Tema de investigación

Producción de una proteína recombínate mediante la clonación del ADNc del gen de la
insulina humana en plantas de coliflor.
Hoy en día la diabetes es un problema muy grave en el mundo entero, muchas personas
mueren a causa de esta enfermedad por lo que buscar una fuente de insulina viable es
prescindible para que las personas puedan combatir esta grave enfermedad.
Justificación
Durante muchos años se extraía del páncreas de diversos animales, sobre todo del cerdo
que es casi idéntica a la insulina humana, gracias al desarrollo de la ingeniería genética
se consiguió la síntesis de insulina mediante técnicas biotecnológicas por lo que gracias
a esto las plantas pueden ser modificadas para producir proteínas terapéuticas
disminuyendo riesgos de contaminación, tiempos y costos de producción.
Las ventajas que ofrece el ocupar plantas transgénicas en la producción biotecnológica
es que esta será segura y rápida, hay menos riesgos de contaminación con patógenos de
origen animal y es posible la producción de proteínas complejas.
La expresión en tejidos de almacenamiento como semillas o tubérculos en los que la
insulina recombinante puede permanecer estable por largos periodos a temperatura
ambiente, removerá la necesidad de establecer y mantener la cadena de frío para el
mantenimiento de la actividad de la insulina.
Metodología

 Aislar a partir de la clona 3950204 (Open Biosystems, USA) de E. coli que lleva
el cDNA del gen de la insulina humana (Ins) insertado en el plásmido pDNR-
Lib.
 La extracción del plásmido se llevará a cabo mediante el kit PureLinkTM.
 Una vez obtenido el plásmido se determinar su concentración y pureza haciendo
una dilución 10:1000 plásmido-agua α y midiendo absorbancia en un
espectrofotómetro a 260 nm y 280 nm respectivamente.
 El cDNA se va a liberar del plásmido pDNR-Lib con las enzimas de restricción
EcoR I, y Xho I.
PCR

 Para la amplificación por PCR usar un termociclador y el kit PlatinumR Super

Mix High Fidelity bajo condiciones de 94 ºC 30 s de desnaturalización, 60 ºC 1
minuto de alineamiento y 70 ºC 1 minuto de extensión, en 40 ciclos.
 Los oligos directo y reverso contienen en sus secuencias bases correspondientes
con la enzima Eco31 combinada con las enzimas Nco I, Bgl II para los oligos
directo y reverso respectivamente y finalmente en la secuencia se incluyen bases
que corresponden a las regiones del cDNA para preproinsulina y proinsulina por
separado
Inserción del cDNA en pCAMBIA

 Recuperar el vector binario pCAMBIA 1105.1 de una cepa de E. coli mediante

el kit comercial de miniprep PureLinkTM.
 Una vez obtenido el plásmido, caracterizar con varias enzimas de restricción que
liberan fragmentos conocidos observando los resultados por electroforesis en gel
de agarosa.
 Las enzimas de restricción Nco I, Bgl II y Eco31 I serán usadas para generar
extremos cohesivos en el vector binario pCAMBIA1105.1 en una relación de
1:1 U de enzima-µDNA para las enzimas Nco I, Bgl II (Ilustración 3); y el
cDNA amplificado anteriormente en una relación 1.5:1 U de enzima-µDNA para
la enzima Eco31.
 Una vez obtenido el DNA comprobar que la reacción de restricción se efectuaba
haciendo una ligación entre los mismos fragmentos; vector-vector amplificado-
amplificado y la formación de los constructos, vector-preproinsulina y vector-
proinsulina (Ilustración 3).
 Utilizar una T4 DNA ligasa y varias relaciones de vector-vector, amplificado-
amplificado y vector-amplificado observando los resultados por electroforesis en
gel de agarosa.
 Para la amplificación de los constructos obtenidos usar la cepa de E.coli DH5α
previamente transformada utilizando las mezclas de ligación (vector-
preproinsulina y vector-proinsulina) y células electrocompetentes en una celda
de electroporación bajo condiciones establecidas.
 Incubar por 3-4 hrs las células electroporadas y se propagar en medio de cultivo
LB (Luria-Bertani) con estreptomicina (100 µg/ml)
 Seleccionar aleatoriamente clonas resultantes bajo esta selección, para obtener el
constructo por extracción plasmídica mediante el kit PureLink.
 Este plásmido se usará como templado para comprobar la integración del
amplificado de interés (preproinsulina y proinsulina) al vector pCAMBIA
1105.1 por PCR.
 Seleccionar una clona PCR positiva de cada constructo (pCppINS-bgr y
pCpINS-bgr) para extraer los constructos y transferirlos por electroporación a
Agrobacterium.
Transformación de Agrobacterium

 Usar la cepa de Agrobacterium rhizogenes LBA9402 la cual contiene el

plásmido pRi-1855 del tipo agropina, que induce la formación de raíces
transformadas mediante la transferencia del T-DNA de dicho plásmido.
 Dicha cepa transformada por electroporación, bajo las condiciones establecidas,
deberá resultar en cepas que contengan los constructos anteriores.
 La presencia de los plásmidos en las clonas correspondientes se llevará acabo de
la misma forma que con las clonas de E. coli.
  Estas cepas de Agrobacterium rhizogenes se usarán para la transferencia del T-
DNA contenido en cada constructor a plántulas de Brócoli e inducir líneas de
raíces transformadas con el cDNA correspondiente
Transferencia del cDNA a Coliflor

 Serán plántulas de Coliflor obtenidas mediante la germinación de semillas en

medio B5 adicionado con vitaminas y 1.8 g/l de bioreactivo para plantas.
 Las plántulas de 3-4 semanas de germinación y sin hojas verdaderas se usarán
para la transferencia por punción, la cual desencadena las señales químicas entre
planta Agrobacterium promoviendo la transfección del T-DNA del plásmido
bacteriano al genoma de la planta.
Prueba de la presencia del cDNA en el tejido vegetal

 Utilizar la amplificación por PCR de los fragmentos de preproinsulina y

proinsulina con los oligos correspondientes a partir del DNA genómico del
tejido vegetal.
 Este se extraerá del tejido.
 Utilizar como templado para la PCR utilizando un termociclador con el kit
Platinum con las condiciones mencionadas arriba.
Una vez completado el desarrollo de la planta, obtenemos plantas de coliflor que
contienen proteína insulínica

Bibliografía
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