Ciencia del medio ambiente total 743 (2020) 140621

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Primera detección de ARN del SARS-CoV-2 en aguas residuales en América del Norte: un estudio en Luisiana,

EE. UU.

Samendra P. Sherchan un , • , Shalina Shahin un , Lauren M. Ward un , Sarmila Tandukar segundo , Tiong G. Aw un ,
Bradley Schmitz C , Warish Ahmed re , Masaaki Kitajima mi
un Departamento de Ciencias de la Salud Ambiental, Universidad de Tulane, 1440 Canal Street, Suite 2100, Nueva Orleans, LA 70112, EE. UU.
segundo Centro interdisciplinario para el medio ambiente de la cuenca fluvial, Universidad de Yamanashi, 4-3-11 Takeda, Kofu, Yamanashi 400-8511, Japón

C Loudoun Water, 44865 Loudoun Water Way, Ashburn, VA 20147, EE. UU.
re CSIRO Land and Water, Ecosciences Precinct, 41 Boggo Road, Dutton Park, QLD 4102, Australia
mi División de Ingeniería Ambiental, Facultad de Ingeniería, Universidad de Hokkaido, North 13 West 8, Kita-ku, Sapporo, Hokkaido 060-8628, Japón

DESTACAR GRÁFICAMENTE ABSTRACTO

• Primer estudio en Luisiana, EE. UU. Que informa la

detección de ARN del SARS-CoV-2 en aguas residuales
utilizando ultra fi filtración.
• Dos de las siete muestras de aguas residuales sin tratar
dieron positivo en ARN del SARS-CoV-2.

• Ninguno de los secundarios tratados y fi ef nal fl uent

muestras dieron positivo.
• Los métodos de concentración y los ensayos de RT-qPCR

aplicados para la detección del ARN del SARS-CoV-2 necesitan

más información fi nement.

información del artículo resumen

Historia del artículo: Investigamos la presencia de ARN del coronavirus 2 (SARS-CoV-2) del síndrome respiratorio agudo severo en muestras de aguas residuales en el sur de
Recibido el 12 de junio de 2020
Louisiana, EE. UU. Se recolectaron muestras de aguas residuales tratadas y no tratadas en fi cinco veces durante un período de cuatro meses de enero a abril de
Recibido en forma revisada el 27 de junio de 2020 Aceptado el
2020. Las muestras de aguas residuales se concentraron a través de ultra fi filtración (método A) y adsorción - Método de elución utilizando membranas
28 de junio de 2020
electronegativas (Método B). Se detectó ARN del SARS-CoV-2 en 2 de las 15 muestras de aguas residuales mediante dos ensayos de reacción en cadena de la
Disponible online el 30 de junio de 2020
polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) (CDC N1 y N2). Ninguno de los secundarios tratados y fi ef nal fl Las muestras de fluidos dieron
positivo para ARN del SARS-CoV-2. Hasta donde sabemos, este es el fi primer estudio que informa sobre la detección de ARN del SARS-CoV-2 en aguas
Montaje: Damia Barcelo
residuales en América del Norte, incluidos los EE. UU. Sin embargo, los métodos de concentración y los ensayos RTqPCR deben fi ned y validado para aumentar

Palabras clave: la sensibilidad de detección de ARN SARS-CoV-2 en aguas residuales.

Epidemiología basada en aguas residuales

SARS-CoV-2
Vigilancia © 2020 Elsevier BV Todos los derechos reservados.
COVID-19
RT-qPCR
Aguas residuales

1. Introducción
• Autor para correspondencia en: Departamento de Ciencias de la Salud Ambiental # 8360, Escuela de Salud
Pública y Medicina Tropical, Universidad de Tulane de Louisiana, 1440 Canal Street Suite 2100, Nueva Orleans, LA
70112, EE. UU. Síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), miembro de la Coronaviridae familia,
Dirección de correo electrónico: sshercha@tulane.edu (SP Sherchan). surgió en Wuhan, China en

https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2020.140621
0048-9697 / © 2020 Elsevier BV Todos los derechos reservados.
2 SP Sherchan y col. / Ciencia del medio ambiente total 743 (2020) 140621
Diciembre de 2019 con un total de 9.473.214 con fi casos curados y 484,249 muertes en todo el
mundo (al 26 de junio de 2020) ( Organización Mundial de la Salud, 2020 ). En los EE. UU., El número
total de casos es de 2.414.870 con 124.325 muertes al 26 de junio de 2020 ( CDC, 2020a ) .La OMS
anunció una de fi nombre cial de la enfermedad [enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19)]
causada por SARS-CoV-2 y clasi fi lo edificó como una pandemia global OMS, 2020 ). Aunque el
SARS-CoV-2 es principalmente de naturaleza respiratoria, los estudios han fi rmed, el ARN viral se
puede detectar en las heces de las personas infectadas, incluso después de que los síntomas
respiratorios hayan remitido ( Kitajima et al., 2020 ). El estado de Louisiana se ve muy afectado por
COVID-19 en los EE. UU. los fi El primer caso de COVID-19 se registró el 9 de marzo de 2020 en la
parroquia de Jefferson y ha habido 53,415 con fi casos rmed y
3,164 muertes al 26 de junio de 2020 ( CDC, 2020a ). Un importante festival anual, Mardi Gras, en
febrero de 2020 en Nueva Orleans, LA, puede haber contribuido a este aumento.
Varios estudios han informado de la detección de ARN del SARS-CoV-2 en muestras de heces
de personas infectadas ( Wang et al., 2020 ;
Wu et al., 2020 ; Holshue et al., 2020 ; Xiao et al., 2020 ; Tang et al., 2020 ; To et al., 2020 ; Wölfel et al.,
2020 ; Yeo et al., 2020 ; Harcourt y col., 2020 ; Zhang et al., 2020 ). Esto implica que el SARS-CoV-2
puede excretarse a través de las heces y otras secreciones corporales, como la saliva y la orina, de
las personas infectadas, y posteriormente transportarse a las plantas de tratamiento de aguas
residuales ( Kitajima et al., 2020 ; MaalBared et al., 2020 ).
La epidemiología basada en aguas residuales (WBE) se ha utilizado para avanzar en nuestra
comprensión de la aparición y epidemiología de virus patógenos como poliovirus y norovirus en
comunidades de todo el mundo ( Kitajima et al., 2020 ). Recientemente, se ha informado de la
detección de aguas residuales inmunicipal ARN del SARS-CoV-2 en varios países, incluido Australia
( Ahmed y col., 2020a ), España ( Randazzo et al., 2020 ), Italia ( La Rosa et al., 2020 ), Países Bajos ( Medema
los fi La unidad del ltro se invirtió y se centrifugó a 1000 gramo durante 2 min para recuperar el
et al., 2020 ) y Japón ( Haramoto et al., 2020 ), lo que sugiere la aplicabilidad del enfoque WBE para
monitorear COVID-19.
Uno de los principales desafíos en los estudios de COVID-19 WBE es el ef fi-
ciencias de concentración y recuperación de SARS-CoV-2 y detección de su ARN en aguas
residuales ( Ahmed y col., 2020b ). Poco se sabe sobre la recuperación ef fi eficiencia del SARS-CoV-2
de las aguas residuales. Se ha sugerido que la recuperación ef fi La eficiencia del SARSCoV-2
envuelto puede ser diferente a la de los virus entéricos no envueltos ( Kitajima et al., 2020 ; La Rosa et
al., 2020 ). Estudios recientes han utilizado varios métodos de concentración de virus para recuperar
el SARS-CoV-2 de las aguas residuales. Por ejemplo, Medema y col. (2020) se utilizó 100 kDa
Centricon® Plus-70 (Millipore, Amsterdam, Países Bajos) centrífuga ultra fi Dispositivo de filtración
para recuperar SARS-CoV-2 de aguas residuales sin tratar en los Países Bajos. Ahmed y col., 2020b
utilizó el método de adsorción-extracción con membrana electronegativa, así como el centrífugo
Centricon® Plus-70 ultra fi Dispositivo de filtración.
La Rosa et al., (2020) utilizó una separación de dos fases (método de PEG-dextrano) como se
describe en el protocolo de las Directrices de la OMS para la Vigilancia Ambiental del Poliovirus de
2003 e informó que 6 de las 12 muestras de aguas residuales en Italia dieron positivo al
SARS-CoV-2.
Randazzo y otros, (2020) utilizó un método de adsorción y precipitación de hidróxido de aluminio
para la detección de ARN del SARS-CoV-2 en aguas residuales en España. Sin embargo, ninguno
de estos estudios ha informado el porcentaje de recuperación de ARN del SARS-CoV-2 de las aguas
residuales. Un estudio reciente evaluó siete métodos de concentración mediante la siembra del virus
de la hepatitis murina (MHV) en muestras de aguas residuales no tratadas y las recuperaciones
medias de MHV variaron de 26,7 a 65,7% para los métodos de concentración utilizados ( Ahmed y
col., 2020b ).
En el presente estudio, investigamos la presencia de ARN del SARS-CoV-2 en aguas residuales en
el sur de Louisiana, EE. UU., Utilizando dos métodos de concentración seguidos de la reacción en
cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR). Hasta donde sabemos, este
es el fi primer estudio que informa sobre la detección de ARN del SARS-CoV-2 en aguas residuales en
América del Norte, incluidos los EE. UU.
2. Materiales y métodos
2.1. Recolección de muestras de aguas residuales
Se recolectaron mensualmente nueve muestras compuestas y seis simples de aguas residuales
en dos plantas de tratamiento de aguas residuales (PTAR) (A y B), ubicadas respectivamente en el
sur de Luisiana de enero a abril.
2020. Se recolectaron muestras compuestas de 24 horas utilizando un muestreador automático,
mientras que las muestras individuales se recolectaron temprano en la mañana (7 am-11 am). Durante
este período, las aguas residuales sin tratar ( n = 7), tratamiento secundario ( n = 4) y fi ef nal fl uentes
después de la desinfección con cloro ( n = 4) fueron recolectados. La población atendida por las EDAR
A y B fue
244,627 y 45,694, respectivamente. Ambas EDAR utilizaron lodos activados convencionales
seguidos de desinfección con cloro. Se recogió un litro de agua residual por cada agua residual no
tratada, tratada secundariamente y
fi ef nal fl uentes en frascos estériles Nalgene de 1 L y transportados en hielo al laboratorio. Las
muestras recolectadas en enero-marzo se almacenaron en
- 80 ° C hasta un análisis posterior, mientras que las muestras de abril de 2020 se procesaron dentro de las 6 h
posteriores a la recolección de la muestra.
2.2. Concentración y extracción de ácidos nucleicos
Se utilizaron dos métodos de concentración de virus para maximizar la posibilidad de detección
del ARN del SARS-CoV-2 en las aguas residuales. Método A (ultra fi filtración) se realizó con
centrifugación de 250 mL de la muestra durante 30 min a 3000 gramo para eliminar partículas
grandes y sólidos en suspensión. Luego se concentraron 70140 mL del sobrenadante de 250 mL
usando la centrífuga Centricon® Plus-70 fi ltro con un lmite de peso molecular nominal (NMWL) de
100 kDa (Merck Millipore; parte no UFC710008) mediante centrifugacin (1500 gramo durante 15 min).
concentrado viral de aproximadamente 350 μ L, que luego se recogió del depósito de muestra con
una pipeta.
Método B (adsorción - método de elución utilizando una membrana electronegativa) se realizó
como se describió anteriormente ( Schmitz y col.,
2016 ; Tandukar et al., 2020 ). queso Brie fl año, 2,5 MMgCl 2 se añadió a todas las muestras (100 mL
en fl uent y 750 mL secundario tratado y fi ef nal fl uent)
para obtener un fi concentración final de MgCl 25 mM 2. Las muestras se pasaron posteriormente a
través de un electronegativo. fi ltro (90 mm de diámetro
y 0.45- μ m tamaño de poro; Merck Millipore, Billerica, Estados Unidos; Catálogo no. HAWP-09000)
unido a un vaso fi soporte de ltro (Advantec, Tokio, Japón). Luego se eliminaron los iones de
magnesio mediante el paso de 200 ml
de 0,5 mMH 2 ENTONCES 4 ( pH3.0) a través del fi ltro, y los virus se eluyeron con 10 ml de NaOH 1,0
mM (pH 10,8). El eluido se recuperó en un
tubo que contiene 50 μ L de 100 mM H 2 ENTONCES 4 y 100 μ L de tampón Tris-EDTA 100 × para
neutralización. Luego se centrifugaron 10 ml con un Centriprep
YM-30 (Merck Millipore) que contiene un ultra fi Membrana de filtración con NMWL de 30 kDa (Merck
Millipore) para obtener una fi volumen final de aproximadamente 650 μ L.
2.3. Inhibición y control de calidad de RT-qPCR
Pseudomonas bacteriófago Φ 6 (DSM 21518, DSMZ, Braunschweig, Alemania) se utilizó como un
control de proceso de muestra (SPC) para determinar la ef fi eficiencia de la extracción de ARN y
RT-qPCR. queso Brie fl y, 2 μ L de Pseudomonas
bacteriófago Φ 6 (2,0 × 10 5 copias / μ L) se sembró en 200 μ L de muestras concentradas de aguas
residuales y agua de grado biológico molecular se utilizó como control no inhibitorio. La extracción - RT-qPCR
ef fi El% de eficiencia (E) se calculó como se describió anteriormente ( Schmitz et al., 2016 ;
Tandukar et al., 2020 ).
2.4. Extracción de ARN viral y transcripción inversa (RT)
Se extrajo ARN viral de la muestra concentrada de aguas residuales sembrada con Pseudomonas
bacteriófago Φ 6 control de proceso (202 μ L en total) utilizando un kit de ARN viral ZR (Zymo
Research, Irvine, EE. UU.) Para obtener
 SP Sherchan y col. / Ciencia del medio ambiente total 743 (2020) 140621 3

tabla 1
Secuencias de oligonucleótidos de cebadores y sondas utilizadas en este estudio.

Ensayo Gen diana Cebador / sonda Secuencia (5 ′ - 3 ′) un Referencia

CDC N1 Nucleocápside (N) 2019-nCoV_N1-F GACCCCAAAATCAGCGAAAT CDC (2020b)

2019-nCoV_N1-R TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG
2019-nCoV_N1-P FAM-ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC-BHQ1
CDC N2 Nucleocápside (N) 2019-nCoV_N2-F TTACAAACATTGGCCGCAAA CDC (2020b)
2019-nCoV_N2-R GCGCGACATTCCGAAGAA
2019-nCoV_N2-P FAM-ACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAG-BHQ1
phi6 phi-6S 1 phi6- F TGGCGGCGGTCAAGAGC Gendron y col. (2010)
( Φ 6) phi6- R GGATGATTCTCCAGAAGCTGCTG
phi6- P FAM-CGGTCGTCG / ZEN / CAGGTCTGACACTCGC-IBFQ

un FAM, 6-carboxi fl uoresceína; BHQ1, extintor de agujeros negros 1; ZEN, extintor interno ZEN; IBFQ, Iowa Negro fl extintor fluorescente.

un fi volumen final de 100 μ L ARN, según protocolo del fabricante. La RT se realizó utilizando un kit de 3. Resultados

transcripción inversa cDNAReverse de alta capacidad (Applied Biosystems, Foster City, EE. UU.) ( Schmitz
et al., 2016 ; Tandukar et al., 2020 ). 3.1. Ef fi eficiencia de la extracción de ácido nucleico viral y rendimiento del ensayo RT-qPCR

Las muestras de aguas residuales concentradas se sembraron con Pseudomonas

bacteriófago Φ 6 como control de proceso para monitorear la extracción de ARN-RTqPCR ef fi eficiencia.

2.5. RT-qPCR para SARS-CoV-2
La recuperación de la media geométrica ef fi cienciencias de Pseudomonas bacteriófago Φ 6 fueron
56% (n = 15) y 54% (n = 15) para los métodos A y B, respectivamente. La pendiente de los
Los ensayos de RT-qPCR para SARS-CoV-2 se realizaron con un instrumento CFX96 RealTime
estándares para Φ 6, los ensayos CDC N1 y N2 fueron - 3,34, - 3,07 y - 3.01. Los valores de
PCR (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Mezclas de reacción (25 μ L) consistió en 12,5 μ L de
intersección con el eje Y fueron - 41 ( Φ 6), - 39,17 (N1) y - 38,49 (N2). El coef de correlación fi-
PerfecTa qPCR ToughMix (Quantabio, Beverly, MA), 0.1 μ L de 100 μ M cada cebador y sonda, y 2,5 μ
L de plantilla de ADNc. Los cebadores y sondas CDC N1 y N2 utilizados en este estudio se muestran
cient R 2) Los valores para estos ensayos fueron 0,996% (N1), 0,991% (N2) y
en tabla 1 . La condición de qPCR para SARS-CoV-2 fue la siguiente: 95 ° C durante 10 min y 45
0,999% ( Φ 6), respectivamente.
ciclos de 95 ° C durante 10 sy 55 ° C durante 30 s ( CDC, 2020b ). La condición de PCR para Pseudomonas
bacteriófago Φ 6 fue de 94 ° C durante 3 min seguido de 35 ciclos de 94 ° C durante 15 sy 60 ° C
durante 1 min con una lectura de placa después del paso de elongación ( Gendron et al., 2010 ). 3.2. Detección de ARN del SARS-CoV-2 en muestras de aguas residuales

Diluciones seriadas de diez veces del plásmido estándar de SARS-CoV-2 o gBlocks para Pseudomonas
bacteriófago Φ 6, obtenidos de IDT (Coralville, IA) se utilizaron para producir curvas estándar. Se Dos de los fi quince (13%) muestras de aguas residuales dieron positivo con los ensayos RT-qPCR,
utilizó agua de grado de biología molecular como controles sin molde. El ampli fi cation ef fi cienciencias MI)como se muestra en Tabla 2 , y ambas eran muestras de aguas residuales sin tratar. Aguas residuales
se calcularon en base a la ecuación: con tratamiento secundario y fi ef nal fl Las muestras de fluidos arrojaron resultados negativos para ARN del
SARS-CoV-2, lo que indica que los procesos de tratamiento de aguas residuales eliminaron el virus hasta
un nivel indetectable ( Tabla 2 ). El 29 de abril de 2020, un agua residual sin tratar de la PTAR A dio
positivo utilizando el ensayo CDC N2. Las muestras de aguas residuales no tratadas recolectadas el 8 de
abril de 2020 dieron positivo con los ensayos CDCN1 y N2. Se encontraron muestras positivas en una
E = 10 ( - 1 / pendiente) - 1. Se incluyeron controles negativos y positivos en cada serie de qPCR y todos
media geométrica de 7,5 × 10 3
los ensayos de qPCR se realizaron por duplicado de acuerdo con las pautas de MIQE ( Bustin y col.,
2009 ).

Tabla 2
Detección de ARN del SARS-CoV-2 en muestras de aguas residuales en el sur de Louisiana.

Ubicación Tipos de muestras Fecha de muestreo Tipo de ejemplo RT-qPCR un Copias / L

Método A (ultra fi filtración) Método B (adsorción-elución)

CDC N1 CDC N2 CDC N1 CDC N2

EDAR A Compuesto 13/01 En fl uent - - - -

Tratamiento secundario - - - -
Ef final fl uent - - - -
02/03 En fl uent - - - -
Tratamiento secundario - - - -
Ef final fl uent - - - -
29/04 En fl uent - 3,1 x 10 3 - -
Tratamiento secundario - - - -
Ef final fl uent - - - -
EDAR B Agarrar 02/03 En fl uent - - - -
Tratamiento secundario - - - -
Ef final fl uent - - - -
08/04 En fl uent 7,5 x 10 3 4,3 x 10 3 - -
En fl uent - - - -
En fl uent - - - -

un Las concentraciones se calcularon como media geométrica a partir del número de copias de ADNc de los dos tubos de qPCR.

- : No detectado.
LOD: 1.0 x 10 3 copias / L para el Método A y 1.7 x 10 2 copias / L para el Método B.
 4
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Figura 1. Detección de ARN del SARS-CoV-2 en aguas residuales y con fi Casos de COVID-19 resueltos en el sur de Louisiana, EE. UU. Los círculos, cuadrados y triángulos representan tipos de muestra, es decir, en fl uente, con tratamiento secundario y fi ef nal fl uent, respectivamente. Los símbolos rojos y azules representan muestras recolectadas de las plantas de tratamiento de

aguas residuales A y B, respectivamente. Los símbolos cerrados y abiertos denotan detecciones positivas y negativas de ARN del SARS-CoV-2, respectivamente. Las gráficas de barras y líneas denotan casos de COVID-19 nuevos y acumulativos, respectivamente, en las parroquias A (rojo) y B (azul) donde se encuentran las respectivas PTAR (A y B). Datos epidemiológicos sobre

con fi Los casos confirmados de COVID-19 en cada parroquia en el estado de Louisiana se recuperaron de los hechos de EE. UU. (https://usafacts.org/ visualizations / coronavirus-covid-19-spread-map /).
 SP Sherchan y col. / Ciencia del medio ambiente total 743 (2020) 140621 5

copias / L del ensayo N1 y 3,1 × 10 3 y 4,3 × 10 3 copias / L del ensayo de N2. Las muestras de aguas
residuales procesadas mediante el Método A arrojaron resultados positivos, mientras que todas las
muestras dieron resultados negativos utilizando el Método B. Datos epidemiológicos sobre la
contaminación fi Los casos confirmados de COVID-19 en cada parroquia del estado de Louisiana se
recuperaron de los hechos de EE. UU. (https: // usafacts.org/ visualizations /
coronavirus-covid-19-spread-map /). Cuando las muestras dieron positivo al ARN del SARS-CoV-2 en fl (8
de abril para la EDAR B y 29 de abril para la EDAR A), el valor acumulado fi Los casos confirmados de
COVID-19 fueron 6173 (el 29 de abril) en la parroquia A donde se encuentra la PTAR A y 308 (el 8 de
abril) en la parroquia B donde se encuentra la PTAR B Figura 1 ).
4. Discusión
Se han realizado varios estudios para la cuanti fi catión de ARN del SARSCoV-2 en aguas
residuales sin tratar durante la pandemia de COVID-19 en curso ( Tabla 3 ). Sin embargo, se
necesitan más estudios para evaluar la recuperación ef fi eficiencia de los métodos de concentración
de virus existentes para la detección y cuantificación precisas fi catión de ARN del SARS-CoV-2 en
aguas residuales. Para la evaluación de la extracción de ARN y RT-qPCRef fi eficiencia, usamos Pseudomonas
secuencias de los cebadores y las sondas, la sensibilidad del ensayo, los bajos niveles de ARN del
bacteriófago Φ 6. Themean recovery ef fi La eficiencia fue bastante alta, lo que indica que no se
produjo una inhibición o pérdida considerable durante la extracción de ARN y el análisis de
RT-qPCR. Ye et al. (2016) recuperado
18,2 ± 9,5% Pseudomonas bacteriófago Φ 6 usando un ultra optimizado fi método de filtración. Medema
y col. (2020) también usé un ultra fi método de filtración (dispositivo centrífugo Centricon® Plus-70 de
100 kDa) y determinó la recuperación de F-speci fi c RNA fagos por el puri fi Pasos de concentración y
catión utilizando el ensayo de placa, que produjo una recuperación media ef fi eficiencia del 73%. Un
estudio reciente realizado por Ahmed y col., 2020b evaluó siete métodos de concentración diferentes
utilizando un coronavirus sustituto (CoV),
es decir, virus de la hepatitis murina (MHV). La recuperación ef fi Ciencies de MHV usando
Amicon®Ultra - 15 y Centricon®Plus-70 ultra fi Los dispositivos centrífugos de filtración fueron 56,0 ±
32,3% y 28,0 ± 9,10%, respectivamente. Acuerdo-
yendo a Ahmed y col., 2020b , un método de adsorción-extracción con MgCl 2
el pretratamiento fue el más ef fi método ciente para concentrar MHV de
aguas residuales. Sin embargo, dado que el presente estudio se inició antes de que los resultados
presentados en Ahmed y col., 2020b , no pudimos incluir
el método de adsorción-extracción con MgCl 2 pretratamiento.
En este estudio, utilizamos dos métodos de concentración de virus, a saber, ul-
tra fi ltración y adsorción-elución, para la detección de ARN del SARS-CoV-2 en aguas residuales. De
los dos métodos probados, el método A (ultra fi filtración) recuperó con éxito el ARN del SARS-CoV-2
de dos muestras de aguas residuales sin tratar. Ninguno de los secundarios tratados y fi ef nal fl Las
muestras de fluidos dieron positivo para ARN del SARS-CoV-2, lo que indica la eliminación del ARN
del SARSCoV-2 durante los procesos de tratamiento de aguas residuales a un nivel indetectable. Sin
embargo, Randazzo y col. (2020) usó un hidróxido de aluminio
método de adsorción-precipitación y encontró un 11% (2 de 18 muestras) positivo en agua tratada
secundaria con al menos un ensayo de RTqPCR de SARS-CoV-2 ( Tabla 3 ). Otro estudio de Haramoto y
col. (2020) en Japón se detectó ARN del SARS-CoV-2 en el 20% (1/5) de las muestras de aguas
residuales tratadas de forma secundaria utilizando el ensayo N_Sarbeco RT-qPCR ( Tabla 3 ).
Recolectamos muestras de aguas residuales en cuatro meses consecutivos (13 de enero, 3 de
febrero, 2 de marzo y 8 y 29 de abril). Sin embargo, pudimos detectar el ARN del SARS-CoV-2 solo
durante el mes de abril en ambas plantas de tratamiento de aguas residuales mediante el Método A, lo
que sugiere que el rendimiento del Método A para la recuperación del ARN del SARS-CoV-2 en aguas
residuales es superior al del Método B. El en fl muestra de fluido de la WWTP A fue positiva usando el
ensayo CDC N2 RT-qPCR, mientras que, en fl Las muestras de fluidos de la WWTP B dieron positivo
utilizando los ensayos N1 y N2. Medema y col. (2020)
utilizó los tres ensayos de CDC N1, N2 y N3 para la detección de ARN de SARSCoV-2 en muestras
de aguas residuales en los Países Bajos y obtuvo resultados inconsistentes entre los tres ensayos de
RT-qPCR. Un estudio similar en España observó discrepancias entre los ensayos de los CDC para
cuanti fi catión de ARN del SARS-CoV-2 en aguas residuales sin tratar ( Randazzo et al., 2020 ). Esta
inconsistencia entre los resultados del ensayo RT-qPCR podría deberse a varios factores, incluidas las
SARS-CoV-2 en las aguas residuales y el error de submuestreo ( Ahmed y col., 2020a ; Li et al., 2020 ; Randazzo
et al., 2020 ). Varios otros factores también pueden afectar la aparición y detección de patógenos
virales en las aguas residuales, como lluvia, temperatura, tiempo de retención hidráulica, tiempo de
retención de sólidos e inhibidores de PCR ( de Roda Husman et al., 2009 ).
Las concentraciones de ARN del SARS-CoV-2 (3,1 × 10 3 - 7,5 × 10 3 copias / L) en muestras de
aguas residuales en este estudio fue mayor que la reportada por
Ahmed y col., 2020a en Australia (1,9 × 10 1- 1,2 × 10 2 copias / L), pero dos órdenes de magnitud más
bajas que las reportadas por Randazzo y col. (2020)
en España (1,4 × 10 5- 3,4 × 10 5 copias / L) ( Tabla 3 ). Esto podría deberse a las diferencias en la
abundancia de SARS-CoV-2 en las aguas residuales debido al nivel pandémico en la comunidad y las
metodologías para la detección de ARN viral, incluida la concentración de virus, la extracción de ARN y
los ensayos de RT-qPCR.
los fi primera estafa fi El caso de COVID-19 en Luisiana se informó el 9 de marzo de 2020 ( CDC,
2020a ). El 8 y 29 de abril, cuando las muestras dieron positivo al ARN del SARS-CoV-2 en fl uente, el
total fi El número real de casos de COVID-19 fue de 6173 y 308 en parroquias atendidas por las PTAR
A y B, respectivamente. Aunque analizamos muestras de enero, no pudimos detectar el ARN viral en
las aguas residuales hasta abril.
2020. Este resultado sugiere que las concentraciones del ARN viral en las aguas residuales no eran
detectables o estaban por debajo del límite de detección del ensayo en las aguas residuales hasta que
los casos eran altos en el área de estudio. No encontramos evidencia de la presencia de ARN del
SARS-CoV-2 en las aguas residuales del sur Louisiana antes del fi El primer caso de COVID-19 se
informó en la comunidad el 9 de marzo. Solo se analizaron una pequeña cantidad de muestras.

Tabla 3
Informes revisados por pares disponibles actualmente sobre la detección de ARN del SARS-CoV-2 en aguas residuales municipales.

Tipos de Método de concentración de virus Muestra Rango de concentración de muestras para Ensayos de PCR País Referencias
muestras positivo muestras positivas (gen
copias / L)

Extracción de ARN directo de adsorción compuesta Aguas residuales sin tratar 2/9 1,9 x 10 1 - 1,2 x 10 2 RT-qPCR (N_Sarbeco, Australia Ahmed y col.,
y agarra y Ultra fi Compuesto de NIID_2019-nCOV_N) (2020a)
filtración Ultra fi filtración Aguas residuales sin tratar 14/24 2,6 x 10 3 - 2,2 x 10 6 RT-qPCR (CDC N1, N2, N3, E_Sarbeco) los Medema
Países Bajos et al., (2020)
Agarrar Hidróxido de aluminio Aguas residuales sin tratar 35/42 1,4 x 10 5 - 3,4 x 10 5 RT-qPCR (CDC N1, N2, N3) España Randazzo
adsorción-precipitación Tratamiento secundario 2/18 segundo LOQ: 2,5 x 10 5 et al., (2020)
Tratado terciario 0/12 N/A

Precipitación compuesta de PEG / dextrano Aguas residuales sin tratar 6/12 DAKOTA DEL NORTE RT-qPCR (RdRp), PCR anidada (ensayos ORF1ab Italia La Rosa et al.,
y S) (2020)
Agarrar Vórtice de membrana electronegativa Aguas residuales sin tratar 0/5 N/A RT-qPCR (N_Sarbeco, Japón Haramoto
(EMV) y extracción de ARN directa por Tratamiento secundario 1/5 2,4 x 10 3 NIID_2019-nCOV_N, CDC N1, N2), PCR et al., (2020)
adsorción agua de rio 0/3 N/A anidada (ensayos ORF1a y S) RT-qPCR
Compuesto Ultra fi filtración y Aguas residuales sin tratar 2/7 3,1 x 10 3 - 7,5 x 10 3 (CDC N1, N2) Estados Unidos Este estudio

y agarre Adsorción-elución usando Tratamiento secundario 0/4 N/A

membrana electronegativa Ef final fl uent 0/4 N/A

ND: No determinado; NA: No disponible; LOQ: límite de cuanti fi catión.

6 SP Sherchan y col. / Ciencia del medio ambiente total 743 (2020) 140621
de dos EDAR, y en este estudio solo se utilizaron dos métodos de concentración de virus. Además,
algunas de las muestras fueron muestras al azar recolectadas en un momento en el que los niveles
de ARN viral podrían haber sido bajos en las corrientes de aguas residuales. Por lo tanto, parece
prudente analizar más muestras de aguas residuales y evaluar el rendimiento de varios otros
métodos de concentración, incluido el método de adsorción-extracción ( Ahmed y col., 2020b ) y
ensayos moleculares utilizando PCR digital de gotitas. En resumen, detectamos ARN del
SARS-CoV-2 en muestras de aguas residuales no tratadas en el sur de Luisiana, EE. UU. fi método
de filtración. Este es el fi Primer estudio de prueba de concepto que informa la detección de ARN del
SARS-CoV-2 en aguas residuales en Norteamérica, incluidos los EE. UU. Se necesitan más estudios
para mejorar los métodos de concentración y los ensayos moleculares para una detección más
sensible del ARN del SARS-CoV-2 en las aguas residuales hacia la aplicación de un enfoque
epidemiológico basado en aguas residuales para la vigilancia centinela de COVID-19 a nivel
comunitario.
Declaración de contribución de autoría de CRediT
Samendra P. Sherchan: Conceptualización, Metodología, Validación, Análisis formal, Redacción
- borrador original, Redacción - revisión y edición, Supervisión, Adquisición de fondos. Shalina
Maal-Bared, R., Bastian, R., Bibby, K., Brisolara, K., Gary, L., Gerba, C., Olabode, L., et al.,
Shahin: Metodología, Validación, Análisis formal, Redacción - borrador original. Lauren M. Ward: Metodología,
Redacción - borrador original. Sarmila Tandukar: Validación, Redacción - borrador original. TiongG.
Aw: Escritura: revisión y edición. Bradley Schmitz: Revisión y edición de escritura. Warish Ahmed: Escritura:
revisión y edición. Masaaki Kitajima: Validación, visualización, recursos, redacción: revisión y edición.
Declaración de intereses en competencia
Los autores declaran no contra fl tic de interés.
Expresiones de gratitud
Esta investigación fue apoyada parcialmente por las subvenciones de la Junta de Regentes
LEQSF (2018-21) -rd-a-21 y LEQSF (2019-23) -ENH-DE-15 a la Dra. Samendra Sherchan y la
Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) a través de la Promoción de la
Investigación Internacional Conjunta (Fomento de la Investigación Internacional Conjunta (B))
GrantNumber JP18KK0270. Los autores desean agradecer a los gerentes de planta de dos plantas de
tratamiento de aguas residuales anónimas en el sur de Louisiana por su colaboración.
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