FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS Radicado

PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA

TÍTULO BACTERIAS AMBIENTALES AISLADAS EN SANTIAGO DE CALI: UNA

PROPUESTA APROXIMACIÓN DESDE LA TAXONOMÍA INTEGRATIVA
DATOS DE LA PROPUESTA
Grupo de investigación Grupo de investigación en Microbiología, Industria y Medio
Ambiente (GIMIA)
Línea de investigación Microbiología Ambiental

ESTUDIANTE (S)
Nombre: Laura Isabella Vergara López
Identificació 1006100176
n
Correo: laura.vergara01@usc.edu.co
Teléfono: 3175025663
Nombre: Alejandro Ortiz Díaz
Identificació 1143876463
n
Correo: alejandro.ortiz02@usc.edu.co
Teléfono: 3136746508

DIRECTOR
Nombre: Doris Rosero García
Identificació 37124488
n
Correo: doris.rosero00@usc.edu.co
Teléfono: 3163694537
CODIRECTOR
Nombre: N/A
Identificació
n
Correo:
Teléfono:
 BACTERIAS AMBIENTALES AISLADAS EN SANTIAGO DE CALI: UNA
APROXIMACIÓN DESDE LA TAXONOMÍA INTEGRATIVA

Laura Isabella Vergara López 

Alejandro Ortiz Díaz

Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de:
Microbiólogo

Directora:
Doris Rosero-García
Microbióloga, M.Sc., PhD.

Línea de Investigación:
Microbiología Ambiental
Grupo de Investigación:
Grupo de investigación en Microbiología, Industria y Medio Ambiente 
(GIMIA)

Universidad Santiago de Cali

Facultad de Ciencias Básicas
Programa de Microbiología
Cali, Colombia
2019

Contenido
Resumen........................................................................................................................... 6

Abstract............................................................................................................................. 7

1. Planteamiento de la pregunta o problema de investigación.....................................8

2. Justificación en términos de necesidades y pertinencia........................................10

3. Marco teórico y estado del arte.................................................................................12

3.1 Aspectos taxonómicos de las bacterias ambientales....................................12
3.2 Bacterias aisladas en Plantas de Tratamientos de Lixiviados (PTL) en
Colombia..............................................................................................................13
3.3 Caracteres morfológicos de utilidad en la taxonomía de bacterias...............14
3.4 Taxonomía integrativa....................................................................................18
3.4.1 Antecedentes..............................................................................................18
3.4.2 Definición de taxonomía integrativa y concepto de especie bajo esta
perspectiva...........................................................................................................19
3.4.3 Consideraciones metodológicas para estudios de taxonomía integrativa. 19
3.4.5 Integración de la información......................................................................20
3.4.6 Enfoques integrativos para la delimitación de especies.............................21
3.4.7 Categorías taxonómicas.............................................................................22
3.5 Planta de tratamiento de lixiviados (PTL) ubicada en el Antiguo Vertedero de
Navarro (AVN)......................................................................................................24
4. Objetivos..................................................................................................................... 27
4.1Objetivo General:............................................................................................27
4.2 Objetivos Específicos:....................................................................................27
5. Metodología Propuesta..............................................................................................28
5.1 Trabajo de campo..........................................................................................28
5.2 Trabajo en el laboratorio................................................................................29
5.3 Recopilación de datos....................................................................................30
5.4 Protocolo de taxonomía integrativa para la asignación de la categoría
taxonómica...........................................................................................................30
6. Cronograma de actividades.......................................................................................32

7. Presupuesto................................................................................................................ 33

9. BIBLIOGRAFIA............................................................................................................ 36
Lista de figuras
Pág.
Figura 1. Forma macro y microscópica, borde y elevación de las colonias bacterianas. a)
forma b) morfología c) bordes d) elevación. Modificado de (42)........................................15
Figura 2. Tipos de agrupaciones de las bacterias (cocos): A) diplococos, B)
estreptococos, C) tétrada, D) estafilococos, E) sarcinas. Tomado de López y cols. (40).. 16
Figura 3. Morfología y agrupaciones bacterianas observadas con la tinción de Gram
tomado de García y cols. (44)...........................................................................................17
Figura 4. Sistema de tratamiento de lixiviados, Antiguo Vertedero de Navarro (AVN)
tomado de García 2018 (103)...........................................................................................25
Figura 5. Imagen representativa de las cuatro etapas requeridas para la realización del
estudio. Fuente: elaboración propia..................................................................................28
Figura 6. Ubicación de la Planta de Tratamiento de Lixiviados (PTL) esquema
representativo de las lagunas L3, L4, L5, L6, L7, L8 donde se realizará el muestreo.
Imagen modificada de Google Maps (105)........................................................................29
Lista de tablas
Pág.
Tabla 1. Ejemplos de bacterias con importancia en el campo ambiental (37)...................11
Tabla 2. PRESUPUESTO GLOBAL de la propuesta (en miles de pesos).........................32
Tabla 3. Descripción de los gastos de personal (en miles de $)........................................32
Tabla 4. Descripción de los equipos y software que se planea adquirir o utilizar, costo de
compra o servicio (en miles de $)......................................................................................32
Tabla 5. Materiales Bibliográficos, Publicaciones, insumos, suministros y bibliografía (en
miles de $)......................................................................................................................... 33
Tabla 6. Descripción y justificación de los viajes (en miles de $)......................................33
Resumen

La taxonomía integrativa se define como el uso de una perspectiva múltiple y

complementaria para la delimitación de especies. En el presente estudio se
aislarán bacterias cultivables de seis lagunas que hacen parte de una Planta de
Tratamiento de Lixiviados (PTL) ubicada en el Antiguo Vertedero de Navarro
(AVN). Para cada uno de los aislamientos se obtendrán caracteres de taxonomía
bacteriana tradicional, caracteres moleculares obtenidos de secuencias del ARN
ribosomal (ARNr) de la subunidad 16S (ARNr 16S). y algunos datos ecológicos.
Además, se tomará registro fotográfico de los caracteres relevantes para cada
aislamiento y se diseñará un protocolo de taxonomía integrativa para la asignación
de las siguientes categorías taxonómicas: Especie Descrita (DS, por sus siglas en
ingles), Especie Candidata no Confirmada (UCS, por sus siglas en ingles),
Especie Candidata Confirmada (CCS, por sus siglas en ingles) y Linaje Co-
especifico Profundo (DCL, por sus siglas en ingles). Con el desarrollo de esta
investigación se busca contribuir con el conocimiento sobre la biodiversidad de
bacterias a nivel local y/o nacional y se implementará una metodología que hasta
la fecha no se ha utilizado para la identificación de bacterias ambientales en
Colombia.

Palabras clave: taxonomía integrativa, biodiversidad, bacterias ambientales,

lixiviados

6
Abstract
Integrative taxonomy is defined as the use of multiple and complementary
perspective to delimit species. In the present study, culture bacteria will be isolated
from six lagoons that are part of a Planta de Tratamiento de lixiviados (PTL) at the
Antiguo Vertedero de Navarro (AVN). For each of the isolates traditional bacterial
taxonomy characters, molecular characters obtained from sequences of ribosomal
RNA (rRNA) of the 16S subunit (16S rRNA) will be obtained and some ecological
data. In addition, the photographic record of the relevant characters for each
isolation will be taken and an integrative taxonomy protocol will be designed for the
assignment of the following taxonomic categories: Described Species (DS),
Unconfirmed Candidate Species (UCS), Confirmed Candidate Species (CCS) and
Deep Co-specific Lineage (DCL). With the development of this research, we seek
to contribute knowledge about the biodiversity of bacteria at the local and / or
national level. In addition, a methodology will be implemented that to date has not
been used for the identification of environmental bacteria in Colombia.

Keywords: integrative taxonomy, biodiversity, environmental bacteria, leachate

7
1. Planteamiento de la pregunta o problema de
investigación

Las bacterias son microorganismos unicelulares, se reproducen por fisión binaria y

la mayoría son de vida libre. Taxonómicamente, estos microorganismos
pertenecen al Reino mónera y al dominio bacteria (1). La ciencia que se encarga
de la clasificación de los diferentes organismos se denomina taxonomía (2).
Tradicionalmente, la taxonomía bacteriana se basa en un sistema de
nomenclatura binomial cuyas categorías taxonómicas son de menor a mayor:
especie, género, familia, orden, clase y filo (3). El uso de caracteres morfológicos
(micro y macroscópicos) permite distinguir un morfotipo bacteriano de otro por las
diferencias que estos presentan (4). Además, en la identificación de bacterias es
importante el uso de la coloración de Gram para su clasificación como bacterias
Gram positivas y Gram negativas (5). También se conocen otras herramientas
convencionales como las pruebas bioquímicas que permiten determinar las
características metabólicas de bacterias Gram negativas para la asignación de
género y/o especie (6). Sin embargo estas pruebas han sido diseñadas en su
mayoría para la identificación de bacterias de interés clínico como: Salmonella,
Klebsiella, Enterobacter, entre otras (7). Otros sistemas para la identificación de
bacterias son los equipos automatizados como el VITEK® y el MALDI-TOF. El
sistema VITEK® utiliza tarjetas de identificación y pruebas de sensibilidad a los
antibióticos (AST) donde se inocula el aislamiento bacteriano, se realiza la
incubación y la lectura de cada tarjeta un equipo (8). Por otro lado, MALDI-TOF es
un sistema basado en la espectrometría de masas y permite la detección de
géneros y especies de bacterias y hongos, además también permite identificar
virus (9–11).

Las herramientas mencionadas anteriormente han sido de utilidad para la

identificación de bacterias, sin embargo, tanto las tradicionales como los sistemas

8
automatizados se especializan en la identificación de bacterias de interés clínico
(11–14). El interés de la presente investigación es la identificación de bacterias
aisladas en matrices ambientales, por ejemplo, aquellas que están presentes en
los lixiviados que hacen parte de las plantas de tratamiento. En el mundo existen
entre 5 y 50 millones de especies, de las cuales solo se han caracterizado
alrededor de 1,5 millones (4,15). Para el caso de las bacterias, algunos
investigadores sugieren que solo se ha descrito entre el 1 y 2% de la población
bacteriana (16), lo que evidencia el desconocimiento de la biodiversidad de este
grupo de microorganismos.

Las bacterias son un modelo interesante de estudio porque se considera que son
las que ocupan el primer lugar con el mayor número de especies (17). Sin
embargo, se realizó una búsqueda bibliográfica y no se encontró un listado de
especies bacterianas ambientales para Colombia, lo que muestra que a pesar de
que hace parte de los países mega diversos (18) aún se desconoce cuál es el
número de bacterias aisladas en contextos ambientales. Además, se considera
que para la taxonomía de bacterias sería necesario buscar una alternativa que
permita identificar el mayor número posible de géneros y/o especies. La
taxonomía integrativa es una propuesta taxonómica para la delimitación de
especies con al menos tres líneas de evidencia que idealmente deben ser
complementarias: filo geografía, morfología, genética de poblaciones, ecología,
comportamiento, etc. (19,20). Desde su propuesta formal, los autores consideran
que el enfoque de la taxonomía integrativa es necesario para obtener un mayor
nivel de confianza en la asignación de las categorías taxonómicas (19–21). Por
esta razón, en el presente estudio diseñará un protocolo de taxonomía integrativa
que permita identificar bacterias cultivables aisladas de lixiviados de seis lagunas
que hacen parte de una Planta de Tratamiento de Lixiviados (PTL) ubicada en un
vertedero de la ciudad Santiago de Cali. De esta manera y por primera vez para
Colombia se identificarán bacterias desde la perspectiva de la taxonomía
integrativa.

9
2. Justificación en términos de necesidades y
pertinencia

Colombia es un país mega diverso, al igual que otros como Brasil, China y
Australia contribuyendo con la mayor biodiversidad en el planeta (18). Se conoce
que en Colombia habitan alrededor de 7.835 especies de vertebrados, 20.647 de
invertebrados, 30.736 especies de plantas, 2.160 especies de algas y 1.674
especies de líquenes (22). Sin embargo, a pesar de que las bacterias se
consideran como los organismos más diversos (17) se desconocen muchas de las
especies que habitan en el país (23). Para Colombia, se ha registrado 88 especies
bacterianas (24) algunas de las cuales pertenecen a géneros de importancia
clínica como: Staphylococcus, Pseudomonas, Escherichia, Salmonella,
Streptococcus, Klebsiella, Burkholderia, Nocardia, Rickettsia, entre otros. Con
respecto a las bacterias ambientales algunas de estas pertenecen a los géneros
Streptomyces, Bacillus, Oscillatoria, Pseudomonas, Rhizobium, entre otros (18).

Para Colombia no se conocen datos claros sobre la diversidad de bacterias, una

de las razones para este problema radica en la crisis de la biodiversidad, debido a
diversos factores como la falta de taxónomos, la falta de recursos y de apoyo
institucional para los estudios de taxonomía y los bajos o no existentes índices de
impacto de las revistas que incluyen estos temas (4,25). Las consecuencias de
esta crisis, son la pérdida de la biodiversidad y además muchos de los organismos
se extinguen sin identificarlos (26). Lo anterior causa, no solo un vacío en la
información relacionada con las comunidades microbianas sino también un
estancamiento en la diversidad y finalmente el desconocimiento de las especies
bacterianas (27,28). Además, la falta de información en el campo ambiental, se
puede relacionar con el hecho de que los estudios que se centran en la
caracterización de especies, se enfocan principalmente en las investigaciones
clínicas (29,30).

10
El término taxonomía integrativa fue inicialmente acuñado en dos publicaciones de
manera independiente Dayrat 2005 (19) y Will y cols. 2005 (20).Con el uso de esta
perspectiva taxonómica, se conocen trabajos realizados para la identificación de
hongos Basidiomycota (31) e Insectos como moscas (32). También se conocen
trabajos de taxonomía integrativa para la identificación de ardillas (33), plantas
(34), nemátodos (35), anfibios (36), entre otros. Sin embargo, para el caso
particular de las bacterias sólo se conoce un trabajo de taxonomía integrativa
realizado en el Himalaya con bacterias aisladas de suelo, los autores utilizaron
información de taxonomía bacteriana tradicional y el uso de secuencias del ARN
ribosomal (ARNr) de la subunidad 16S (ARNr 16S) (37). Para el caso de Colombia
no se han realizado este tipo de investigaciones y por ello se considera que el
presente estudio es de importancia porque contribuirá con información sobre la
biodiversidad de bacterias en el país mediante la aplicación de un protocolo que
permita la identificación de bacterias desde la perspectiva de la taxonomía
integrativa.

11
3. Marco teórico y estado del arte

3.1 Aspectos taxonómicos de las bacterias ambientales. La clasificación de

especies se realiza a partir de un sistema de nomenclatura denominado sistema
binomial, el nombre científico consta de dos palabras, la primera corresponde al
nombre genérico y la segunda al nombre específico (38). Dada la gran diversidad
de bacterias ambientales (tabla 1), para su identificación taxonómica se
necesitarían varias herramientas que permitan una buena aproximación para
conocer cuántas y cuales especies están presentes.

Tabla 1. Ejemplos de bacterias con importancia en el campo ambiental tomado de

(39).

Grupo de Género Importancia ambiental

bacterias

Bacterias Pseudomonas Degrada compuestos orgánicos

degradadoras Flavobacterium Degrada proteínas
Zooglea Forma flóculos en plantas de lodos
Clostridium activados
Micrococcus Produce ácidos grasos desde organismos
Methanobacterium en digestor anaeróbico
Methanococcus Producen gas metano desde ácidos grasos
Methanosarcina en un digestor anaeróbico

Bacterias Nitrobacter Oxida compuestos de nitrógeno inorgánico

nitrificadoras Nitrosomonas

Bacterias Bacillus Reduce nitrato y nitrito a nitrógeno gas u

desnitrificadoras Pseudomonas óxido nitroso

Bacterias que Azotobacter Capaces de fijar nitrógeno atmosférico a

fijan nitrógeno Beijerinckia NH3

12
 Bacteria sulfuro Thiobacillus Oxida sulfuro y fierro

Bacterias Chlorobium Reducen sulfitos a sulfuro elemental

fotosintéticas Chromatium

Bacterias de Spherotilus Responsable por formar iodos oxida fierro

fierro Leptothrix

Bacterias Desulfovibrio Involucrada en corrosión de tuberías de

reductoras de Fierro
sulfato

En general las bacterias ambientales se pueden identificar por medio del

aislamiento a partir de diluciones seriadas de las muestras, cuando se obtiene un
cultivo puro es necesario realizar pruebas complementarias para identificar el
género, algunas de estas son las tinciones de Gram y esporas (40). Dicha
identificación es primordial para acceder al conocimiento de la diversidad biológica
(41).

3.2 Bacterias aisladas en Plantas de Tratamientos de Lixiviados (PTL) en

Colombia

Después de cualquier proceso de degradación de residuos con materia orgánica

se obtiene un desecho llamado lixiviado, el cual es el resultante de un conjunto de
desechos sólidos, que son transformados en un fertilizante orgánico con una carga
microbiológica muy alta (42). En las Plantas de Tratamiento de Lixiviados (PTL) en
Colombia se han realizado algunos estudios en donde se han aislado diferentes
microorganismos, entre los cuáles se encuentran las bacterias.

En el relleno sanitario de Girardot (Cundinamarca) se identificó Proteus mirabilis y

se confirmó la ausencia de Salmonella sp. en muestras de lixiviado (43). En San
Pedro (Valle del Cauca) se realizó un estudio de la diversidad de las comunidades
de algas asociadas a un sistema de algas de alta tasa fotosintética para la

13
biorremediación de lixiviados de rellenos sanitarios y se encontraron individuos
representantes del phylum Cyanobacteria pertenecientes a Chroococcus sp. y
Phormidium sp. (44).

En la planta de tratamiento de aguas residuales de la Universidad de Boyacá, se

obtuvieron 16 aislamientos de bacterias oxidadoras de amonio de diferentes
ambientes, con una gran diversidad morfológica, todos los aislamientos
presentaron movilidad y 15 de ellos fueron positivos para la prueba de catalasa
(45).

3.3 Caracteres morfológicos de utilidad en la taxonomía de bacterias

La siembra de bacterias en superficie en un medio sólido permite la formación de

colonias que representan una masa constituida por miles de bacterias. Las
bacterias exhiben ciertas características que permiten su identificación, ya que
pueden presentar diversas formas, colores, tamaños u otros caracteres que
pueden distinguir unas de otras. El tamaño y el aspecto se utilizan como
características diferenciales para determinar morfotipos bacterianos debido a que
estos caracteres son constantes en este nivel de clasificación (1). En algunas
ocasiones se puede presentar un fenómeno de pleomorfismo cuando una misma
especie presenta una morfología variable; esto depende de las condiciones del
cultivo tales como tiempo, presencia de antibiótico, entre otros (46). En la figura 1
se ilustran las diferentes formas que pueden presentar las colonias, la morfología
en la tinción de Gram, las diferencias macroscópicas de los bordes y la elevación
de las colonias bacterianas.

14
Figura 1. Forma macro y microscópica, borde y elevación de las colonias
bacterianas. a) forma b) morfología c) bordes d) elevación. Modificado de (42).

También se conocen diferentes agrupaciones bacterianas como: cadenas

(estreptococos), racimos (estafilococos) o conjuntos de dos (diplococos) (figura 2).

15
Figura 2. Tipos de agrupaciones de las bacterias (cocos): A) diplococos, B)
estreptococos, C) tétrada, D) estafilococos, E) sarcinas. Tomado de López y cols.
(47).

Otros caracteres taxonómicos de utilidad son las agrupaciones que se observan

en la coloración de Gram (Figura 3) y la formación de estructuras especiales como
las esporas (48). Estas esporas permiten que las bacterias puedan sobrevivir en
condiciones extremas y solo se pueden visualizar a través de coloraciones
especiales (49). Los géneros formadores de esporas son Bacillus, Clostridium,
Desulfotomaculum, Sporolactobacillus, Alicyclobacillus, Thermoactinomyces y
Sporosarcina (50). Las esporas se pueden encontrar dentro de la célula bacteriana
como endospora, o fuera de esta en el ambiente como exospora (50).

16
 Figura 3. Morfología y agrupaciones bacterianas observadas con la tinción de
Gram tomado de García y cols. (51).

También es importante tener en cuenta que existen especies de bacterias Gram

variables, debido a que pueden o no teñirse con el colorante del cristal violeta (52).
Debido a esto se pueden observar teñidas con ambos colorantes, esto se observa
en bacterias Gram positivas del género Bacillus, donde algunos representantes se
observan Gram negativos cuando alcanzan cierto tiempo de crecimiento. En las

17
bacterias Gram negativas los géneros Acinetobacter y Moraxella muestran una
tendencia a resistir la decoloración con etanol lo que conlleva a la observación de
dos colores (52). Con respecto a las bacterias de interés ambiental se ha descrito
que la mayoría son Gram negativas (53), destacando la presencia de algunas
entero bacterias por su importancia clínica

3.4 Taxonomía integrativa

3.4.1 Antecedentes. Dadas las dificultades para la identificación de algunas

especies, en el año 1.985 se habló abiertamente de una crisis taxonómica (54,55).
Esta crisis está caracterizada por la poca comunicación e interacción entre
diferentes disciplinas, así como por la disminución aparente de especialistas en
varios grupos biológicos, la escasa financiación para trabajos taxonómicos y los
bajos o no existentes índices de impacto de las revistas que incluyen estos temas
(56–62). Como una forma de contribuir a la resolución de la crisis taxonómica, en
el año 1.995 se propuso un concepto de taxonomía ortodoxa basado en múltiples
criterios (similaridad, diversidad, ecología, entre otros) para acceder a la
identificación de los taxa. Este concepto, parece ser el origen de la “taxonomía
integrativa”, cuyo término fue inicialmente acuñado en dos publicaciones de
manera independiente (19,20).

Dayrat en 2005 (19) usó el término taxonomía integrativa, de una manera

práctica para proponer una serie de guías que los taxónomos podrían usar con el
objetivo de facilitar la integración de datos de diferentes fuentes para la
identificación de las especies. Este estudio ha sido citado en 1291 publicaciones
(63). Por otro lado, Will y cols (20) utilizaron el término definiéndolo como un
proceso taxonómico que utiliza diferentes fuentes de evidencia, incluyendo
caracteres moleculares y otro tipo de datos para la caracterización de especies.
Aunque estos dos trabajos difieren en algunos aspectos, ambos acuñaron el
término “taxonomía integrativa” enfatizando en la necesidad de integrar diferentes
fuentes de datos para desarrollar hipótesis de taxa preferiblemente a nivel de

18
especie.

3.4.2 Definición de taxonomía integrativa y concepto de especie bajo esta

perspectiva.

La taxonomía integrativa se define como el uso de una perspectiva múltiple y

complementaria para la delimitación de especies (19,20) y ha sido ampliamente
aplicada en distintos grupos biológicos, principalmente para explorar los límites
de las especies que no pueden identificarse fácilmente con un enfoque
morfológico tradicional (64–66). En efecto, se ha demostrado que la combinación
de diferentes métodos puede aumentar la precisión y la confianza en los estudios
taxonómicos necesarios para la determinación de la diversidad biológica, para la
conservación de especies y para la realización de inventarios (19,20,35,63,67).

La taxonomía integrativa como un protocolo metodológico, acepta las

implicaciones del Concepto Unificado de Especie, en el cual se considera que las
especies son linajes poblacionales o meta poblaciones evolucionando en forma
independiente (68–70). El énfasis de la exploración de los límites de las especies
se realiza a través de “criterios operativos” (monofilia recíproca, diagnosis,
coalescencia exclusiva, nichos ecológicos, etc.) como evidencia de su
divergencia o diferenciación (70,71). Las especies son consideradas como
hipótesis científicas sobre especies-taxa que se encuentran en un proceso de
clasificación y pueden ser definidas y evaluadas mediante el estudio de
diferentes líneas de evidencia (72). Dependiendo del tipo de evidencia que
permita corroborar una hipótesis, se considerarán como especies morfológicas
(diferencias morfológicas), especies genéticas (divergencias), especies biológicas
(barreras reproductivas), especies ecológicas (un solo nicho), entre otras
(68,70,73,74).

3.4.3 Consideraciones metodológicas para estudios de taxonomía

integrativa.

19
El principal objetivo de la taxonomía integrativa es combinar diferentes fuentes de
datos de varias disciplinas compatibles, pero cómo líneas de evidencia
independientes (ILE, por la sigla en inglés, independent line of evidence) para la
delimitación de especies con el fin de contribuir contra la crisis de la biodiversidad
y no necesariamente para proponer nuevos nombres (19,75,76). Se ha propuesto
que una sola línea de evidencia puede ser suficiente para plantear una hipótesis
inicial e incluso en algún momento se consideró que la información obtenida con
base en un único marcador molecular sería suficiente como línea de evidencia y
en muchas ocasiones, como principal punto de partida para la identificación de
especies (77–79). Sin embargo, actualmente se considera que la delimitación de
especies o de las hipótesis sobre las especies debe ser realizada lo más
objetivamente posible y utilizando caracteres morfológicos en complemento con
caracteres de otro tipo, como análisis multi-locus de ADN nuclear-ADNn y ADN
mitocondrial- ADNmt, junto con la información de datos ecológicos (64-69).
Además, en algunos estudios se propone el uso datos bibliográficos como línea
de evidencia adicional (73-74). Los protocolos propuestos como base de una
taxonomía integrativa permiten un mejor conocimiento sobre las especies y no
buscan reemplazar la taxonomía basada en caracteres morfológicos (63,64,66).

3.4.5 Integración de la información.

En el contexto de los estudios de taxonomía integrativa se proponen tres formas

de integración de la información; la integración por congruencia total (ITC, por la
sigla en inglés, Integration by Total Congruence), la integración por acumulación
(IC, por la sigla en inglés, Integration by Cumulation) y la integración por
congruencia parcial (IPC, por la sigla en inglés, Integration by Partial
Congruence), con algunas formas intermedias o modificadas (19,67,79,84–86).

En la ITC, una especie es reconocida como tal si su identidad es soportada por la

congruencia entre diferentes clases de datos como los morfológicos, los

20
ecológicos y los de comportamiento (19,79). Siendo altamente exigente, este tipo
de integración podría subestimar el número de especies porque el proceso de
especiación no siempre se acompaña por cambios en todos los caracteres (84).
De otra forma, en la IC una especie puede ser identificada con base en un solo
conjunto de caracteres, sobreestimando el número de especies en algunos casos
(67,81,87). Una tercera forma de integración, que representa un punto de
equilibrio entre el poder de resolución de la IC y la confianza dada por la ITC es
la integración por congruencia parcial (IPC), donde se considera como especies
candidatas a aquellas cuya identidad esté soportada por al menos dos líneas de
evidencia independientes (85,86). Es decir que debe existir congruencia en la
integración de al menos dos conjuntos de caracteres para establecer el estatus
taxonómico de una especie (19,35,88,89).

3.4.6 Enfoques integrativos para la delimitación de especies.

Se conoce diferentes enfoques para abordar la delimitación de especies

mediante taxonomía integrativa. Uno de estos fue propuesto por DeSalle y cols.
(88) y se refiere como círculo taxonómico. Este representa rutas experimentales
donde la única manera de salir para delinear un nuevo taxón es la congruencia
de dos o más caracteres sin hacer un razonamiento repetitivo o redundante. En
otro enfoque, tres líneas de evidencia basadas en ADNnt, ADNmt y taxonomía
morfológica son combinadas para tomar decisiones sobre el estatus taxonómico
de especies a través de un enfoque integrativo que permite definir hipótesis de
especies basadas en análisis filogenéticos (90–92). Adicionalmente, se ha
propuesto el uso de modelos de delimitación de especies basados en
coalescencia, que podrían tener un papel importante en estudios de taxonomía
integrativa, principalmente relacionados con especies crípticas y alopátricas
(75,93).

En los casos donde la información de diferentes caracteres taxonómicos no sea

suficiente, se ha considerado el uso de análisis iterativos de datos ecológicos,

21
morfológicos y ADN (94). Esta metodología involucra el uso de múltiples fuentes
de evidencia para resolver hipótesis de especies planteadas con un tipo de datos
en un primer paso y verificadas con otro tipo de datos en pasos subsiguientes
(21,89,95). Existen dos protocolos con una serie de pasos iterativos que permiten
la identificación de especies. En uno de ellos se acuñó el término “turbo-
taxonomía” para describir un protocolo que combina enfoques basados en ADN
con descripciones morfológicas precisas de taxónomos expertos e imágenes
microscópicas de luz o electrónicas de alta definición. Este enfoque ha sido
aplicado con éxito en la realización de inventarios recientes de grupos de
invertebrados altamente diversos (89). En otro protocolo se parte de una
identificación morfológica provisional para obtener caracteres de ADN, región
código de barras, posteriormente los resultados de identidad de las secuencias
se validan o invalidan en pasos adicionales, usando la información de otras
fuentes de evidencia como marcadores nucleares, datos de la historia de vida y
caracteres morfológicos adicionales (95).

3.4.7 Categorías taxonómicas

El objetivo final de los trabajos de taxonomía integrativa es la asignación de

categorías y no estrictamente la asignación de nombres a las especies
(19,79,88). Dependiendo de la evidencia disponible y del enfoque utilizado, se ha
propuesto cuatro categorías taxonómicas. Para los especímenes cuya taxonomía
está claramente descrita se asigna la categoría de Especies Descritas (DS, por la
sigla en inglés, Described Species) y ha sido aplicada en especies con un estatus
taxonómico definido (96). La segunda categoría corresponde a Especies
Candidatas no Confirmadas (UCS, por la sigla en inglés, Unconfirmed Candidate
Species) y hace referencia a linajes genealógicos profundos, generalmente poco
estudiados y que usualmente provienen de poblaciones geográficamente
distantes, siendo necesario realizar estudios adicionales para clarificar su estatus
taxonómico. La tercera categoría se denominó Especies Candidatas Confirmadas
(CCS, por la sigla en inglés, Confirmed Candidate Species) y corresponde a

22
especies diferenciadas por caracteres diagnósticos (ej. morfológicos,
comportamentales, etc.) y que usualmente presentan un cierto grado de
diferenciación genética, para sustentar la hipótesis de que son distintas,
probablemente representan distintas especies, pero aún no han sido formalmente
descritas y nombradas. La cuarta categoría corresponde a Linajes Con-
específicos Profundos (DCL, por la sigla en inglés, Deep Conspecific Lineages) y
comprende los linajes que difieren sólo por distancias genéticas, pero carecen de
diferencias morfológicas(81,97–100).

En el contexto de modelos de delimitación de especies basados en coalescencia,

se propone sólo dos categorías taxonómicas (93). La primera de ellas se conoce
como Especie Candidata (CS, por la sigla en inglés, candidate species) y hace
referencia a los linajes con diferente historia evolutiva y definidos usando por lo
menos dos líneas de evidencia (ADNmt, ADNnt, diferentes aspectos fenotípicos,
reducido flujo de genes). La segunda categoría se conoce como Unidades
Evolutivamente Significativas (ESUs, por la sigla en inglés, evolutionary
significant units) y comprende los linajes en los cuales los niveles de divergencia
(morfológico/molecular) permiten una separación, pero no lo suficiente para ser
reconocidos como especies por lo que se requeriría una fuente adicional de datos
como evidencia adicional (93) .

Existen otras categorías propuestas en contextos no relacionados directamente

con estudios de taxonomía integrativa, pero que podrían implementarse a futuro,
considerando que para su determinación es necesario el uso de por lo menos
dos líneas de evidencia. Una de estas se conoce como Unidades Taxonómicas
Operativas (OTUs, por la sigla en inglés, Operational Taxonomic Units), que son
grupos de especímenes considerados como la base de comparación para
estudiar patrones de variación y sirven como grupos iniciales para el estudio
preliminar de los caracteres (101). Estos grupos de especies corresponden a
especímenes colectados y pueden ser unidos iterativamente al comparar
caracteres. Algunos autores han definido OTUs con base en caracteres

23
ecológicos, principalmente los hábitats donde se desarrollan las especies (102–
105). Otra categoría corresponde a Unidades Moleculares Taxonómicas
Operativas (MOTUs, por la sigla en inglés, Molecular Operacional Taxonomic
Units) en un contexto molecular. El término MOTUs hace referencia a grupos de
individuos con secuencias similares permitiendo la identificación de especies
putativas o candidatas (106,107).

Recientemente, se ha propuesto que, con la adición de otros datos, algunos

MOTUs y UCS pueden ser elevados a la categoría de DCL o Unidades
Taxonómicas Operativas Integradas (IOTUs, por la sigla en inglés, Integrated
Operational Taxonomic Units), que describen organismos que son similares a
nivel genético, pero comparten al menos otra característica adicional del circulo
taxonómico, es decir que son confirmados por al menos dos líneas de evidencia,
una de las cuales necesariamente debe ser molecular. Finalmente, cuando un
IOTU ha alcanzado un nivel suficiente de información podría elevarse al rango de
CCS (98).

Con respecto a la taxonomía integrativa de bacterias, sólo se conoce un estudio

realizado en el Himalaya con bacterias aisladas de muestras de suelo y se
observó el crecimiento de cuatro colonias de color blanco, amarillo y rojo. Todas
las bacterias presentaron una forma microscópica de bacilos Gram negativos,
además de ser indol negativo. Los fragmentos de ADNr 16S separados por
electroforesis mostraron tamaños de 1500 pb (37). En Colombia no se han
realizado estudios de taxonomía integrativa para bacterias, por lo que el presente
estudio se constituye en un aporte valioso para la región. Las bacterias se
cultivarán y aislarán a partir de muestras de lixiviados y se identificarán con base
en un protocolo de taxonomía integrativa que permita la asignación de una
categoría taxonómica a cada uno de los aislamientos.

3.5 Planta de tratamiento de lixiviados (PTL) ubicada en el Antiguo Vertedero

de Navarro (AVN)

24
El Antiguo Vertedero de Navarro (AVN) fue construido en el corregimiento de
Navarro en la ciudad Santiago de Cali y se encuentra ubicado en un terreno
arcilloso sobre los antiguos cauces del rio Cauca, en una zona de humedal,
cercano al canal CVC que transporta las aguas de los ríos Lili, Meléndez y
Cañaveralejo (108). Este fue el basurero de la ciudad desde hace más de 40 años,
para lo cual contaba con un área de 12.000 m² a la redonda y 15 m de profundidad
(108). La situación se agravó hacia los años 90 cuando la concentración de las
basuras alcanzó alrededor de quince millones de toneladas y una altura de 65
metros, obligando a que la Corporación Autónoma Regional del Valle del Cauca
(CVC) diera la orden de cierre debido a las aguas toxicas que eran vertidas sobre
el rio y avanzaban dos kilómetros aguas abajo (108). Además, en el año 1999 el
vertedero producía siete litros de basura cada segundo, debido al gran crecimiento
que tuvo la ciudad (109). Fue ahí donde la Corporación Autónoma del Valle
ordeno su cierre, pero este no se dio completamente hasta el 25 de julio en el año
del 2008 (109).

Actualmente, en el AVN opera una Planta de Tratamiento de Lixiviados (PTL), la

cual trabaja en dos etapas, en la primera se remueven los sólidos suspendidos de
los lixiviados y en la segunda etapa se remueve la parte disuelta de los desechos,
a partir de membranas que operan como filtros los cuales separan el agua de las
sustancias como los lodos y concentrados producidos en ambas etapas los cuales
son procesados en una celda de seguridad para residuos sólidos (110). El sistema
de tratamiento de lixiviados consta de varios subsistemas como se observa en la
figura 4. Cada uno de estos complementa el sistema de tratamiento de lixiviados
con el objetivo de tratar todo el lixiviado existente en el vertedero (110).

25
Figura 4. Sistema de tratamiento de lixiviados, Antiguo Vertedero de Navarro
(AVN) tomado de García 2018 (111).

La PTL opera para un caudal de 4 L/s, generando en promedio 3 L/s de agua

tratada y 1 L/s de concentrados. El proceso de depuración se llevará a cabo en
dos etapas: la primera el pre tratamiento físico y la segunda consta de un
tratamiento mediante osmosis inversa (111). Actualmente la Planta de Tratamiento
de Lixiviados cuenta con ocho lagunas, seis de estas se encuentran en
funcionamiento y son las que están autorizadas para la realización del muestreo
que permitirá la realización del presente estudio.

Las lagunas 7,5 y 3 no presentan un tratamiento previo en estas lagunas se

recogen lixiviados puros los cuales son generados por los desechos que elimina la
montaña del antiguo basurero, la laguna 8 es la encargada de recolectar los
lixiviados y enviarlos a la PTL para que se realice el proceso de remoción y
filtración de los diferentes componentes. En la laguna 6 se realiza el proceso de
cristalización, y se acumulan los concentrados resultantes de la PTL con algunos
ácidos. Después el lixiviado pasa a la laguna 4 para la evaporación de los residuos
que se originan en la PTL (comunicación personal, trabajadores Emsirva).

26
4. Objetivos

4.1Objetivo General:
Determinar el estatus taxonómico de las bacterias ambientales aisladas en
Santiago de Cali, Valle del Cauca utilizando un enfoque de taxonomía integrativa.

4.2 Objetivos Específicos:

Identificar géneros y especies/morfotipos de bacterias con base en caracteres de

taxonomía bacteriana tradicional

Asignar la categoría taxonómica mediante un protocolo de taxonomía integrativa

que involucre el análisis de tres líneas de evidencia incluyendo los datos
morfológicos, moleculares y aspectos ecológicos

Elaborar fichas taxonómicas para los morfotipos con la categoría taxonómica

correspondiente

27
5. Metodología Propuesta

El desarrollo de este estudio se realizará en cuatro etapas enfocadas en el trabajo

de campo, trabajo de laboratorio, la recopilación de los datos en una base de
datos y la elaboración de un protocolo de taxonomía integrativa para la asignación
de la categoría taxonómica correspondiente (Figura 5).

Figura 5. Imagen representativa de las cuatro etapas requeridas para la

realización del estudio. Fuente: elaboración propia.

5.1 Trabajo de campo

En este estudio se realizará la toma de muestra en seis lagunas que hacen parte
de una Planta de Tratamiento de Lixiviados (PTL) ubicada en el Antiguo Vertedero
de Navarro (AVN). Estas se denominan como lagunas L3, L4, L5, L6, L7, L8 y
lixiviado puro (LP) (Figura 6). Cada laguna se dividirá en seis cuadrantes y se
tomarán muestras simples o compuestas dependiendo de la estructura de cada
laguna. Cada una de las muestras se recolectará en frascos de vidrio y se
transportarán al laboratorio de Microbiología de la Universidad Santiago de Cali.
Además, se tomarán algunos datos correspondientes a variables ambientales
como pH, temperatura y porcentaje de humedad. Se realizarán al menos tres
muestreos en diferentes épocas del año para lograr obtener muestras
representativas.

28
Figura 6. Ubicación de la Planta de Tratamiento de Lixiviados (PTL) esquema
representativo de las lagunas L3, L4, L5, L6, L7, L8 donde se realizará el
muestreo. Imagen modificada de Google Maps (112).

5.2 Trabajo en el laboratorio

Posteriormente se sembrarán 100 uL de las diluciones 10 -3, 10-4, 10-5 y 10-6 en

Agar Nutritivo (AN). Las cajas con AN se incubarán 48 a 72 horas a temperatura
ambiente. Cuando se obtenga el crecimiento de las colonias serán descritas por
caracteres morfológicos teniendo en cuenta el color, la forma, la elevación, la
superficie, el tamaño, la textura y el borde. De esta manera se obtendrán
morfotipos bacterianos que serán nombrados con números consecutivos.
Adicionalmente, se contará cuantas colonias tiene cada morfotipo y se registrará

29
en que laguna se encontraron. Luego de caracterizar los morfotipos, se realizará
un registro fotográfico de cada morfotipo y de los principales resultados que
evidencien el por qué se asigna en una categoría u otra. Seguidamente se
realizará la coloración Gram (5) y tinción de esporas para los morfotipos que
presentan forma bacilar Gram positiva (85) y a un 10% de los otros morfotipos.
Adicionalmente, para los morfotipos Gram negativos se realizarán pruebas
bioquímicas para tener un acercamiento de género y especie (7). Para la
obtención de caracteres moleculares, se realizará extracción de ADN utilizando el
kit comercial Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promegag, USA) y para la
amplificación del gen ARNr 16S, se usarán cebadores bacterianos universales U1-
5CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3
– U2 5-ATCGG(C/T) TACCTTGTTACGACTTC-3 (113). La obtención de
secuencias ARNr 16S hace parte de un trabajo paralelo realizado por integrantes
del semillero de investigación, pero se utilizará los datos arrojados del análisis de
secuencias correspondientes a la identificación de especies.

5.3 Recopilación de datos

Todos los datos obtenidos en este estudio se guardarán en una base de datos que
será creada en un archivo de Microsoft Excel donde se consignarán resultados
obtenidos durante el trabajo en el laboratorio. Así mismo se registrarán los datos
obtenidos en el trabajo de campo como el método de toma de muestra (simple o
compuesta), laguna correspondiente, numero de cuadrante, numero de colonias,
temperatura, porcentaje de humedad, pH Todos estos datos serán registrados
para cada uno de los morfotipos bacterianos.

5.4 Protocolo de taxonomía integrativa para la asignación de la categoría

taxonómica

Para el desarrollo de este estudio se tomarán como base protocolos de taxonomía

integrativa denominados como turbo taxonomía (84,90). En los cuales combinan

30
enfoques basados en la taxonomía del ADN con descripciones morfológicas (19).
Se diseñará un protocolo que permita la identificación de bacterias combinando al
menos tres líneas de evidencia caracteres morfológicos, análisis de las secuencias
del ARNr 16s y datos ecológicos. Cada morfotipo será asignado en una de las
siguientes categorías taxonómicas: Especie Descrita (DS, por sus siglas en
ingles), Especie Candidata no Confirmada (UCS, por sus siglas en ingles),
Especie Candidata Confirmada (CCS, por sus siglas en ingles) y Linaje Co-
especifico Profundo (DCL, por sus siglas en ingles).

Además, se diseñarán fichas taxonómicas donde se consigne la información que

permite la identificación de bacterias mediante el enfoque de taxonomía
integrativa. Estas fichas tendrán la foto del morfotipo, el resultado de la coloración
de Gram, coloración de esporas, serie bioquímica (si aplica), secuencia ARNr 16S,
datos ecológicos, y toda la información de evidencia que permitió la asignación de
la categoría taxonómica.

31
6. Cronograma de actividades
No Actividad Tiempo (meses) Duración
. (meses)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 Revisión X X X X X X X X X X X X 12
bibliográfica
2 Toma de muestras X X X 3
3 Trabajo en el X X X X X X X X 8
laboratorio
4 Análisis de X X X X X X X X X X X X 12
resultados
Construir protocolo X X X X
de taxonomía
integrativa
5 Asignación X X X X X 5
categorías
taxonómicas
6 Informe final X X X X X 5

32
7. Presupuesto
Tabla 2. PRESUPUESTO GLOBAL de la propuesta (en miles de pesos).
.
 
RUBROS FUENTES
TOTAL
USC CONTRAPARTIDA
  Efectivo 1
Especie (terceros)
PERSONAL (Tabla 3) $ 20.000.000
EQUIPOS Y SOFTWARE (Tabla 4) $ 22.500.000
MATERIALES BIBLIOGRÁFICOS,
PUBLICACIONES, INSUMOS Y
SERVICIOS TÉCNICOS (Tabla 5) $ 15.000.000
VIAJES (Tabla 6) $ 5.000.000

TOTAL $ 20.000.000 $42.500.000 $ 62.500.000

Tabla 3. Descripción de los gastos de personal (en miles de $).

RECURSOS
NOMBRE DEL FUNCIÓN
INVESTIGADOR / FORMACIÓN DENTRO DEDICACIÓ USC
TOTAL
EXPERTO/ ACADÉMICA DEL N (h/semana) Contrapartida
AUXILIAR/ESTUDIANTE PROYECTO Especie

Doris Amanda Rosero Microbióloga,

Director 1 5 10.000.000
García M.Sc., Ph.D.

NA NA Director 2 NA NA
Laura Isabella Vergara
López Estudiante Tesista 20 5.000.000

Alejandro Ortiz Díaz Estudiante Tesista 20 5.000.000

TOTAL $ 20.000.000 $ $
Doris Amanda Rosero Microbióloga,
Director 5 10.000.000
García M.Sc., Ph.D.
NA NA Director 2 NA

Tabla 4. Descripción de los equipos y software que se planea adquirir o utilizar,

costo de compra o servicio (en miles de $).

EQUIPO JUSTIFICACIÓN   TOTAL

RECURSOS

33
 USC Contrapartida
    Efectivo Especie    
Autoclave Esterilización material 2.000.000
Centrifuga Extracción ADN 5.000.000
Termociclador Realización PCR 10.000.000
Cámara
electroforesis Electroforesis 1.000.000
Cámara Tomar fotos geles
fotográfica electroforesis 500.000
Almacenamiento
Nevera muestras 2.000.000
Otros: pipetas, Procedimientos de
etc. biología molecular 2.000.000
22.500.00
TOTAL $ 0 $

Tabla 5. Materiales Bibliográficos, Publicaciones, insumos, suministros y

bibliografía (en miles de $)

USC Total
Contrapartida
    Efectivo Especie
Trabajo en el
laboratorio: cultivo y
aislamiento,
extracción ADN, PCR
Reactivos laboratorio y electroforesis $ 10.000.000
Obtener secuencias
Servicio de secuenciación ARNr 16S $ 5.000.000

  TOTAL $ 15.000.000

Tabla 6. Descripción y justificación de los viajes (en miles de $)

Lugar /No. De Estadía Total, Recursos

Justificación** Pasajes ($)
viajes ($) días Total
USC Contrapartid
          Efectivo Especie a
Trabajo de Toma de
campo muestras $ 5.000.000

8.Resultados/Productos esperados y
potenciales beneficiarios

34
El desarrollo del presente trabajo permitirá implementar una metodología para la
asignación de categorías taxonómicas a bacterias aisladas de seis lagunas que
hacen parte de una Planta de Tratamiento de Lixiviados (PTL) ubicada en el
Antiguo Vertedero de Navarro (AVN), Santiago de Cali. La identificación de
bacterias se realizará desde el enfoque de taxonomía integrativa para contribuir al
conocimiento de la biodiversidad de este importante grupo de microorganismos.
Además, se busca contribuir en la formación académica de dos estudiantes de
pregrado profundizando en el área de Microbiología Ambiental. Finalmente se
espera que los resultados obtenidos sean publicables en una revista de impacto
internacional.

35
9. BIBLIOGRAFIA

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