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International Dairy Journal 18 (2008) 1090-1096

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Revista Internacional de Lechería

página web de la revista : w w w .e lse vi e r .c om /l oc a te /i da ir yj

Determinació n de los efectos inducidos por el calor en la distribució n del

tamañ o de las partículas de las micelas de caseína mediante dispersió n de luz
diná mica y aná lisis de seguimiento de nanopartículas
Thu Tran Le a,b, Pieter Saveyn a, Hoang Dinh Hoa b, Paul Van der Meeren a,*
a
Universidad de Gante, Facultad de Ingeniería de Biociencias, Grupo de Tecnología de Partículas e Interfacial, Coupure Links 653, B-9000 Gent, Bélgica
b
Universidad Tecnológica de Hanoi, Instituto de Biotecnología y Tecnología Alimentaria, 1-Dai Co Viet, Hanoi, Vietnam

artículosenforma
abstracto
ció n
El cambio en la distribució n del tamañ o de las partículas de las dispersiones micelares de caseína
Historia del artículo:
inducido por el calentamiento, tanto en ausencia como en presencia de proteínas de suero, se investigó
Recibido el 14 de noviembre de 2007
Recibido en forma revisada el 19 de
mediante dos té cnicas. Mientras que la dispersió n diná mica de la luz (DLS) es una té cnica de conjunto
junio de 2008 Aceptado el 21 de junio de que intenta recuperar una distribució n del tamañ o de las partículas a partir de la señ al combinada de
2008 todas las partículas presentes en la muestra, el aná lisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)
investiga la difusió n de partículas individuales. Tanto el DLS como el NTA indicaron que el
calentamiento de las dispersiones micelares de caseína en presencia de proteínas de suero dio lugar a
una distribució n bimodal. Mientras que el modo de diá metro pequeñ o no se vio afectado de forma
significativa por el calentamiento, se obtuvo un modo adicional de diá metro grande. Esta observació n
indica que el aumento del tamañ o medio de las partículas es principalmente una consecuencia de la
agregació n micelar de la caseína, que en sí misma es una consecuencia má s de la deposició n de
proteínas de suero de leche inducida por el calor en las micelas de caseína.
2008 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.

Autor correspondiente. Tel.: þ 3 2 9 264 60 03; fax: þ 3 2 9 264 62 42.

1. Introducció n Dirección de correo electrónico: paul.vandermeeren@ugent.be (P. Van der Meeren).

La leche es una dispersió n coloidal que contiene micelas de

caseína con diá metros en el rango de 50-300 nm (Walstra,
Wouters, & Geurts, 2006). Varios estudios han utilizado la
dispersió n diná mica de la luz (DLS) para medir la distribució n del
tamañ o de las micelas de caseína (Anema, 1997; Anema,Lowe,&
Stockmann, 2005; Horne, 1984) porque su rango de medició n (de
5 nm a 5 mm) lo hace especialmente conveniente para medir
partículas submicró nicas (Hupfeld, Holsaeter, Skar, Frantzen, &
Brandl,2006).
Al investigar las dispersiones micelares de caseína en presencia
de proteínas de suero, AnemayLi(2003b) observaron un aumento
del tamañ o medio tras el calentamiento. Dado que
CorredigyDalgleish(1996, 1999), así como
Dalgleish,vanMourikyCorredig(1997), revelaron que la deposició n
de proteínas de suero en las micelas de caseína se producía al
calentar la leche desnatada, se podría suponer que el aumento del
diá metro hidrodiná mico se debía a la deposició n de proteínas de
suero desnaturalizadas. Esta hipó tesis se sostiene ademá s por el
hecho de que Anema y Li (2003b) encontraron una relació n entre
los cambios en el tamañ o de las micelas de caseína y el nivel de
proteína de suero desnaturalizada asociada a las micelas de
caseína, especialmente teniendo en cuenta el alto volumen
especificamente hidratado de las proteínas de suero coaguladas
por calor, que, segú n Rojas,Goff,Senaratne,

Dalgleish, y Flores (1997), puede llegar a 10 L kg-1 de proteína
para la b-lactoglobulina desnaturalizada por calor.
Por otro lado, la agregació n de micelas de caseína
inducida por el calor, que tambié n se denomina coagulació n
por calor, podría proporcionar una explicació n alternativa
para el aumento observado del diá metro hidrodiná mico. En
este contexto, AnemayLi(2003a) mencionaron que no es
posible determinar si la asociació n de la proteína del suero
en sí misma influye en el tamañ o de la micela de caseína o si
la agregació n micelar causó el aumento del tamañ o de la
micela a medida que la asociació n progresaba. Ademá s, el
aumento del tamañ o medio de las partículas podría deberse
también a la agregació n de las proteínas de suero
desnaturalizadas en partículas grandes. De hecho, Sharma,
Haque y Wilson (1996), así como HaqueySharma(1997),
0958-6946/$ - see front matter © 2008 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.
doi:10.1016/j.idairyj.2008.06.006
observaron que se formaban agregados de b-lactoglobulina
de gran tamañ o (incluso de tamañ o micrométrico) a 70 ◦C y má s.
Recientemente, se ha introducido una nueva técnica de
dimensionamiento de nanopartículas que permite visualizar las
partículas a nanoescala en los líquidos de forma individual.
MalloyyCarr(2006) informaron de que esta técnica de aná lisis de
seguimiento de nanopartículas (NTA) tiene la capacidad de medir
diá metros en el rango de 10-600 nm. Dado que esta técnica
permite la visualizació n y el seguimiento de partículas individuales
o agregados, parece ser ideal para obtener una mejor comprensió n
del mecanismo que causa el aumento del tamañ o medio de las
dispersiones micelares de caseína calentadas en presencia de
proteínas de suero.
El primer objetivo de este estudio era validar la técnica NTA
para aplicaciones lá cteas. Para ello, se utilizaron tanto la NTA
como el DLS para caracterizar la distribució n del tamañ o de las
micelas de caseína en
 T. Tran Le et al. / International Dairy Journal 18 (2008) 1090-1096
Tabla 1
Distribució n del tamañ o de las partículas de dos muestras comerciales de leche
desnatada UHT diluida en tampó n Ca- imidazol (pH 6,55), determinada por
dispersió n diná mica de la luz (DLS) y aná lisis de seguimiento de nanopartículas
(NTA). Los valores medios y las desviaciones está ndar se basan en tres ré plicas
Muestra Diámetro hidrodinámico Percentileb (nm)a Diámetro Modalmedio (nm)b (nm)bFoods (Deventer, Países Bajos). El polvo se había fabricado
ScatteringDispersión D10D50 D90
ángulo ¼ 150◦ ángulo ¼ 90◦ ((nm)nm)(nm)(nm)
A186.3 3 213.5 2.3 133 13 206 9 287 15 222 18 206 13
B192.0 2.4 216.8 2.2 156 14 225 13 312 6 230 20 228 12
a
Resultados del DLS (200 veces diluido).
b
Resultados del NTA (6400 veces diluido).
La leche desnatada procesada a temperatura ultra alta (UHT), así
como los cambios en la distribució n del tamañ o de las micelas de
caseína tras el tratamiento té rmico, tanto en presencia como en
ausencia de proteínas de suero. Ademá s, queríamos encontrar una
respuesta a la pregunta de si el aumento del tamañ o medio de las
partículas se debía a la propia deposició n de proteínas del suero o
a la agregació n micelar de caseína concomitante. Para ello, se
optimizó la composició n del sistema modelo con el fin de
promover las interacciones de las proteínas lá cteas inducidas por
el calor, combinando un mayor contenido proteico global con una
proporció n de proteína de suero y caseína má s alta que la que se
encuentra normalmente en la leche (TranLeetal.,2007).
2. Materiales y mé todos
2.1. Materiales
Se compraron dos productos diferentes de leche desnatada
tratada directamente con UHT en supermercados belgas. Segú n el
fabricante, contenían un 3,3% de proteínas y un 4,8% de hidratos
de carbono, mientras que el contenido en lípidos era del 0,05%.
Las muestras para los experimentos de dispersió n de la luz se
prepararon dispersando las muestras de leche desnatada en un
tampó n Ca-imidazol que contenía
Número de contador
10
20 mM de imidazol, 5 mM de CaCl2$H2O, 30 mM de NaCl y 1,5 mM
de NaN3 segú n Anema (1997). El pH se ajustó a 6,55 utilizando
HCl 1 M.
El fosfocaseinato nativo en polvo se obtuvo de Friesland Dairy
mediante microfiltració n de leche desnatada sin calentar a 50 ◦C,
utilizando una membrana de 0,2 mm, hasta alcanzar un contenido
de proteínas del 11%, seguido de un secado por aspersió n. El paso
de microfiltració n elimina una gran parte de las proteínas del
suero, mientras que deja la composició n de la solució n salina
prá cticamente igual a la de la leche. El aná lisis Kjeldahl reveló que
este polvo micelar de caseína contenía un 63,0% de proteínas, y la
electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) indicó que el 98,4%
de la proteína total estaba formada por caseínas, mientras que só lo
había un 1,6% de proteína de suero. El contenido de humedad y
cenizas se determinó por secado hasta peso constante a 102 ◦C y
por incineració n a 525 ◦C, y arrojó valores de 5,6% y 8,47%,
respectivamente.
El polvo de aislado de proteína de suero se obtuvo de Davisco
Foods International Inc. (BiPRO®, Le Sueur, MN, USA). Contenía
un 92,6% de proteínas (por aná lisis Kjeldahl), un 1,6% de cenizas
(por incineració n a 525 ◦C) y un 5,0% de humedad (por pérdida de
peso a 102 ◦C).
2.2. Preparación de la muestra
Para obtener una dispersió n micelar de caseína con un 11% de
proteína, se mezclaron 1,732 g de caseína en polvo con 0,02% de
NaN3 en agua destilada hasta un total de 10 mL y se agitó durante
la noche, restaurando así la dispersió n micelar de caseína original
microfiltrada. Se preparó una solució n madre de aislado de proteína
de suero que contenía un 11% de proteína añ adiendo 1,188 g de
BiPRO® en polvo en tampó n Ca-imidazol (pH 6,55) hasta un total de
volumen de 10 mL.
2.3. Tratamiento térmico
Se mezcló una dispersió n micelar de caseína al 11% (1 mL) con 0,5
mL de solució n madre de aislado de proteína de suero (11%) y se
ajustó a un total de

20
A
15

10

0
0170
349 527 706 885
Diámetro (nm)
Número de contador

20
B
15

10

0 0170
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10 349 527 706 885
Diámetro (nm)

Fig. 1. Distribuciones de diá metro ponderadas en nú mero obtenidas a partir del aná lisis de seguimiento de nanopartículas de un vídeo de muestras de leche
desnatada A y B, respectivamente.
 60
El diá metro hidrodiná mico medio ponderado, también
% en la clase

0 minutos
A 1 minuto
denominado diá metro medio z, de las micelas de caseína se derivó
5 minutos del aná lisis cumulante mediante el software Automeasure
40 15 minutos (Malvern Instru- ments, Malvern, Reino Unido). Se seleccionó el
aná lisis de mínimos cuadrados no negativos (NNLS) para obtener
una distribució n del tamañ o de las partículas.
20
2.5. Análisis de seguimiento de nanopartículas

Los experimentos de aná lisis de seguimiento de nanopartículas

0
1 10 100 100010000 (NTA) se realizaron utilizando un sistema de microscopio digital
Diámetro (nm) LM10 (NanoSight, Salisbury, Reino Unido). Se introdujo una
pequeñ a cantidad de la muestra diluida en la cá mara mediante una
60 jeringa. Las partículas de la muestra se observaron con el
0 minutos microscopio digital. Las imá genes de vídeo del movimiento de las
B
% en la clase

1 minuto partículas en movimiento browniano se analizaron con el software

5 minutos de aná lisis de imá genes NTA, versió n 1.3 (B196) (NanoSight). Cada
40 15 minutos
clip de vídeo se capturó durante 30 s. El umbral de detecció n se fijó
en 100, mientras que el salto má ximo de la partícula y la longitud
mínima de la pista se fijaron en 10 en el software NTA.

20
0
1 10 100 1000
Diámetro
(nm)
Fig. 2. Distribució n del tamañ o las partículas ponderada por intensidad de las
dispersiones ac uosas de
micelas de caseína en polvo en funció n del tiempo de calentamiento a 80 ◦C en
ausencia (A) y presencia (B) de proteínas de suero.
volumen de 2 mL con tampó n Ca-imidazol. Las mezclas se
calentaron durante 1, 5 o 15 minutos en un bañ o de agua a 80 ◦C y
posteriormente se enfriaron bajo el agua del grifo.
2.4. Dispersión dinámica de la luz
Las mediciones de dispersió n diná mica de la luz se
realizaron por triplicado a una temperatura de 25 ◦C durante 120 s
con un Espectró metro 100SM (Malvern Instruments, Malvern,
Reino Unido) que contenía un lá ser He-Ne de 15 mW. Antes de la
medició n, las muestras se diluyeron 1:200 con tampó n Ca-
imidazol (pH 6,55). El procesamiento de los datos se llevó a cabo
con un correlacionador multi 8 bits Malvern K7032. La intensidad
armó nica
Función de autocorrelación
3. Resultados y discusió n
3.1. Distribución del tamaño de las micelas de caseína de la leche
desnatada
10000 Para investigar la distribució n del diá metro de las micelas de
caseína, se utilizaron dos productos comerciales de leche
desnatada UHT. Las muestras se diluyeron 1:200 o 1:6400 en
tampó n Ca-imidazol (pH 6,55) antes de la medició n por DLS y NTA,
respectivamente. De la tabla1 se desprende que
Es evidente que se obtuvieron resultados muy similares para
ambas muestras de leche desnatada. Comparando la DLS con la
NTA, los valores de la mediana (D50), así como el diá metro medio
de las partículas en estos productos comerciales de leche
desnatada obtenidos por la NTA fueron muy similares a los valores
de la media z medidos por la DLS a un á ngulo de dispersió n de 90◦,
lo que indica que ambas técnicas pueden utilizarse para medir la
distribució n del tamañ o micelar de la caseína de la leche
desnatada.
Se observó una gran diferencia al considerar la
reproducibilidad. Mientras que el coeficiente de variació n de la
DLS fue de só lo un 1%, en el caso de la NTA se situó en torno al
10%. Esto ú ltimo es una consecuencia ló gica de la gran diferencia
en el nú mero total de partículas detectadas: mientras que millones
de partículas contribuyen a la funció n de autocorrelació n de la
DLS, só lo unos cientos de partículas fueron rastreadas durante un
vídeo de 30 s en la NTA. Una clara ventaja de la NTA es que no só lo
proporciona informació n cuantitativa, sino también visual. Así, los
insertos de la Fig. 1 muestran que las micelas de caseína está n bien
dispersas y resueltas espacialmente dentro del campo de visió n.

Los resultados de la DLS indicaron que el á ngulo de dispersió n

tenía algú n efecto sobre el diá metro hidrodiná mico de las micelas
1 5,5%CN - 0min de caseína. Esto se debe al hecho de que las partículas má s grandes
5,5%CN - 15min
5,5%CN+2,75%WP - 0min
dentro de una muestra polidispersa se dispersan preferentemente
5,5%CN+2,75%WP - 1min en la direcció n hacia delante y, por lo tanto, quedan má s
5,5%CN+2,75%WP - 5min representadas cuando se reduce el á ngulo de dispersió n
5,5%CN + 2,75%WP - 15min (VanderMeeren,Bogaert,Vanderdeeleny Baert, 1992).

0 6000
0.1
20004000

0.01
 ño de las ó n de tamañ os en una dispersió n acuosa de micelas de caseína en
3.2.
800010000 partículas de polvo se investigó mediante DLS y NTA. La Fig. 2A muestra que el
Dist
las dispersiones diá metro micelar de la caseína no cambió en ausencia de la
rib
micelares de proteína de suero añ adida al calentarla a 80 ◦C durante 15 minutos.
uci
caseína De hecho, las funciones de autocorrelació n (Fig. 3, símbolos abiertos)
ón
del antes y despué s del calentamiento apenas pueden discernirse.
ta La Ademá s, tanto las distribuciones del tamañ o de las partículas,
ma distribuci como las fotografías (Fig.4) de las muestras diluidas
Tiempo no revelan ninguna diferencia significativa. Por otra parte, la Fig.
(µs)
2B indica claramente que, en presencia de proteínas de suero, la
Fig. 3. Funciones de autocorrelació n de las dispersiones micelares de caseína en ausencia distribució n del tamañ o micelar de la caseína cambió de
(símbolos abiertos) y en presencia (símbolos rellenos) de proteínas de suero en funció n monomodal (antes del calentamiento) a bimodal tras el
del tiempo de calentamiento a 80 ◦C.
calentamiento, lo que sugiere que la caseína
 Número contado
20
A
15

10

0
0 195 400 606 811
Número contado

20
B
15

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0
0 195 400 606 811
Número contado

20
C
15

10

0
0 195 400 606 811
Número contado

20
D
15

10

0
0195
400 606 811
Diámetro
(nm)

Fig. 4. Distribució n del diá metro ponderado en nú mero e imá genes de dispersiones micelares de caseína sin proteínas de suero añ adidas con (A) sin calentamiento y con
calentamiento a 80 ◦C durante (B) 1 min,
(C) 5 min y (D) 15 min, capturados por el aná lisis de seguimiento de nanopartículas.

La agregació n micelar o la agregació n extendida de la proteína de resultados encontrados por Anema y Li (2003b), lo que es una
suero fue inducida por el tratamiento térmico. consecuencia ló gica de la mayor concentració n global de proteínas
La Fig.3 (símbolos cerrados) ilustra que la funció n de
autocorrelació n, cuando se representa en una escala
semilogarítmica, se vuelve cada vez má s curvada al aumentar el
tiempo de calentamiento. La pendiente inicial no se modificó , lo
que apunta al hecho de que el tamañ o de algunas de las micelas de
caseína no se vio afectado, mientras que una fracció n creciente de
partículas de mayor tamañ o surgió al calentar las micelas de
caseína en presencia de proteínas de suero. En la Tabla2, el DLS
indica claramente que el diá metro hidrodiná mico medio aumenta
en gran medida al calentar una dispersió n micelar de caseína
concentrada en presencia de proteínas de suero. De hecho, el
aumento del diá metro fue mucho mayor en comparació n con los
así como la mayor proporció n de proteína de suero a caseína en
nuestro sistema modelo (TranLeetal.,2007): estos autores
observaron un aumento de hasta 30 nm a pH 6,55, mientras que
só lo se informó de un aumento de 10 nm a pH 6,7 en leche
desnatada reconstituida calentada.
Segú n Anema y Li (2003b), el aumento del diá metro medio
podría ser un resultado directo de la deposició n de proteína de
suero o podría ser una consecuencia má s de la agregació n
micelar de caseína resultante. Sin embargo, la primera hipó tesis
debería dar lugar a una distribució n monomodal con un
diá metro modal creciente, lo que no parece ser el caso en
nuestros experimentos, como puede deducirse de las funciones
de autocorrelació n de la Fig. 3. Dado que la Fig. 2B muestra
claramente una distribució n bimodal tras el calentamiento en
presencia de proteínas de suero, la agregació n parece ser una
explicació n mucho má s probable para el aumento observado del
diá metro medio. Sin embargo, la DLS no
Cuadro 2
Diá metro hidrodiná mico obtenido a partir de mediciones de dispersió n de luz diná mica (DLS) con un á ngulo de dispersió n de 150 ◦, así como el diá metro medio
ponderado en nú mero, el diá metro modal y los percentiles de la distribució n de diá metro ponderado en nú mero derivados del aná lisis de seguimiento de nanopartículas
(NTA) para dispersiones micelares de caseína al 5,5% con y sin proteína de suero de leche al 2,75% (n ¼ 3)a

Suero proteín Añ adid Calefac tiem (min) z-Diá metro mediob (nm) Percentilesc Diá metro (nm)c Diá metro (nm)c
de a o: ció n po modal medio
leche D10 (nm) D50 (nm) D90 (nm)
Ningu 0 170,4 1,2x,y 139 17 208 16x,y 301 21 191 18x 212 13x,y
no
,z
1 167,2 2,4y 147 14 221 5x 345 11 197 16x 233 8x,y
5 172,9 1,4x,y 135 15 227 40x 329 40 200 22x 228 31x,y
15 177.2 1.2x 150 15 223 4x 338 8 209 21x 230 5x,y

2.75% 0 162.0 1.6z 134 10 204 12x,y 337 18 175 4x 220 15x,y
1 208.8 0.8w 127 15 209 16x,y 370 19 215 19x 201 14x
5 335.6 1.8v 125 2 158 7y 416 13 217 56x 265 1y
15 389.3 6.9u 104 4 214 9x,y 379 14 223 12x 234 15x,y
a
Los resultados de la prueba de Tukey (intervalo de confidencia del 95%) para las diferencias significativas entre los valores medios de una determinada columna se indican
con letras de superíndice: los valores con la misma letra de superíndice no son significativos.
b
Resultados del DLS.
c
Resultados de la NTA.

no permite discriminar entre la agregació n de micelas de caseína o

(Hupfeld et al., 2006). La NTA, por otro lado, produce
la agregació n de proteínas de suero como causa de la aparició n de
distribuciones de tamañ o de partícula ponderadas por el nú mero,
un segundo modo de mayor tamañ o al calentar las micelas de
que se sabe que son menos sensibles a (un nú mero bastante
caseína en presencia de una gran concentració n de proteínas de
limitado de) partículas de tamañ o excesivo.
suero. La NTA, por otro lado, proporciona informació n visual
directa sobre las partículas de dispersió n. Así, la Fig.5 demuestra
4. Conclusiones
claramente que las partículas má s grandes son, de hecho,
agregados de dispersores separados (es decir, micelas de caseína)
La validez de la técnica NTA para la determinació n de la
y, por lo tanto, proporciona pruebas muy só lidas para la hipó tesis
distribució n del tamañ o de las micelas de caseína se evaluó
de que el aumento del diá metro medio de las partículas debe
comparando los resultados con los obtenidos por DLS. La
atribuirse a la agregació n micelar de caseína inducida por el calor
comparació n de ambas técnicas reveló que la DLS proporciona una
en presencia de proteínas del suero.
estimació n má s reproducible y fiable de la distribució n del tamañ o
Por otro lado, la NTA parecía ser menos apropiada para seguir
de las partículas de muestras amplias y multimodales. Por otro
los agregados grandes y de difusió n lenta, que contienen varios
lado, la NTA proporciona informació n visual directa sobre las
centros de dispersió n. Mientras que en las distribuciones de
partículas submicró nicas y, como tal, es ideal para confirmar el
tamañ o de partícula de la NTA se observó una ligera cola al
inicio de los fenó menos de agregació n. Así, la NTA indicó
calentarse, como puede deducirse del aumento de la fracció n de
claramente que el aumento del diá metro medio en el sistema
partículas mayores de 400 nm en la Fig. 6, no se observó ningú n
modelo estudiado derivado de la DLS se debía a la agregació n
efecto significativo en el diá metro mediano, modal o medio
micelar de la caseína al calentarse en presencia de proteínas de
(Tabla2). Lo má s probable es que esta observació n deba atribuirse
suero.
al hecho de que el software experimenta problemas a la hora de
derivar las huellas de estos objetos complejos a partir de una
Agradecimientos
secuencia de imá genes. Por lo tanto, la informació n sobre la
distribució n del tamañ o de las partículas como tal es mucho
Tran Le Thu agradece el apoyo financiero del Consejo
menos sensible al efecto del calentamiento en comparació n con el
Interuniversitario Flamenco VLIR a través de la beca VLIR-ICP-
DLS. De hecho, la sensibilidad de esta ú ltima técnica se ve
PhD (nú mero de subvenció n: VLIR-UOS 2005.0010). Los autores
favorecida por el poder de dispersió n mucho mayor de los
agregados má s grandes, que exagera su contribució n en el tamañ o
de partícula DLS ponderado por intensidad
 ◦C
Fig. 5. Imá genes detalladas de dispersiones de micelas de caseína en presencia de aislado de proteína de suero con (A) sin calentamiento y (B) con calentamiento a 80 durante
5 minutos, capturadas por el análisis de seguimiento de nanopartículas; las agrupaciones de micelas de caseína inducidas por el calor se indican con flechas.
 Número contado
20
A
15

10

0
0 195 400 606 811
Número contado

20

B
15

10

0
0 195 400 606 811
Número contado

20

15
C

10

0
0 195 400 606 811
Número contado

20

D
15

10

0
0195
400 606 811
Diámetro
(nm)

Fig. 6. Distribució n del diá metro ponderado en nú mero e imá genes de las dispersiones de micelas de caseína en presencia de aislado de proteína de suero con (A) sin
calentamiento y con calentamiento a 80 ◦C durante
(B) 1 min, (C) 5 min y (D) 15 min, capturados por el aná lisis de seguimiento de nanopartículas.

desean agradecer al Sr. Bob Carr (NanoSight Ltd., Inglaterra) y al
Sr. Felix Devreese (Ankersmid NV, Bélgica) su amable ayuda
durante los experimentos del sistema LM10.
Referencias
Anema, S. G. (1997). The effect of chymosin on kappa-casein-coated polystyrene
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