Investigación del agua 195 (2021) 117002

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Investigación del agua

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Viabilidad del SARS-CoV-2 en agua de río y aguas residuales a diferentes

temperaturas y contenido de sólidos

Leonardo Camilo de Oliveira a , Andrés Felipe Torres-Franco B , Bruna Coelho Lopes B ,

Beatriz Senra Álvares da Silva Santos C , Erica Azevedo Costa C , Michelle S. Costa D ,
Marcus Tulius P. Reis mi , Marília C. Melo F , Rodrigo Bicalho Polizzi gramo ,
Mauro Martins Teixeira a , ∗ , César Rossas Mota B , ∗
a Departamento de Bioquímica e Inmunología, Universidad Federal de Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil
B Departamento de Ingeniería Sanitaria y Ambiental, Universidad Federal de Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil
C Escuela de Veterinaria, Universidad Federal de Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil.

D Autoridad de Salud del Estado de Minas Gerais (SES)

mi Empresa de Saneamiento de Minas Gerais (COPASA)
F Instituto
de Gestión del Agua de Minas Gerais (IGAM)
gramo Agencia Reguladora de Servicios de Agua Potable y Alcantarillado del Estado de Minas Gerais (ARSAE)

información del artículo abstracto

Historia del artículo: Los pacientes con COVID-19 pueden excretar el virus SARS-CoV-2 viable a través de la orina y las heces, lo que ha
Recibido el 21 de diciembre de 2020
suscitado preocupaciones sobre la posibilidad de transmisión de COVID-19 a través de agua contaminada en aerosol
Revisado el 1 de marzo de 2021
o por la vía fecal-oral. Estas preocupaciones se agravan especialmente en muchos países de ingresos bajos y
Aceptado el 2 de marzo de 2021
medianos, donde las aguas residuales sin tratar se vierten con frecuencia a las aguas superficiales. Se ha detectado
On-line el 3 de marzo de 2021
ARN del SARS-CoV-2 en muestras de agua de río (RW) y aguas residuales sin tratar (WW). Sin embargo, se sabe poco
Palabras clave: sobre la viabilidad del SARS-CoV-2 en estas matrices ambientales. La determinación de la persistencia del SARS-CoV-2
SARS-CoV-2 en el agua en diferentes condiciones ambientales es de gran importancia para los supuestos básicos en la evaluación
viabilidad cuantitativa del riesgo microbiano (QMRA). En este estudio, la persistencia de SARS-CoV-2 se evaluó mediante
persistencia ensayos de placa después de la adición de muestras de RW y WW con SARS-CoV-2 infeccioso que se aisló
agua
previamente de un paciente con COVID19. Estos ensayos se llevaron a cabo en muestras autoclavadas de RW y WW,
aguas residuales
filtradas (0,22 μm) y sin filtrar, a 4ºC. ° C y 24 ° C. Los modelos de regresión lineal y no lineal se ajustaron a los datos. El
la temperatura
modelo de regresión de Weibull logró el error cuadrático medio (RMSE) más bajo y, por lo tanto, se eligió para
estimar T 90 y T 99 ( tiempo requerido para reducciones de 1 log y 2 log, respectivamente). El SARS-CoV-2 permaneció viable
durante más tiempo filtradas en comparación con las muestras sin filtrar. RW y WW mostraron T 90 valores de 1,9 y
1,2 días y T 99 valores de 6,4 y 4,0 días, respectivamente. Cuando las muestras se filtraron a través de 0,22 μm
membranas de tamaño de poro, T 90 los valores aumentaron a 3.3 y 1.5 días, y T 99 aumentó a 8.5 y 4.5 días, para las
muestras RW y WW, respectivamente. Se observaron aumentos notables en la persistencia del SARS-CoV-2
en ensayos a 4 ° C, que mostró T 90 valores de 7,7 y 5,5 días, y T 99 valores de 18,7 y 17,5 días para RW y WW,
respectivamente. Estos resultados destacan la variabilidad de la persistencia del SARS-CoV-2 en el agua y
matrices de aguas residuales y pueden ser muy relevantes para los esfuerzos encaminados a cuantificar los riesgos relacionados con el
agua, lo que podría ser valioso para comprender y controlar la pandemia.

© 2021 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.

1. Introducción (SARS-CoV-2), ha sido identificado como el agente etiológico de COVID-

La pandemia de COVID-19 en curso ya ha provocado más de 2.6 millones de
muertes reportadas en todo el mundo para febrero de 2021. Un nuevo
coronavirus, síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2
∗ Autores correspondientes.
Correos electrónicos: mmtex.ufmg@gmail.com (MM Teixeira), cesar@desa.ufmg.br
(CR Mota).
19. Los coronavirus son virus de ARN envueltos ampliamente distribuidos entre
humanos, otros mamíferos y aves, que causan infecciones agudas y persistentes ( Knipe
y Howley, 2013 ). Se ha planteado la hipótesis de que el origen de la enfermedad
podría estar asociado con fenómenos de transmisión de desbordamiento de un
reservorio de animales salvajes, como los pangolines ( Lam y col. 2020 ),
murciélagos ( Zhou y col. 2020 ), a humanos. Aunque COVID-19 es una enfermedad
respiratoria, se han detectado grandes cantidades de ARN del SARS-CoV-2 en las
heces ( Wu y col. 2020 )

https://doi.org/10.1016/j.watres.2021.117002
0043-1354 / © 2021 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.
LC de Oliveira, AF Torres-Franco, BC Lopes et al. Investigación del agua 195 (2021) 117002

de pacientes, y posteriormente en aguas residuales sin tratar ( Ahmed y col. 2020 ; tabla 1
Parámetros fisicoquímicos para agua de río (RW) y aguas residuales brutas (WW),
Chernicharo y col. 2020 ; Fongaro y col. 2020 ; La Rosa
filtradas (RWF y WWF) y sin filtrar.
et al. 2021 ; Medema y col. 2020 ; Mota y col. 2021 ), lodos de depuradora ( Peccia y
col. 2020 ) y aguas superficiales ( GuerreroLatorre et al. 2020 ). Se ha aislado Parámetros WW RW WWF RWF

SARS-CoV-2 viable de la orina ( Sun y col. 2020 ) y heces ( Wang y col. 2020 , TS (mg / L) 455 ± dieciséis 34 ± 2 N/A N/A

VS (mg / L) 255 ± 11 10 ± 5 N/A N/A

Zhang y col. 2020 , Xiao y col. 2020 ) de los pacientes, lo que plantea TSS (mg / L) 267 ± 17 8±0 N/A N/A

VSS (mg / L) 227 ± 24 2±1 N/A N/A

preocupaciones sobre la posibilidad de las vías de transmisión fecal-oral o
VS / TS 0,56 0,29 N/A N/A
fecal-nasal del COVID-19. Kang y col. (2020) han informado recientemente de Turbidez (NTU) 274 ± 2 10 ± 1 6±0 1±0
pruebas circunstanciales de la transmisión del SARS-CoV-2 a través de aguas DQO (mg / L) 334 ± 19 <5 53 ± 3 <5
residuales en aerosol en un edificio residencial en Guangzhou, China. La presencia Amoniaco (mg / L) 30.21 0,58 25,79 0,23
Ortofosfato (mg / L) 3.1 < 0,001 2.3 < 0,001
de SARS-CoV-2 viable en el agua y las aguas residuales puede tener consecuencias
pH 7,50 5.50 7,50 5.50
de gran alcance para la salud pública y las estrategias de control de la pandemia ( Heller
y col. 2020 ), especialmente en países en desarrollo con acceso inadecuado al NA: no aplica.

saneamiento y agua potable. Actualmente, no hay evidencia de que COVID-19

pueda transmitirse a través del agua contaminada ( La Rosa et al., 2020 ). No
y turbidez. Los datos de persistencia de virus generados con muestras de aguas
obstante, la Organización Mundial de la Salud ha destacado la necesidad de
residuales sin filtrar podrían usarse para simular redes de alcantarillado y ríos que se ven
realizar investigaciones sobre la persistencia del SARS-CoV-2 en matrices
fuertemente afectados por descargas de aguas residuales sin filtrar. Se podrían utilizar
ambientales, como aguas superficiales y aguas residuales ( OMS, 2020 ).
muestras de agua de río filtradas para simular matrices de agua de río con turbidez
Determinar la persistencia del SARS-CoV-2 en el agua del río en diferentes
extremadamente baja.
condiciones ambientales es de gran importancia para los supuestos básicos en la
evaluación cuantitativa de riesgos microbianos (QMRA). Las condiciones 2. Material y métodos
ambientales pueden tener un fuerte efecto sobre la viabilidad viral, incluidas las
variaciones estacionales o de temperatura, la turbidez, el grado de contaminación 2.1. Muestreo
del agua del río con aguas residuales, etc. Además, el tipo de virus puede afectar
la supervivencia del virus en el medio ambiente ( John y Rose 2005 ). La estructura Las matrices ambientales utilizadas en este estudio fueron agua de río (RW) y
del virus tiene una influencia significativa en la persistencia del virus en las aguas residuales crudas (WW). RW fue recolectado en Rio das Velhas, en el
matrices ambientales, dependiendo de si su capa externa permanece intacta ( Mitchell municipio de Nova Lima, estado de Minas Gerais, Brasil (20 ° 00 ′ 33,9 "S 43 ° 49 ′ 50,6
y Akram, 2019 ). Por este motivo, los virus envueltos como los coronavirus, con su "W), mientras que el WW se recogió de la Planta de Tratamiento de Aguas
frágil capa externa lipídica, suelen ser mucho menos persistentes que los virus no Residuales de Arrudas (19 ° 53 ′ 46,9 "S 43 ° 52 ′ 41,4 "de ancho).
envueltos en agua, permaneciendo viables unos días, en lugar de meses, como es
el caso de estos últimos ( Kutz y Gerba, 1988 ). 2.2. Condiciones ambientales

La persistencia de SARS-CoV-2 en RW y WW se evaluó en 4 ° C y 24 ° C durante

Debido a los altos riesgos de infección, se requieren laboratorios de nivel de
bioseguridad 3 para los métodos de propagación que involucran SARS-CoV-2
viable. Por este motivo, diferentes estudios han utilizado virus alternativos como
sustitutos para predecir el comportamiento del coronavirus en matrices
ambientales ( Aquino De Carvalho y col. 2017 ; Casanova y col. 2009 ,
Gundy y col. 2009 ). Sin embargo, los efectos de diferentes matrices y parámetros
ambientales sobre la inactivación de virus son complejos y producen resultados
muy variables, dependiendo de la cepa viral utilizada como sustituto ( Carraturo y
col. 2020 ). Aunque los estudios basados en virus sustitutos son muy relevantes,
los virus sustitutos pueden responder de manera diferente a las tensiones
ambientales en comparación con los virus patógenos objetivo, lo que enfatiza la
necesidad de pruebas que utilicen el patógeno de interés real.
Bivins y col. (2020) Recientemente han evaluado cómo la persistencia del SARS-CoV-2
en el agua y las aguas residuales se ve afectada por las temperaturas cálidas.
tures. Demostraron que a los 50 ° C y 70 ° C, T 90 Los valores en aguas residuales fueron de
15 y 2 minutos, respectivamente, mientras que a temperatura ambiente
peratura (20 ° C), T 90 fue de 1,7 días, para la misma matriz. Similar,
El ARN del SARS-CoV-2 mostró T 90 valores que van de 8.04 a 27.8 días en aguas
residuales y de 9.4 a 58.6 días en agua del grifo para
aturas de 37 ° C y 4 ° C, respectivamente ( Ahmed y col., 2020b ). Persistencia viable
del SARS-CoV-2 en agua y aguas residuales a bajas temperaturas (4 ° C) permanece
desconocido. La determinación de la persistencia del SARS-CoV-2 en el agua y las
aguas residuales a altas y bajas temperaturas es de gran importancia para la
planificación y ejecución de las estrategias de control de una pandemia.
15 días para determinar la influencia de las variaciones estacionales de
temperatura (clima frío y caliente). Se utilizaron muestras de RW y WW filtradas y
sin filtrar para simular matrices de agua con diferente contenido de sólidos y
turbidez, yendo desde redes de alcantarillado y ríos que están fuertemente
impactados por descargas de aguas residuales sin filtrar (WW cruda sin filtrar)
hasta matrices de agua de río con turbidez extremadamente baja (Filtered RW ,
RWF). Las muestras filtradas se prepararon filtrando consecutivamente a través de
membranas de nitrato de celulosa con tamaños de poro de 0,45 µm y 0,22 µm
(RWF y WWF). Todas las muestras (1 L cada una) se esterilizaron en autoclave a 121 °
C durante 15 minutos para eliminar el efecto de patógenos distintos del
SARS-CoV-2 que pudieran estar presentes en las muestras originales. Las muestras
esterilizadas en autoclave se almacenaron a 4 ° C hasta el ensayo de infectividad del
cultivo celular. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
2.3. Parámetros fisicoquímicos
Las muestras se caracterizaron por parámetros fisicoquímicos típicos de agua
y aguas residuales, como sólidos totales (TS), sólidos volátiles (VS), sólidos totales
suspendidos (TSS), demanda química de oxígeno (DQO), nitrógeno (amoníaco) y
ortofosfato, todos medidos de acuerdo con a APHA (2017) . Los parámetros
adicionales caracterizados en muestras totales y filtradas se presentan en tabla 1 .
2.4. Ensayos de infectividad en cultivos celulares de SARS-CoV-2

En este estudio, evaluamos la persistencia de SARS-CoV-2 en muestras de agua
de río y aguas residuales bajo diferentes condiciones ambientales simuladas
mediante el uso de un ensayo de placa en células Vero. Los ensayos de
persistencia del virus se llevaron a cabo a las 4 ° C y 24 ° C, para simular diferentes
estaciones del año, y con muestras filtradas y sin filtrar, para simular matrices de
agua con diferente contenido de sólidos.
Todas las pruebas de persistencia del SARS-CoV-2 se realizaron en una
instalación de alto contenido y nivel de bioseguridad 4 (OIE BSL-4 - Organización
Mundial de Sanidad Animal) en el Laboratório Federal de Defesa Agropecuária,
LFDA-MG, ubicado en Pedro Leopoldo, MG, Brasil, inoculando SARS-CoV-2
infeccioso en muestras de agua y aguas residuales esterilizadas en autoclave.
SARS-CoV-2 aislado SP02 / BRA

2
LC de Oliveira, AF Torres-Franco, BC Lopes et al.
(SARS.CoV2 / SP02.2020.HIAE.Br) fue amablemente proporcionado por el Dr.
Edison Luiz Durigon (Departamento de Microbiología, Instituto de Ciencias
Biomédicas, Universidad de São Paulo, São Paulo, Brasil) Araujo y col. 2020 ).
Se preparó stock de virus SARS-CoV-2 después de la infección de células Vero
CCL-81 y se almacenó a -80ºC. ° C hasta su uso posterior en pruebas de picos. Los
títulos de SARS-CoV-2 se determinaron con ensayo de placa en placas de 24
pocillos sembradas con células Vero CCL-81 a una concentración de 1 × 10 5
células / pocillo. Después de alcanzar una con fl uencia del 80-90%, se transfirieron
diluciones diez veces mayores de suspensiones de virus en DMEM-FBS al 2% (100
μ L / pocillo) a las placas sembradas. Después de 1 h de adsorción, los pocillos se
cubrieron con una capa de DMEM-FBS al 2% que contenía carboximetilcelulosa
(CMC) al 1% (p / v). Las placas se incubaron a 37 ° C en 5%
CO 2 durante 72 horas, fijado en una solución de formalina al 10% y teñido con un
Solución Crystal Violet al 0,5%. Se fabricaron unidades formadoras de placa (PFU)
ualmente enumerados y registrados como PFU / mL.
2.5. Inoculación de muestra con SARS-CoV-2
La persistencia del virus en cada una de las matrices ambientales inoculadas
por triplicado con SARS-CoV-2 también se determinó mediante ensayo de placa. En
resumen, se transfirió una alícuota de 4,8 ml de cada muestra de agua diferente a
un tubo cónico de polipropileno estéril de 15 ml. Entonces, 1 × 10 5 Se añadió PFU
de stock de SARS-CoV-2 en 200 μL a cada tubo (Vf = 5mL; título inicial diseñado
para SARS-CoV-2 = 2 × 10 4
PFU / mL). Las matrices de agua inoculada se mantuvieron a 24 ° C o almacenado a
4 ° C, según el diseño experimental. Después de la exposición, el SARS-CoV-2
infeccioso en suspensión se probó para determinar su infectividad en células Vero
CCL-81 en los puntos de tiempo 0, 6, 24, 48, 72, 96, 120, 240 y 360 horas después
de la inoculación. En cada momento, incluso inmediatamente después de la
inoculación, 50 μ L de cada muestra se recogió y se añadió a 450 μ L de DMEM-2%
FBS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Controles negativos que constan de
50 μ L de aguas residuales sin inocular añadido a 450 μ También se prepararon L
de DMEM-FBS al 2% en cada momento.
2.6. Análisis estadístico
Además del modelo log-lineal ( Ecuación 1 ), no lineal
Se aplicaron modelos para describir los patrones de desintegración y se obtuvieron por mínimos
cuadrados no lineales ( nls) método, incluyendo exponencial-
nls Ecuación 2 ), bifásico exponencial (exp-bifásico, Ecuación 3 ), Weibull ( Ecuación 4 )
y Gompertz ( Ecuación 5 ) modelos.
( Ct)
Iniciar sesión =-k·t
C 0
() C t
= a · Exp( - B · t)
C0
() C t
= a 1 · Exp( - Exp( B 1 · t)) + a 2 · Exp( - Exp( B 2 · t))
C0
() C t ( )
= Asym1 - Soltar 1 · exp exp ( lrc 1 · t) pwr 1
C0
() C t
t)
= Asym2 ∗ Exp( - B 3 B 4
C0
Donde k es la pendiente y la constante de decaimiento de primer orden, C t es el
concentración del virus en el tiempo t, y C 0 es la concentración inicial del virus en t
= 0. La desintegración bifásica exponencial consistió en
periodos de decaimiento inicial y final, rápido y lento, en los que b 1 y B 2
corresponden a las constantes de decaimiento rápido y lento, mientras que un 1 y
a 2 representan la descomposición del virus al comienzo de los períodos de descomposición
rápida y lenta, respectivamente ( Bivins y col. 2020 ). El modelo Weibull
es descrito por Asym1, que representa la asíntota horizontal en el lado derecho,
Drop es un parámetro numérico que representa la
Investigación del agua 195 (2021) 117002
cambio de Asym a la intersección con el eje y, lrc1 es un parámetro numérico que
representa el logaritmo natural de la constante de velocidad, pwr es un parámetro
numérico que representa la potencia a la que t es elevado.
En el modelo de Gompertz, Asym2 representa la asíntota, b 3 es re
relacionado con el valor de la función en t = 0 y b 4 es un parámetro numérico
relacionado con la escala del eje x.
Todas las regresiones y análisis estadísticos se realizaron utilizando el farmacocinética
PAQUETE) nlstools paquetes en CRAN y Rstudio ( Equipo, 2020 ). Las regresiones
lineales fueron evaluadas por R 2 valores y verificando los supuestos de
homogeneidad de normalidad y varianza en las gráficas de QQ y de residuos
frente a valores ajustados. Se realizó una prueba de Shapiro-Wilk para evaluar de
manera complementaria el supuesto de normalidad, mientras que una razón de
asimetría (la razón entre el valor de asimetría y el error estándar de asimetría)
mayor que 2 se usó como referencia para considerar que los datos tenían
asimetría no ignorable ( Yan et al., 2016 ). La relación de sesgo se determinó
utilizando el Skwelmm paquete. La ocurrencia de diferencias significativas entre las
primeras constantes de desintegración se evaluó mediante ANOVA ( estadisticas paquete).
Para regresiones no lineales, los parámetros de inicio de la exponencial
(exponencial-
nls), Los ajustes exponenciales bifásicos (exp-bifásicos), Weibull y Gompertz se
estimaron utilizando los modelos de autoarranque. El ajuste de los modelos a los
datos observados se evaluó mediante una suma de cuadrados extra F.La prueba
del criterio de información bayesiana (BIC) y los errores de raíz cuadrada media
(RMSE) se utilizaron para comparar los ajustes ( estadisticas paquete). Se
prefirieron los modelos con BIC y RMSE bajos a los ajustes con valores altos.
Cuando se obtuvieron valores similares, el modelo menos complejo se consideró
como el mejor ajuste ( Kauppinen y
Miettinen, 2017 ). Para la comparación de la tasa de decaimiento, T 90 y T 99 ( el
tiempo para lograr reducciones del 90% y 99% del título inicial) fueron
determinado utilizando el mejor modelo de ajuste. Correlaciones de Spearman entre
interpolación T 90 y T 99 Los valores y los parámetros fisicoquímicos también se
evaluaron utilizando Rstudio ( estadisticas paquete).
3. Resultados y discusión
3.1. Constantes de tasa de decaimiento de primer orden
Los modelos logarítmicos lineales de primer orden se ajustaron a los datos
experimentales para la evaluación preliminar de la desintegración del SARS-CoV-2 ( Tabla
2 ). Sobre Figura 1 , cada recuadro muestra las regresiones lineales realizadas para los
datos experimentales originales de ensayos por triplicado (puntos negros). Las tasas de
desintegración de primer orden para muestras sin filtrar fueron de -0,37 d - 1 y -0,83 d - 1
para RW-24 ° C y WW-24 ° C, respectivamente. Muestras filtradas a través
(1) Las membranas con un tamaño de poro de 0,22 μm presentaron tasas de
descomposición ligeramente más bajas de -0,32 d - 1 y -0,80 d - 1 para RWF-24 ° C y
WWF-24 ° C, mientras que las tasas de decaimiento de primer orden en muestras a
(2)
4 ° C presentó valores aún más bajos de 0.16 d - 1 ( RW-4 ° C) y 0,19 d - 1 ( WW-4 ° C).
ANOVA y comparaciones por pares de las tasas de desintegración mostraron que
RW-4 ° C y WW-4 ° C exhibió valores significativamente más bajos (p <0.05) que las
(3)
otras tasas de descomposición, lo que indica un aumento significativo en la
persistencia viral a baja temperatura.
(4) Los parámetros de la ecuación de Arrhenius se establecieron para determinar
los coeficientes de reacción para diferentes temperaturas (4 ° C y 24 ° C) (Material
complementario - Ecuación S1 y Figura S.7). Las constantes de desintegración de
(5) primer orden siguieron la relación de Arrhenius con energías de activación de 22,8
y 50,4 KJ mol - 1 para RW y WW, respectivamente, lo que indica que la
desintegración del SARS-CoV-2 en WW fue más sensible a la temperatura que en
RW. Energías similares de 39 kJ mol - 1 Se han notificado casos de inactivación del
poliovirus tipo 1 durante la termofilia (51 a 56 ° C) digestión anaeróbica de lodos ( Popat
y col. 2010 ) y 59,8 kJ mol - 1 para la inactivación del poliovirus 2 por Cloramina-T en
agua (5 a 35 ° C, Gowda y col. 1981 ). Además, la inactivación de MHV (coronavirus
murino) en acero inoxidable mostró valores entre 30 y 100 kJ mol - 1 ( Casanova y col.
2010 ;
Roos, 2020 ).
3
LC de Oliveira, AF Torres-Franco, BC Lopes et al. Investigación del agua 195 (2021) 117002

Tabla 2
Modelos con los valores de RMSE y BIC más bajos en comparación con las regresiones log-lineales.

Muestra Modelo Tasa de decaimiento (d - 1) RMSE BIC

agua de rio Log-lineal (R 2 = 0,649) m = -0,37 0,8017 67,0

(RW-24 ° C)
Exponencial- nls b = -1,55 0.0559 - 69,1
Exp-bifásico B 1 = - 2,82 0.0478 71,1
B 2 = - 0,66
Gompertz B 3 = 0,98 0.0490 - 72,8
Weibull mi - lcr 1 = - 4.1 0.0486 70,19
Agua de río filtrada Log-lineal (R 2 = 0,821) m = -0,32 0.4525 39,6
(RWF-24 ° C)
Exponencial- nls b = -0,98 0.0795 - 50,2
Exp-bifásico B 1 = - 5.40 0.0633 - 55,9
B 2 = - 0,63
Gompertz N/A - -
Weibull mi - lcr 1 = - 6.6 0.0665 - 53,2
Agua de río a 4 ° C Log-lineal (R 2 = 0,761) m = -0,16 0.4049 37,69
(RW-4 ° C)
Exponencial- nls b = -0,43 0.0827 - 48,0
Exp-bifásico B 1 = - 0,96 0.0633 - 56,8
B 2 = - 0,17
Gompertz B 3 = 0,99 0.0728 - 51,7
Weibull mi - lcr 1 = - 2.2 0.0636 - 55,7
Aguas residuales Log-lineal (R 2 = 0,791) m = -0,83 0,7350 55,8
(WW-24 ° C)
Exponencial- nls b = 1,98 0.0767 - 118
Exp-bifásico B 1 = - 2.30 0.0213 - 115
B 2 = - 0,85
Gompertz B 3 = 0,99 0.0214 - 118
Weibull mi - lcr 1 = - 2.5 0.0224 - 112
Filtrado Log-lineal (R 2 = 0,796) m = -0,80 0,6959 53,5
aguas residuales

(WWF-24 ° C)
Exponencial- nls b = 1,29 0.0827 - 52,1
Exp-bifásico N/A
Gompertz N/A
Weibull mi - lcr 1 = - 0,5 0.052 - 66,5

Aguas residuales a 4 ° C Log-lineal (R 2 = 0,752) m = -0,19 0.5094 50.08

(WW-4 ° C)
Exponencial- nls b = -0,65 0.0867 - 49,4
Exp-bifásico B 1 = - 1,71 0.0622 - 56,8
B 2 = - 0,20
Gompertz B 3 = 0,98 0.0679 - 55,4
Weibull mi - lcr 1 = - 4.8 0.0619 - 57,1

3.2. Regresiones no lineales aumento de la incertidumbre en regresiones lineales (Figura S1 a S6 - Material

Las regresiones log-lineales no se ajustaban bien a los datos experimentales,
como lo indican los valores de RMSE ( Tabla 2 ). Se probaron cuatro modelos no
lineales: exponencial- nls, bifásico exponencial, Weibull y Gompertz. Los
parámetros de regresión calculados para cada modelo se presentan en la Tabla S1
(Materiales suplementarios). Todos los modelos no lineales mostraron mejores
ajustes en comparación con los modelos lineales, como lo demuestran los valores
de RSME más bajos en comparación con los encontrados para las regresiones
lineales. En general, el modelo de Weibull se ajusta mejor al conjunto de datos
completo.
Aunque la cinética lineal de primer orden es un modelo clásico de
descomposición del virus en el agua y las aguas residuales, incluidos los virus
envueltos y no envueltos, en algunos casos, su ajuste no se evalúa
cuidadosamente, lo que dificulta la capacidad de identificar los factores que
pueden afectar la cinética de inactivación o determinar la cinética real. patrones de
decadencia Dean y col. 2020 ). En este estudio, la falta de precisión del modelo
loglineal fue consecuencia de posibles valores atípicos y la violación de los
supuestos de normalidad y homogeneidad de la varianza. La violación del
supuesto de normalidad (prueba de Shapiro-Wilk y gráficos QQ, Figura S1 a S6 -
Material complementario) ocurrió para todas las regresiones log-normales. La
evaluación de la relación de asimetría mostró una asimetría alta en todos los casos
(excepto para WW-24 ° C y WW4 ° C). Además, varias matrices mostraron violaciones
del supuesto de homogeneidad de varianza ( es decir, RW-4 ° C, WWF-24 ° C y WW-4 ° C),
complementario).
Se ha informado que los modelos exponenciales que representan una "cola
plana" proporcionan una mejor representación de la descomposición de los
patógenos, incluidos los virus. Por ejemplo, la dinámica bifásica puede surgir
como consecuencia de la heterogeneidad de la población de patógenos o el
endurecimiento ( Brouwer y col. 2017 ). De manera similar, también se ha
observado cinética de inactivación bifásica para virus sin envoltura, que se
atribuyó a subpoblaciones de virus con variadas susceptibilidades a la química o
temperatura de la solución ( Ye et al. 2016 ). Kauppinen y Miettinen (2017) encontraron
que los modelos Weibull y Double-Weibull presentaban los mejores ajustes para la
inactivación del genoma de Norovirus GII en aguas residuales (3 ° C) y agua
potable (21 ° C), respectivamente, que mostraron un alto efecto de cola que
describe la larga persistencia del virus. Se ha informado que el efecto de cola
representado por el modelo de Weibull proporciona una mejor descripción de la
inactivación de los clones del virus de la fiebre aftosa sometidos a 50
transferencias de placa a placa debido a pequeñas diferencias en la replicación del
virus, que se amplifican durante el curso. de replicación, resultó en fluctuaciones
más grandes y la "cola plana" en la distribución de probabilidad, que
eventualmente desarrolla una forma de Weibull exponencial estirada ( Lázaro y col.
2003 ). Los datos experimentales mostrados en el estudio actual indicaron mayores
fluctuaciones en la supervivencia del SARS-CoV-2 con títulos virales bajos y
principalmente a bajas temperaturas.

4
LC de Oliveira, AF Torres-Franco, BC Lopes et al. Investigación del agua 195 (2021) 117002

Figura 1. Regresiones log-lineales y no lineales para A) agua de río (RW-24 ° C); B) agua de río filtrada (RWF-24 ° C); C) agua de río a 4 ° C (RW-4 ° C); D) aguas residuales (WW-24 ° C); E) aguas residuales
filtradas (WWF-24 ° C); F) aguas residuales en 4 ° C (WW-4 ° C). Modelo log-lineal (rojo), exponencial- nls modelo (azul), modelo exp-bifásico (verde), modelo Weibull (violeta), modelo Gompertz (naranja).

Tabla 3
Parámetros de regresión de Weibull, T estimada 90 y T 99 para cada una de las muestras.

Muestra Parámetros de regresión de Weibull

Asym Soltar Lrc1 Pwr T 90 ( dias) T 99 ( dias)

Agua de río (RW-24 ° C) 0,995 1.031 1,758 - 0,981 1,9 6.4

Agua de río filtrada (RWF-24 ° C) Agua 0,998 1.102 1.295 - 0,660 3.3 8.5
de río a 4 ° C (RW-4 ° C) Aguas 1.013 1.105 2.397 - 0,779 7.7 18,7
residuales (WW-24 ° C) 0,997 1.015 2.258 - 1.300 1.2 4.0
Aguas residuales filtradas (WWF-24 ° C) 0,999 1.010 3.796 - 1.636 1,5 4.5
Aguas residuales a 4 ° C (WW-4 ° C) 1.001 1.071 1.618 - 0,691 5.5 17,5

3.3. SARS-CoV-2 T 90 y T 99 en agua y aguas residuales
T 90 y T 99 Los valores se calcularon para la supervivencia del SARS-CoV-2 en
todas las muestras utilizando el modelo de Weibull ( Tabla 3 ). RW-24 ° C y WW-
24 ° C mostró T 90 valores de 1,9 y 1,2 días y T 99 valores de 6.4
y 4.0 días, respectivamente. El conjunto 90 Los valores estaban dentro del mismo
rango de los reportados por Bivins y col. (2020) , que fueron 2.0
y 1,6 días para muestras de agua corriente y aguas residuales, respectivamente.
Sin embargo, estos T 99 valores (a 24 ° C) son levemente superiores a los reportados
por Bivins y col. (2020) , a los 3,9 días y 3,2 días para el grifo
agua y aguas residuales, respectivamente. Las diferencias en tiempos de
supervivencia más largos podrían deberse potencialmente a las diferencias en los
modelos de regresión utilizados (Weibull en el estudio actual, versus Log-
lineal). Cuando las muestras se filtraron a través de un tamaño de poro de 0,22 μm
membranas, T 90 los valores aumentaron a 3.3 y 1.5 días, y T 99 aumentado a 8.5 y
4.5 días, para RW-24 ° C y WW-24 ° Muestras C,
respectivamente. Incrementos notables en los tiempos de supervivencia del SARS-CoV-2
se observaron en ensayos a las 4 ° C, que mostró T 90 valores de 7.7
y 5,5 días, y T 99 valores de 18,7 y 17,5 días para muestras de agua de río y aguas
residuales, respectivamente.
Se reconoce que la temperatura tiene un fuerte efecto sobre la persistencia
del virus. Previamente se ha informado de una alta persistencia a bajas
temperaturas para otros coronavirus ( Casanova y col. 2009 ;
Gundy y col. 2009 ; Bertrand y col. 2012 ). La viabilidad del SARS-CoV-2 aún no se ha
confirmado en aguas residuales reales o en aguas fluviales naturales. Sin
embargo, evaluar el efecto de la temperatura sobre el SARS-CoV-2 por

5
LC de Oliveira, AF Torres-Franco, BC Lopes et al. Investigación del agua 195 (2021) 117002

Cuadro 4
Los mejores modelos de ajuste y T 90 estimaciones para SARS-CoV-2, otros coronavirus, coronavirus sustitutos y otros virus en matrices de agua.

Referencia Virus Matriz Temperatura Modelo de mejor ajuste RMSE T 90 ( dias)

Este trabajo SARS-CoV-2 RW ∗ 24 ° C Weibull 0.0486 1,9

RW ∗ 4°C Weibull 0.0636 7.7
RWF ∗ 24 ° C Weibull 0.0665 3.3
WW ∗ 24 ° C Weibull 0.0224 1.2
WW ∗ 4°C Weibull 0.0619 5.5
WWF ∗ 24 ° C Weibull 0.0520 1,5
Ahmed y col. (2020b) ARN del SARS-CoV-2 WW 37 ° C Primer orden 1,10 0,74
WW 25 ° C Primer orden 0,67 12,6
WW 15 ° C Primer orden 0,59 20,4
WW 4°C Primer orden 0,37 27,8
WW ∗ 37 ° C Primer orden 0,59 5.71
WW ∗ 25 ° C Primer orden 0,48 13,5
WW ∗ 15 ° C Primer orden 0,32 29,9
WW ∗ 4°C Primer orden 0,14 43.2
TW-D 37 ° C Primer orden 0,86 9.40
TW-D 25 ° C Primer orden 0,68 15,2
TW-D 15 ° C Primer orden 0,33 51,2
TW-D 4°C Primer orden 0,17 58,6
Bivins y col. (2020) SARS-CoV-2 WW 20 ° C Log-lineal 1.8 1,6
TW 20 ° C Log-lineal 1.2 2.0
WW 50 ° C Log-lineal 1.4 15 minutos

WW 70 ° C Log-lineal 1,9 2,2 min

Kauppinen y Miettinen (2017) ARN del norovirus GII_A WW 3°C Weibull doble 0,11 38
WW 21 ° C Log-lineal 0,03 58
WW 36 ° C Log-lineal 0,11 58
DW 21 ° C Weibull 0,09 230
DW 36 ° C Log-lineal 0,31 58
Gundy y col. (2009) HCoV TP 23 ° C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE8.1

TP-F 23 ° C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE6,8

TP-F 4°C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE392

WW 23 ° C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE2.4

WW-F 23 ° C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE1,6

SE 23 ° C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE1,9

FIPV TW 23 ° C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE8.3

TW-F 23 ° C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE6,8

TW-F 4°C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE87,0

WW 23 ° C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE1,7

WW-F 23 ° C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE1,6

SE 23 ° C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE1.8

PV-1 TW 23 ° C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE47,5

TW-F 23 ° C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE43.3

TW-F 4°C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE135

WW 23 ° C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE7.3

WW-F 23 ° C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE23,6

SE 23 ° C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE3.8

Casanova y col. (2009) ∗ TGEV W 4°C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE110

W 25 ° C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE11

WW ∗ 4°C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE24

WW ∗ 25 ° C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE4

MVH W 4°C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE> 365

W 25 ° C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE9

WW ∗ 4°C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE35

WW ∗ 25 ° C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE3

Bibby y col. 2015 ∗ Ébola WW ∗ 20 ° C Log-lineal DAKOTA DEL NORTE< 1 día

Abreviaturas de matrices TP-D: Agua del grifo sin cloro; OOOH; Aguas residuales esterilizadas en autoclave; DW: agua potable; RW: agua de río, RW-F:
agua de río filtrada; SE: e ffl uente secundario (aguas residuales tratadas); TW: agua del grifo; TW-F: Agua del grifo filtrada WW: Aguas residuales;
WW-F: Aguas residuales - Filtradas; Abreviaturas de virus FIPV: virus de la peritonitis infecciosa felina. HCoV: coronavirus humano 229E; MHV: hepatitis
de ratón; PV-1: Poliovirus 1 LSc-2ab. TGEV: gastroenteritis transmisible. ( ∗) Muestras esterilizadas en autoclave o pasteurizadas.

La coherencia en las matrices de agua podría ser muy relevante para cuantificar
los riesgos relacionados con la exposición al agua contaminada con SARS-CoV-2,
ya que varios países están experimentando picos de transmisiones de COVID19,
que coinciden con el invierno boreal. Las bajas temperaturas estacionales pueden
aumentar el riesgo de transmisión del SARSCoV-2 relacionado con el agua, lo que
genera preocupaciones sobre el riesgo de transmisión de COVID-19 por agua
contaminada en aerosol y aguas residuales, o por la transmisión fecal-oral.
El contenido y la composición de sólidos probablemente fueron un factor secundario
que afectaba la persistencia del SARS-CoV-2 en las muestras de agua y aguas residuales
analizadas. Se observaron tiempos de supervivencia más prolongados del SARS-CoV-2
en agua de río en comparación con aguas residuales, y muestras filtradas en comparación con
muestras sin filtrar. Aunque no existe una correlación significativa
Se observaron ciones para T 90 o T 99 valores y parámetros fisicoquímicos (Tabla S.2
- material suplementario), composición de sólidos
y el pH puede afectar la persistencia del SARS-CoV-2. En RW-24 ° C, el pH más bajo
pudo haber estimulado interacciones electrostáticas más altas y adsorción viral a
los sólidos, que presentaron una composición más mineral (relación sólidos
volátiles / sólidos totales de 0.3) en comparación con los sólidos presentes en las
muestras de aguas residuales (relación sólidos volátiles / sólidos totales de 0,5).
Estos resultados concuerdan con el efecto de la composición de la matriz descrito
previamente en la literatura, con un virus más rápido

6
LC de Oliveira, AF Torres-Franco, BC Lopes et al.
inactivación en matrices complejas en lugar de simples ( Bertrand y col. 2012 ). En la
misma nota, la persistencia viral en agua no estéril y aguas residuales debería ser
menor en comparación con la persistencia viral en muestras esterilizadas en
autoclave (determinada en el estudio actual), como también se verificó para el ARN
del SARS-CoV-2 por Ahmed y col. (2020b) . El pH y los sólidos orgánicos e
inorgánicos pueden desempeñar un papel importante en la formación de
superficies cargadas eléctricamente dependientes del pH ( Michen y Graule, 2009 ; Scheller
y col. 2020 ) al producir alteraciones significativas en las proteínas de la estructura
del virus debido a cambios en su punto isoeléctrico (IEP). Una explicación
hipotética de una inactivación más rápida en muestras de agua de río sin filtrar en
comparación con las filtradas es la presencia de arcillas inorgánicas, debido a sus
propiedades altamente adsorbentes, que podrían actuar como inhibidores del
SARS-CoV-2 (Sahel N Abduljauwad y col. 2020 ). Cuadro 4 muestra una comparación
de la
SARS-CoV-2 T 90 valores determinados en el estudio actual con T 90
valores informados previamente para otros coronavirus, coro-
naviruses y otros virus.
4. Conclusión
Saber cuánto tiempo el SARS-CoV-2 puede permanecer viable en el agua y las aguas
residuales es esencial para evaluar los riesgos para la salud pública asociados con el agua
contaminada. Nuestros datos mostraron que la temperatura
tura tuvo un fuerte efecto sobre la persistencia del SARS-CoV-2, con T 90 valores en
4 ° C de 7.7 y 5.5 días para RW y WW (respectivamente),
que son de 4 a 4,5 veces T 90 valores determinados a 24 ° C para las mismas
muestras. Es importante señalar que la transmisión fecal-oral
La sión de COVID-19 aún no ha sido con fi rmada. Sin embargo, estos resultados
podrían ser muy relevantes para la evaluación cuantitativa del riesgo microbiano
(QMRA) relacionada con la exposición a agua contaminada con SARS-CoV-2, ya que
varios países están experimentando actualmente los picos más altos hasta la fecha
en nuevos casos de COVID-19. En lugares donde no se cuenta con una
infraestructura de saneamiento adecuada, las altas cargas de SARS-CoV-2 podrían
estar llegando a los cuerpos de agua y permanecer activas durante períodos
relativamente largos. Las bajas temperaturas estacionales pueden aumentar el
riesgo de transmisión del SARS-CoV-2 relacionado con el agua, lo que genera
preocupaciones sobre la transmisión del COVID-19 a través del agua contaminada
en aerosol y las aguas residuales. Una limitación importante de este estudio es el
hecho de que los ensayos de persistencia se llevaron a cabo en muestras estériles,
enriquecidas con SARS-CoV-2 infeccioso. Por lo tanto, los tiempos de supervivencia
reales en no estériles,
Declaración de intereses en competencia
Los autores declaran que no tienen intereses económicos en competencia o
relaciones personales que pudieran haber parecido influir en el trabajo informado
en este artículo.
Agradecimientos
Agradecemos a Marcelo Fernandes Camargos y Kelly Fagundes Nascimento
por todo su apoyo. Agradecemos especialmente al Laboratório Federal de Defesa
Agropecuária LFDA-MG, Ministerio de Agricultura, Ganadería y Abastecimiento
(MAPA), por permitir y apoyar nuestras actividades en el laboratorio BSL-4. Este
trabajo fue apoyado con subvenciones del INCT Dengue (Proyecto 465425 / 2014-3
financiado por MCTI / CNPQ / CAPES / FAPS N ° 16/2014 - PROGRAMA INCT). Este
trabajo también fue apoyado por una subvención de la Royal Society (ICA \ R1 \
191241). LCO está financiado con una beca de investigación de CAPES, AFTF, BCL,
BSASS, EAC. Los autores desean agradecer a COPASA (Empresa de Saneamiento
del Estado de Minas Gerais) por poner a disposición muestras de agua y aguas
residuales.
7
Investigación del agua 195 (2021) 117002
Materiales complementarios
El material complementario asociado con este artículo se puede encontrar, en
la versión en línea, en doi: 10.1016 / j.watres.2021.117002 .
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