Análisis de la unión de la toxina Cry11Bb1 de bacillus

thuringiensis subesp. Medellín a vesículas del epitelio en

borde de cepillo del mosquito Aedes aegypti
César Segura, Michael J. Adang, Sergio Ordúz

Resumen

Las proteínas Cry11 son producidas por Bacillus thuringiensis, estas son potentes toxinas
insecticidas contra larvas de mosquitos y su modo de acción se cree que es similar al de las
toxinas del tipo Cry1, las cuales interactúan con el intestino medio de larvas de lepidópteros. En
este trabajo, se estudió la interacción de la toxina de 94 kDa Cry11Bb de Bacillus thuringiensis
subesp. medellin con el epitelio intestinal de larvas del mosquito Aedes aegypti utilizando vesículas
de la membrana en borde de cepillo (VMBC). Un intermediario de la protoxina Cry11Bb de 68 kDa,
y su forma activa 30/35 kDa se marcaron con Iodo-radioactivo e incubaron con las VMBC del
mosquito. La protoxina marcada (125I-68 kDa) interactuó específicamente con las vesículas y los
experimentos de saturación en presencia de cantidades crecientes de vesículas mostraron que la
interacción vesícula-125I-68 kDa fue saturable en el rango entre 10 a 80 ?g de VMBC. En
contraste, la toxina marcada (125I-30/35 kDa) no mostró ni unión específica, ni saturabilidad en
la interacción. Adicionalmente, la toxina fue susceptible al ataque de las proteasas presentes en
las vesículas y mediante la técnica de dynamic Light scattering, se evidenció que la toxina se
presenta como un agregado proteico. Los resultados sugieren que la protoxina Cry11Bb de 68 kDa
podría determinar la especificidad de la interacción y después de la unión ésta ser procesada hacia
una forma funcional de 30/35 kDa capaz de interactuar con los lípidos de la membrana y generar,
mediante la formación de poros, el desbalance osmótico que lleva a la muerte a las larvas de
mosquitos.

Iatreia: palabra griega (ιατρεια) que significa medicina o curación. Forma parte de

muchos vocablos médicos españoles como iatrogénico, pediatría, fisiatría y psiquiatría.

Clasificada en la categoría A2 según el Índice Bibliográfico Nacional de Colciencias -

Publindex II Actualización 2009.

Expresión de toxinas activas para larvas de mosquito por

una cepa nativa de Asticaccaulis excentricus
Magally Romero, Flor M. Gil, Sergio Ordúz

Resumen
El control de mosquitos con insecticidas biológicos, como las toxinas producidas por
especies del género Bacillus ha sido usado ampliamente en muchos países. Sin
embargo, la rápida sedimentación de éstas las coloca fuera del alcance de la zona de
alimentación de las larvas de mosquito. Con el propósito de resolver este problema se
ha propuesto clonar los genes de dichas toxinas en bacterias acuáticas que son capaces
de vivir y multiplicarse en la parte superior de la columna de agua, donde se alimentas
los mosquitos anofelinos. Se escogieron dos cepas de la bacteria acuática Asticaccaulis
excentricus para expresar los genes de la toxina binaria de B. sphaericus y el gen
cry11Bb de B. thuringiensis subesp. Medellín clonados en un vector de expresión
adecuado. En experimentos de alimentación se encontró que larvas de las especies
Culex quinquefasciatus, Aedes aegypti y Anopheles albimanus fueron capaces de
sobrevivir en una dieta basada exclusivamente en esta bacteria gram negativa. Las
células de A. excentricus recombinante fueron capaces de expresar ambos genes, pero
solamente la cepa expresando los genes de la toxina binaria de B. sphaericus fue tóxica
para larvas de mosquito. Extractos de proteasas de A. excentricus no degradaron la
toxina Cry11Bb, lo que indica que es otro el mecanismo que interfiere con la expresión
de la toxicidad de la toxina Cry11Bb en esta bacteria recombinante. Los experimentos
de flotación mostraron que A. excentricus recombiante se mantiene en la parte superior
de la columna de agua al igual que las cepas nativas, y por más tiempo que las cepas de
Bacillus.

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Escalamiento para la producción de un biopesticida a partir

de B. thuringiensis subsp. israelensis en biorreactores de 20
y 200 Litros
Andrés González, Alexandre Restrepo, Sergio Ordúz

Resumen
Bacillus thuringiensis es una bacteria gram positiva esporulada que en fase estacionaria
expresa algunas endotoxinas, contra un amplio espectro de larvas de insectos. Para
desarrollar un biopesticida con base en B. thuringiensis que sea competitivo localmente
es necesario generar la tecnología necesaria para su producción masiva, por esta razón
el objetivo del trabajo fue escalar el proceso para la producción de B. thuringiensis
basándose en el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno corregido por
presión (KLap) partiendo de un biorreactor de 20 litros hasta llegar a un biorreactor de
200 litros.

Para llevar a cabo este objetivo se realizó en primer lugar una evaluación del KLa a
diferentes velocidades de agitación y flujos de aire por el método dinámico con el fin de
obtener un modelo matemático que relacionara las variables anteriores. Se realizaron
diferentes fermentaciones en un biorreactor de 20 litros con 11 litros de medio de
cultivo utilizando B. thuringiensis subesp. israelensis. La velocidad de agitación y el
flujo de aire se fijaron con base en un diseño factorial 22 con punto central realizando
una repetición por cada punto del diseño, a continuación se realizaron dos
fermentaciones adicionales por fuera del diseño para corroborar los resultados. Las
fermentaciones de mayor escala se realizaron en un biorreactor de 200 litros con 110
litros de medio de cultivo, la velocidad de agitación y el flujo de aire se fijaron con base
en los resultados obtenidos en las fermentaciones de 11 litros en condiciones de baja,
media y alta transferencia de oxígeno. Las variables que se cuantificaron para
determinar la respuesta fisiológica del microorganismo fueron la concentración de
biomasa, esporas y la toxicidad contra larvas de tercer estadio de Aedes aegypti.

Se encontró una relación de aumento lineal entre la velocidad específica de crecimiento

y el KLap tanto en las fermentaciones de 11 como en las de 110 litros, llegando a
valores de 0.65 h-1en KLap de 135 atm*h-1. Se halló también una relación hiperbólica
entre la concentración de biomasa y el KLap, el valor máximo de biomasa fue 4.75 gr*l-
1 en 125 atm*h-1. No se logró detectar un efecto del KLap sobre la concentración de
esporas, debido a la variabilidad de los resultados obtenidos. El tiempo total del proceso
presentó una disminución lineal al aumentar el KLap en ambas escalas. La toxicidad del
ingrediente activo presentó una disminución exponencial por debajo de 40 atm*h-1.
Todos los resultados sugieren un KLap de 125 atm*h-1 para producción industrial de B.
thuringiensis subesp. israelensis debido que en este punto se alcanzó la máxima biomasa
y la concentración de esporas, tiempo total del proceso y toxicidad se mantuvieron en
valores aceptables.
Procesamiento proteolítico de la toxina Cyt1Ab1 producida
por Bacillus thuringiensis subespecie Medellín
Elizabeth Escobar, César Segura, Magnolia Vanegas, Manuel Elkín Patarroyo, Sergio Ordúz

Resumen

Bacillus thuringiensis produce d1 endotoxinas que requieren activación proteolítica para

ser activas. La activación de la toxina citolítica de 28 kDa (Cyt1Ab1) de B.
thuringiensis subesp. Medellín con tripsina, quimotripsina y extractos intestinales de
larvas del mosquito Culex quinquefasciatus fue analizada. La toxina Cyt1Ab1 de B.
thuringiensis subsp. medellin fue procesada por todas las proteasa evaluadas a
fragmentes entre 23 y 25 kDa, mientras que el procesamiento de la toxina Cyt1Aa1
produjo fragmentos entre 22.5 y 24.5 kDa. La toxina Cyt1Ab1 fue procesada
preferencialmente in vitro en un pH de 12, produciendo un fragmento de 25 kDa cuando
se trató con extractos intestinales de larvas de mosquito, y resultados similares se
obtuvieron cuando la toxina fue activada in vivo por larvas de C. quinquefasciatus. La
toxina solubilizada y los fragmentos resistentes a la acción de las proteasas generados
en los experimentos in vitro, demostraron actividad hemolítica, pero no mosquitocida.
La secuencia amino terminal del fragmento tratado con extractos intestinales de C.
quinquefasciatus indica que el sitio de corte está localizado entre Lys31 y Asp32,
generando una proteína con secuencia amino Terminal de DDPNEKNNHNS; mientras
que la toxina tratada con tripsina mostró un sitio de corte entre Leu29 y Arg30, y la
tratada con quimotripsina entre Arg30 and Lys31.

Iatreia: palabra griega (ιατρεια) que significa medicina o curación. Forma parte de

muchos vocablos médicos españoles como iatrogénico, pediatría, fisiatría y psiquiatría.

Clasificada en la categoría A2 según el Índice Bibliográfico Nacional de Colciencias -

Publindex II Actualización 2009.

 
39 Procesamiento y unión de la toxina Cry11Bb del
Bacillus thuringiensis subsp. Medellín al intestino
de larvas de mosquitos
Sergio Orduz1, César Segura2, Lina Ruiz3,
Michael Adang4, Fanny Guzmán5, Manuel Patarroyo6
PALABRAS CLAVE
B. THURINGIENSIS
TOXINA CRY11BB
MOSQUITO
PROCESAMIENTO
UNIÓN
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
La proteína Cry11Bb (94 kDa) es producida por B. thuringiensis subsp. Medellín.
El modo de acción de las toxinas Cry incluye el procesamiento proteolítico y la unión de
la toxina a receptores específicos sobre la superficie del intestino de las larvas de los
insectos susceptibles. Después de unida, la toxina forma poros de baja selectividad sobre
la superficie de la membrana apical de las células intestinales, produciendo un desequilibrio
osmótico que lleva a la destrucción celular y consecuente muerte de la larva (1). Los
objetivos de esta investigación fueron: caracterizar el procesamiento de la proteína
Cry11Bb (94kDa) y analizar la unión de ésta proteína a los intestinos de las larvas de los
mosquitos suceptibles C. quinquefasciatus, A. aegypti y A. albimanus.
METODOLOGÍA
El procesamiento proteolítico de la protoxina Cry11Bb se caracterizó mediante
electroforesis y secuencia del extremo amino de los fragmentos generados. La capacidad
de unión de la proteína se analizó mediante ensayos de unión con la toxina radiomarcada
y vesículas preparadas a partir de larvas completas de los mosquitos, por ligand blot e
inmunohistoquímica usando secciones de tejido larval.
RESULTADOS
El procesamiento proteolítico de la protoxina Cry11Bb de 94 kDa indica la
formación de fragmentos de 30 y 35 kDa que forman el complejo 30/35 kDa, a través
de un fragmento de 68 kDa (2). Tanto 30/35 kDa como 68 kDa fueron prepurificados
y aislados. Los resultados de los ensayos de unión sugieren que sólo la forma de 68 kDa
podría interactuar específicamente con las vesículas. La toxina se localizó en la membrana
apical del intestino medio de las larvas. Varias proteínas de las vesículas reconocieron el
fragmento de 68 kDa.
CONCLUSIONES
La toxina Cry11Bb (94 kDa) se procesa en fragmentos de 30 y 35 kDa a través
de un fragmento de 68 kDa (2). El fragmento de 68 kDa interactúa específicamente con
las vesículas de las larvas de los mosquitos. El sitio primario de acción de la toxina Cry11Bb
es la membrana apical del intestino medio. Se sugiere la presencia de receptores para la
toxina Cry11Bb en el intestino de los mosquitos.
BIBLIOGRAFÍA
1. SCHNEPF E, CRICKMORE N, VAN RIE J, LERECLUS D, BAUM J, FEITELSON J, et al.
Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol Mol Biol Rev 1998;
62: 775-797.
2. SEGURA C, GUZMÁN F, PATARROYO ME, ORDUZ S. Activation pattern and toxicity
of the Cry11Bb1 toxin of Bacillus thuringiensis subsp. Medellín. J Invertbr Pathol
2000; 76: 56-62.