95% (α = 0.05). Previamente, fue evaluada la normalidad de los
datos con la prueba Shapiro-Wilk y en caso de no ser normales, se les realizo una
transformación logarítmica.

3. Resultados

3.1 Crecimiento celular

De la transferencia 1 a la 5 se observó crecimiento en el control A. Sin embargo, a medida

que el medio iba sufriendo cambios a nivel composicional, se logró evidenciar una
disminución del crecimiento (Fig. 2a). Entre la transferencia 6 y la 10, el valor de la OD600
del control A fue 0. De la transferencia 1 a la transferencia 5, los valores de OD600 de las
réplicas oscilaron entre 2.727 ± 0.043 y 1.105 ± 0.019 (Fig. 2b). La OD600 de las réplicas de
la transferencia 6 a la transferencia 10 estuvieron entre 0.946 ± 0.046 y 0.813 ± 0.009 (Fig.
2b). Los valores de crecimiento de la transferencia 6 a la 10 presentan una diferencia
significativa con respecto a los valores de las primera 5 transferencias de acuerdo con los
resultados del ANOVA (p <0.05). Así mismo, no se observó crecimiento en el control
negativo B. Esta disminución en el crecimiento entre la transferencia 2 a la transferencia 6
indica un proceso de selección, mientras los valores entre la transferencia 6 y la transferencia
10 muestra la estabilidad del consorcio en términos de crecimiento (Fig. 2b).

Figura 2. Crecimiento medido por densidad óptica (OD600) en el proceso de enriquecimiento del consorcio
microbiano. A) Comportamiento de la densidad óptica del control A. B) Valor de la densidad óptica de las
réplicas biológicas en cada transferencia. C) Cambios realizados en el medio en cada transferencia. Los datos
cuantitativos se muestran como medias ± SE. ***p <0.001, ****p <0.0001 (ANOVA unidireccional).

3.2 Crecimiento celular por recuento en placa.

Se evidenció una disminución en el crecimiento de células viables a lo largo del proceso de

enriquecimiento. Sin embargo, dado que los datos no tenían un comportamiento que se
ajustara dentro de una distribución normal se realizó la transformación logarítmica de estos
para poder realizar el análisis estadístico. El recuento de bacterias ácidos lácticas de la
transferencia 1 a la transferencia 5 en el agar MRS disminuyó de 1011 hasta 108 UFC/mL
(Fig. 3a). Adicionalmente, los recuentos de bacterias ácidos lácticas de la transferencia 8 y
10 fueron de 2.000×105 ± 2.309×104 y 2.133×105 ± 1.667×104, respectivamente (Fig. 3a).
Los valores de la transferencia 8 y 10 fueron significativamente más bajos en comparación
con las primeras 5 transferencias de acuerdo con los resultados del ANOVA (p <0.05).
Además, se observó una disminución entre los valores de las transferencias 3, 4 y 5 con
respecto a los valores de las transferencias 1 y 2, mientras que los valores entre las
transferencias 8 y 10 fueron similares (Fig. 3a). En cuanto a los recuentos en placa en el agar
R2A de la transferencia 2 y 4 fueron de 3.380×1012 ± 2.510×1012 y 2.133×1011 ±
1.667×1010, respectivamente (Fig. 3b). Los valores de la transferencia 6, 8 y 10 fueron
significativamente más bajos en comparación con las transferencias 2 y 4 de acuerdo con los
resultados del ANOVA (p <0.05) (Fig. 3b). Los valores de las transferencias 2 y 4 no
muestran diferencias significativas entre ellos, al igual que los valores de las transferencias
6, 8 y 10 (Fig. 3b). Al igual que en el recuento bacteriano en el agar MRS, se ve una
disminución en el crecimiento de las bacterias totales, siendo entonces que hay menor
número de células de estas bacteria en las transferencias 6 a la 10, con respecto a las primeras
transferencias.

Figura 3. Crecimiento medido por recuento en placa (Log10[UFC/mL]) en el proceso de enriquecimiento del
consorcio microbiano. A) Recuento de bacterias ácido lácticas de las transferencias 1-5, 8 y 10 en agar MRS.
B) Recuento de bacterias totales de las transferencias 2, 4, 6, 8 y 10 en agar R2A. Los datos cuantitativos se
muestran como medias ± SE. *p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001, ****p <0.0001 (ANOVA unidireccional).

3.3 Degradación del forraje

Se evidenció un incremento en el porcentaje de degradación desde la transferencia 6 hasta la

10 de acuerdo con los resultados. Siendo los valores correspondientes 14.133 ± 0.811%,
13.200 ± 1.058%, 14.133 ± 0.701%, 14.000 ± 1.058% y 13.867 ± 0.706%, respectivamente
(Fig. 4). En cuanto a las primeras 5 transferencias, sus valores respectivos son 4.800 ±
0.462%, 4.267 ± 0.581%, 5.200 ± 0.231%, 4.667 ± 0.133% y 7.333 ± 0.353% (Fig. 4). Siendo
entonces, que existen diferencias significativas (p <0.05) entre los valores de las 5 primeras
transferencias (T1 – T5) con respecto a los valores de las transferencias siguientes (T6 –
T10), pero entre los valores de la transferencia 1 a la transferencia 5 no existen diferencias
significativas (p >0.05) al igual que entre los valores de la transferencia 6 a la 10 según la
prueba ANOVA.

Figura 4. Porcentaje de degradación por transferencia. Los datos cuantitativos se muestran como medias ± SE.
****p <0.0001 (ANOVA unidireccional).

Se evidenció en términos generales, que la implementación de la aproximación del método

dilution-to-stimulation si generó una selección de bacterias capaces tanto de crecer usando
como única fuente de carbono el forraje como de degradar al mismo (Fig. 2 y Fig. 4). Esto
se relaciona igualmente con la disminución del crecimiento de bacterias totales (Fig. 3b) a
causa de la restricción en la fuente de carbono. Sin embargo, debido a los cambios realizados
en el medio (Fig. 1) se observó una disminución en el crecimiento de BALs (Fig. 3a)
probablemente por la falta de componentes necesarios para su crecimiento y selección.

4. Discusión

En este estudio se enriqueció un consorcio bacteriano usando la aproximación dilution-to-

stimulation para hacer una selección de un consorcio lignocelulítico a partir de poblaciones
de bacterias ácido lácticas con el fin de que pueda ser usado en un proceso de ensilaje del
forraje Megathyrsus maximus. Los resultados obtenidos mostraron que el crecimiento celular
de bacterias totales y ácido lácticas, y la actividad lignocelulolítica fueron cambiando a
medida que se realizaban las transferencias. La disminución en los valores de densidad óptica
(OD600) indican una disminución en la densidad celular del consorcio a medida que se
realizaba las transferencias. Además, en los recuentos de placas en el medio R2A también se
observó que los valores eran menores en las transferencias 6, 8 y 10. Por ende, esto demuestra
una clara disminución en el número de bacterias totales presentes desde el inicio del
procedimiento hasta el final de este.

Lo anterior puede explicarse debido al proceso de selección que se da durante el diseño del
consorcio; ya que en los consorcios microbianos se genera una selección en las diversas
poblaciones bacterianas hacia aquellas cepas más adecuadas (Lee et al., 2013).
Específicamente, el inóculo inicial es un factor relevante en este proceso de selección, debido
a que determina la composición de los consorcios degradadores microbianos finales (Cortes-
Tolalpa et al., 2016); así como también lo es la fuente de carbono (forraje), quien posee una
gran relevancia en el perfil de la comunidad ya que establece una condición ambiental
especifica que direcciona la selección (Wongwilaiwalin et al., 2013). Esto va a generar
entonces, que durante las primeras transferencias aquellas bacterias de crecimiento rápido
proliferen más, pero con la presión de selección generada con cada transferencia aumentarán
las bacterias de crecimiento lento que son más eficientes, desplazando a las de crecimiento
rápido. Esto puede explicarse en términos ecológicos por la teoría de “r/k selection”. Tales
que, en las primeras transferencias habrá presencia de poblaciones que usan la estrategia r y
en las últimas transferencias habrá mayor presencia de bacterias que usan la estrategia k. Las
poblaciones r no son buenas competidoras y solo consumen nutrientes disponibles en alta
cantidad, en este caso azucares simples, permitiendo que se reproduzcan con mayor rapidez
(Vadstein et al., 2018) por lo que al disminuir dichos nutrientes disminuyen dichas
poblaciones. Por otro lado, la poblaciones k son buenas competidoras lo que les confiere una
ventaja en nichos con alta densidad celular ya que pueden crecer allí (lentamente) y presentan
una alta afinidad por el sustrato presente (Vadstein et al., 2018), en este caso son
microorganismos lignocelulolíticos, por ende al disminuir la disponibilidad de azucares
simples prevalecerá la presencia de estas poblaciones.
Siendo entonces, que la disminución en la rapidez de crecimiento de bacterias totales es un
efecto del establecimiento del consorcio funcional, el cual consistirá en aquellas bacterias
esenciales quienes mantienen la función deseada (Cortes-Tolalpa et al. 2016; de Lima Brossi
et al. 2016; Jiménez et al. 2016), en este caso la degradación del material vegetal. Dado lo
anterior, no siempre en el diseño de un consorcio la densidad celular aumentará a la misma
velocidad en todas las transferencias. En concreto, la biomasa microbiana se correlaciona
positivamente con los valores del porcentaje de degradación hasta llegar al nivel óptimo. Es
decir, la degradación máxima se dará cuando se establezcan el máximo de poblaciones
posibles con actividad lignocelulolítica seleccionadas durante el proceso. De tal modo que,
durante las primeras transferencias se cuantifica una mayor densidad debido a que prevalecen
las poblaciones bacterianas de crecimiento rápido (estrategia r) pero igual hay presencia de
poblaciones bacterianas de crecimiento lento (estrategia k). Por otro lado, debido a la
selección generada a medida que se realizan las transferencias (disminución de azucares
simples, quedando aquellos difíciles de degradar) quedan solo poblaciones de crecimiento
lento las cuales por el proceso de enriquecimiento va aumentando su densidad celular pero
este aumento será en un tiempo más largo (Jiménez et al., 2017). Por ende, en términos de
densidad celular, el número de células bacterianas total al cuarto día será menor en las últimas
transferencias en comparación con el número de células bacteriana total de las primeras
transferencias en este mismo periodo de tiempo.

En cuanto a la densidad celular de las bacterias ácido lácticas se observó que esta fue
disminuyendo con las transferencias. En las primeras 5 transferencias se vio un crecimiento
celular que osciló de 1x1011 a 1x108 en los recuentos de placa en el medio MRS. Después de
la transferencia 5 el recuento de bacterias ácido lácticas se reduce significativamente a 1x105.
Esto indica que, al igual que las bacterias totales, las ácido lácticas disminuyeron en densidad
poblacional en el consorcio, sin embargo, siguen presentes en este. Estos resultados se deben
a las condiciones del proceso de enriquecimiento, ya que este va a favorecer las BALs que
presenten actividad lignocelulolítica e incluso aquellas bacterias no ácido lácticas con dicha
actividad. Las BALs proliferan mejor en condiciones de anaerobiosis y con una gran
disposición de azucares en el medio (Xu et al., 2017). De igual modo, para que se dé una alta
densidad celular es necesario una alta presencia de fuentes de nitrógeno y de carbono; ya que
estas fuentes son las responsables de aportar los azucares necesarios para la producción de
ácido láctico, por lo que es necesaria más de una fuente de carbono o adicionar elementos
que aporten azucares (Sun et al., 2019). Esto explicaría el por qué se presentó crecimiento en
el control que no poseía sustrato, dado que, el medio MRS además de la glucosa posee otros
componentes que pueden otorgar carbono a los microorganismos. Siendo entonces, que al
retirarle estos componentes al medio MRS modificado, los nutrientes necesarios para
incentivar el crecimiento de BALs disminuyeron bastante. Lo anterior explica el bajo conteo
de UFC de BALs en el medio MRS a medida que se hacían las transferencias. No obstante,
es probable que la presencia de BALs sea mayor que lo que se calculó con el título bacteriano,
debido a aquellas bacterias no cultivables.
Teniendo en cuenta el sustrato usado, es probable que en el inóculo inicial e incluso en las
primeras transferencias se encuentren lactobacilalles como Lactobacillus, Lactococcus,
Lactobacillus y Weissella; también Leuconostocaceae y Lactobacillaceae (Duniere et al.,
2017). En este tipo de forrajes, los géneros más comunes de BALs epifitas son Lactococcus
y Lactobacillus (Xu et al., 2017). Estas especies fueron encontradas como BALs epifitas de
forrajes de cebada, trigo, triticale y maíz las cuales son de la familia Poaceae, al igual que el
forraje Megathyrsus maximus. Cabe aclarar que el porcentaje de bacterias ácido lácticas
epifitas en forrajes de este tipo es muy reducido (Duniere et al., 2017). Por otra parte, no
siempre las BALs epífitas del forraje son las que tendrán una mayor presencia durante el
ensilaje, dado que para este proceso las bacterias ácido lácticas heterofermentativas son más
eficientes (Xu et al., 2017). Esto lleva a pensar, que probablemente la diversidad en el inóculo
inicial es baja dado que dicho inóculo consistía en BALs epífitas del forraje usado. En este
orden de ideas, esto afectará la composición del consorcio final como ya se explicó
anteriormente. Realmente, el número de estudios realizados para evaluar consorcios que
puedan mejorar los ensilajes es muy escaso. Lo más predominante es la evaluación del efecto
de cepas específicas.

Por otro lado, se confirma que el consorcio final muestra presencia de actividad
lignocelulolítica, basándose en los valores de degradación de este. En este caso, a medida
que se va estableciendo el consorcio a través de las transferencias se va observando un
aumento en el porcentaje de degradación, por lo tanto, el incremento de actividad
lignocelulolítica. Además, esto indica que el consorcio final es capaz de usar el sustrato
(forraje) como su principal fuente de carbono. Para asegurarse de que realmente se este dando
una actividad lignocelulolítica, se deben realizar ensayos de actividad enzimática. Dichas
ensayos buscan cuantificar la actividad enzimática en términos de unidad enzimática (U).
Estos mismos ensayos son hechos por Maruthamutu et al. (2016) en el que analizaron la
actividad beta-galactosidasa, beta-xilanasa y alfa-glucosidasa en dos consorcios
degradadores de paja de trigo. También puede hacerse uso de herramientas comerciales como
el Glycospot, el cuál es una placa de 96 pozos que contiene sustratos diversos para medir
actividad enzimática mediante un lector de absorbancia (espectrofotómetro) para cuantificar.
En el proceso se vio un gran aumento en la actividad lignocelulolítica en la transferencia 6
con respecto a las transferencias anteriores. Esto se relaciona con los cambios hechos al
medio (Fig. 1), dado que hasta que no se logró establecer que las bacterias presentes en el
consorcio usarán el forraje como la única fuente de carbono no se evidencio una gran
actividad de degradación del forraje por parte de estas. El proceso de enriquecimiento basado
en una única fuente de carbono (sustrato) nutrirá a aquellos que sean capaces de usarla. Por
lo que en un principio se irá disminuyendo la presencia de los microorganismos que no
pueden usar satisfactoriamente el sustrato hasta que finalmente quedan los que poseen la
capacidad superior de crecer en la biomasa vegetal como la única fuente de energía y carbono
(Jiménez et al., 2017).
En este orden de ideas, dada la metodología a seguir y el forraje usado, es probable que las
bacterias con actividad lignocelulolítica a encontrar a partir de la transferencia 6 sean del
género Serratia, Pandoraea, Bacillus y Cryptococcus; así como la enterobacteria E. coli; las
cuales secretan enzimas delignificadoras que han sido reportadas en los sustratos de bagazo
de caña de azúcar, maíz y pasto (Longe & Garnier & Saito, 2016). También, las bacterias
más comunes que se han encontrado en el rumen son Fibrobacter succinogenes,
Ruminococcus albus y R. flavefaciens y en general las bacterias capaces de degradar
lignocelulosa se encuentran en los grupos taxonómicos actinomicetos, α-proteobacterias y γ-
proteobacterias (Kuhad et al., 2013). Más específico, Pseudomonas, Brevundimonas,
Caulobacter, Stenotrophomonas, Xanthomonas, Pseudoxanthomonas, Achromobacter y
Paenibacillus son capaces de degradar la celulosa y hemicelulosa; y Caulobacter lo realiza
mediante exoenzimas tales como las celulasas, xilosidasas y desacetilasas de polisacáridos
(Jimenéz et al., 2016).

En los resultados obtenidos se ve un factor común, el cual se basa en que entre las 5 primeras
transferencias se dan cambios significativos en los valores obtenidos entre cada transferencia
y con respecto a los valores de las transferencias 6 en adelante. Esto se explica por la dinámica
que presenta el consorcio mientras se dan las sucesiones. Es decir, estas diferencias en los
valores de los resultados son debido a que el consorcio aún no se ha estabilizado. Siendo
entonces, que, durante las primeras 5 transferencias se estaban estableciendo las
comunidades necesarias para conformar el consorcio funcional y partir de la 6 ya se conformó
este, por lo que a partir de esta se va a tener un consorcio estable. Esto es consecuencia del
medio usado así como de los cambios hecho en este. En un consorcio microbiano, la variación
espaciotemporal en los nutrientes va a repercutir en las interacciones y en la dinámica de este,
dado que el flujo de los nutrientes da paso a las sucesiones del consorcio que a su vez
repercute en qué comunidades se van a establecer (Lee et al., 2013). En consecuencia, todos
los cambios hechos en la composición del medio liquido usado para el enriquecimiento
representan un factor de selección y determinación de las comunidades y del potencial final
del consorcio obtenido.

Con todo esto, el uso de la aproximación dilution-to-stimulation permite que se de esa presión
de selección mientras se diseña y establece el consorcio final funcional. Lo anterior debido a
que, con este enfoque se dan procesos estocásticos para el ensamblaje del consorcio final,
pero también, está presente una fuerte fuerza selectiva (Jiménez et al., 2014). De igual
manera, las diluciones seriadas facilitan el aislamiento del consorcio funcional mediante la
selección y propagación de cepas bacterianas con atributos específicos para funciones
determinadas (Lee et al., 2013), obtener una densidad celular óptima de bacterias productoras
de enzima lignocelulolíticas y mejorar la sacarificación (de Lima Brossi et al., 2016).

En un estudio realizado por De Lima Brossi et al. (2016), se diseñaron tres consorcios
degradadores de lignocelulosa con tres sustratos distintos mediante la aproximación de
dilution-to-stimulation en un total de 10 transferencias. Los inóculos iniciales fueron
obtenidos del suelo de un bosque en Países Bajos. Los sustratos fueron paja de trigo, pasto
varilla y rastrojo de maíz. . En cuanto al porcentaje de degradación, los autores obtuvieron
una mayor degradación (pérdida de peso) después de la sexta transferencia. Los valores de
degradación obtenidos por De Lima Brossi y colaboradores son más altos y fueron
aumentando después de la transferencia 6 con respecto a los valores obtenidos en nuestro
estudio. Este estudio, tuvo en cuenta aspectos como el pH del sustrato y tomaron mediciones
al inicio de cada transferencia y al final para medir el crecimiento presentado durante la
incubación y así poder reportar mejor si la aproximación sí estimula el crecimiento
bacteriano. Es probable que, las diferencias presentadas entre los resultados de este estudio
y el estudio propio se deba a las diferencias en la metodología a seguir.

Jiménez, Korenblum & van Elsas (2016) diseñaron dos consorcios con actividad
lignocelulolítica. Al igual que en el estudio anterior, siguieron la aproximación de dilution-
to-stimulation con el fin de que un consorcio usara como única fuente de carbono paja de
trigo cruda y el otro paja de trigo tratada. En este estudio se observó que el crecimiento celular
bacteriano incrementaba con cada transferencia. A diferencia del anterior, aquí se midió
directamente la actividad hemicelulolítica de los consorcios mediante la degradación de
carboximetilcelulosa y xilanasa. Los resultados de esto indicaron que ambos consorcios están
involucrados en la bioconversión de lignocelulosa. Nuevamente, la variación en los
resultados del crecimiento celular entre el estudio nombrado y el presente puede deberse a
las variaciones en la metodología realizada, principalmente a causa del cambio de
componentes del medio de enriquecimiento.

Por otro lado, el estudio expuesto en este documento presenta una novedad en cuanto al
objetivo de obtener un consorcio de bacterias ácido lácticas con actividad lignocelulolítica.
Siendo entonces, que no se conoce un estudio en el que se haya deseado seleccionar bacterias
ácido lácticas capaces de crecer con el sustrato de interés como única fuente de carbono
usando la estrategia de dilution-to-stimulation. De acuerdo con los estudios anteriores, la
aproximación de dilution-to-stimulation es adecuada para diseñar un consorcio sintético
capaz de degradar lignocelulosa. Sin embargo, el medio para el enriquecimiento usado era
de sal minerales. Esto permite asegurar el uso del sustrato como única fuente de carbono y
no otro componente. Por el contrario, en el proceso de enriquecimiento se implementó un
medio diferente con diversas modificaciones como ya fue explicado. Sin embargo, el
resultado del medio usado en la transferencia 6 concluye en un medio mineral, una vez se le
realizó todos los cambios.

Cabe aclarar, que debido a la falta de análisis taxonómico es difícil poder hacer una
comparación y discusión real sobre los resultados y la presencia verídica de bacterias que
puedan presentar actividad lignocelulolítica y producir ácido láctico. Esto limita el análisis
de resultados y genera varios puntos de sesgo. De igual manera, esto permite que a partir del
este estudio surjan nuevas investigaciones para conocer la composición taxonómica del
consorcio y los cambios sufridos en este aspecto a lo largo de las transferencias. En adición,
se abre un nuevo enfoque de estudio sobre los consorcios bacterianos con actividad
lignocelulolítica y con presencia de BALS para ser usado en los procesos de ensilaje.
Además, una perspectiva para el mejoramiento del estudio es implementar en el proceso de
enriquecimiento la condición de anaerobiosis, usar directamente el medio obtenido a partir
de la transferencia 6 en este estudio para que no se deba realizar cambios constantes y alargar
el tiempo de incubación durante las transferencias (> 4 días). De este modo, probablemente
pueda obtenerse una mayor presencia de BALs sin que se alteré la selección de bacterias
lignocelulolíticas.

Por último, se concluye que el consorcio final presenta degradación de sustrato específica y
crecimiento a partir de este, lo que indica que está siendo usado por parte de los
microorganismos como fuente de carbono; también que hay presencia de posibles bacterias
ácido lácticas. Además, que el sustrato y el proceso de enriquecimiento condicionan el flujo
de nutrientes los cuales influyen e interfieren en el ensamblaje de las comunidades del
consorcio final funcional y por ende en el potencial metabólico del mismo. Así mismo, la
aproximación dilution-to-stimulation fue efectiva para el diseño del consorcio. Finalmente,
se espera poder entender las interacciones ecológicas presentes en el consorcio obtenido
mediante el conocimiento de la composición estructural del mismo.

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