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INFORME TÉCNICO DEL PROYECTO SECTORIAL SAGARPA CONACYT-2011-09-172352 DEMANDA 6.
“Desarrollo
de normatividad y métodos para detección y medición de organismos microbiológicos en alimentos”.
Informe técnico de la
Demanda Específica 6.
“Desarrollo de normatividad y
métodos para detección y
medición de organismos
microbiológicos en alimentos”
Del proyecto sectorial

SAGARPA-CONACYT 2011-
09-172352
1
INFORME TÉCNICO DEL PROYECTO SECTORIAL SAGARPA CONACYT-2011-09-172352 DEMANDA 6. “Desarrollo
ÍNDICE
Alcance 6
Justificación del proyecto 8
Discusion y guía del manual integrado de la normatividad y métodos de detección y 17

medición de organismos microbiológicos en alimentos como vegetales y frutas
frescas, productos del mar y cárnicos de animales terrestres
Conclusiones de los resultados de las encuestas realizadas a laboratorios de México 58
que analizan microorganismos patógenos en alimentos
Programas internacionales implementados en materia de inocuidad de los alimentos 62
en beneficio del sector productivo de cárnicos, productos de frutas y a base de
vegetales
Recomendaciones para establecer un programa de verificación interno en México 71
Propuestas de mejora a la normatividad para la detección 79
de Vibrio cholerae, V. vulnificus, V. parahaemolyticus 79

de Salmonella spp 81
de Listeria monocytogenes 83
de E. coli O157 y productoras de shiga toxinas 84
de Staphylococcus aureus 84
PROPUESTA DE NORMAS 85
Propuesta de Norma Oficial Mexicana, bienes y servicios. Método para la cuenta e identificación 125
de Escherichia coli diarreogénica.
Propuesta de Norma Oficial Mexicana, bienes y servicios. Método para la detección de Vibrio 181
cholerae enterotoxigénico
CONCLUSIONES 200
BIBLIOGRAFÍA 202
2
PREFACIO
El presente informe de normatividad y métodos para la detección y medición de microorganismos
patógenos en alimentos fue integrado y compilado por el Centro Nacional de Metrología con el
apoyo del Proyecto Sectorial SAGARPA-CONACyT 2011-09-172352, Demanda Específica 6.
“Desarrollo de normatividad y métodos para detección y medición de organismos microbiológicos
en alimentos”, el cual fue realizado en colaboración con el Centro de Investigación en Alimentación
y Desarrollo, A.C. y tuvo aportaciones honoríficas de distinguidos investigadores y usuarios de
México.
Centro Nacional de Metrología

Responsable Técnico: Dr. Yoshito Mitani Nakanishi
Responsable Administrativo: C.P. Guillermo Salomón Villalobos Castrejón
Director General del CENAM. Dr. Héctor Nava Jaimes
CENAM
km 4.5 Carretera a los Cués,
Municipio El Marqués, Querétaro.
C.P. 76246 México Tel. (442) 2110500 al 04
Correo electrónico: meperez@cenam.mx
Compilado y escrito por:

Dra. Melina Pérez Urquiza. Coordinador Científico. Líder de la Demanda Específica 6
Dr. Aldo Amaro Reyes, profesor investigador de la UAQ, contratado por CENAM con fondos del
proyecto.
Dra. Nohelia Castro del Campo. CIAD Culiacán
M.en C. Leobardo Montoya Rodríguez. CIAD Mazatlán
Esta publicación ha sido revisada por:

Dra. Blanca García Almendarez profesor-investigador de la Universidad Autónoma de Querétaro
Q.A. Judith Sainz Uribe Coordinador Científico
®2013 por el Centro Nacional de Metrología

Secretaría de Economía
Primera Edición consta de 500 ejemplares

Reservado todos los derechos
ISBN: 978-607-96162-5-0
Ninguna parte de esta publicación puede ser reproducida, almacenada en un sistema o

transmitida, en ninguna forma o en ningún medio, electrónico, mecánico, fotocopia, grabado, sin el
permiso de los copropietarios. Para simplificar la información, se han utilizado los nombres de los
productos comerciales. Este manual no pretende recomendar productos nombrados o ilustrados,
como tampoco existe una crítica implícita de productos similares que no se mencionan o ilustran.
3
Agradecimientos por su contribución en la elaboración del presente informe técnico
UAQ
Dra. Blanca García Almendarez profesor-investigador de la Universidad Autónoma de Querétaro
CIAD Culiacán
Dr. Cristóbal Chaidez Quiroz
Dra. Josefina León Félix
Dr. Osvaldo López Cueva
Dra. Hilda Karina Ramírez Medina
QFB Célida Isabel Martínez Rodríguez
QFB Jesús Hector Carrillo Yáñez
Dra. Nohelia Castro del Campo
CIAD Mazatlán
Dr. Miguel Betancourt Lozano
M.C. Leobardo Montoya Rodriguez
M.C. Jesus Efren Astorga Rodriguez
Dr. Bruno Gómez-Gil Rodríguez Salas
Dra. Sonia Araceli Soto Rodríguez
Dr. Omar Calvario Martínez
Dra. Lorena Olivia Noriega Orozco
Dra. Maribel Jiménez Edeza
M. en C. Maria Eugenia Ménez Robles
4
CENAM
Dr. Yoshito Mitani Director General de Metrología de Materiales
Q.en A. Judith Sainz Uribe Coordinador Científico
Dra. Mariana Arce Osuna Director de Análisis Orgánico
M.C. Judith Rivera Mellado contratada por CENAM con fondos del proyecto
IIA Blanca Erika Alvarez Nieves contratada por CENAM con fondos del proyecto
Con el apoyo de los ayudantes de proyecto y tesistas de licenciatura:
p.IBQ Marycarmen Merino Sanchez. Instituto Tecnológico de Celaya
p.IBQ Alma Liliana Villarreal Cásares. Instituto Tecnológico de Durango
5
ALCANCE
En este volumen se presentan:
Las conclusiones y sugerencias resultado del Proyecto
1. En el estado actual, las metodologías microbiológicas nacionales para el análisis

microbiológico de productos cárnicos, frutas, verduras y marinos, en comparación con las
internacionales, (metodologías propuestas y validadas por organismos de reconocimiento
internacional ISO, AOAC, BAM) no son concordantes en el uso de técnicas de biología
molecular, pruebas automáticas y ensayos rápidos mediante kits comerciales, pero si son
concordantes ó parcialmente concordantes, dependiendo del caso, con las metodologías
tradicionales de identificación bioquímica y medios selectivos.
2. Se expone la oferta y la demanda de proveedores de ensayos para análisis de
microorganismos patógenos de los alimentos y se proporciona el fundamento científico y la
factibilidad técnica en relación a la actualización de la normatividad nacional y su
aplicación referente a estudios microbiológicos en productos cárnicos, frutas, verduras y
marinos.
3. Se informa acerca de los programas internacionales implementados en materia de inocuidad
de los alimentos, y se sugiere su adopción en México.
4. Una vez considerado que la presentación de las normas internacionales se realiza por
patógeno y que tenemos dos dos modelos a seguir, el de los Estados Unidos de
Norteamérica y el de la Comunidad Europea. a) En el caso de seguir el modelo utilizado
por Estados Unidos de Norteamérica, se sugiere elaborar un manual con los métodos de
determinación de los patógenos en las diferentes matrices, al cual se podría hacer referencia
en las normas, lo que facilitaría y mantendría actualizados los métodos de medición sin la
necesidad de esperar los largos periodos de tiempo que implican la actualización de una
norma. Dicho manual como el presentado por CENAM en este informe podría contener los
métodos estandarizados por nuestros principales socios comerciales (en este caso Estados
Unidos de Norte América, la Comunidad Europa y Reino Unido) de tal forma que el
usuario pueda elegir el adecuado para su propósito, sin restringirlo a un kit, equipo ó
método especifico, sin embargo sería un requisito el utilizar patrones de medición ó
Materiales de Referencia Certificados con los cuales se garantice la trazabilidad,
incertidumbre y calidad del resultado de la medición realizada. b) En el caso de seguir el
modelo de la Comunidad Europea se sugiere tener una norma por patógeno para las
diferentes matrices alimentarias de interés, en lugar de tener una norma por producto para
los diferentes patógenos.
5. Considerando lo anterior, se presentan dos propuestas de norma para la evaluación,
validación y aplicación de nuevos métodos para la detección de Vibrio cholerae, Vibrio
paraemoliticus, Vibrio vulnificus y E. coli productora de shiga toxinas (STEC) en las
diferentes matrices alimentarias, tomando como base lo expuesto en el BAM de los Estados
Unidos de Norteamérica.
6. Se realizó un comparativo de normas nacionales y extranjeras de aplicación actual y un
estudio de factibilidad (en base a la consulta con las instituciones nacionales de
investigación, laboratorios de ensayo, laboratorios de gobierno federal y del sector
productivo que requieren u ofrecen el servicio de evaluación de la inocuidad de los
alimentos nacionales e internacionales) para introducir modificaciones en las normas
6
nacionales sobre la detección y/o cuantificación de microorganismos patógenos en

alimentos en sus diferentes matrices.
7. Se sugiere que las normas nacionales sean concordantes con la correspondiente sección del
BAM y con los métodos de análisis reconocidos a nivel internacional para la determinación
de los patógenos de interés requeridos para los productos exportables hacia los Estados
Unidos de Norteamérica y/o los distintos socios comerciales de México.
8. Se sugiere la implementación de pruebas interlaboratorio nacionales, tomando la
experiencia de proveedores de ensayos de análisis de microorganismos patógenos de los
alimentos internacionales.
9. Se propone trabajar en las comparaciones del recién formado grupo de trabajo de
microbiología del CCQM con el objetivo de desarrollar materiales de referencia nacionales
tomando la experiencia del proceso de desarrollo de los MRC internacionales para la
determinación de los patógenos motivo de este estudio en alimentos.
Metodología empleada:
1. Revisión de normas nacionales e internacionales sobre las metodologías microbiológicas

que involucran la detección de microorganismos patógenos como Salmonella spp,
Escherichia coli, Listeria Monocytogenes, Vibrio spp, Staphylococcus aureus y E. coli
O157:H7 y productoras de shiga toxinas.
 NOMs SSA: 109, 110, 112, 113, 114, 115, 143 y 242 , que para el caso de productos
del mar se complementan con más de 20 NOM ó NMX (NOM-001-STPS-1993, NOM-
002-SCFI-1993, NOM-051-SCFI-1994, NOM-030-SCFI-2006, NOM-027, 040, 092,
116, 117, 120, 128, 129, 130 y NMX-F-083, 088, 144, 254, 304, 314, 315).
 Normas internacionales: ISO (se revisaron 34 normas aplicables del compendio de
normas UNE sobre microbiología de los alimentos), AOAC, BAM, BS, CFIA (Agencia
Canadiense de Inspección de Alimentos por sus siglas en inglés), y del CODEX.
2. Encuestas a 35 laboratorios de México que realizan análisis de microorganismos patógenos
en alimentos
3. Revisión de programas internacionales implementados en materia de inocuidad de los
alimentos en beneficio del sector productivo de cárnicos, productos de frutas y a base de
vegetales
4. Visita a los laboratorios de USDA, NIST, LGC y NIBSC
5. Resultados:
a. Propuestas de mejora a la normatividad existente (NOM) referente a los 5
patógenos motivo de estudio y
b. propuesta de dos normas de la traducción al castellano de las establecidas en el
Manual Analítico de Bacteriología
i. Método para la cuenta e identificación de Escherichia coli diarreogénica
ii. Método para la detección de Vibrio cholerae enterotoxigénico
c. Algunas Propuestas adicionales. Ver propuestas en las páginas 76-197
Los entregables son:
 Un Informe técnico que describe las actividades y los hallazgos del proyecto “Desarrollo de
normatividad y métodos para detección y medición de organismos microbiológicos en
alimentos”, así como sugerencias y propuestas de mejora regulatoria
 Un Manual de Normas
7
Compendio de las normas y métodos estandarizados en México y las traducciones al

castellano de las aplicables de nuestros principales socios comerciales como son las
presentadas en el Manual Analítico de Bacteriología (BAM por sus siglas en Ingles) de
Estados Unidos de Norte América, las guías ISO de la Comunidad Europea y las normas
británicas del Reino Unido, para los 5 patógenos motivo de estudio en este proyecto:
Salmonella spp, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Vibrio spp, Staphylococcus
aureus y E. coli O157:H7 y productoras de shiga toxinas.
JUSTIFICACIÓN DEL PROYECTO

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) son un problema cada vez más importante a
nivel internacional debido al intercambio comercial y al movimiento de personas entre los
diferentes países. Se estima que tres millones de personas en los países desarrollados y en desarrollo
mueren cada año a consecuencia de ellas y que muchos millones más se enferman (FAO, 2012). La
mayoría de estas enfermedades son ocasionadas por los géneros bacterianos, considerados
patógenos como Salmonella, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli O157,
Listeria monocytogenes, entre otros.
Con la finalidad de garantizar la inocuidad de los alimentos y proteger a los consumidores los
países han implementado sistemas nacionales de control de los alimentos con una base oficial y de
carácter obligatorio. Dichos sistemas aseguran también que los alimentos importados cumplen con
los requisitos nacionales. En Estados Unidos de América, por ejemplo, la Food and Drug
Administration (FDA) firmó recientemente, en enero del 2012, la ley denominada Food Safety
Modernization Act. Esta ley provee a la FDA de herramientas para tratar a los alimentos importados
con los mismos estándares de calidad que los impuestos para los alimentos locales.
El entorno mundial del comercio de productos alimenticios impulsado por las exigencias de los
consumidores y el aseguramiento de la inocuidad para la prevención de las enfermedades, impone
numerosas obligaciones a los países, en cuanto al fortalecimiento de sus sistemas de control de los
alimentos que incluyen: la legislación alimentaria, la inspección de los alimentos, los análisis
(laboratorios oficiales), la gestión del control de los alimentos y la información, educación y
comunicación.
El panorama actual en materia de inocuidad alimentaria presenta varias razones que justifican la
necesidad de unificar la normatividad mexicana actual en materia de detección de microorganismos
patógenos con las normas internacionales vigentes. Algunas de ellas son las siguientes:
Los sistemas de control alimentario de los países desarrollados presentan barreras técnicas que
dificultan el comercio internacional de productos agropecuarios mexicanos y productos derivados
de la pesca.
Aunado a ello, la mayoría de las Normas Oficiales Mexicanas que establecen la metodología para la
determinación de microorganismos patógenos en alimentos no han sido actualizadas desde que
fueron publicadas en los años noventa (Ver Tabla 1). A excepción de la norma NOM-242-SSA1-
2009, Productos y servicios. Productos de la pesca frescos, refrigerados, congelados y procesados.
Especificaciones sanitarias y métodos de prueba, que fue publicada en el año 2010. Sin embargo,
debe considerarse, que aunque su revisión se realizó en 2010, esta norma hace referencia a los
métodos y procedimientos microbiológicos propuestos en otras normas que no han sido actualizadas
8
y por lo tanto las normas actualmente utilizadas no contemplan las ventajas del uso de la tecnología
moderna, lo cual representa una serie desventaja que afecta no solo a los productores, sino también
a los consumidores, es decir a todos los usuarios
Tabla 1. Fecha de publicación de algunas Normas Oficiales Mexicanas para el análisis de

microorganismos patógenos en los alimentos y el tiempo en años que las mismas llevan sin
actualizarse.
Normas Oficiales Mexicanas Fecha de Tiempo en años

publicación sin actualización
hasta el 2012
NOM-112-SSA1-1994, Bienes y servicios. Determinación 10 de mayo de 17
de bacterias coliformes. Técnica del número más probable. 1995
NOM-113-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método para la 10 de mayo de 17

cuenta de microorganismos coliformes totales en placa. 1995
NOM-143-SSA1-1995, Bienes y servicios. Método de 31 de octubre 15
prueba microbiológico para alimentos. Determinación de de 1997
Listeria monocytogenes.
NOM-110-SSA1-1994, Bienes y servicios. Preparación y 10 de mayo de 17
dilución de muestras de alimentos para su análisis 1995
microbiológico.
NOM-109-SSA1-1994, Bienes y servicios. Procedimientos 26 de mayo de 18
para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos 1994.
para su análisis microbiológico.
determinación de Salmonella en alimentos. 1995
determinación de Staphylococcus aureus en alimentos. 1995
NOM-242-SSA1-2009, Productos y servicios. Productos de 3 de 2
la pesca frescos, refrigerados, congelados y procesados. noviembre de
Especificaciones sanitarias y métodos de prueba. 2010
Esta situación persiste en nuestro país, a pesar de que la Ley Federal sobre Metrología y
Normalización (LFMN) establece en su Artículo 51 que: Las normas oficiales mexicanas deberán
ser revisadas cada 5 años a partir de la fecha de su entrada en vigor.
Otra razón que justifica la actualización de las normas es que la mayoría de ellas no presenta
concordancia con las normas internacionales, situación que explica por qué muchos productos
mexicanos no pueden ser comercializados a nivel internacional ya que no cumplen con los
estándares requeridos por ellos. En la actualidad la única norma que tiene concordancia con normas
internacionales es la NOM-242-SSA1-2009, Productos y servicios. Productos de la pesca frescos,
refrigerados, congelados y procesados. Especificaciones sanitarias y métodos de prueba.
La LFMN en el Artículo 51-A establece que:
Para la elaboración de las normas mexicanas se realizará lo siguiente:
9
… II. Tomar como base las normas internacionales, salvo que las mismas sean ineficaces o
inadecuadas para alcanzar los objetivos deseados y ello esté debidamente justificado…
A diferencia de las normas mexicanas, las normas internacionales han sido actualizadas más
recientemente. Por ejemplo, los procedimientos de análisis compilados en el Bacteriologycal
Analytical Manual (BAM) publicado por la Food and Drug Administration han sido revisados
desde el 2001 y la revisión más reciente es del 2011.
Tabla 2. Comparación de la fecha de revisión de las Normas para detección de microorganismos

patógenos en alimentos Nacionales e Internacionales.
Aplicación de Norma Oficial Comité Europeo Bacteriological British Standard

la Norma Mexicana de Analytical Manual Institution (BS)
(NOM) Normalización- (BAM)
Asociación
Española de
Normalización y
Certificación
(UNE/ISO)
Salmonella 114-SSA1- 6579:2002 Capítulo 5.
1994 Revisión 2003 Salmonella.
Revisión 1995 Revisión 2011
Listeria 143-SSA1- 11290-1:1997 Capítulo 10.
monocytogenes 1995 Revisión 1997 Detección y recuento
Revisión 1997 11290-2:2000 de Listeria
Revisión 2000 monocytogenes en los
alimentos.
Revisión 2011
Protocolo:
Confirmación
simultánea de especies
aisladas de Listeria y
L. monocytogenes por
PCR en tiempo real.
Revisión 2011
Staphylococcus 115-SSA1- 6888-1: 1999 Capítulo 12 5763:Part 7:1983
aureus 1994 Revisión 2000 Staphylococcus Revisión 1983
Revisión 1995 6888-2:1999 aureus
Revisión 2000 Revisión 2001
6888-3:2003
Revisión 2003
E coli O157 16654:2002
Revisión 2002
Escherichia coli Capitulo 4ª
diarreogénica Escherichia coli
diarreogénica.
Revisión 2011
Bacterias 112-SSA1- 16654:2002 Capítulo 4. Recuento 5763:Part13:1989
coliformes y E. 1994 Revisión 2002 de Escherichia coli y Revisión 1989
coli 113-SSA1- bacterias coliformes. 5763:Part 10:1993
1994 Revisión 2002 Revisión 1993
10
Revisión 1995
Vibrio NOM-242- Capítulo 9. Vibrio. 5763:Part14:1991
SSA1-2009 Revisión 2004 Revisión 1991
Revisión 2010
Procedimientos 109-SSA1- Capítulo 1: Muestreo 5763:Part 0:1986
para la toma, 1994 de alimentos y Revisión 1986
manejo y Revisión 1994 preparación de la
transporte de muestra
muestras homogeneizada.
Revisión 2003
Preparación y 110-SSA1- 6887-1 Capítulo 1: Muestreo 5763:Part 0:1986
dilución de 1994 Revisión 2000 de alimentos y Revisión 1996
muestras Revisión 1995 preparación de la
muestra
homogeneizada.
Revisión 2003
Las normas Mexicanas aplicables a la detección de microorganismos patógenos en alimentos para

consumo humano proponen métodos convencionales basados en crecimiento en medios de cultivo,
aislamiento, identificación bioquímica y en ocasiones serología. Sin embargo, la detección rápida
de patógenos en alimentos es crítica ya que con ella se asegura a los consumidores. En algunas
normativas internacionales se ha establecido el uso de métodos rápidos, término subjetivo usado
para describir la variedad de pruebas que ofrecen una detección e identificación más rápidas, más
convenientes, sensibles y más específicas, como “kits” bioquímicos, pruebas de anticuerpos,
pruebas basadas en ADN y ensayos que son modificaciones de pruebas convencionales para
acelerar los análisis.
La mayoría de los “kits” bioquímicos miniaturizados requieren de (18 a 24) horas de incubación,
con excepción de algunos en los que los resultados pueden leerse en 4 horas. Han sido diseñados
para identificar bacterias entéricas, pero existen también los que permiten identificar a
Campylobacter, Listeria, anaerobios, bacterias Gram-negativas no fermentativas y bacterias Gram-
positivas (BAM, 2001).
La alta especificidad de la unión anticuerpo-antígeno y la versatilidad de esta reacción, ha facilitado

el diseño de una gran variedad de ensayos y formatos de anticuerpos. Son 5 los formatos de ensayos
de anticuerpos más utilizados. El más simple es la aglutinación látex (LA), en la que se usan
anticuerpos cubiertos de látex coloreado o partículas doradas para una identificación serológica o un
aislado de cultivos puros de bacterias de los alimentos. En la inmunodifusión, una muestra
enriquecida es colocada en una matriz de gel con anticuerpos; si el antígeno específico está
presente, se forma una línea de precipitación. El ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas
(ELISA) es el formato de ensayo de anticuerpos más utilizado para la detección de patógenos en
alimentos. En este ensayo, un anticuerpo está ligado a una matriz sólida y es usado para capturar al
antígeno presente en un cultivo de enriquecimiento y un segundo anticuerpo conjugado a una
enzima es usado para su detección. Las paredes de los pozos de las placas “microtiter” son los
soportes sólidos más utilizados. (BAM,2001). En la separación inmunomagnética (IMS) se usan
anticuerpos acoplados a partículas magnéticas para capturar patógenos del medio de
preenriquecimiento. Esta tecnología puede sustituir los enriquecimientos selectivos, pero en lugar
de usar antibióticos o reactivos fuertes que puedan causar estrés, se usa un anticuerpo para capturar
un antígeno.
11
La inmunoprecipitación o inmunocromatografía es otro formato de anticuerpo. Es un procedimiento

“sándwich”, como el ELISA, pero en lugar de un conjugado enzimático, la detección del anticuerpo
es acoplada a una cuenta de látex coloreada a oro coloidal.
Los métodos basados en ADN y anticuerpos comenzaron a surgir en los años ochenta cuando la
investigación básica fue aplicada en áreas como la biotecnología. Existen varios formatos de
ensayos basados en ADN, pero únicamente las sondas, el PCR y los bacteriófagos han sido
desarrollados comercialmente para detectar patógenos en alimentos (BAM,2001).
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método en el que fragmentos cortos de ADN

(sondas) o primers son hibridizados en una secuencia específica, la cual es amplificada
enzimáticamente por una enzima conocida como Taq polimerasa usando un termociclador.
Teóricamente el PCR puede amplificar una copia simple de ADN en un millón de copias en menos
de 2 horas. Sin embargo, la presencia de inhibidores en los alimentos y en los medios de cultivos
pueden disminuir la eficiencia de la amplificación, por lo que la extrema sensibilidad del PCR se ve
reducida cuando se usa en pruebas de alimentos (BAM, 2001).
Los métodos de detección e identificación de patógenos microbianos, basados en el ADN y en la

técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) -método molecular, ofrecen ventajas tanto
para los productores como para los consumidores. La seguridad microbiológica de los alimentos
continúa suscitando gran preocupación entre todos los componentes de la cadena alimentaria, del
campo a la mesa (EUFIC, 2000).
Los métodos moleculares necesitan de más presupuesto, ya que parte del proceso es automatizado,
sin embargo tienen mayor sensibilidad para detectar e identificar microorganismos a través de
pruebas simples y específicas y se realiza en pocas horas. En México se ha limitado el uso de
métodos moleculares a la investigación privada, porque aún no se han validado como métodos
oficiales (Carrillo-Inungaray et al., 2011).
Por otro lado, el uso de los métodos moleculares ha recibido un gran impulso a través de la creación
de “PulseNet”, red de subtipificación molecular creada por el CDC (Center for Disease Control), la
asociación de los departamentos de salud estatal y la Asociación de Laboratorios de Salud Pública
(APHL) de Estados Unidos, que se basa en la identificación de ADN de bacterias causantes de
enfermedades relacionadas con alimentos. El proyecto está siendo implementado primero para
Escherichia coli 0157-H7 y luego será extendido para incluir Salmonella typhimurium y otros
patógenos relacionados con los alimentos tales como Shigella, Listeria o Campylobacter. Todos los
participantes utilizarán equipos y protocolos estandarizados y se compilará una base de datos
centralizada de patrones de ADN (“huellas genéticas del ADN”) en un servidor computacional en el
CDC. A través de la participación del Departamento de Agricultura y la Food and Drug
Administration de los Estados Unidos, la base de datos incluirá huellas genéticas derivadas de
alimentos contaminados y de aislados clínicos (Pulsenet, Consultado el 15 de mayo de 2012.
http://fos.panalimentos.org/Default.aspx?alias=fos.panalimentos.org/pulsenet).
Esta metodología convenientemente estandarizada y con adecuados controles de calidad, tiene la

gran ventaja de poder ser realizada en diferentes laboratorios al mismo tiempo, las fotografías de los
fragmentos de ADN obtenidos pueden ser analizados en el o los laboratorios que lo generan y
enviados electrónicamente a una base de datos habilitada para comparar los perfiles de las cepas
aisladas en diferentes países y regiones en tiempo real. Esta secuencia de eventos organizados en
una red regional-internacional, con participación de los sectores de salud humano, animal y de
alimentos, posibilita la detección temprana del brote, en particular en brotes dispersos y la respuesta
rápida y oportuna a las infecciones por patógenos bacterianos transmitidos por alimentos (Pulsenet,
Consultado el 15 de mayo de 2012.
12
http://fos.panalimentos.org/Default.aspx?alias=fos.panalimentos.org/pulsenet).
Siguiendo la tendencia de implementar metodología molecular al análisis de microorganismos

patógenos de los alimentos, se han incorporado análisis moleculares en algunos capítulos del
manual analítico bacteriológico (Bacteriological Analytical Manual, BAM, 1998) como podemos
apreciar en los siguientes ejemplos:
Capítulo de Vibrio (BAM, 1998).
… una serie de cambios sustanciales se han hecho en esta versión del capítulo referente a Vibrio en
donde se incluye un mayor énfasis hacia los métodos moleculares, tales como hibridación de ADN
de colonia y PCR para la identificación y caracterización de Vibrio
spp patógenos. Con la adición de estas opciones, se ha puesto menos énfasis en algunos de los
métodos más antiguos y en algunos casos, en secciones que requieren reactivos peligrosos o
difíciles de obtener (es decir O/129 reactivo) han sido eliminadas…
…estas nuevas tecnologías tienen la ventaja de una mayor detección e identificación rápida y se
incluyen en aquellos laboratorios con el equipo adecuado. La identificación basada en la PCR
ofrece un análisis en un día, mientras que los procedimientos con sondas de genes, incluyendo los
que se presentan en este capítulo, son análisis que tardan de uno a dos días. El procedimiento
tradicional cualitativo y la técnica del número más probable (NMP) requieren de cuatro a siete días
para completarse…
Adicionalmente en la página oficial de la FDA se encuentra descrito, además de la metodología

preferida estándar, las metodologías rápidas alternativas permitidas para la detección y aislamiento
de Listeria monocytogenes.
Capitulo Listeria y pruebas alternativas.
Los “kits” de detección rápida con sus respectivos medios de enriquecimiento pueden ser utilizados
para detectar la presencia de contaminantes de Listeria. Las cepas aisladas presuntivamente de
Listeria en agares selectivos pueden ser confirmadas por pruebas de identificación convencionales o
por una serie de pruebas de este tipo en forma de kit. Además, los aislamientos pueden ser
confirmados rápidamente como L. monocytogenes (o no) mediante el uso de “kits” de prueba
específicos. Por otro lado, la tipificación de aislamientos de L. monocytogenes para los aislamientos
de la FDA tienen que ser tipificados serológicamente, por electroforesis en gel de campo pulsado
(PFGE) y por ribotipificación (BAM, 1998).
Asimismo, revisando las características relevantes en la aplicación de análisis molecular de

patógenos en los alimentos, podemos generar un análisis de fortalezas, oportunidades, debilidades y
amenazas (FODA) en donde se aprecian las características relevantes en la aplicación de esta
tecnología (Tabla 3).
Tabla 3. Análisis de fortalezas, oportunidades, debilidades y amenazas del análisis molecular de

patógenos en los alimentos.
Fortalezas Debilidades
Especificidad (pueden detectar solo la molécula No distinguen entre organismos vivos y
o microorganismo de interés). muertos.
Sensibilidad (son capaces de detectar la Se tiene que contar con conocimientos de
presencia de un solo microorganismo). secuencias de nucleótidos específicas del
patógeno a diagnosticar.
Rapidez (se puede identificar un La mayoría de ensayos son cualitativos o semi
13
microorganismo en menos de 24 horas). cuantitativos.

Permiten estudiar las poblaciones microbianas La mayoría de ensayos sólo detectan una
sin hacer aislamientos, por lo tanto, se evitan los especie o muy pocas especies a un tiempo.
sesgos que pueden surgir con el cultivo de
microorganismos.
Ha permitido identificar nuevos Se desarrollan procedimientos con múltiples
microorganismos, los cuales no había sido etapas, lo que incrementa la posibilidad de
posible su cultivo e identificación por técnicas errores.
tradicionales.
Permiten la detección de microorganismos No permite el aislamiento del microorganismo
altamente patógenos, los cuales pueden ser para la posterior detección de resistencia.
identificados muertos evitando así los riesgos de
infección del analista.
Útiles en situaciones clínicas donde los métodos La mayoría de los ensayos detectan sólo las
convencionales son muy insensibles (v.g. especies a que apuntan y presentan errores en
durante la etapa asintomática de las infecciones detectar especies no esperadas.
del VIH), muy lenta (cultivo micobacterial) o
muy complicados para ser usados a gran escala
(v.g. aislamiento viral).
Monitoreo del surgimiento de mutaciones en el Sesgos en PCR de amplio espectro debidos a
genoma, por ejemplo, la selección de variantes procedimientos de homogenización,
resistentes durante la terapia amplificación preferencial de ADN y extracción
antiviral/antibiótica. diferencial de ADN.
Puede detectar microorganismos muertos.
En el caso de Staphylococcus aureus la bacteria
muere a temperaturas que no degradan la toxina
así la detección de la bacteria muerta es un
indicativo de la presencia de toxinas en la
muestra.
Oportunidades Amenazas
El alto costo de las técnicas moleculares tenderá La falta de estandarización de las técnicas
a bajar a medida que se incremente el uso de
estas técnicas.
El problema de falsos positivos y falsos La probabilidad de resultados falsos positivos
negativos se puede solucionar si se incluye en por contaminación con productos de
cada análisis un testigo positivo y un testigo amplificados anteriores “Amplicones”, hace
negativo. necesario una cuidadosa evaluación de sus
resultados.
Pueden ser automatizadas (permiten tener un La probabilidad de falsos negativos por la
diagnóstico en un menor tiempo y reducir los presencia de inhibidores o inconvenientes en los
costos). diferentes pasos de las técnicas.
No requiere de condiciones anaeróbicas Se requiere de personal altamente capacitado
cuidadosamente controladas en la toma de la para el desarrollo de las pruebas de
muestra, transportación y manipulación. identificación.
Puede ser utilizada durante el tratamiento de un Se requiere equipo más específico para el
antimicrobiano. diagnóstico, lo cual eleva la inversión inicial.
Las muestras pueden ser congeladas para un
análisis posterior.
El ADN puede ser transportado entre
laboratorios fácilmente
14
Cocolina et al., 2011, Mandal et al., 2011, Velusamy et al., 2010, Rodríguez-Herrera et al., 2009,
Rojas y Herrera 2006.
Podemos apreciar que las fortalezas y oportunidades lograrían enmascarar a las debilidades y
amenazas en la aplicación del análisis molecular de patógenos en los alimentos.
Casi todos los métodos rápidos se diseñan para detectar un solo microorganismo blanco, lo cual lo
hace ideal para utilizarlo en programas de control de calidad y analizar rápidamente un gran número
de muestras de alimentos para la presencia de un patógeno en particular o una toxina. Un resultado
positivo por un método rápido sin embargo, es solo considerado como presuntivo y se debe
confirmar por los métodos estándar. Aunque la confirmación podría tardar varios días, esto podría
no ser una limitación de imposición, ya que la mayoría de los análisis de alimentos resultan
negativos (BAM, 2001).
Una de las ventajas que presentan estos métodos es que son más rápidos que los tradicionales, la
mayoría de ellos se puede hacer desde unos cuantos minutos hasta pocas horas. Sin embargo,
cuando son usados en el análisis de alimentos aún carecen de suficiente sensibilidad y especificidad
para una prueba directa. Por esta razón, las muestras de alimento requieren de un enriquecimiento
previo antes de ser analizados. Aunque el enriquecimiento es una limitante en términos del tiempo
del ensayo, provee beneficios como la dilución de los efectos de los inhibidores, la diferenciación
entre células viables y no viables y permite la reparación del estrés celular o daño celular causados
por los procesos a los que se someten los alimentos (BAM, 2001).
La evaluación de métodos rápidos ha mostrado que algunos tienen un mejor desempeño en ciertos
tipos de alimentos que otros métodos. Esto se puede atribuir principalmente a interferencias de los
componentes de la misma muestra, algunos de los cuales pueden ser especialmente complicados
para las tecnologías de los métodos rápidos. Por ejemplo, un ingrediente presente en el alimento
puede inhibir la hibridización del ADN o la acción de la Taq polimerasa, pero este mismo
ingrediente no tiene efecto en las interacciones antígeno anticuerpo o viceversa. Debido a que la
eficiencia de los métodos podría ser dependiente del alimento, se recomienda realizar estudios
comparativos para asegurar que un ensayo particular será efectivo en el análisis de ese tipo de
alimento.
La especificidad de los ensayos de ADN es dirigida por sondas cortas; así, un resultado positivo
basado en una sonda o cebador específico para el gen de una toxina solo indica está presente la
bacteria que contiene la secuencia de ese gen y que tiene el potencial de ser toxigénico. No
obstante, esto no indica que el gen está siendo expresado y que está presente la toxina.
15
Símbolos, acrónimos y abreviaturas
± más menos PM peso molecular
/ signo de división RVBA agar-rojo-violeta-bilis-lactosa
⁰C Celsius s segundo
% por ciento UFC unidades formadoras de colonias
1/d inversa de la dilución spp especies plurales
ATCC American Type Culture Collection v volumen
ß beta x signo de multiplicación
cbp cuanto basta para NIBSC National Institute for Biological

Standards and Control
CIP Culture International Production
LGC Laboratory of the Government
cm centímetro Chemistry, Reino Unido
cm2 centímetro cuadrado BS British Standards
g gramo CFIA (Agencia Canadiense de Inspección de
Alimentos por sus siglas en inglés)
h hora
ISO International Standards Organization
kg kilogramo
l, L litro
lb libras
μm micrómetro
M molar
ml, mL mililitro
mm milímetro
min minuto
N normal
NCTC National Culture Type Collection
NMP número más probable
p peso
p. ejem. por ejemplo
pH potencial de hidrógeno
16
DISCUSIÓN Y GUIA DEL USUARIO DEL MANUAL INTEGRADO

DE LA NORMATIVIDAD Y MÉTODOS DE DETECCIÓN Y
MEDICIÓN DE ORGANISMOS MICROBIOLÓGICOS EN
ALIMENTOS COMO VEGETALES Y FRUTAS FRESCAS,
PRODUCTOS DEL MAR Y CÁRNICOS DE ANIMALES
TERRESTRES
NORMAS OFICIALES Y REGULACIONES NACIONALES E INTERNACIONALES RELACIONADAS CON LOS
MÉTODOS PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS
Para la realización del manual se consultaron las siguientes normas oficiales y regulaciones
nacionales e internacionales relacionadas con los métodos para el análisis microbiológico de
alimentos en productos para consumo humano incluidos productos frescos de vegetales, frutas,
carne de animales terrestres y productos del mar (Ver Tablas 4 y 5).
Tabla 4. Normatividad nacional e internacional que rige los procedimientos para la toma, manejo y
preparación de las muestras de alimentos revisada para la realización del manual.
Objeto y campo de
aplicación Normas aplicables
Procedimientos para la toma, NOM 109-SSA1-1994

manejo y transporte de BAM Capítulo 1: Muestreo de alimentos y preparación de la
muestras muestra homogeneizada
BS 5763: Part 0: 1986
NOM 110-SSA1-1994
UNE/ISO 6887-1
Preparación y dilución de
muestras BAM Capítulo 1: Muestreo de alimentos y preparación de la
muestra homogeneizada
BS 5763: Part 0: 1986
NOM: Norma Oficial Mexicana, UNE/ISO: Comité Europeo de Normalización-Asociación Española de
Normalización y Certificación, BAM: Manual Analítico Bacteriológico, BS: Institución de Normas
Británicas.
Tabla 5. Normatividad nacional e internacional revisada para la realización del manual para
determinar microorganismos patógenos en alimentos de consumo humano y animal.
Objeto y campo de
aplicación Normas aplicables
NOM 112-SSA1-1994
Bacterias coliformes y NOM 113-SSA1-1994
Escherichia coli NOM-242-SSA1-2009
UNE/ISO 16654:2002
17
BAM Capítulo 4. Recuento de Escherichia coli y bacterias

coliformes
BS 5763: Part13: 1989
BS 5763: Part 10: 1993
Escherichia coli O157 BAM Capitulo 4A. Escherichia coli diarreogénica
NOM 143-SSA1-1995
NOM-242-SSA1-2009
UNE/ISO 11290-1:1997
Listeria spp. y L. UNE/ISO 11290-2:2000
monocytogenes
BAM Capítulo 10. Detección y recuento de Listeria
monocytogenes en los alimentos; Protocolo: Confirmación
simultánea de especies aisladas de Listeria y L. monocytogenes por
PCR en tiempo real.
NOM 115-SSA1-1994
NOM-242-SSA1-2009
UNE/ISO 6888-1: 1999
Staphylococcus aureus UNE/ISO 6888-2:1999
UNE/ISO 6888-3:2003
BAM Capítulo 12. Staphylococcus aureus
BS 5763: Part 7: 1983
NOM 114-SSA1-1994
NOM-242-SSA1-2009
Salmonella spp.
UNE/ISO 6579:2002
BAM Capítulo 5. Salmonella
NOM-242-SSA1-2009
Vibrio BAM Capítulo 9. Vibrio
BS 5763:Part14:1991
NOM: Norma Oficial Mexicana, UNE/ISO: Comité Europeo de Normalización-Asociación Española de
Normalización y Certificación, BAM: Manual Analítico Bacteriológico, BS: Institución de Normas
Británicas.
Normas oficiales y regulaciones nacionales e internacionales relacionadas con los métodos

para el análisis microbiológico de alimentos en productos frescos de vegetales, frutas, carne de
animales terrestres y productos del mar.
Ante la necesidad imperante de países en vías de desarrollo de actualizar su tecnología, equipos,

infraestructura y métodos de detección rápida y efectiva de microorganismos; utilizados para la
exportación de productos alimenticios a mercados que exigen el ingreso de alimentos inocuos para
su población y estableciendo en sus fronteras para lograrlo, de estrictos y rigurosos sistemas de
monitoreo de embarques alimenticios vía terrestre o marítima..
Ante esta problemática, en la que el exportador requiere cumplir con los criterios de aceptación del
país que importará su producto, exige a sus gobiernos planes, programas y estrategias que le
18
permitan estar a la vanguardia en métodos para el análisis microbiológico del alimento a exportar y
le asegure el ingreso de su producto en esos mercados.
México no es la excepción, que teniendo tratados bilaterales y de libre comercio, sus productos
deben cumplir con los criterios de aceptación del mercado importador, por lo que se ve en la
necesidad de apoyar a sus productores con metodologías actualizadas, rápidas y precisas; y así dar
el cumplimiento a estos criterios dando paso a normas oficiales y regulaciones nacionales e
internacionales en el aspecto de determinación de microorganismos microbiológicos.
En términos de producción de alimentos y capacidad de adquirirlos, los países se dividen en tres

grupos: 1) Los que tienen la capacidad agrícola para ser autosuficientes en la producción de
alimentos; 2) Los que no son autosuficientes en la producción de alimentos pero tienen otros
recursos que les permiten importar suministros alimentarios adecuados; y 3) Los que no son
autosuficientes en la producción de alimentos y no poseen los recursos financieros necesarios para
cubrir el déficit con importaciones. Siendo México incluyente dentro del primer grupo tiene
establecidas las siguientes normas con las cuales regula dentro del territorio mexicano los productos
alimenticios que son generados tanto para exportación o el consumo de los mismos dentro del país.
• Norma Oficial Mexicana NOM-110-SSA1-1994, bienes y servicios. Preparación y dilución

de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.
• Norma Oficial Mexicana NOM-114-SSA1-1994, bienes y servicios. Método para la
Determinación de Salmonella en Alimentos.
• Norma Oficial Mexicana NOM-115-SSA1-1994, bienes y servicios. Método para la
determinación de Staphylococcus aureus en alimentos.
• Norma Oficial Mexicana NOM-143-SSA1-1995, bienes y servicios. Método de prueba
microbiológico para alimentos. Determinación de Listeria monocytogenes.
Algunas tendencias en las que se conjuga no solo la búsqueda de alimentos saludables sino la
posibilidad de alimentarse adecuadamente en el difícil mundo de hoy, muestran que el público
general busca alimentos menos procesados con aspecto y calidad similares a los recién preparados.
Entre estos se incluyen : alimentos frescos o mínimamente procesados, platos preparados o
precocinados (refrigerados, congelados), productos semipreparados o precocidos que sólo requieren
calentamiento para su consumo y la “comida rápida” en la que se valora que sea rápida de
consumir, fácil de llevar y que además sean productos saludables. Ante esta situación el control
biológico de estos alimentos requiere de metodologías microbiológicas que le permitan identificar y
cuantificar en forma eficiente y rápida, por la vida de anaquel tan corta que presentan estos
alimentos. Los microorganismos son responsables de algunas de las más serias intoxicaciones
alimentarias y causan también la descomposición de una gran variedad de alimentos.
Ante esta temática, es importante la actualización e incorporación a la normatividad mexicana de

nuevas guías determinativas más adecuadas y con el alcance necesario que el productor mexicano
requiera para la colocación de sus productos alimenticios en mercados tanto nacionales como
internacionales, como lo son las normas ISO y algunos métodos rápidos del BAM (Bacteriological
Analytical Manual), USDA Laboratory Guide Notebook, por mencionar algunos.
Desarrollo de métodos
Desde la década del 70, el desarrollo y la implementación de los métodos rápidos para la
identificación de microorganismos evolucionaron en paralelo con los adelantos en otras áreas de la
investigación científica, en particular con la generalización del uso de galerías de pruebas
bioquímicas miniaturizadas.
19
A partir de la década del 80, el avance en la producción de anticuerpos monoclonales hizo posible el
desarrollo de pruebas inmunológicas de identificación, como el ELISA o la inmunocromatografía.
En 1990, con el advenimiento de las técnicas de biología molecular comenzaron a utilizarse

técnicas como la PCR, tanto para tamizaje como para la identificación de microorganismos y sus
factores de virulencia.
A partir del año 2000, comenzó el desarrollo de biosensores y en menor medida de biochips y
microarreglos.
El crecimiento exponencial de los métodos rápidos aplicados a la microbiología de los alimentos

puede evidenciarse en la gran cantidad de equipos comerciales que se ofrecen en la actualidad con
el objetivo de tener resultados rápidos, en tiempo real, exactos y de bajo costo. Por ejemplo, como
consecuencia de la automatización, el estudio de genotipos bacterianos pasó de ser un proceso
tedioso y lento a un método práctico que se puede aplicar en los ensayos microbiológicos
cotidianos.
Los factores que justifican la utilización de métodos rápidos e impulsan su desarrollo son
numerosos, entre ellos se pueden mencionar las presiones regulatorias, las modernas prácticas de
producción y la complejidad analítica.
Para hacer frente a las presiones regulatorias, la industria alimentaria debe utilizar métodos oficiales
de referencia, como los recomendados por la ISO (International Standards Organization) y AOAC
(International Association of Official Analytical Chemists), entre otras. Actualmente, algunos
métodos rápidos son recomendados como técnicas de tamizaje por agencias regulatorias
internacionales. En consecuencia, la oferta de métodos rápidos es cuantiosa. Sin embargo, se debe
considerar que antes de la adopción de nuevos métodos por parte de la industria, estos deben tener
constancia del proceso de estandarización y validación ante entidades internacionales, o bien en
instancias inter e intralaboratorio.
Algunos métodos para la detección de patógenos evolucionaron desde los análisis estándar
realizados en el laboratorio, hacia análisis efectuados en tiempo real en la línea de producción. Esta
tendencia hacia las pruebas en tiempo real, que surgió debido a la necesidad de ofrecer información
de utilidad durante la operación de producción de alimentos, se trata de un esfuerzo para superar en
parte las deficiencias de los métodos convencionales cuyos resultados no se pueden utilizar para
controlar el proceso in situ.
En el presente, la industria de alimentos basa la seguridad y calidad de sus productos en pruebas o

medidas fuera de la línea de producción. Sin embargo, las nuevas tendencias hacen cada vez más
necesaria la implementación de un sistema de medición continua y en tiempo real, que haga posible
la intervención in-line u on-line.
Las medidas de intervención in-line son aquellas que se efectúan directamente en la línea del
proceso y las medidas de intervención on-line son aquellas que pueden efectuarse en un asa by-pass
de la línea principal del proceso y que luego de la medida se retorna a la línea principal.
Desde una perspectiva futurista, el Dr. Daniel Fung, profesor de la Universidad de Kansas y uno de
los mayores expertos sobre métodos rápidos aplicados a la microbiología de alimentos, propuso el
siguiente escenario para los próximos años:
1) no se podrá reemplazar el recuento de microorganismos viables,
20
2) la supervisión de la higiene con métodos rápidos se efectuará en tiempo real,
3) las técnicas genotípicas serán habituales en los laboratorios de alimentos,
4) las pruebas inmunológicas serán automatizadas,
5) los resultados más rápidos se obtendrán con inmunocromatografía,
6) en los programas de análisis de peligros y de puntos críticos de control o HACCP (siglas en

inglés) se utilizarán biosensores,
7) los patógenos se detectarán inmediatamente de forma computarizada,
8) se realizará la separación y la concentración eficaz de las bacterias buscadas,
9) se utilizará un sistema de alerta microbiológico en los envases de alimentos,
10) los consumidores tendrán dispositivos de alerta rápido para detectar patógenos en sus hogares.
Como se puede deducir, el desarrollo de métodos rápidos está dirigido hacia las empresas
productoras de alimentos en primera instancia y luego a los consumidores. Sin embargo, se debe
considerar que para los organismos municipales, provinciales o nacionales responsables del control
de los alimentos no es habitual el uso de métodos rápidos, sobre todo de métodos moleculares. Esto
se debe a que actualmente la tendencia internacional de los organismos de control está orientada al
aseguramiento de los programas de HACCP utilizados por las empresas productoras de alimentos y
no al análisis microbiológico del producto final. Aunque en países como el nuestro, donde la
aplicación de este tipo de programas de control aún no es de cumplimiento obligatorio, no es
posible asegurar que la oferta de alimentos en la boca de expendio provenga de empresas que
utilizan programas HACCP.
Es entonces cuando la utilización de los métodos rápidos puede agilizar y mejorar los resultados
generados por los organismos de control. Sin embargo, también se debe considerar que para la
utilización de los métodos rápidos, además de inversiones y operadores capacitados, se requieren
políticas estatales de control tendientes a asegurar la calidad de los alimentos que consumimos.
Características principales de los microorganismos patógenos más relevantes considerados en

la normatividad de productos de la pesca y la acuicultura, por su implicación en salud pública
y por ser causa de detenciones y notificaciones de producto en el ámbito internacional.
(Representa el fundamento científico para considerar la conveniencia o no de la regulación de un

patógeno en un alimento).
El estudio de las ETAs de origen acuático en el ámbito mundial, se ha incrementado notablemente

en las últimas tres décadas, debido a diversos factores:
a) Culturales, que ha implicado mayor apertura a productos del mar que anteriormente no se
consumían o estaban restringido a ciertas tradiciones o hábitos culinarios;
b) Sociales, incremento de las poblaciones humanas y con ello de la demanda de proteínas de

calidad. Al mismo tiempo, las ETAs son motivo de ausencia al trabajo, gastos médicos y pérdidas
económicas;
21
c) Comerciales, la globalización del comercio de alimentos permite ahora el acceso a

productos de diferentes países sin un adecuado control que garantice su condición de inocuidad,
causa detenciones y notificaciones de producto, cancelación de ventas y en ocasiones hay
desperdicio del producto.
d) Deficiencias en prácticas de higiene. Falta de capacitación y conocimiento en el manejo

adecuado de estos productos en toda la cadena de producción, procesamiento, comercialización y
consumo;
e) Intensificación de la producción acuícola y pesquera. Debido a la presión que ejerce la

demanda de pescados y mariscos sobre estos sistemas de producción, el esfuerzo pesquero y las
densidades de organismos que se manejan son cada vez mayores y con ello, los riesgos de
contaminación y diseminación de patógenos también se han incrementado;
f) Otras actividades antropogénicas han ocasionado cambios relacionados con la calidad de

agua en cuerpos naturales y con ello los niveles de contaminación microbiológica;
g) Aparición de nuevas cepas o variantes patógenas;
Los patógenos más relevantes que se han relacionados con las ETAs, de origen acuáticos, son:
Salmonella spp., E. coli, V. cholerae, V. parahaemolyticus y V. vulnificus, las enfermedades son
causadas por los microorganismos y/o sus toxinas y la mayoría se manifiestan como cuadros
gastrointestinales, que varían en gravedad y duración.
El Centro de Control y Prevención de Enfermedades (CDC) ha estimado 76 millones de casos, con

5 000 muertos y 325 000 hospitalizaciones relacionadas con las ETAs cada año en EE. UU. y un
gran porcentaje han estado relacionadas con pescados y mariscos. Se considera que las
enfermedades causadas por Campylobacter, Salmonella, E. coli O157, y Listeria monocytogenes
tienen costos de casi US$ 7 billones cada año.
En países en desarrollo, se calcula en 2 millones de niños las mortalidades por enfermedades

diarreicas causadas por alimentos y agua contaminada cada año, siendo la causa más común los
patógenos virales y bacterianos.
En México el consumo de productos pesqueros es de aproximadamente 1.3 millones de toneladas

anuales, de las cuales el 5.66 % son de consumo de camarón. La contaminación de este producto
por diversos microorganismos patógenos, lo convierten en fuente importante de ETAs; de esta
manera en el año de 1999, se notificaron 163 brotes de ETAs determinándose 2 427 personas
enfermas y 9 defunciones; en el 2005, se informó de 191 brotes con 4 771 enfermos y 17 decesos,
este informe indicó que el número de brotes asociados con el consumo de pescados fue del 6.3 %, lo
que significó el 4º lugar entre los alimentos más involucrados con brotes de ETAs. En relación con
los agentes etiológicos, sólo en el 56 % de los brotes se identificó su naturaleza, de los cuales 12.9
% fueron de origen bacteriano (Pérez et al., 2005).
Revisión y análisis de la normatividad nacional e internacional más importante en el campo

de la microbiología, para garantizar la inocuidad en alimentos de origen acuático.
Nacional.
22
El Gobierno Mexicano tiene como prioridad el establecimiento de políticas que promuevan la

inocuidad de los alimentos, mediante la implementación de sistemas de reducción de riesgos en
unidades de producción, extracción y procesamiento primario de alimentos de origen acuícola y
pesquero, tanto para disminuir la incidencia de enfermedades ocasionadas a la población por la
contaminación de los mismos, como para asegurar e incrementar su comercialización interna y de
exportación.
El marco legal y normativo para garantizar la inocuidad de los alimentos de origen acuático en
México, es responsabilidad de SAGARPA a través del SENASICA (Servicio Nacional de Sanidad,
Inocuidad y Calidad Agroalimentaria) y es un tema principal en la agenda dentro de las actividades
primarias. Este organo tiene competencia sobre la inocuidad de los alimentos a partir del 2001 y
esta respaldado en la Ley General de Pesca y Acuicultura Sustentables actualizada en el 2009.
El Reglamento interior establece atribuciones específicas al SENASICA en el artículo 49, las cuales
son:
Establecer políticas, lineamientos, criterios, sistemas, estrategias, programas, proyectos,

procedimientos y servicios que coadyuven a mejorar la inocuidad de los alimentos de origen
animal, vegetal, acuícola y pesquero.
Proponer disposiciones generales a través de reglamentos y normas oficiales mexicanas

para garantizar la inocuidad de los alimentos y sus procesos de producción, procesamiento,
almacén, empaque, transporte y distribución.
Reconocer, autorizar y en su caso, certificar los sistemas de producción, procesamiento,

verificación e inspección de alimentos con el fin de garantizar su calidad sanitaria para consumo
nacional o exportación.
La Secretaría de Salud en México, es la encargada de regular los aspectos relacionados a la salud de

las personas. La Ley General de Salud reglamenta el derecho a la protección de la salud que tiene
toda persona en los términos del artículo 4° de la Constitución Política de los Estados Unidos
Mexicanos, el cual establece que “Toda persona tiene derecho a la alimentación nutritiva, suficiente
y de calidad. El estado lo garantizará” (decreto publicado en el DOF del 13 de octubre de 2011). Es
de aplicación en toda la República y sus disposiciones son de orden público e interés social.
Finalmente, cuenta con reglamentos específicos sobre los productos acuáticos, como el Reglamento
de Control Sanitario de Productos y Servicios (DOF miércoles 26 de enero 2011).
El siguiente es un listado de la reglamentación en materia de inocuidad y presenta las normas y

otros documentos que son aplicados en México como guías y directrices en relación a las
especificaciones sanitarias y de higiene, así como a métodos y técnicas para la detección de los
microorganismos patógenos más importantes y reconocidos como responsables de enfermedades
transmitidos por alimentos (ETAS) de origen acuáticos (pesca y acuicultura). Aplica a los procesos
productivos, transporte, almacenamiento, procesamiento y venta de crustáceos, moluscos y peces en
diferentes presentaciones. La normativa plantea también la aplicación de un sistema de análisis de
riesgos y control de puntos críticos (HACCP) en plantas procesadoras y de buenas prácticas como
medidas preventivas.
1. Secretaría de Salud. “Método de prueba para la estimación de la densidad microbiana por la

técnica del número más probable (NMP), detección de coliformes totales, coliformes
fecales y Escherichia coli.” CCAYAC-M-004. Revisión No. 8. Fecha de emisión: 25 Nov.
2011. México. 34p.
23
2. NOM-027-SSA1-1993, bienes y servicios. Productos de la pesca. Pescados frescos-

refrigerados y congelados. Especificaciones sanitarias.
3. NOM-028-SSA1-1993, bienes y servicios. Productos de la pesca. Pescados en conserva.
Especificaciones sanitarias.
4. NOM-029-SSA1-1993, bienes y servicios. Productos de la pesca. Crustáceos frescos-
refrigerados y congelados. Especificaciones sanitarias.
5. NOM-030-SSA1-1993, bienes y servicios. Productos de la pesca. Crustáceos en conserva.
Especificaciones sanitarias.
6. NOM-031-SSA1-1993, bienes y servicios. Productos de la pesca. Moluscos bivalvos
frescos-refrigerados y congelados. Especificaciones sanitarias.
7. NOM-032-SSA1-1993, bienes y servicios. Productos de la pesca. Moluscos bivalvos en
conserva. Especificaciones sanitarias.
8. PROY-NOM-109-SSA1-1994, bienes y servicios. Procedimientos para la toma, manejo y
transporte de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.
9. NOM-110-SSA1-1994, bienes y servicios. Preparación y dilución de muestras de alimentos
10. NOM-112-SSA1-1994, bienes y servicios. Determinación de bacterias coliformes. Técnica
del número más probable.
11. NOM-113-SSA1-1994, bienes y servicios. Método para la cuenta de microorganismos
coliformes totales en placa.
12. NOM-114-SSA1-1994, bienes y servicios. Método para la determinación de Salmonella en
alimentos.
13. NOM-115-SSA1-1994, bienes y servicios. Método para la determinación de
Staphylococcus aureus en alimentos.
14. NOM-128-SSA1-1994, bienes y servicios. Que establece la aplicación de un sistema de
análisis de riesgos y control de puntos críticos en la planta industrial procesadora de
productos de la pesca.
15. NOM-129-SSA1-1995. Bienes y servicios. Productos de la pesca: secos salados, ahumados,
moluscos cefalópodos y gasterópodos frescos-refrigerados y congelados. Disposiciones y
especificaciones sanitarias.
16. NOM-143-SSA1-1995, bienes y servicios. Método de prueba microbiológico para
alimentos. Determinación de Listeria monocytogenes.
17. NOM-242-SSA1-2009, Productos y servicios. Productos de la pesca frescos, refrigerados,
congelados y procesados. Especificaciones sanitarias y métodos de prueba
18. NOM-251-SSA1-2009, Prácticas de higiene para el proceso de alimentos, bebidas o
suplementos alimenticios.
19. NMX-F-539-SCFI-2009 Productos de la pesca - filetes de anchoa en aceite enlatados –
especificaciones.
20. NOM–242-SSA1-2009, Productos y servicios. Productos de la pesca frescos, refrigerados,
congelados y procesado. Especificaciones sanitarias y métodos de prueba”.
La mayoría de las normas no indican concordancia con normas internacionales, otras solo señalan
equivalencia parcial, sin embargo los métodos y técnicas a los que hacen mención, están basados en
procedimientos estandarizados y recomendados en el ámbito internacional. En la Tabla 6 se
presenta de manera resumida, información relevante y particular de cada norma y la manera como
se complementa con otras.
En particular, la NOM-242-SSA1-2009 es de reciente publicación en el Diario Oficial de la

Federación (Febrero 2011) y está basada en información científica, reglamentos e instrumentos
nacionales e internacionales de EE. UU., Canadá, Australia, Unión Europea (UE) y organismos
24
como FAO, OMS, OIE y OMC. Integra información relacionada con técnicas y métodos para la
detección de los principales patógenos relacionados con ETAs de origen acuático (Salmonella spp.
Staphylococcusaureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Vibrio cholerae, Vibrio
parahaemolyticus y Vibrio vulnificus), así como para Clostridium spp. y coliformes.
Pese a lo anterior, dicha norma no toma en cuenta los adelantos científicos y nuevas tecnologías
desarrolladas en las últimas dos décadas en materia de análisis microbiológico y diagnóstico, ni de
adecuaciones a los métodos analíticos convencionales que pudieran ofrecer mayores beneficios a
los usuarios en términos de automatización, especificidad, sensibilidad, capacidad y tiempo de
respuesta, disminución de costos, discriminación de cepas toxigénicas y principalmente del nivel
de seguridad en la inocuidad de los alimentos.
Tabla 6.- NORMAS MEXICANAS DESTINADAS A ASEGURAR LA INOCUIDAD DE

PRODUCTOS DERIVADOS DE LA PESCA Y ACUICULTURA.
NOMBRE DE LA CAMPO DE FUNDAMENTO

NORMA APLICACIÓN
25
Secretaría de Salud. Este método es aplicable La detección de bacterias coliformes se

“Método de prueba para para la detección de usa como indicador de la calidad
la estimación de la coliformes totales, sanitaria de agua o como indicador de
densidad microbiana por coliformes fecales y E. coli, condiciones sanitarias en el
la técnica del número más especialmente en productos procesamiento de alimentos. Las
probable (NMP), que se encuentran en bajas coliformes fecales continúan siendo el
detección de coliformes concentraciones de indicador de elección para moluscos
totales, coliformes microorganismos (<10 bivalvos y sus aguas de cultivo y E.
fecales y Escherichia UFC/g o ml). Por ejemplo: coli como indicador de contaminación
coli.” CCAYAC-M-004. alimentos cuyas fecal reciente o condiciones higiénicas
Revisión No. 8. Fecha de características particulares inadecuadas. El método se basa en la
emisión: 25 Nov. 2011. puedan interferir en la fermentación de la lactosa y el NMP es
México. 34p. exactitud de la cuenta de una prueba presuntiva y confirmativa.
unidades formadoras de La serie de 3 tubos generalmente se
Concordancia: El colonias (UFC). utiliza para la mayoría de los
documento no menciona alimentos, la serie de 5 tubos se emplea
concordancia con normas para moluscos y para diversos tipos de
internacionales. Sin aguas, las series de 3, 5, y 10 tubos
embargo la metodología dependiendo de la contaminación
que presenta se basa en esperada y del grado de exactitud
procedimientos deseado. Se basa en la dilución de la
estandarizados y muestra en tubos múltiples, de tal
recomendados en el forma que todos los tubos de la menor
ámbito internacional. dilución sean positivos y todos los
tubos de la mayor dilución sean
negativos. El resultado positivo se
demuestra por la presencia de gas y/o
crecimiento microbiano propiedad de
los microorganismos coliformes para
producir gas a partir de la fermentación
de lactosa dentro de las 48 horas
incubación a 35 ± 0.5 °C (coliformes) y
a 45.5 ± 0.2 °C (coliformes fecales y E.
coli).
NORMA OFICIAL Establece las Las enfermedades transmitidas por

MEXICANA NOM-027- especificaciones sanitarias de alimentos, en su mayoría son de tipo
SSA1-1993, bienes y los pescados frescos- infeccioso, su incidencia sigue
servicios. Productos de la refrigerados y congelados. constituyendo un grave problema de
pesca. Pescados frescos- salud pública y es una de las causas
refrigerados y Es de observancia obligatoria principales de morbilidad que ocupan
congelados. en el territorio nacional para el segundo lugar entre las
Especificaciones las personas físicas o enfermedades transmisibles de
sanitarias. morales que se dedican a su notificación obligatoria. Entre los
proceso o importación. alimentos involucrados resaltan el
Concordancia: Esta Presenta el método de prueba pescado fresco-refrigerado y
Norma no menciona para la determinación congelado, debido a que por su origen,
concordancia con normas microbiológica de Vibrio es probable la contaminación
internacionales. Se cholerae (NOM-031-SSA1- microbiológica y química, entre otras y
que aunado a la forma de consumo,
26
complementa con: 1994). pueden generar enfermedades para el

consumidor.
NOM-031-SSA1-1993; Establece el límite máximo
permisible para: Mesofílicos Una norma oficial Mexicana que regule
NOM-051-SFCI-1994; aerobios, Coliformes a estos productos desde el punto de
fecales, Staphylococcus vista sanitario, permitirá promover el
NOM-092-SSA1-1994; aureus, Vibrio cholerae O1 consumo de los mismos y a la vez
NOM-112-SSA1-1994; toxigénico y Salmonella proteger la salud del consumidor.
spp.
NOM-113-SSA1-1994;
NOM-114-SSA1-1994;
NOM 115-SSA1-1994;
NOM-120-SSA1-1994;
NOM-128-SSA1-1994.

SSA1-1993, bienes y los pescados en conserva. Es infeccioso, su incidencia sigue
servicios. Productos de lade observancia obligatoria en constituyendo un grave problema de
pesca. Pescados en el territorio nacional para las salud pública y es una de las causas
conserva. personas físicas o morales principales de morbilidad que ocupan
Especificaciones que se dedican a su proceso el segundo lugar entre las
sanitarias. o importación. Establece enfermedades transmisibles de
como requisito, la ausencia notificación obligatoria. Entre los
Concordancia: Esta de: alimentos involucrados resaltan los
norma no menciona pescados en conserva, debido a que
concordancia con normas Mesofílicos aerobios, estos productos en su origen están
internacionales. Mesofílicos anaerobios, sometidos a una contaminación
Termofílicos aerobios y microbiológica y química entre otras
Se complementa con: Termofílicos anaerobios. y que aunado a la forma de consumo
NOM-120-SSA1-1994 y generan enfermedades para el
consumidor.
NOM-128-SSA1-1994.
Una norma oficial Mexicana que regule
a estos productos desde el punto de
vista sanitario, permitirá promover el
consumo de los mismos y a la vez
proteger la salud del consumidor.
Los productos con un pH superior a 4.6

deben recibir un tratamiento capaz de
destruir todas las esporas de
Clostridium botulinum, a menos que la
proliferación de las esporas
supervivientes quede impedida en
forma permanente por otras
27
características distintas del pH.

SSA1-1993, bienes y los crustáceos frescos- infeccioso, su incidencia sigue
servicios. Productos de la refrigerados y congelados. constituyendo un grave problema de
pesca. Crustáceos salud pública y es una de las causas
frescos-refrigerados y Es de observancia obligatoria principales de morbilidad que ocupan
congelados. en el territorio nacional para el segundo lugar entre las
Especificaciones las personas físicas o enfermedades transmisibles de
sanitarias. morales que se dedican a su notificación obligatoria. Entre los
proceso o importación. alimentos involucrados resaltan los
Concordancia: Presenta el método de prueba crustáceos frescos-refrigerados y
para la determinación congelados, debido a que estos
Esta Norma no menciona microbiológica de Vibrio productos en su origen están sometidos
concordancia con normas cholerae (NOM-031-SSA1- a una contaminación microbiológica y
internacionales. 1994). química entre otras, que aunado a la
Se complementa con: forma de consumo generan
Establece el límite máximo enfermedades para el consumidor.
permisible para:
NOM-027-SSA1-1993;
Mesofílicos aerobios, a estos productos desde el punto de
NOM-031-SSA1-1993; Coliformes fecales, vista sanitario, permitirá promover el
NOM-092-SSA1-1994 Staphylococcus aureus, consumo de los mismos y a la vez
Vibrio cholerae O1 proteger la salud del consumidor.
NOM-110-SSA1-1994 toxigénico y Salmonella
spp.
NOM-112-SSA1-1994
NOM-113-SSA1-1994
NOM-114-SSA1-1994
NOM-115-SSA1-1994
NOM-120-SSA1-1994
NOM-128-SSA1-1994
NORMA Oficial Establece las

Las enfermedades transmitidas por
Mexicana NOM-030- especificaciones sanitarias de
alimentos, en su mayoría son de tipo
SSA1-1993, bienes y los crustáceos en conserva. infeccioso, su incidencia sigue
servicios. Productos de Es de observancia obligatoriaconstituyendo un grave problema de
la pesca. Crustáceos en en el territorio nacional para
salud pública y es una de las causas
conserva. las personas físicas o principales de morbilidad que ocupan
Especificaciones morales que se dedican a su el segundo lugar entre las
sanitarias. proceso o importación. enfermedades transmisibles de
notificación obligatoria. Entre los
Establece como requisito, la alimentos involucrados resaltan los
ausencia de: crustáceos en conserva, debido a que
Concordancia: estos productos en su origen están
Mesofílicos aerobios, sometidos a una contaminación
28
Esta norma no tiene Mesofílicos anaerobios, microbiológica y química entre otras,

concordancia con normas Termofílicos aerobios y que aunado a la forma de consumo
internacionales. Termofílicos anaerobios. generan enfermedades para el
consumidor.
Se complementa con:
NOM-120-SSA1-1994 a estos productos desde el punto de
NOM-128-SSA1-1994 consumo de los mismos y a la vez

MEXICANA NOM-031- especificaciones sanitarias de
alimentos, en su mayoría son de tipo
SSA1-1993, bienes y los moluscos bivalvos infeccioso, su incidencia sigue
servicios. Productos de la frescos-refrigerados y constituyendo un grave problema de
pesca. Moluscos congelados. salud pública y es una de las causas
bivalvos frescos- principales de morbilidad que ocupan
refrigerados Es de observancia obligatoria el
y segundo lugar entre las
congelados. en el territorio nacional para enfermedades transmisibles de
Especificaciones las personas físicas o notificación obligatoria. Entre los
sanitarias. morales que se dedican a su alimentos involucrados resaltan los
proceso o importación. moluscos frescos-refrigerados y
Concordancia: congelados, debido a que estos
Establece el límite máximo productos en su origen están sometidos
Esta norma no tiene permisible para a una contaminación microbiológica y
concordancia con normas microrganismos química entre otras, que aunado a la
internacionales. forma de consumo generan
Mesofílicos aerobios,
Se complementa con: Bacterias coliformes fecales, enfermedades para el consumidor.
Salmonella spp. y Vibrio Debido a lo anterior y a la fisiología de
NOM-092-SSA1-1994 cholerae 01 toxigénico, en los moluscos, se hace necesaria la
carne y liquido intervalvar. regulación y clasificación de las áreas
NOM-110-SSA1-1994 De igual manera en áreas de de producción.
NOM-112-SSA1-1994 producción clasificadas Una norma oficial Mexicana que regule
como: Área aprobada, área a estos productos desde el punto de
NOM-114-SSA1-1994 aprobada condicionalmente, vista sanitario, permitirá promover el
área restringida y área consumo de los mismos y a la vez
NOM-120-SSA1-1994 prohibida. proteger la salud del consumidor.
NOM-128-SSA1-1994 Describe la técnica y
procedimientos para la
investigación de Vibrio
cholerae en moluscos
bivalvos y el procedimiento
para la diferenciación de V.
cholerae O1, V.cholerae No
01 y otras especies de
Vibrios.
NORMA Oficial Establece las Las enfermedades transmitidas por

Mexicana NOM-032- especificaciones sanitarias de alimentos, en su mayoría son de tipo
29
SSA1-1993, bienes y los moluscos bivalvos en infeccioso, su incidencia sigue

servicios. Productos de la conserva. constituyendo un grave problema de
pesca. Moluscos salud pública y es una de las causas
bivalvos en conserva. Es de observancia obligatoria principales de morbilidad que ocupan
Especificaciones en el territorio nacional para el segundo lugar entre las
sanitarias. las personas físicas o enfermedades transmisibles de
morales que se dedican a su notificación obligatoria. Entre los
Concordancia: proceso o importación. alimentos involucrados resaltan los
moluscos bivalvos en conserva,
Esta norma no tiene Establece como requisito, la debido a que estos productos en su
concordancia con normas ausencia de: origen están sometidos a una
internacionales. contaminación microbiológica y
Mesofílicos aerobios,
Se complementa con: Mesofílicos anaerobios, química entre otras, que aunado a la
Termofílicos aerobios y forma de consumo generan
NOM-120-SSA1-1994 Termofílicos anaerobios. enfermedades para el consumidor.
Debido a lo anterior y a la fisiología de
NOM-128-SSA1-1994 los moluscos, se hace necesaria la
regulación y clasificación de las áreas
de producción.

a estos productos desde el punto de
consumo de los mismos y a la vez
PROYECTO de Norma Establece los procedimientos Destaca la importancia del muestreo, la

Oficial Mexicana NOM- para la toma, transporte y adecuada selección y toma de muestra,
109-SSA1-1994, bienes y manejo de muestras de los medios de conservación, su
servicios. alimentos para su análisis transporte al laboratorio, ya que son
microbiológico. Es de factores determinantes para la
Procedimientos para la observancia obligatoria en el obtención de resultados significativos y
toma, manejo y territorio nacional para las confiables.
transporte de muestras personas físicas o morales
de alimentos para su que requieren efectuar este
análisis microbiológico. procedimiento para el
análisis microbiológico de
Concordancia: alimentos nacionales y de
Esta norma no tiene importación.
concordancia con normas No hace distinción para
internacionales. algún alimento en
Se complementa con: particular, pero es de vital
importancia en alimentos
NOM-008-SCFI-1993 perecederos.
Norma Oficial Mexicana.
Sistema General de
Unidades de Medida.
Secretaría de Comercio y
30
Fomento Industrial.
NORMA OFICIAL Establece el procedimiento Se basa en la preparación de diluciones

MEXICANA NOM-110- para la preparación de primarias, para obtener una
SSA1-1994, bienes y diluciones para el análisis distribución lo más uniforme posible de
servicios. Preparación y microbiológico de productos los microorganismos presentes en la
dilución de muestras de alimenticios. porción de muestra.
alimentos para su
análisis microbiológico. Es de observancia obligatoria
en el territorio nacional para
Concordancia: las personas físicas o
morales que se dedican a
Esta norma es efectuar este método en
técnicamente equivalente alimentos nacionales o de
a la norma ISO 6887- importación, para fines
1983 (E) microbiology oficiales.
general guidance for the
preparation of dilutions
for microbiological
examination.
international organization
for standardization.
Se complementa con:
NOM-109-SSA1-1994.
NORMA OFICIAL Establece el método El método se basa en que las bacterias

MEXICANA NOM-112- microbiológico para estimar coliformes, fermentan la lactosa
SSA1-1994, bienes y el número de coliformes incubadas a 35 ± 1°C durante (24 a 48)
servicios. Determinación presentes en productos horas, resultando una producción de
de bacterias coliformes. alimenticios, por medio del ácidos y gas el cual se manifiesta en las
Técnica del número más cálculo del número más campanas de fermentación.
probable. probable (NMP).
Este procedimiento debe seleccionarse
Concordancia: Puede aplicarse a agua cuando la densidad esperada es como
potable, agua purificada, mínimo de una bacteria en 10 ml de
El documento no hielo y alimentos procesados producto líquido o una bacteria por
menciona concordancia térmicamente, así como a gramo de alimento sólido.
con normas muestras destinadas a
internacionales. Sin evaluar la eficiencia de Si la densidad microbiana se espera sea
embargo la metodología prácticas sanitarias en la mayor a 100 por mililitro o gramo de
que presenta se basa en industria alimentaria. muestra, ampliar el intervalo de
procedimientos diluciones o utilizar el método en
estandarizados y Es de observancia obligatoria placa.
recomendados en el en el territorio nacional para
ámbito internacional. las personas físicas o
morales que requieran
Se complementa con: efectuar este método en
productos nacionales o de
NOM-109-SSA1-1994 importación, para fines
31
NOM-110-SSA1-1994 oficiales.
NORMA OFICIAL Establece el método El método permite determinar el

MEXICANA NOM-113- microbiológico para número de microorganismos
SSA1-1994, bienes y determinar el número de coliformes presentes en una muestra,
servicios. Método para microorganismos coliformes utilizando un medio selectivo (agar
la cuenta de totales presentes en rojo violeta bilis) en el que se
microorganismos productos alimenticios por desarrollan bacterias a 35 °C en
coliformes totales en medio de la técnica de cuenta aproximadamente 24 h, dando como
placa. en placa. resultado la producción de gas y ácidos
orgánicos, los cuales viran el indicador
Es de observancia obligatoria de pH y precipitan las sales biliares.
en el territorio nacional para
Concordancia:. las personas físicas o
morales que requieran
El documento no efectuar este método en
menciona concordancia productos nacionales o de
con normas importación, para fines
internacionales. Sin oficiales.
embargo la metodología
que presenta se basa en
procedimientos
estandarizados y
recomendados en el
ámbito internacional.
Se complementa con:
NOM-109-SSA1-1994
NOM-110-SSA1-1994
NOM-092-SSA1-1994
NOM-112-SSA1-1994
NORMA OFICIAL Establece un método general El método describe de manera general

MEXICANA NOM-114- para la determinación de 5 pasos básicos para la detección de
SSA1-1994, bienes y Salmonella en alimentos. Salmonella.:
servicios. Método para
la determinación de Es de observancia obligatoria a) Preenriquecimiento, permite la
Salmonella en en el territorio nacional para restauración de las células de
alimentos. las personas físicas y Salmonella dañadas a una condición
morales que requieran fisiológica estable.
Concordancia: efectuar este método en
productos nacionales y de b) Enriquecimiento para incrementar
El documento no importación para fines las poblaciones de Salmonella e inhibir
menciona concordancia oficiales. otros organismos presentes en la
con normas muestra.
internacionales. Sin
embargo la metodología c) Crecimiento en medios sólidos
que presenta se basa en selectivos, con el fin restringir el
32
procedimientos crecimiento de otros géneros diferentes

estandarizados y a Salmonella y permitir el
recomendados en el reconocimiento visual de colonias
ámbito internacional. sospechosas.
Se complementa con: d) Identificación bioquímica, para la

determinación genérica de Salmonella.
NOM-109-SSA1-1994
e) Serotipificación, para la
identificación específica de la cepa en
cultivo.
NORMA OFICIAL Establece el método El método permite hacer una

MEXICANA NOM-115- microbiológico para estimación del contenido de S. aureus
SSA1-1994, bienes y determinar la cuenta de S. en alimentos. Se efectúa directamente
servicios. Método para aureus presente en alimentos en placas de medio de cultivo selectivo
la determinación de de cualquier tipo (nacionales y diferencial y confirmación mediante
Staphylococcus aureus o de importación), que las pruebas de coagulasa y
en alimentos. puedan estar potencialmente termonucleasa.
contaminados con este
Concordancia: patógeno. Es de observancia El método es adecuado para el análisis
obligatoria en el territorio de alimentos en los cuales se esperen
El documento no nacional para las personas más de 100 células de S. aureus por g.
menciona concordancia físicas o morales que
con normas requieran demostrar, para
internacionales. Sin fines oficiales, la ausencia de
embargo la metodología microorganismos en sus
que presenta se basa en productos.
procedimientos
estandarizados y
recomendados en el
Se complementa con:
NOM-109-SSA1-1994
NOM-110-SSA1-1994
NORMA OFICIAL Establece la aplicación de un Disposiciones sanitarias para moluscos

MEXICANA NOM-128- sistema de análisis de bivalvos crudos.
SSA1-1994, bienes y riesgos y control de puntos
servicios. Que establece críticos en la Aquella planta industrial o importador
planta
la aplicación de un industrial procesadora de que se dediquen al manejo de los
sistema de análisis de productos de la pesca. moluscos bivalvos deben incluir en su
riesgos y control de Programa de Análisis de Riesgos y
puntos críticos en la Se aplica a las personas Control de Puntos Críticos (HACCP)
planta industrial físicas o morales que se la manera por medio de la cual estén
procesadora de dedican a su proceso y controlando el origen de los mismos.
productos de la pesca. comercialización.
En la planta industrial sólo deben
No se aplica a las personas procesarse moluscos bivalvos que
33
Concordancia: físicas o morales que sólo cumplan con la Norma Oficial

cosechan y transportan Mexicana correspondiente.
-Fish Inspection Act, alimentos de origen marino,
R.S.C., 1070, c.F.-12, es decir que no están Los procesadores o importadores deben
Canadian Fish involucradas en el proceso guardar y mantener actualizados los
Inspections Regulations. del producto ni a las registros de cada lote recibido y
operaciones que se efectúan procesado.
-Fish Inspection en los establecimientos de
Regulations, p.C. 1978, venta al detalle.
c.802, as amended,
Canada.
- Food And Drugs Act

and Regulations,
Department Of National
Health and Welfare,
Canada.
-Diario Oficial de la
Comunidad Europea, L
268, 34o. año, 24 de
septiembre de 1991.
Comunidad Europea, L
268, 34o. año, 24 de
septiembre de 1991.
Comunidad Europea,
VI/3202/93-EN-Rev.7
(PVET/EN/2016).
NOM-129-SSA1-1995. Esta Norma Oficial Las enfermedades transmitidas por

Bienes y servicios. Mexicana establece alimentos, en su mayoría son de tipo
Productos de la pesca: especificaciones sanitarias infeccioso, su incidencia sigue
secos salados, para productos de la pesca en constituyendo un grave problema de
ahumados, moluscos diferentes presentaciones. salud pública y es una de las causas
cefalópodos y principales de morbilidad que ocupan
gasterópodos frescos- Para productos frescos, el segundo lugar entre las
refrigerados y refrigerados y congelados enfermedades transmisibles de
congelados. considera a: Mesofílicos notificación obligatoria. Entre los
Disposiciones y aerobios, Coliformes alimentos involucrados resaltan los
especificaciones fecales, Salmonella spp. y productos de la pesca: secos salados,
sanitarias. Vibrio cholerae O1 ahumados, moluscos cefalópodos y
toxigénico. gasterópodos frescos-refrigerados y
Concordancia: congelados. Debido a que estos
Para productos secos – productos en su origen están sometidos
Esta Norma es salados: Staphylococcus a una contaminación microbiológica y
parcialmente equivalente aureus y Salmonella spp. química entre otras, que aunado a la
a la siguiente norma y forma de consumo generan
Para ahumados:
34
códigos. Mesofílicos aerobios, enfermedades para el consumidor.

Salmonella spp.,
-FAO/OMS. Norma Coliformes fecales, Una Norma Oficial Mexicana que
Codex para Pescado seco Staphylococcus aureus, regule a estos productos desde el punto
- salado (Klippfish) de la Listeria monocytogenes, de vista sanitario, permitirá promover
familia de los Gadidae. Clostridium botulinum y el consumo de los mismos y a la vez
Codex Stan 167-1989. Vibrio cholerae O1 proteger la salud del consumidor.
toxigénico.
-FAO/OMS. Código
Internacional
recomendado de prácticas
para el Pescado seco- Esta Norma Oficial
salado. CAC/RCP 26- Mexicana es de observancia
1979. obligatoria en el territorio
nacional para las personas
-FAO/OMS. Código físicas o morales que se
Internacional dedican a su proceso o
recomendado de prácticas importación.
para el Pescado ahumado.
CAC/RCP 25-1979.
-FAO/OMS. Código
Internacional
recomendado de prácticas
para Cefalópodos.
CAC/RCP 37-1989.
Se complementa con:
NOM-028-SSA1-1993
NOM-030-SSA1-1993
NOM-031-SSA1-1993
NOM-051-SCFI-1993
NOM-092-SSA1-1994
NOM-110-SSA1-1994
NOM-112-SSA1-1994
NOM-113-SSA1-1994
NOM-114-SSA1-1994
NOM-115-SSA1-1994
NOM-120-SSA1-1994
35
NOM-122-SSA1-1994
NOM-128-SSA1-1994
NOM-143-SSA1-1994
NOM-143-SSA1-1995, Establece el método El método se basa en el aislamiento y

bienes y servicios. microbiológico para la diferenciación de especies de
Método de prueba determinar la presencia de Listeria spp., principalmente por la
microbiológico para Listeria en alimentos. fermentación de carbohidratos y la
alimentos. actividad hemolítica de los miembros
Determinación de Es de observancia obligatoria de este género.
Listeria monocytogenes. en el Territorio Nacional
para las personas físicas o
Concordancia: morales que requieran
efectuar este método en
El documento no productos nacionales y de
menciona concordancia importación, para fines
con Normas oficiales.
Internacionales. Sin
embargo la metodología
que presenta se basa en
procedimientos
estandarizados y
recomendados en el
Se complementa con:
NOM-110-SSA1-1994
NORMA Oficial Establece los requisitos Incluye las diferentes técnicas y

Mexicana NOM-242- sanitarios para: las áreas metodologías convencionales y
SSA1-2009, Productos y de captura de moluscos aceptadas para la detección y
servicios. Productos de bivalvos; los cuantificación de diferentes patógenos
la pesca frescos, establecimientos que (Salmonella spp, Coliformes fecales
refrigerados, congelados procesan productos de la y/o E. coli, Listeria monocytogenes,
y procesados. pesca frescos, refrigerados, Clostridium botulinum, Vibrio cholerae
Especificaciones congelados y procesados, O:1 y no O:1, Vibrio parahemolitycus
sanitarias y métodos de incluyendo las y Staphylococcus aureus) y otros
prueba. embarcaciones de pesca y contaminantes, en alimentos derivados
recolección, así como las de la pesca y acuicultura, en sus
Concordancia: especificaciones sanitarias diferentes presentaciones.
que deben cumplir dichos
Esta norma es productos.
parcialmente equivalente
con las siguientes normas Es de observancia obligatoria
internacionales: en el Territorio Nacional
para las personas físicas o
-Codex Alimentarius. morales que se dediquen a la
ALINORM 01/18. captura, extracción,
36
Apéndice V. procesamiento,
conservación,
-Codex Alimentarius. almacenamiento,
ALINORM 01/18. distribución, transporte,
Apéndice III.. venta o importación de
productos de la pesca.
-Codex Alimentarius.
ALINORM 01/18.
Apéndice VI.
ALINORM 95/18.
Apéndice VII.
ALINORM 95/18.
Apéndice IX.
ALINORM 95/18.
Apéndice X.
ALINORM 95/18.
Apéndice XI.
ALINORM 95/18.
Apéndice XII.
ALINORM 95/18.
Apéndice XIII.
ALINORM 95/18.
Apéndice XIV.
ALINORM 95/18.
Apéndice XV.
Se complementa con:
NOM-051-SCFI/SSA1-
2010
NOM-084-SCFI-1994
NOM-051-SSA1-2009
NOM-127-SSA1-1994
37
NOM-128-SSA1-1994
NOM-130-SSA1-1995
NOM-201-SSA1-2002
NOM-251-SSA1-2009, Establece los requisitos Las buenas prácticas de higiene

Prácticas de higiene mínimos de buenas prácticas representan un requisito
para el proceso de de higiene que deben indispensable que deben ser
alimentos, bebidas o observarse en el proceso de implementado, desde los sitios de
suplementos alimentos, bebidas o producción hasta la distribución y
alimenticios. suplementos alimenticios y venta de los productos, pasando por
sus materias primas a fin de la cosecha, procesamiento. Cada una
Concordancia: evitar su contaminación a lo de las partes y el personal que esta en
largo de su proceso. contacto con los productos debe
-Código Internacional cumplir con dichas prácticas.
Recomendado de Es de observancia obligatoria
Prácticas. Principios para las personas físicas o Los establecimientos deben contar con
Generales de Higiene de morales que se dedican al instalaciones que eviten la
los Alimentos. proceso de alimentos, contaminación de las materias primas,
CAC/RCP-1 (1969), Rev. bebidas o suplementos alimentos, bebidas o suplementos
4 (2003). alimenticios, destinados a los alimenticios.
consumidores en territorio
Se complementa con: nacional.
NOM-127-SSA1-1994 Hace énfasis en la
conveniencia de la aplicación
de un sistema de análisis de
peligros y de puntos críticos
de control (HACCP) y
directrices para su
aplicación.
NMX-F-539-SCFI-2009 La presente norma mexicana Esta Norma Oficial Mexicana se

Productos de la pesca - se aplica únicamente a los fundamenta en la verificación de las
filetes de anchoa en filetes de anchoa en aceiteespecificaciones físicas que se
aceite enlatados – enlatados que seestablecen en esta norma, que se
especificaciones. comercializan en territoriodeben aplicar las normas mexicanas
nacional. que se indican en el capítulo de
Concordancia: referencias y el método de prueba que
La determinación de se indica a continuación, así como los
Esta norma mexicana no microorganismos se efectúa métodos establecidos por la Secretaría
es equivalente a ninguna de acuerdo con las normas de Salud.
norma internacional por mexicanas NMX-F-088-
no existir referencia 1964, NMX-F-358-S-1981,
alguna al momento de su NMX-F-359-S1980 y NMX-
elaboración F-361-S-1981.
Se complementa con:
NOM-001-STPS-1993
38
NOM-002-SCFI-1993
NOM-027-SSA1-1993
NOM-030-SCFI-2006
NOM-040-SSA1-1993
NOM-051-SCFI-1994
NOM-092-SSA1-1994
NOM-109-SSA1-1994
NOM-110-SSA1-1994
NOM-111-SSA1-1994
NOM-112-SSA1-1994
NOM-113-SSA1-1994
NOM-114-SSA1-1994
NOM-115-SSA1-1994.
NOM-116-SSA1-1994
NOM-117-SSA1-1994
NOM-120-SSA1-1994
NOM-128-SSA1-1994
NOM-129-SSA1-1995
NOM-130-SSA1-1995
NMX-F-083-1986
NMX-F-088-1964
NMX-F-144-1978
NMX-F-254-1977
NMX-F-304-1977
NMX-F-314-1977
NMX-F-315-1978
NMX-F-317-S-1978
39
NMX-F-358-S-1981
NMX-F-359-S-1980
NMX-F-360-1981
NMX-F-361-S-1981.
NMX-FF-539-SCFI-2009
NMX-Z-012/1-1987
NMX-Z-012/2-1987
NMX-Z-012/3-1987
Esta norma
Europea. Normas AENOR–UNE-ISO.
El objetivo de la política de seguridad alimentaria de la UE es proteger la salud y los intereses de

los consumidores y garantizar el buen funcionamiento del mercado interior entre los 27 países que
la conforman. Para lograr este objetivo, la UE establece y vela por el cumplimiento de normas de
control en materia de higiene de los productos alimenticios, de salud y bienestar de los animales, de
fitosanidad y de prevención de los riesgos de contaminación por sustancias externas además de
establecer normas para el adecuado etiquetado de los productos.
Esta política fue reformada a principios del año 2000, de acuerdo con el enfoque “de la granja a la
mesa”. La Comisión de la Comunidad Europea (CCE), ha hecho de la inocuidad alimentaria una de
sus prioridades principales, por lo que elaboró el Libro Blanco sobre seguridad alimentaria en el que
se estableció una política alimentaria nueva y dinámica, la SE modernizó la legislación fijando un
conjunto coherente y transparente de normas, se reforzaron los controles desde la explotación hasta
la mesa del consumidor y se aumentó la eficiencia del sistema de asesoramiento científico para
garantizar un elevado nivel de salud y protección de los consumidores (CCE, 2000).
Las prioridades estratégicas para la CCE son:
 Crear una autoridad Europea de inocuidad alimentaria.

 Implantar sólidamente el enfoque “de la granja a la mesa” en la normativa alimentaria.
 Establecer el principio según el cual, las empresas productoras de alimentos para consumo
humano, son las primeras responsables de la inocuidad alimentaria y los gobiernos de los
estados miembros deben realizar la supervisión y control.
 La CCE evalúa la eficiencia de las capacidades y aptitudes de los estados miembros para
realizar ese control por medio de auditorias e inspecciones.
Para el 2002, el consejo y el parlamento europeo crearon, la European Food Safety Authority
(EFSA) como un organismo independiente con tareas esenciales, que abarcan la formulación de
dictámenes científicos, la gestión de los sistemas de alerta rápida, la comunicación y el diálogo con
los consumidores sobre las cuestiones sanitarias y de seguridad alimentaria, así como la creación de
40
redes con las agencias nacionales y los organismos científicos; convirtiéndose, la EFSA, en la
piedra angular de las evaluaciones de riesgo de la UE concerniente a la seguridad alimentaria (para
humanos y piensos animales), colaborando estrechamente con los estados miembros, organismos
europeos y organizaciones internacionales y de terceros países para compartir información, datos y
mejores prácticas, identificar los riesgos emergentes y desarrollar comunicaciones coherentes de los
riesgos de la cadena alimentaria.
Los riesgos microbiológicos de los productos alimenticios de origen acuático, constituyen una
prioridad debido a que es de las principales fuentes de ETAs. De acuerdo al reglamento (CE) nº
2073/2005 y a otros, los alimentos no deben contener microorganismos ni sus toxinas o metabolitos
en cantidades que supongan un riesgo para la salud humana al mismo tiempo prioriza un enfoque
estructurado de prevención, con el buen diseño de procesos y materias primas y la aplicación de
buenas prácticas de higiene, así como los principios HACCP.
En relación al uso de métodos analíticos alternativos, se autoriza su aplicación siempre que existan
procedimientos de validación con respecto al método de referencia, conforme a la norma EN/ISO
16140 u otros protocolos similares internacionalmente aceptados y su uso deberá ser autorizado por
la autoridad competente como la Asociación Española de Normalización y Certificación (AENOR).
Dicha asociación es una entidad privada, independiente, sin fines de lucro, reconocida en los
ámbitos nacional, comunitario e internacional, contribuye, mediante el desarrollo de las actividades
de normalización y certificación, a mejorar la calidad en las empresas, sus productos y servicios, así
como a proteger el medio ambiente y, con ello, el bienestar de la sociedad. Se constituyó en 1986,
coincidiendo con la incorporación de España a la UE. Un año más tarde, AENOR asumió la
representación de España ante el Comité Europeo de Normalización (CEN) y ante la ISO.
Actualmente, son más de 200 los comités técnicos de normalización en los que participan cerca de
6.000 expertos, de tal manera que dichas normas sirven de referencia para las normas europeas e
internacionales.
Las Normas UNE-EN-ISO son las que rigen específicamente lo relativo a la microbiología de los
alimentos en la Unión Europea. Su contenido proporciona información para el desarrollo e
implementación de métodos normalizados en los laboratorios, garantizando los resultados, la
calidad y la seguridad de los alimentos sometidos a control. Contienen, entre otras especificaciones:
 Preparación de medios de cultivo en laboratorios

 Preparación de muestras de ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para examen
microbiológico
 Protocolos de validación de métodos alternativos
 Aplicación de la PCR para determinación de patógenos.
Detección de los siguientes patógenos: Salmonella typhi, S. paratyphi, Salmonella spp., Escherichia
coli O157, Shigella spp., Yersinia enterocolítica y Listeria monocytogenes, otros patógenos
contemplados son: Staphylococcus aureus coagulasa positivos, Bacillus cereus y Clostridium
perfingens. No se especifican límites máximos permitidos en los alimentos (pescados, crustáceos o
moluscos) ni la matriz que se utiliza. Sin embargo en los reglamentos de la CE, relativo a los
criterios microbiológicos aplicables a los productos de origen acuático, si se establecen
requerimientos en términos cuantitativos, dependiendo de las diferentes presentaciones
(REGLAMENTO (CE) no 2073/2005 DE LA COMISIÓN de 15 de noviembre de 2005).
Todas estas normas tienen concordancia con normas ISO, que están aprobadas por el CEN y están
sujetas a revisiones periódicas para asegurar su actualización y concordancia con los progresos de la
41
industria y de la sociedad. En la Tabla 7, se presentan las Normas UNE-CEN-ISO mas recientes

relacionadas con la microbiología de alimentos de origen acuático.
Tabla 7. Normas UNE-CEN ISO más recientes que se relacionan con la microbiología de los
alimentos para consumo humano y animal.
1 UNE-CEN ISO/TS 11133- Guía para la preparación y producción de medios de

1:2009 cultivo. Parte 1: Directrices generales para el
aseguramiento de la calidad para la preparación de
Microbiología de los alimentos medios de cultivo en el laboratorio. (ISO/TS 11133-
para consumo humano y 1:2009).
animal.
2 UNE-EN ISO 11290-1:1997 Método horizontal para la detección y el recuento de

Listeria monocytogenes. Parte 1: Método de detección.
Microbiología de los alimentos (ISO 11290-1:1996).
para consumo humano y para
animales.
3 E-EN ISO 11290- Método horizontal para la detección y el recuento de

1:1997/A1:2005 Listeria monocytogenes. Parte 1: Método de detección.
Modificación 1: Modificación del medio de
(ISO 11290-1:1996/AM1:2004 aislamiento y de la prueba de la hemólisis e inclusión
Microbiología de los alimentos de los datos de precisión
animales).
4 UNE-EN ISO 11290-2:2000 Método horizontal para la detección y recuento de

Listeria monocytogenes. Parte 2: Método de recuento.
Microbiología de los alimentos (ISO 11290-2:1998).
animales
5 UNE-EN ISO 16140:2003 Protocolo de validación de métodos alternativos (ISO

16140:2003).
Microbiología de los alimentos
para consumo humano y
animal
6 UNE-EN ISO 16654:2002 Método horizontal para la detección de Escherichia

coli O157. (ISO 16654:2001)
Microbiología de los alimentos
animal.
7 UNE-EN ISO 20838:2007 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la

detección de patógenos en los alimentos. Requisitos
Microbiología de los alimentos para la amplificación y la detección para los métodos
para consumo humano y cualitativos. (ISO 20838:2006).
animal
8 UNE-EN ISO 6579:2003 Método horizontal para la detección de Salmonela spp.
42
Microbiología de los alimentos (ISO 6579:2002)

alimentación animal.
9 UNE-EN ISO 6887-3:2004 Preparación de las muestras de ensayo, suspensión

inicial y diluciones decimales para examen
Microbiología de los alimentos microbiológico. Parte 3: Reglas específicas para la
para consumo humano y preparación de pescados y productos de la pesca. (ISO
animal. 6887-3:2003)
10 UNE-EN ISO 6888-1/A1:2004 Método horizontal para el recuento de estafilococos

coagulasa-positivos (Staphylococcus aureus y otras
Microbiología de los alimentos especies). Parte 1: Técnica que utiliza el medio agar de
para consumo humano y Baird-Parker. Modificación 1: Incorporación de los
animal. datos de precisión.(ISO 6888-1:1999/Amd 1:2003).
Estados Unidos (EE. UU.)
Al igual que en otros países la responsabilidad del aseguramiento de la inocuidad de los productos
para consumo humano, está a cargo de instancias gubernamentales y se basa en reportes,
investigaciones y programas. Los principales actores en el área de prevención de las ETAs, son:
a) The Food and Drug Administration (FDA)
Es una de las agencias responsables de la protección de la salud pública, procurando que solamente
productos inocuos lleguen al mercado, sus actividades incluyen:
o Ayudar y orientar a productores y consumidores de alimentos para que conozcan cuáles son
los riesgos a la salud que pueden derivarse de los mismos.
o Promover la aplicación de buenas prácticas de manejo sanitario de los alimentos por parte
de los consumidores y productores.
o Promover la detección, seguimiento y prevención de enfermedades relacionadas con el
consumo de alimentos.
Opera un programa de seguridad de manera obligatoria para el sector acuícola y pesquero bajo las
disposiciones de la Ley de Servicios a la Salud Pública y Reglamentos Relacionados (FD&C Act.),
fundamentado en la investigación, inspección, desarrollo, difusión, cumplimiento y ejecución de
normas. El “Manual de Análisis Bacteriológicos” (BAM), elaborado por la FDA, es un compilado
de procedimientos de laboratorio que sirve de guía para el análisis microbiológico de alimentos y
cosméticos, es una recopilación de información científica actualizada y de la política relacionada a
los riesgos potenciales en la producción y consumo de productos de la pesca y los controles eficaces
para prevenir su ocurrencia. El BAM representa la piedra angular del programa.
Dichas guías y documentos son actualizados y reconocidos a nivel mundial. Explican los
lineamientos a seguir en lo relacionado con los planes HACCP y orienta a los usuarios para la
identificación de los principales peligros microbiológicos como: Salmonella spp., Staphylococcus
aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus y V.
vulnificus, así como Clostridium perfringes, Bacillus cereus, Campillobacter jejuni y coliformes en
productos alimentarios de origen acuático como: peces (en general), crustáceos (camarón, cangrejo,
43
langosta) y moluscos (ostión, almeja, mejillón, caracol), en diferentes presentaciones (frescos,

congelados, pre cocidos, cocinados, enteros y enlatados) ver Tabla 8.
Recientemente se formó la “Red de Evaluación y Respuesta Coordinada a Brotes (CORE, por sus
siglas en inglés), integrada por equipos multidisciplinarios con personal de tiempo completo para
preparar, coordinar y mejorar el tiempo de respuesta a brotes ocasionados por alimentos. Al tener
un sistema centralizado aplica las experiencias en la elaboración de políticas eficaces y prácticas
preventivas de seguridad alimentaria para evitar incidentes en el futuro.
Otra publicación de referencia, es el BAD BUG BOOK, publicado por el Centro para la Seguridad
Alimentaria y la Nutrición Aplicada de la FDA, Departamento de Salud y Servicios Humanos.
b) Center of Disease Control and Prevention (CDC)
Estos centros van a la cabeza de los esfuerzos federales para recopilar información sobre las ETAs,
su objetivo es investigar dichas enfermedades, los brotes y supervisar la efectividad de los esfuerzos
de prevención y control realizados para disminuir esos sucesos, también desempeñan un papel
fundamental en el desarrollo de la capacidad epidemiológica de laboratorio y de salud ambiental en
el departamento de salud estatal y local a fin de respaldar la vigilancia de las ETAs y la respuesta
ante los brotes. Investigan los brotes de enfermedades que surgen en relación con alimentos y se
encargan de realizar estudios sobre problemas de salud o producidos por determinados ambientes.
Igualmente, gestionan programas de ámbito nacional para la prevención y control de dichas
enfermedades.
Cuando un brote es identificado, los CDC colaboran con la FDA, la USDA, o la Agencia de
Protección Ambiental (EPA), para rastrear el alimento desde sus orígenes, evaluar las medidas de
inocuidad alimentaria de los restaurantes y las procesadoras, haciendo una investigación desde la
granja de producción, hasta retirar el producto del mercado.
Tabla 8. Métodos y Referencias en ISO y en BAM para la detección de los principales patógenos
reconocidos en alimentos acuáticos
Internacional EUA (BAM)
Método Referencia Método Referencia

b c
EN-ISO
Convencional 16654: 2002 Convencional Feng et al., 2002
Escherichia coli c h
ISO 7251:
Convencional 2005 Inmunológico Feng et al., 2002
i
Conv-Molec Feng et al., 2011
a c
ISO (EN-ISO) Hitchins y Jinneman,
Listeria Convencional 11290-1: 2005 Convencional 2002
monocytogenes j
Hitchins y Jinneman,
Conv-Molec 2011
44
k
Hitchins y Jinneman,
Kits AOAC 2011
d
ISO (EN-ISO)
Salmonella spp Convencional 6579: 2002 Convencional Andrews et al., 2011
e e,l
EN ISO 6888- Bennett y Lancette,
Convencional 1: 2000 Convencional 2001
e g,l
Staphylococcus EN ISO 6888- Bennett y Lancette,
aureus Convencional 2: 2000 Convencional 2001
f,
EN ISO 6888-
g
Convencional 3: 2003
a a,
ISO 21872-1: Kaysner y DePaola,
m
Convencional 2007 Convencional 2004
Vibrio cholerae o
Kaysner y DePaola,
Molecular 2004
a c,
Vibrio ISO 21872-1: Kaysner y DePaola,
n
parahaemolyticu Convencional 2007 Convencional 2004
s o
Kaysner y DePaola,
Molecular 2004
a c,
ISO 21872-2: Kaysner y DePaola,
n
Convencional 2007 Convencional 2004
Vibrio vulnificus o
Kaysner y DePaola,
Molecular 2004
a
El procedimiento general en el met. de Cultivo son; dos enriquecimientos, aislamiento y
confirmación
La expresión de resultados es presencia o ausencia en x gr ó ml de muestra.
b
El procedimiento general en el met. de cultivo son; enriquecimiento, separación,
concentración, aislamiento y confirmación
La expresión de resultados es presencia o ausencia en X gr ó ml de muestra.
c
El procedimiento general en el met. de cultivo son; Enriquecimiento, separación,
concentración, aislamiento y confirmación.
La expresión de resultados es número más probable en X gr ó ml de muestra.
d
El procedimiento general en el met. de cultivo son; Pre-enriquecimiento, enriquecimiento,
cultivo y confirmación.
e
El procedimiento general en el met. de cultivo son; Inoculación, incubación y confirmación.
La expresión de resultados es N# de Estafilococos coagulasa-positivos por gr ó ml de
muestra.
45
f
El procedimiento general en el met. de cultivo son; Enriquecimiento, subcultivo y
confirmación.
g
El procedimiento general en el met. de cultivo son; Cultivo, incubación, subcultivo y
confirmación.
La expresión de resultados es N# de Estafilococos coagulasa-positivos más probable por gr
ó ml de muestra.
h
Ensayo LST-MUG es exclusivo para moluscos bivalvos fríos o congelados.
i
Detección de E. coli O157:H7 Se realiza un previo enriquecimiento y se lleva a PCR en
Tiempo Real, donde además están configurados para las plataformas SmartCycler II o
LightCycler® 2.0. Es específico para los Genes stx1 y stx2. Y las muestras que den positivas
en PCR se confirman por cultivo.
j
Son recomendaciones de confirmación por métodos moleculares (PCR en tiempo real y
campos pulsados -PGDE-) para la detección se utiliza comúnmente el Gen hly y 16s rARN
k
Enzyme Linked Immunofluorescent Assay (ELFA) VIDAS LIS Assay; Colorimetric
monoclonal enzyme-linked immunosorbent assay method; TECRA Listeria Visual
Immunoassay [TLVIA]
l
La expresión de resultados para e es S. aureus/g de muestra y para g es S. aureus (NMP/g)
m
El reporte final debe incluir identificación bioquímica y serológica del aislado y resultados de
enterotoxicidad
n
Membrana filtrante hidrofóbica cuadriculada (HGMF), similar al convencional por el tiempo
de incubación
o
Se enriquece y para confirmación con PCR se utiliza para V. cholerae el Gen ctxAB, para V.
vulnificus es el gen vvhA y para V. parahaemolyticus (PCR Multiplex) los genes tlh, trh y
tdh
Canadá
La Agencia Canadiense de Inspección de Alimentos (CFIA por sus siglas en inglés), desarrolla y
verifica el cumplimiento de las normas de procesos que contribuyen a la obtención de productos
apropiados y con una calidad aceptable, garantiza la seguridad e identidad de pescados y mariscos
que son procesados en establecimientos federales o importados en Canadá. Sus actividades
incluyen:
o Registro federal de productos de la pesca que procesan los establecimientos,

o Inspección del pescado importado y productos de la pesca,
o Desarrollo y mantenimiento de disposiciones con países con sistemas aprobados de
inspección,
o Inspección y ejecución de regulaciones, incluyendo la aplicación de normas de etiquetado,
o Pruebas para detección de residuos.
Parte del alcance de las inspecciones incluye actividades de: limpieza, fileteado, glaseado, embalaje,
enlatado, congelación y presentaciones como: ahumado, salado, cocinado, en escabeche, seco o
46
cualquier otra. Se encarga de examinar patógenos de alto riesgo en los alimentos como: E. coli, L.
monocytogenes, S. aureus, Salmonella y Shigella. El Compendium of Analytical Methods (Vol. 2 y
3), proporciona la descripción de las técnicas recomendadas para la detección de los patógenos
(Tabla 9).
Dentro de los programas que maneja la CFIA se encuentran: el de importación/exportación de peces

y mariscos, inspección de los planes de acción de seguridad alimentaria (químicos y
microbiológicos) y planes HACCP, entre otros.
a) El CFSP (Canadian Fish and Seafood Program) basa las inspecciones a peces y mariscos
procesados, en el documento Fish Inspection Regulations considera los siguientes productos y
presentaciones:
o Productos enlatados (almejas, mejillón, ostión, coctel y pasta de langostino, salmón, atún y
sardina),
o Frescos y congelados (empanizados, carne de langosta, ostiones, salmón, coctel de
camarón, vieira (escallopos), eperlanos y pescado blanco),
o Además en escabeche, condimentados, marinados, salados, secos y ahumados.
o Para que la importación se lleve a cabo, es necesario que los lotes de interés, sean sujetos a
una inspección rigurosa y a muestreos aleatorios para los siguientes análisis:
o Físicos (calidad del empacado, etiqueta, etc.),
o Químicos (mercurio, metales pesados, plaguicidas, etc.),
o Fisicoquímicos (sensoriales, pH, índice de calidad, etc.),
o Microbiológicos (E. coli, L. monocytogenes, Salmonella spp., S. aureus, Vibrio spp., etc.).
b) El Canadian Shellfish Sanitation Program (CSSP) es un programa federal dirigido y

administrado conjuntamente por la CFIA, el departamento del medio ambiente (EC) y el de Pesca y
el Océano (DFO). El objetivo principal es proteger a los canadienses de los riesgos a la salud
asociados con el consumo de moluscos bivalvos contaminados (p.ej. mejillones, ostiones y
almejas), a partir de él, el gobierno canadiense implementó controles para verificar que solo los
mariscos que cumplan con los estándares de calidad e inocuidad alimentaria lleguen al mercado
nacional e internacional. Incluye tanto a la industria como al consumidor.
c) El Programa de Inspección de Peces (FIP), se encarga de la calidad e inocuidad alimentaria,

basada en resultados analíticos. Dentro de él se creó una política para que terceros laboratorios
pudieran hacer las pruebas de los productos derivados de la pesca (Policy on the Use of Third Party
Laboratories for Testing Fish and Fish Products), a través del reglamento de inspección de peces
(FIR), el cual establece las condiciones de aceptación de los resultados de dichos laboratorios y
aplica solo dentro del programa de gestión de calidad para importadores (QMPI). Sin embargo, hay
otras situaciones donde pruebas analíticas, por terceros laboratorios, son mayormente requeridas,
por lo que es necesaria una política clara sobre las condiciones de trabajo de laboratorios
acreditados o no, para diferentes actividades dentro de la FIP.
d) Programa de monitoreo microbiológico, es una de las actividades que realiza la CFIA, la

cual consiste en un muestreo aleatorio y análisis de muestras para una amplia variedad de productos
nacionales e importados. Los análisis se realizan cada año para evaluar la contaminación
microbiológica en el suministro de alimentos, haciéndose pruebas para patógenos de alto riesgo,
incluyendo E. coli, Listeria monocytogenes, Salmonella spp. y Shigella.
e) El Plan de acción de seguridad alimentaria (FSAP) es apoyado por la CFIA para construir el
sistema de seguridad alimentaria actual. Esta iniciativa permite responder rápida y eficazmente a
47
problemas de seguridad alimentaria e identificación de los riesgos potenciales de manera temprana.

Con este plan se examinan los alimentos que se consideran con gran potencial de riesgo a la salud
debido a la variedad de patógenos. Las muestras son analizadas bajo los estándares de seguridad
alimentaria que han sido establecidos por Health Canada y varias organizaciones internacionales,
tales como la comisión del Codex Alimentarius. Cuando la CFIA encuentra un alimento o un
ingrediente que viola esos estándares, toma alguna de las siguientes acciones correctivas:
o Realizar mas inspecciones,

o Más muestreos,
o Emitir anuncios públicos y
o Retirar los productos del mercado que poseen un riesgo a la salud.
f) Los planes de muestreo para análisis microbiológicos y químicos fueron adoptados de la

International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF). Sin embargo, la
Health Canada preparó un manual que provee de métodos de referencia listos para aplicarse y es
utilizado por la Health Products and Food Branch (HPFB) en los siguientes casos:
o Para determinar si la industria alimentaria cumple con la regulación y guías en relación a

materiales extraños y microbiológicos en alimentos,
o Para evaluar la calidad de los alimentos en general con respecto a su contenido
microbiológico o material extraño,
o Para fungir como apoyo en la investigación de las ETAs.
g) Health Canada. Para esta institución, es esencial tener una base científica para prevenir y
responder apropiadamente cuestiones de inocuidad y salud, donde las investigaciones y las mismas
actividades científicas juegan un papel importante en muchos procesos de toma de decisiones. Este
conocimiento contribuye al desarrollo de políticas y programas, regulaciones, servicios,
información y evaluación de riesgo, mismos que incluyen el estudio de:
o Productos químicos potencialmente peligrosos en alimentos y sus efectos sobre la salud

humana,
o Aspectos nutricionales y metabólicos de los alimentos, incluyendo las relaciones de
determinados aspectos de la dieta a las condiciones de la enfermedad,
o Consumo de alimentos y los patrones de ingesta de nutrientes de los canadienses,
o Organismos infecciosos y toxigénicos, (p.ej., E coli, Salmonella, Listeria monocytogenes) y
medidas de control para la seguridad alimentaria.
1.5 Japón. Ley Básica de Seguridad Alimentaria.
En 2002, el Director Food and Environmental Hygiene (DFEH) estableció directrices en relación a
los límites de seguridad de nueve agentes patógenos, principales, transmitidos por los alimentos.
El 01 de julio de 2003, entró en vigor la Ley Básica de Seguridad Alimentaria (FSBL) con el
propósito de promover integralmente las políticas para garantizar la seguridad alimentaria mediante
el establecimiento de principios básicos, entre los que se encuentra, el “Reconocer que la protección
a la salud de los ciudadanos japoneses es prioritaria” y que la guía básica incluye:
o Promoción de evaluar el riesgo (evaluando el efecto de los alimentos en la salud),

o Gestionar el riesgo (formulando políticas que se basen en la evaluación del riesgo) y
o Comunicar el riesgo (donde se comparte información y opiniones entre las partes
interesadas).
48
Debido a las grandes cantidades de productos importados por Japón provenientes de China, se
crearon reglamentos para conocer y monitorear los productos comestibles que son importados al
país, incluyendo lácteos, cárnicos, en diferentes presentaciones, y en particular la “Guide to Import
Marine Products into Hong Kong”. Se elaboraron directrices microbiológicas para alimentos listos
para comer (RTE), las cuales establecen los límites de seguridad de 9 de los principales patógenos
transmitidos por los alimentos: Salmonella spp., Listeria monocytogenes, E. coli O157, V. cholerae,
V. parahaemolyticus, S. aureus, Campylobacter spp., Clostridium perfringens y B. cereus. También
proporciona una clasificación de calidad microbiológica de esos alimentos que refleja el estado
higiénico de los mismos. Los comerciantes de los alimentos involucrados deben obtener asistencia
del personal DFEH, para tomar muestra del alimento en cuestión para su análisis, u otro examen
bacteriológico o de otra índole. Los productos acuáticos concernientes pueden ser: peces,
crustáceos, moluscos, anfibios o cualquier otra forma de vida acuática como mamíferos o reptiles.
La venta de alimentos de origen acuático como ostras, pescados y mariscos en general, crudos y/o
vivos está restringida a personas y establecimientos que cuenten con el permiso específico emitido
por DFEH.
La comisión de seguridad alimentaria (Food Safety Commission of Japan (FSCJ), fue establecida
para la realización de evaluaciones de riesgo de manera neutral e imparcial, sobre la base de
conocimiento científico y conjuntamente con la creación de la ley (FSBL), atienden las situaciones
que englobaban la seguridad alimentaria de Japón ya que las importaciones de productos
comestibles que hace este país se han incrementado drásticamente en las últimas décadas.
Tabla 9. Listados de técnicas para detección y aislamiento de microorganismos patógenos causantes

de ETAs (CAM, Canadá).
49
Numero de
Método indentificacion del Titulo
metodo y apendices
The isolation of Listeria monocytogenes and other Listeria spp. from foods and
MFHPB-07
environmental samples using Palcam broth
Aislamiento e Identificación
Isolation of Listeria monocytogene s and other Listeria spp. from foods and
MFHPB-30
environmental samples
Enumeration of Listeria spp. in environmental samples using 3MJ PetrifilmJ
MFLP-11
Enumeración Environmental Listeria Plates
MFLP-74 Enumeration of Listeria monocytogenes in Food
Detection of Listeria spp. in Foods and Environmental Samples by the VIDAS
MFHPB-29
Listeria™ Method
Detection of Listeria monocytogenes in Foods and Environmental Samples by
MFLP-33
the VIDAS LMO 2™ Method
Detection of Listeria spp. in Foods and Environmental Samples by the VIP
Inmunológicos MFLP- 34
Method
Detection of Listeria spp. in foods and environmental samples using the Oxoid
MFLP-71
Listeria Rapid Test (The Clearview Kit)
Detection of Listeria spp. in food products and environmental samples by the
MFLP-77
VIDAS® Listeria species Xpress (LSX) method
The Genequence Listeria spp. assay for the detection of Listeria spp. in foods
MFLP-13
and environmental surfaces
The Genequence Listeria monocytogenes assay for the detection of Listeria
MFLP-14
monocytogenes in foods
The detection of Listeria species from environmental surfaces using the Dupont
MFLP-15
Qualicon BAX® System method and direct plating
The Qualicon BAX® SYSTEM Method for the detection of Listeria monocytogenes
MFLP-28
Genéticos in a variety of food
Identification of Listeria monocytogenes using the Adiafood Rapid Pathogen
MFLP-31
Detection System, a Real-Time PCR Technique
Detection of Listeria spp. from environmental surfaces using iQ-CheckTM
MFLP-39
Listeria spp. Real-Time PCR Test Kit
Identification of presumptive positive Listeria monocytogenes from foods and
MFLP-78
environmental samples by the Polymerase Chain Reaction
MFLP-88 Identification of Listeria monocytogenes by Accuprobe™
50
Numero de
metodo y apendices
MFHPB-21 Enumeration of Staphylococcus aureus in foods
Determination of Staphylococcus aureus Thermostable
MFHPB-28
Enumeración e Nuclease in foods.
Identificación Enumeration of Staphylococcus aureus in foods and
MFLP-21 environmental samples using 3MJ PetrifilmJ Staph Express
Count (STX) Plates (Supplement to MFLP-21)
Detection of Staphylococcal enterotoxins in food products
MFLP-65 using the VIDAS Staph Enterotoxin II (SET2), an ELFA
(Enzyme-Linked Fluorescent Assay)
Determination of enterotoxin production by
MFLP-67 Staphylococcus aureus in foods and broth media (The
Enterotoxin Reverse Passive Latex Agglutination (RPLA) Method)
Immunological Detection of enterotoxins produced by Staphylococcus
MFLP-68 aureus in foods (The Enzyme-linked Immunosorbent
Assay (ELISA) using the TECRA Kit)
Detection of enterotoxins produced by Staphylococcus
MFLP-69 aureus in foods (Ridascreen SET A, B, C, D, E Enzyme
Immunoassay)
Numero de
metodo y apendices
MFLP-72 The Isolation and Identification of Vibrio cholerae 01 and non-01 from Foods
Aislamiento e
Identificación
MFLP-73 The Isolation and Enumeration of Vibrio vulnificus from Fish and Seafoods
Specific detection of Vibrio parahaemolyticus strains using a multiplex polymerase chain

MFLP-23
Genéticos reaction (pcr) based on the r72h taxonomic marker and the hemolysin genes tdh and trh
MFLP-37 Detection of Halophilic Vibrio Species in Seafood
51
Numero de
metodo y apendices
MFHPB-20 Methods for the Isolation and Identification of Salmonella from Foods in foods and environm
MFHPB-20A Amendment to MFHPB-20 for the analysis of seed used to manufacture sprouts
Aislamiento e Identificación
Procedure for the Isolation of Salmonella species by the Modified Semi-Solid
MFLP- 75
Rappaport Vassiliadis (MSRV) Method feeds, raw foods, fece
MFHPB-24 Detection of Salmonella spp. in Foods by the VIDAS SLMJ Method
foods and in agricultu
The 48h DupontTM Lateral Flow SystemTM Method for the detection of
MFLP-18
Salmonella species in raw and processed meats in raw (ground chicke
Detection of Salmonella by the Tecra Salmonella Visual ImmunoassayJ (VIA)
MFLP- 35
Method foods, food ingredien
Inmunológicos
MFLP-70 Detection of Salmonella in foods by the Modified 1-2 Test animal feed, chicken,
MFLP- 84 Identification of Salmonella spp. by DynabeadsJ anti-Salmonella foods, animal feed an
MFLP- 96 The Reveal Test Kit for detecting Salmonella feeds, raw foods and
MFLP-97 The Alert Test Kit for detecting Salmonella artificially contamina
The Genequence® Salmonella Microwell Assay for the detection of Salmonella
MFLP-20
in a variety of foods in a wide variety of fo
The Qualicon Bax® System Method for the detection of Salmonella in a variety
MFLP-29
of food and environmental samples has been validated fo
Genéticos
Identification of Salmonella species using the Adiafood rapid pathogen
MFLP-32
detection system, a real-time PCR technique foods and other samp
Detection of Salmonella in foods and environmental surfaces - Assurance GDS
MFLP-36
for Salmonella Gene Detection System in a variety of foods a
52
Numero de
metodo y apendices
The method has been
Aislamiento e MFLP- 80 Isolation of E. coli O157:H7 or NM in foods produce satisfactory re
Identificación MFLP- 90 Identification of E. coli O157 by DynaBeadsTM anti-E. coli O157 in food
The DupontJ Lateral Flow SystemJ Method for detecting E. coli O157 in raw in raw ground beef and
MFLP-19
ground and raw boneless beef (Supplement to MFLP-19) boneless beef
Detection of Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) in Food Products and Food food products and foo
MFLP-81
Ingredients by the Assurance EHEC Enzyme Immunoassay (EIA) Method ingredients
MFLP-82 Detection of E. coli O157 by the Merck Singlepath7 E. coli O157 Kit raw ground beef and
pasteurised whole mil
Detection of Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) in food products and food food products, food in
MFLP-87
ingredients by the VIP for EHEC Method and environmental sam
Detection of E. coli O157 by the TecraTM E. coli O157 Visual Immunoassay food products, food in
Inmunológicos MFLP-91
(VIA) Method and TecraTM E. coli O157 Immunocapture and environmental
a variety sam
of foods, incl
MFLP-92 Detection of Escherichia coli O157 in foods by Polymixinbased ground beef, processe
MFLP-92
Enzyme-linked Immunosorbent Assay fruits and vegetables
The Eight Hour Reveal Method for detecting Escherichia coli O157:H7 In raw raw beef cubes, raw gr
MFLP-94
beef and environmental samples. beef, and environmen
The 20 Hour Reveal Method for detecting Escherichia coli O157:H7 from foods with artificially contam
MFLP-95 foods and naturally
and environmental samples. use in raw processed m
Detection of E. coli O157:H7 in food products by the VIDAS® UP E. coli O157 raw unprocessed meat
MFLP-98
(including H7) method leafy greens.
Identification of Escherichia coli O157:H7 and Verotoxin producing Escherichia
MFLP-12 coli O157:NM by the ADIAFOOD Rapid Pathogen Detection System, a Real-
Time Polymerase Chain Reaction System raw ground beef
in raw ground beef, be
Detection of Escherichia coli O157:H7 in Foods - Assurance GDSJ for E. coli orange juice, apple jui
MFLP-16
O157:H7 Gene Detection System vegetables and sprout
Identification of Escherichia coli O157 by the Warnex Real Time Polymerase
MFLP-24
Chain Reaction System foods and food ingred
Genéticos
The Dupont Qualicon Bax7 System Method for the detection of E. coli O157:H7
MFLP-30
in raw beef and fruit juice (Supplement to MFLP-30) raw ground beef and f
Supplement 2 to MFLP-30 The use of the Bax E. coli O157:H7 MP assay
The DuPont Qualicon BAX® System real-time method for the detection of E.
MFLP-76
coli O157:H7 in raw beef trim and raw ground beef raw ground beef and b
Identification of presumptive positive Verocytoxigenic Escherichia coli by the
MFLP-86
Polymerase Chain Reaction from foods and other s
foods to determine co
MFLP-83 Detection of Verotoxins VT 1 and VT 2 by the Merck Duopath7 Verotoxin Kit with the requirements
Pruebas para in food or food ingredi
Verotoxinas Identification of Escherichia coli Verotoxins by the Meridian Premier EHEC determine compliance
MFLP-93
KitTM requirements of Sectio
53
Chile. Agencia Chilena para la Inocuidad Alimentaria (ACHIPIA)
Dicha Agencia implementó un moderno, eficiente y transparente sistema nacional de inocuidad de

los alimentos. Cuenta con un sistema integrado de laboratorios que realizan análisis de alimentos
relacionados con la inocuidad, los cuales utilizan métodos acreditados conforme a la norma
ISO/IEC17025 según recomendación del Comisión del Codex Alimentarius.
En general, la metodología está basada en métodos de referencia internacional o validados a nivel

nacional: AOAC, FDA-BAM, AFNOR, USDA-FSIS, ICMSF, ISO, normas chilenas, FAO/OMS –
Codex Alimentarius, manual de métodos de análisis físico-químicos de alimentos, agua y suelos del
ISP, entre otros.
El servicio nacional de pesca (SERNAPESCA), que depende del Ministerio de Economía,

estableció dentro de la política de la inocuidad de los alimentos el reglamento sanitario de los
alimentos, DTO. N° 977/96, del cual se desprenden algunos apartados específicos para el análisis
microbiológico de productos de origen acuático. Toma como base la clasificación, los parámetros
de control y los planes de muestreo de la ICMSF (International Commission on Microbiological
Specification For Foods), en la cual se definen 18 grupos de alimentos según su origen y/o
tecnología aplicada en su elaboración. El grupo N#11 “Pescados y Productos de la Pesca” muestra
las especificaciones microbiológicas para dichos productos (Tabla 10). En el artículo 173 del
reglamento, se presenta una lista de las bacterias potencialmente presentes en dichos productos, con
la cual, la autoridad sanitaria puede considerar el alimento como contaminado, conforme a la
evaluación de los riesgos que de su análisis se deriven.
Tabla 9. Grupos bacterianos considerados para determinar la inocuidad en pescados y productos de

la pesca, según presentación, de acuerdo a la política de la inocuidad de los alimentos en Chile.
Moluscos bivalvos Pescados y mariscos Pescados y mariscos Pescados y mariscos

frescos: crudos congelados precocidos o cocidos ahumados
congelados;
Recuento Aerobios Recuento Aerobios Recuento Aerobios Recuento Aerobios
Mesófilos, Coliformes Mesófilos, E. coli, S. Mesófilos, E. coli, S. Mesófilos, E. coli, S.
fecales en 100 g. y aureus aureus, Salmonella en aureus.
Salmonella en 25 g. 25 g.
Artículo 174.- En los alimentos listos para el consumo (LPC) también se hace análisis de Listeria
monocytogenes
Fuente: Reglamento sanitario de alimentos. Chile. Artículo 173, DTO. N° 977/96.
En esta perspectiva, Chile ha ido actualizando el reglamento sanitario de los alimentos,

fortaleciendo los programas de higiene y control, perfeccionando los procesos de inspección y
certificación de las exportaciones, ampliando los mecanismos de participación de los distintos
actores, desarrollando los mecanismos de aseguramiento de la calidad y los sistemas de
trazabilidad, fortaleciendo las capacidades analíticas de los laboratorios, e incorporando
crecientemente el enfoque integrado de las cadenas de producción sustentado en el análisis de
riesgo. Muchos de estos mejoramientos, que han significado avances, han contado con la valiosa
cooperación internacional, especialmente de Japón, Unión Europea, Estados Unidos y Canadá.
54
AOAC Official Method.
La Asociación de comunidades analíticas, "AOAC INTERNATIONAL” tiene como fin el ser un

proveedor proactivo, mundial y facilitador en el desarrollo, empleo y la armonización de métodos
validados, analíticos y programas de garantía de calidad de laboratorio y servicios. Las directrices
del comité de métodos para la validación de métodos microbiológicos para los alimentos y análisis
ambientales (Methods Committee Guidelines for Validation of Microbiological Methods for Food
and Environmental Surfaces) es una guía que incluye términos y definiciones asociadas con los
programas oficiales de métodos de análisis estandarizados y métodos estandarizados de pruebas de
rendimiento y los requisitos para la validación de metodologías de identificación confirmatoria,
cuantitativa y cualitativa mas actualizadas. La edición más reciente es de febrero del 2012. El
propósito de este documento es proporcionar directrices técnicas comprensibles para llevar a cabo
estudios de validación microbiológica de los alimentos y de los métodos de análisis ambientales.
Los métodos validados que contiene para los productos de la pesca y acuicultura engloban:
productos frescos y congelados, secos, salados, cocidos, en conserva y semiconservas en vinagre,
anchoas en aceite y productos ahumados. Los patógenos que son considerados en este tipo de
alimentos son: Salmonella, Listeria, Coliformes, E. coli, Legionella, Bacillus y Staphylococus
aureus.
Comisión del Codex Alimentarius.
El CODEX fue creado en 1963 para desarrollar estándares, guías y códigos de buenas prácticas,
destinadas a proteger la salud de los consumidores y garantizar prácticas justas y leales en el
comercio de alimentos bajo la supervisión del Programa de Estándares de Alimentos, de la
Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) y de la
Organización Mundial de la Salud (OMS). Asimismo promueve la coordinación de todos los
trabajos sobre normas alimentarias ejercidas por organizaciones internacionales gubernamentales y
no gubernamentales.
Para esta comisión, es tarea de cada país desarrollar el marco normativo adecuado siguiendo las
guías establecidas por el CODEX e informar y realizar programas de educación para lograr la
inocuidad alimentaria en la producción de alimentos para el consumo humano. En 1983, un comité
de expertos en inocuidad alimentaria fue convocado por la OMS y FAO (organizaciones
internacionales que tienen asignaciones específicas en la materia), para discutir temas relacionados
con la inocuidad alimentaria. La conclusión del comité, fue que las ETAs, posiblemente sea el
problema de salud más importante a nivel mundial y una de las principales causas que contribuyen a
reducir la productividad económica (OMS, 1999).
Existen varias comisiones dentro del Codex que están preparando los códigos de prácticas para los
diversos aspectos relacionados con la inocuidad de diferentes productos:
o Comité del Codex en peces y productos de la pesca.

o Comité del Codex en higiene de alimentos.
o Comisión intergubernamental de investigación Ad-Hoc en alimentación animal.
o Comité del Codex en aditivos y contaminantes en alimentos.
o Comité del Codex en residuos de medicamentos veterinarios en alimentos.
o Comisión intergubernamental de investigación Ad-Hoc en alimentos derivados de la
biotecnología.
o Comité del Codex en sistemas de inspección y certificación de alimentos importados y
exportados.
55
El Comité del CODEX sobre pescados y productos pesqueros establece normas mundiales para
pescado, crustáceos y moluscos bivalvos frescos y congelados o elaborados de cualquier otra forma,
la mayor parte de las evaluaciones son sensoriales (organolépticas). En el código de prácticas para
el pescado y los productos pesqueros se le incorporaron las buenas prácticas de fabricación (BPF) y
el HACCP. En el código, se hace mención de Salmonella, Shigella, E. coli, Vibrio cholerae, Vibrio,
parahaemolyticus y Vibrio, vulnificus como posibles peligros biológicos que pueden encontrarse
contaminando los productos acuáticos, antes de su cosecha; e incluye a Listeria monocytogenes,
Clostridium botulinum y Staphylococcus aureus como aquellos que pueden ser introducidos durante
el procesamiento de los productos. En otros casos se puede presentar contaminación de origen fecal,
cuando las instalaciones se encuentran cerca de la la influencia de poblados o actividades
productivas que puedan contaminar con residuos de medicamentos veterinarios en exceso y de otras
sustancias químicas.
Señala también los posibles peligros para el pescado vivo almacenado y transportado a bajas
temperaturas, como son: contaminación microbiológica, biotoxinas, contaminación química (p. ej.,
aceite, agentes de limpieza y desinfección (Codex, 2012).
En relación a los moluscos, como son organismos filtrantes, los contaminantes se concentran en
niveles mayores que las aguas marinas que los circundan, por consiguiente, la contaminación por
bacterias y virus en la zona de cría es de importancia crítica para la especificación del producto final
y determina los requisitos del proceso de elaboración ulterior. La contaminación por aguas de
escurrimiento agrícola o aguas negras pueden transmitir patógenos bacterianos y/o virales
(Norwalk, virus de la hepatitis). A efectos de controlar los peligros, es muy importante la
identificación y vigilancia de las zonas de cría para la inocuidad de los moluscos bivalvos.
Organización Mundial del Comercio (OMC).
Es el único organismo internacional que se ocupa de las normas que rigen el comercio entre los
países. Su principal propósito es asegurar que las corrientes comerciales circulen con la máxima
facilidad, previsibilidad y libertad posible.
La OMC ha implementado dos acuerdos relacionados con plantas y animales de la acuacultura: el

Acuerdo de Aplicación de Medidas Sanitarias y Fitosanitarias (SPS, por sus siglas en inglés) y el
Acuerdo sobre Barreras Comerciales para el Comercio (TBT, por sus siglas en inglés). El primero
proporciona las reglas básicas para inocuidad alimentaria, conjuntamente con estándares de salud
para animales y plantas, mientras que el segundo cubre todos los requerimientos técnicos,
estándares y consideraciones regionales que no estén cubiertas por el SPS. El resultado es la
certidumbre. Los consumidores y los productores saben que pueden contar con un suministro
seguro y con una mayor variedad en lo que se refiere a los productos acabados, los componentes,
las materias primas y los servicios que utilizan, mientras que los productores y los exportadores
tienen la certeza de que los mercados exteriores permanecerán abiertos a sus actividades. Otra
consecuencia es que el entorno económico mundial se vuelve más próspero, tranquilo y fiable.
(WTO, 2012).
Organización Mundial de la Salud (OMS)
Este organismo internacional entró en vigor el 7 de abril de 1948, siendo la autoridad directiva y
coordinadora de la acción sanitaria en el sistema de las Naciones Unidas. Es responsable de
desempeñar una función de liderazgo en los asuntos sanitarios mundiales, configurar la agenda de
56
las investigaciones en salud, establecer normas, articular opciones de política basadas en la

evidencia, prestar apoyo técnico a los países y vigilar las tendencias sanitarias mundiales. Un
instrumento decisivo en la lucha contra la propagación mundial de las enfermedades infecciosas es
el Reglamento Sanitario Internacional (RSI), negociado por los estados miembros de la OMS,
establece las normas que deben aplicar los países para identificar los brotes epidémicos y detener su
propagación. Es un instrumento jurídico de carácter vinculante para 194 países, entre ellos todos los
estados miembros de la OMS. Su objetivo es ayudar a la comunidad internacional a prevenir y
afrontar riesgos agudos de salud pública susceptibles de atravesar fronteras y amenazar a
poblaciones de todo el mundo. El RSI, que entró en vigor el 15 de junio de 2007, obliga a los países
a comunicar a la OMS los brotes de ciertas enfermedades y determinados eventos de salud pública
(WHO, 2006).
a) Estrategia global para la inocuidad (WHO Global Strategy for Food Safety). En mayo del
2010 la OMS aprobó esta nueva resolución sobre seguridad alimentaria. Se trata de un esfuerzo
global para la vigilancia de lasETAs. Las organizaciones internacionales reconocen que un sistema
global de inocuidad alimentaria compete a todos; desde autoridades gubernamentales hasta
consumidores y que la “elaboración de sistemas eficaces de inocuidad de los alimentos” se basa en
gran medida en la coordinación, colaboración y comunicación entre todas las actividades. Para lo
anterior el análisis de riesgos es una herramienta muy útil que debe ser realizado en colaboración
con agencias internacionales utilizando las herramientas científicas existentes para riesgos
microbiológicos. Los problemas más preocupantes relacionados con la inocuidad de los alimentos
son:
o la propagación de los riesgos microbiológicos

o los contaminantes químicos de los alimentos, la evaluación de nuevas tecnologías
alimentarias, como los alimentos genéticamente modificados y
o la creación de sistemas sólidos que velen por la inocuidad de los alimentos y garanticen la
seguridad de la cadena alimentaria mundial. (WHO, 2002).
La OMS trata de generar estrtegias para prevenir brotes de enfermedades y minimizar los riesgos
para la salud en toda la cadena, desde el productor hasta el consumidor y ha elaborado documentos
de divulgación que sirven como herramienta o guía educativa, así como material de consulta, para
la comunidad educativa para que aprendan como mantener los alimentos seguros y evitar la
contaminación de los mismos. Cabe señalar que esta organización trabaja junto con la OMC y FAO
en estos aspectos.
b) International Food Safety Authorities Network (INFOSAN). Es una iniciativa entre la OMS
y FAO. Las autoridades en materia de inocuidad de los alimentos incluyen autoridades nacionales
involucradas en la legislación alimentaria, la evaluación del riesgo, el control y la gestión de
alimentos; la inspección de alimentos; los laboratorios de control y vigilancia, y los materiales de
información, educación y comunicación sobre inocuidad de los alimentos, en todo el proceso que va
desde la producción hasta el consumo (“de la granja a la mesa”). Por lo tanto, es posible que los
centros de enlace de INFOSAN estén en diferentes ministerios, como los de salud, comercio y
agricultura. Dado que la información que se intercambia puede ser delicada, la comunicación dentro
la red es confidencial y los puntos de contacto de INFOSAN Emergencias son oficialmente
designados por los países. INFOSAN emergencias funciona las 24 horas del día, los siete días de la
semana y la red está estrechamente vinculada con otros sistemas de vigilancia y respuesta de la
OMS (FAO-WHO, 2010).
57
Conclusiones de los resultados de la encuestas a los laboratorios que realizar la determinación

de microorganismos patógenos en alimentos
La participación de los Estados de la República Mexicana a la encuesta fue del 56 %.
El 58 % de los laboratorios o instituciones encuestados pertenecen al sector privado y el 42 %

pertenece al sector público.
El equipo común para realizar el análisis de MPA entre las empresas o instituciones es algún tipo de
microscopio (contraste de fases, campo oscuro, entre otros). El segundo equipo que se utiliza en el
análisis de MPA son relacionados con técnicas moleculares (termocicladores para realizar PCR
punto final y PCR en tiempo real) siendo similar el uso de técnicas de ensayos por inmunoabsorción
ligado a enzimas (ELISA).
El 61 % de las 35 empresas o instituciones encuestadas cuentan con instalaciones para la

capacitación del personal encargado del análisis de MPA y el 31 % no cuenta con instalaciones
destinadas a la capacitación. El 86 % de los entrevistados afirma que cuenta con un programa de
capacitación anual para su personal.
Los análisis más frecuentes de MPA se centran en primer lugar los dedicados a Salmonella spp., en
segundo lugar Coliformes totales y en tercer lugar Coliformes fecales. La mayoría de los análisis
que se solicitan son para matrices complejas o que no se definían como cárnicos, frutas, verduras o
marinos.
Los análisis de Coliformes totales y fecales para frutas y verduras son más frecuentes que los
análisis para estos microorganismos en cárnicos y marinos.
Para cárnicos y marinos son más frecuentes los análisis para Salmonella spp que en frutas y
verduras.
Los análisis para Vibrio cholerae son más frecuentes en marinos que en cárnicos, frutas y verduras.
Las especies de Campilobacter jejuni, Shigella, Yersinia enterocolitica, Yersinia spp. y Bacillus no
son microorganismos sujetos a análisis de MPA por parte de los encuestados.
Las matrices de alimentos no definidas como cárnicos, frutas, verduras y/o marinos, indican que se
utilizan en una misma proporción los procedimientos tanto manuales como automáticos,
independientemente del microorganismo a analizar.
Las técnicas de análisis de MPA más utilizadas son las de medios selectivos.
Para Coliformes totales y fecales el uso de la técnica del número más probable sigue siendo la
técnica de análisis de mayor uso, sin importar la matriz a analizar.
Para el análisis de E. coli O157:H7 y STEC se prefiere el uso de técnicas moleculares basadas en
PCR punto final, PCR tiempo real y también en técnicas de separación inmunomagnética. No hay
variación en la matriz a analizar.
Para el análisis de Salmonella spp. se utilizan métodos tales como PCR punto final, PCR tiempo
real, pruebas inmunológicas, pruebas bioquímicas, medios selectivos, sistemas miniaturizados para
identificar MPA, separación inmunomagnética. Este comportamiento descrito se aplica a todas las
matrices de alimentos descritas en la encuesta.
58
Para el análisis de Listeria monocytogenes se utilizan métodos tales como PCR punto final, PCR
tiempo real, pruebas inmunológicas, pruebas bioquímicas, medios selectivos, ensayo por
inmunoabsorción ligado a enzimas, sistemas miniaturizados para identificar MPA, separación
inmunomagnética. Este comportamiento descrito se aplica a todas las matrices de alimentos
descritas en la encuesta.
Para el análisis de especies de Vibrio se aprecia que además del uso de medios selectivos también se
prefiere su análisis por medio de sistemas miniaturizados de identificación. Este comportamiento
descrito se aplica a todas las matrices de alimentos descritas en la encuesta.
De los laboratorios o instituciones encuestados, 91 % tienen un sistema de calidad implantado. El

80 % de las respuestas brindadas por los laboratorios encuestados indican que adoptaron un sistema
de calidad basado en la norma ISO/IEC 17025:2004 en sus diferentes versiones hasta la versión
2006; el 18 % restante de los laboratorios encuestados adoptó las normas ISO 9000 y sus
actualizaciones hasta la ISO 9001:2008. La norma NMX-EC-17025-IMNC-2006 es la más
adoptada para acreditar un sistema de calidad, en segundo lugar se encuentra una versión anterior de
esta norma (ISO/IEC 17025:2005).
Para analizar Coliformes totales se usan las normas CCAYAC M-04, NOM-112-SSA1-1994 y
NOM-113-SSA1-1994.
Para analizar Coliformes fecales se usan en mayor medida la norma CCAYAC M-04.
Para el análisis de E. coli O157:H7 destacan el uso de las normas AOAC, CCAYAC M-04 y BAM.
Para el análisis de E. coli STEC se repiten en uso las normas descritas por CCAYAC M-04, AOAC,
NOM de la SSA y BAX.
Las normas con las que se realizan los análisis para determinar especies de Vibrio cholerae,
parahaemolyticus y vulnificus se realiza siguiendo las NOM-242-SSA1-2009 y NOM-031-SSA1-
1993, en menor frecuencia se siguen las normas descritas en el BAM.
Los análisis para Salmonella spp, Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus se realizan
siguiendo las normas NOM-114-SSA1-SSA1-1994, NOM-143-SSA1-1995 y NOM-115-SSA1-
1994, respectivamente.
Para analizar Campylobacter jejuni se utiliza la norma OIE y las NOM de la SSA.
El 69 % de los 35 laboratorios o instituciones encuestados ha participado en pruebas

interlaboratorio para análisis de MPA.
Las pruebas interlaboratorio más mencionadas por los laboratorios encuestados son LGC Standars
(internacional) Salmonella en cocoa (2012), Staphylococcus aureus (LGC Standard-Reino Unido),
Coliformes fecales, Coliformes totales, E. coli, Salmonella, FEPAS, M0795, 2010 (Salmonella
especies), S. aureus, Listeria spp. y Listeria monocytogenes.
Las pruebas interlaboratorio que fueron mencionadas una sola vez por los laboratorios encuestados
son: ALAC CONFORME; CENAPA-SENASICA E. coli y Salmonella en jamón (2010);
CENAPA-SENASICA E. coli y Salmonella en embutido de cerdo (2009); FEPAS E. coli en carne
(2009); Mesofilos aerobios (LGC Standard-Reino Unido); Coliformes (LGC Standard-Reino
Unido); E. coli (LGC Standard-Reino Unido); Hongos y levaduras (LGC Standard-Reino Unido);
Vibrio cholerae (LGC Standard-Reino Unido); API; WS-183 Coliformes totales (NMP) Agua
59
potable ERA, FAPAS; QMS, raund 186, 2011 (Vibrio especies y V. parahaemolyticus); QMAS,
round 186, 2011 (Salmonella especies);, QMAS, round 186, 2011 (Listeria monocytogenes);
QUALITY IBN MICROBIOLOGY SCHEME; FEPAS Coliformes totales, indicadores mesofilicos
aerobios, Coliformes totales, E. coli; LGC STANDARDS ROUND 166 MARZO 2010; LGC
STANDARDS ROUND 186 NOVIEMBRE 2011; LGC Standards Proficiency Testing;
Determinación de BMA; LGC Standards. Satisfactorio-presencia/ausencia L. monocytogenes; LGC
Standards. Satisfactorio-presencia/ausencia Salmonella; LGC Standards-- en proceso
Presencia/Ausencia L. monocytogenes; 078QR SourceWatRTM para CT, CF y E. coli; SUERO
SHIGATOXIN STEC; CARNE STEC; Campylobacter en leche; UC Davis/reptiles and anphibians.
Las pruebas interlaboratorio en las que los laboratorios encuestados han participado en orden de
ascendente de número de mención son: Salmonella con 28 %, E. coli con 17 %, Coliformes
totales con 15 % y Listeria con 10 %.
El 97 % de los 35 laboratorios encuestados expresaron que debe actualizarse la normatividad

mexicana existente respecto a la normatividad internacional.
Las normas en orden de prioridad en que los 35 laboratorios encuestados sugieren que se actualicen
las normas son: NOM-114-SSA1-1994, NOM-115-SSA1-1994, NOM-113-SSA1-1994, NOM-143-
SSA1-1995, NOM-092-SSA1-1994, NOM-110-SSA1-1994, NOM-111-SSA1-1994, NOM-112-
SSA1-1994, NOM-031-SSA1-1993, NOM-242-SSA1-2009.
El 84 % de los 35 laboratorios encuestados contestoóafirmativamente en la disposición para invertir

para actualizar sus técnicas de medición de MPA.
60
Lista de empresas o instituciones entrevistadas
1 Laboratorio de Microbiología y métodos moleculares de USAM de CIATEJ

2 Laboratorio Central Regional de Monterrey
3 Analítica del Noroeste SA de CV
4 Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos
5 Laboratorio Estatal de Salud Pública de Chiapas
6 Alimentos y Biotecnología UNAM
7 Laboratorios Becar, S.A. de C.V.
8 Laboratorio Microbiológico ANDA
9 Biofleming Laboratorios
10 Laboratorios de Especialidades Inmunológicas, S.A. de C.V.
11 Analysis & Research Lab., S.A. de C.V.
12 Laboratorio de Microbiología en Inocuidad del CESAVESIN
13 Laboratorio de Análisis Químico, Centro de Investigación y Desarrollo Tecnológico en
Electroquímica, S.C.
14 Laboratorio Químico Industrial y Agrícola S.A. de C.V.
15 Laboratorio Estatal de Salud Pública de Aguascalientes
16 Laboratorio Estatal de Salud Pública de Durango
17 Laboratorios Valdés S.A. de C.V.
18 Laboratorio Microanalítico de Control S.A. de C.V.
19 Ecolaboratorios, S.A. de C.V.
20 Laboratorio Regional de Salud Pública Servicios de Salud Chihuahua
21 Bufete Químico S.A. de C.V.
22 Intertek Testing Services
23 Kimpen, S.A. de C.V.
24 Laura Tobilla Lalo. Consultoría en Inocuidad y Microbiología de Alimentos
25 Nestle Quality Assurance Center (NQAC) Toluca
26 Laboratorio Estatal de Salud Pública de Michoacán
27 Cierto y Seguro S.A. de C.V.
28 Laboratorio Central Regional de Mérida, Yucatán
29 Primus Laboratorios de México, S. de R.L. de C.V.
30 Laboratorio Fermi, S.A. de C.V.
31 Zábok Laboratorio SA de CV
32 Laclicsa Laboratorios
33 Difaza, Laboratorio de Control Industrial S.A. de C.V.
34 Laboratorio de Diagnóstico para la Detección de Organismos Patógenos
35 Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A.C.
61
PROGRAMAS INTERNACIONALES
IMPLEMENTADOS EN MATERIA
DE INOCUIDAD DE LOS
ALIMENTOS EN BENEFICIO DEL
SECTOR PRODUCTIVO DE
CÁRNICOS, PRODUCTOS DE
FRUTAS Y A BASE DE VEGETALES
I.1. PROGRAMAS INTERNACIONALES IMPLEMENTADOS EN MATERIA DE
INOCUIDAD DE LOS ALIMENTOS
I.1.1. Política de Inocuidad, CHILE 2009-2015. Unidad de Diseño FUCOA, Ministerio de

Agricultura.
Su objetivo es velar por la inocuidad de los alimentos
producidos, elaborados y comercializados en el país con el fin
de resguardar la protección de la salud de las personas y de los
derechos de los consumidores, además de favorecer el
desarrollo competitivo y exportador de la industria de los
alimentos. Esto, a través de un moderno, integrado, eficiente y
transparente sistema de inocuidad de los alimentos.
Como objetivos específicos se planea:
1. Perfeccionar el marco regulatorio

a. Contar con un marco regulatorio armonizado o
equivalente con las normas internacionales del
Codex Alimentarius.
i. Mantener actualizadas las normativas
de inocuidad con respecto al Codex
Alimentarius en los casos que corresponda.
ii. Revisar una legislación nacional a fin de analizar si se están detectando los
fraudes alimentarios.
b. Fortalecer la presencia de Chile en instancias internacionales.

i. Dar mayor relevancia al trabajo del Comité Nacional del Codex
Alimentarius.
ii. Robustecer la participación Chilena en el Codex Alimentarius.
2. Fortalecer las capacidades científicas y tecnológicas

a. Aumentar y mejorar la capacidad de los recursos humanos.
62
i. Desarrollar programas permanentes de capacitación.

ii. Apoyar la formación de post-títulos y post-grados.
b. Robustecer la investigación e innovación.

i. Definir agenda de investigación e innovación.
ii. Favorecer la incorporación de los temas de inocuidad de las agencias que
financian investigación.
iii. Desarrollo e innovación.
iv. Fomentar la constitución de consorcios tecnológicos
c. Fortalecer la capacidad analítica de la red de laboratorios.

i. Articular el sistema nacional de referencia.
ii. Impulsar la implementación de metodologías analíticas en ámbitos
emergentes.
3. Modificar los sistemas de control y vigilancia de los alimentos
a. Ampliar y consolidar las prácticas y mecanismo de autocontrol de los peligros

alimenticios.
i. Apoyar la implementación de sistemas de aseguramiento de la calidad en
las empresas de alimentos.
ii. Actualizar las modalidades de inspección de las empresas de alimentos.
iii. Rediseñar programas de fiscalización de la cadena alimentaria.
b. Mejorar programas de control e higiene de los alimentos.

i. Coordinar los programas de control de residuos de alimentos pecuarios e
hidrobiológicos.
ii. Coordinar los programas de control de residuos de plaguicidas en
productos vegetales.
iii. Integrar los programas de control de toxinas marinas.
iv. Implementar programas conjuntos de control de patógenos transmitidos por
alimentos.
c. Desarrollar un sistema de información de inocuidad integrado consistente y eficaz.

i. Compatibilizar los sistemas de información institucionales.
d. Modernizar la gestión de alertas alimentarias.

i. Desarrollar un sistema integrado de gestión de alertas alimentarias.
Perfeccionar el sistema de manejo de alertas vinculado a la exportación de
alimentos a la Unión Europea.
4. Favorecer el comercio internacional perfeccionando procesos de control y certificación de

exportaciones.
a. Mejorar los procedimientos de autorización de importación de los alimentos.
b. Perfeccionar los procesos de control y certificación de la inocuidad de los

productos alimenticios de exportación.
i. Definir un estándar mínimo de inocuidad de exportación.
63
ii. Evaluar la alternativa de hacer obligatoria la certificación de las

exportaciones de alimentos.
iii. Precisar las competencias institucionales para el control, inspección y
certificación de la inocuidad de los alimentos de exportación.
iv. Avanzar en la implementación de la certificación electrónica de las
exportaciones.
5. Promover la industria alimentaria en todos sus eslabones
a. Propiciar la ampliación de las capacidades técnicas y operativas de las empresas en

ámbitos de inocuidad.
i. Difundir e impulsar la aplicación de la Resolución Exenta no. 187, de 2008,
del Ministerio de Salud, referida a los sistemas de control preventivo.
ii. Intensificar el uso de los instrumentos del SENCE.
b. Perfeccionar y ampliar los instrumentos de fomento para las pequeñas y medianas

empresas.
i. Ampliar los programas de fomento relacionados con el aseguramiento de la
calidad
ii. Diseñar e implementar un programa de buenas prácticas de distribución en
las principales ferias mayoristas de alimentos.
6. Desarrollar un marco institucional que facilite y promueva la coordinación y
complementación de las entidades públicas.
a. Modernizar la institucionalidad pública relacionada con la inocuidad alimentaria.

i. Creación por Ley de la Agencia Chilena de Inocuidad de los Alimentos.
ii. Constituir un Comité Científico de Evaluación de Riesgos de los
Alimentos.
iii. Reforzar la modernización del MINSAL, SAG y SERNAPESCA.
iv. Integrar a la agencia el trabajo del Comité Nacional del Codex
Alimentarius.
b. Ampliar y mejorar los mecanismos de participación y de comunicación de los

riesgos.
i. Crear el Consejo Consultivo de la Agencia
ii. Institucionalizar las consultas públicas y la rendición de cuentas.
iii. Intensificar las campañas de información sobre los riesgos alimentarios.
iv. Fortalecer a las organizaciones de consumidores y su acción en el ámbito
de la inocuidad y calidad nutricional de los alimentos.
c. Modernizar la institucionalidad pública relacionada con la inocuidad alimentaria.
I.1.2. Food and Drug Administration Food Safety Program, Estados

Unidos de América
La unión americana cuenta con tres agencias en las cuales se regula la

inocuidad de los alimentos: el United States Department of Agriculture
(USDA), la Food and Drug Administration (FDA) y la Food Safety and
Inspection Service (FSIS).
64
Como parte de su programa se cuenta con un registro de reportes de alimentos, el cual consiste en
un portal para la industria donde puede reportar si hay una probabilidad razonable que el artículo
puede causar consecuencias de salud serias.
Se incluyen también planes de acción específicos como:

1. El plan de acción para la producción inocua
2. El plan de acción para la inocuidad en huevo
3. El plan de acción de acrilamida
El plan de protección de la FDA de 2007 establece una estrategia global e integrada de prevención,
intervención y la respuesta.
Para acceso de información al público en general está disponible el portal Food Safety.gov en el
cual se proporciona información sobre el manejo seguro de los alimentos, información básica de
patógenos, higiene, campañas, alertas, entre otros. En esta página se pueden reportar los casos por
intoxicación, así como se puede tener acceso a un experto a través de un chat. El portal está
disponible en inglés y español.
El documento principal que engloba la inocuidad de los alimentos está definido como el Food
Safety Modernization Act (FSMA) donde se incluyen títulos como:
1. Mejorar la capacidad para evitar problemas de seguridad alimentaria, donde se incluyen

temas como la inspección de los registros, el registro de instalaciones alimenticias, el
análisis de riesgos y peligros basados en los controles preventivos, normas de desempeño,
normas para la inocuidad de los productos, protección contra la adulteración intencional, la
colecta de honorarios por la autoridad, la estrategia para la agricultura nacional y la defensa
de los alimentos, consejos de coordinación para la alimentación y la agricultura, creación de
capacidad nacional, el transporte sanitario de los alimentos, manejo de alergia a los
alimentos y la anafilaxia, nuevos ingredientes de la dieta, requerimiento para la guía para el
procesamiento de la cosecha de ostras crudas, compra en el puerto e instalaciones
relacionadas con el alcohol.
2. Mejorar la capacidad para detectar y responder a los problemas de inocuidad en alimentos

donde se incluye la focalización de los recursos de inspección de las instalaciones
nacionales, las instalaciones extranjeras y puertos de entrada; informe anual, la acreditación
de laboratorios para el análisis de los alimentos, consorcio integrado por redes de
laboratorio, mejorar el seguimiento y el rastreo de los alimentos y el mantenimiento de
registros, vigilancia, autoridad de retiro obligatorio, la detención administrativa de los
alimentos, planes y normas para la descontaminación y desecho, mejorar la capacitación de
funcionarios en la inocuidad alimentos estatales, locales, territoriales y tribales, mejorar la
inocuidad de los alimentos, mejorar el registro de incidentes sanitarios.
3. Mejorar la seguridad de la comida importada que incluye el programa de verificación de

proveedores extranjeros, el programa del importador voluntario calificado, autoridad para
requerir certificaciones de importación de alimentos, notificación previa de embarques de
alimentos importados, fortalecimiento de la infraestructura de los gobiernos extranjeros con
respecto a la inocuidad de los alimentos, inspección de las instalaciones de preparación de
alimentos extranjeras, acreditación de los auditores externos, oficinas de relaciones
exteriores de la FDA y el contrabando de alimentos.
65
4. Otras disposiciones, que incluye la financiación de la inocuidad alimentaria, la protección

de los empleados, jurisdicción, autoridades, el cumplimiento de los acuerdos
internacionales determinación de los efectos presupuestarios.
Entre otros programas se incluyen:
1. El programa de la USDA y FSIS, “FY 2008-2013, Strategic plan” que tiene 6 objetivos
principales tales como:
a. Reforzar la inspección, los sistemas de ejecución y las operaciones para proteger
la salud pública.
b. Mejorar el uso del análisis de riesgos y la vulnerabilidad con el enfoque del FSIS
para proteger la salud pública.
c. Mejorar el desarrollo de la ciencia y las políticas basadas en el riesgo y los
sistemas.
d. Mejorar el desarrollo y el mantenimiento de la colección de datos y sistemas de
análisis para verificar la eficacia y eficiencia de la agencia de programas.
e. Mejorar el desarrollo y mantenimiento de una infraestructura innovadora que
soporta la misión de la agencia y sus programas.
f. Mejorar la eficacia de la agencia en divulgación y comunicaciones para alcanzar
las metas de salud pública.
2. El programa de FSIS “FY 2011-2016, Strategic Plan” que contiene tres temas
estratégicos:
a. Prevención de enfermedades producidas por alimentos: asegurar de que la
inspección de seguridad alimentaria se alinea con los riesgos existentes y
emergentes, maximizar el cumplimiento nacional e internacional con las políticas
de inocuidad de los alimentos, mejorar la educación pública y divulgación para
mejorar la manipulación de los alimentos, fortalecer la colaboración entre las
partes interesadas internas y externas a prevenir las enfermedades transmitidas por
los alimentos.
b. Comprender e influir en la cadena del campo a la mesa: utilizar con eficacia la
ciencia para entender las enfermedades transmitidas por los alimentos y las
tendencias emergentes e implementar políticas efectivas para responder a los
riesgos existentes y emergentes.
c. Fortalecer la capacitación de las personas e infraestructura: Facultar a los
empleados con la formación, recursos y herramientas para facilitar el éxitoen la
protección de la salud pública, en base de las necesidades definidas de la agencia,
desarrollar, mantener y utilizar metodologías innovadoras, procesos y
herramientas, incluyendo PHIS, para proteger la salud pública eficiente y
eficazmente y apoyar las necesidades y metas definidas por la salud pública.
I.1.3. European Commission DG Health and consumers,

SANCO
Esta comisión tiene como objetivos capacitar a los

consumidores, proteger y mejorar la salud pública, garantizar
que los alimentos en Europa (Unidad Europea, UE) sean
seguros y saludables, proteger la salud y el bienestar de los
66
animales de granja y proteger la salud de los cultivos y los bosques.
Parte de sus estrategias es a través de tres puntos básicos:
1. Vigilancia: una vez que la UE ha aprobado leyes sobre la alimentación y la seguridad

de los productos, los derechos del consumidor o la salud pública, corresponde a los
gobiernos nacionales, regionales y locales el aplicar las leyes para asegurar que los
comerciantes, los fabricantes y los productores de alimentos se adhieran a las reglas.
Parte del trabajo de la comisión es comprobar que ésto está sucediendo realmente.
2. Escuchando: para ser eficaz, sus políticas tienen en cuenta las políticas relacionadas
con la UE, por ejemplo sobre el comercio, la competitividad y el medio ambiente y las
preocupaciones de nuestros grupos de interés. A través de una amplia consulta se
enfocan en conocer la opinión de todas las partes interesadas.
3. Actuar: donde se necesita la acción de la UE, realiza propuestas que utilizan una
mezcla de leyes, el apoyo a proyectos y otras medidas. También apoya a las autoridades
nacionales o regionales.
Europa cuenta con la European Food Safety Authority (EFSA) que

es considerada la piedra angular de la Unión Europea (UE) en materia
de evaluación de riesgos e inocuidad de los alimentos. Colabora
estrechamente con las autoridades nacionales y proporciona
asesoramiento científico independiente y clara comunicación sobre
los riesgos existentes y emergentes.
El objetivo central de la política de la Comisión Europea sobre

inocuidad alimenticia es asegurar un alto nivel de protección de la salud humana y los intereses de
los consumidores en relación con los alimentos, teniendo en cuenta la diversidad, incluidos los
productos tradicionales, al tiempo que garantiza el funcionamiento eficaz del mercado interior.
La Comisión Europea tiene un portal como un sistema de alertas

conocido como RASFF (Rapid Alert System for Food and Feeds)
donde se encuentra información general, notificaciones e informes,
alertas entre otros. Además, la Comisión Europea y el RASFF
colaboran con el sistema de alerta de la Organización Mundial de la
Salud (OMS), llamada Red de Autoridades en materia de Inocuidad
de los Alimentos (INFOSAN). Esta red está formada por puntos de
contacto o centros de enlace nacionales en más de 160 países miembro que reciben información de
la OMS en forma de notas de INFOSAN en materia de seguridad alimentaria y la difunden a todos
los ministerios competentes en sus respectivos países. El RASFF colabora con INFOSAN y los dos
sistemas comparten información caso por caso.
La principal guía de la comisión es el Libro Blanco sobre seguridad slimentaria, que consiste en
aplicar un enfoque integrado del campo a la mesa involucrando a todos los sectores de la cadena
alimentaria, incluyendo la producción de piensos, producción primaria, procesamiento de alimentos,
almacenamiento, transporte y venta al por menor.
En este libro se presentan propuestas que transformarán la política alimentaria de la UE en un

instrumento anticipador, dinámico, coherente y global con el propósito de velar por un nivel
67
elevado de salud de las personas y de protección de los consumidores a través de un planeamiento

global e integrado.
Considera que la recopilación y el análisis de información son elementos esenciales de la política de

seguridad alimentaria, y resultan de especial importancia para la detección de peligros potenciales
en la alimentación animal y humana. Esto incluye una apropiada supervisión y vigilancia, sistemas
de alerta, investigación, cooperación científica, apoyo analítico, sistemas actuales de asesoramiento
científico, consulta obligatoria de comités, necesidades de redes científicas, entre otros.
Propone la necesidad de un nuevo marco jurídico para la seguridad alimentaria que esté formado
por un conjunto de normas coherentes y transparentes en materia de seguridad alimentaria.
Regulación de los alimentos para animales, de nuevos productos, aditivos, plaguicidas, ionización
en alimentos, residuos y disposición, alimentos modificados genéticamente, alimentos dietéticos,
proceso de comunicación de riesgos, etiquetado y publicidad, medidas de emergencia, toma de
decisiones, entre otros.
I.1.4. Ley Básica de Inocuidad en Alimentos, Food Safety

Commission, JAPON (2003, amd. 2006)
“En consideración a la importancia vital de las respuestas

precisas para el desarrollo de la ciencia y la tecnología, así
como al avance de la internacionalización y otros cambios que
rodean el entorno de los hábitos alimenticios de Japón, se
propone esta Ley para promover ampliamente las políticas
para garantizar la inocuidad alimenticia mediante el
establecimiento de principios básicos, al aclarar las responsabilidades de los gobiernos estatales,
locales y de la industria de los alimentos y el papel de los consumidores. Así como el
establecimiento de una dirección básica para la formulación de políticas, con el fin de garantizar la
inocuidad alimenticia”.
Esta ley está compuesta por tres capítulos principales:
1. Capítulo I. Disposiciones generales (Artículos 1-10), que contempla el propósito,

definiciones, reconocimiento básico para tomar medidas que aseguren la inocuidad de
los alimentos, medidas apropiadas en cada etapa del proceso del suministro de
alimentos, prevención de efectos adversos en la salud de los ciudadanos,
responsabilidades del estado, responsabilidades de gobiernos estatales, responsabilidad
de las empresas relacionadas con la alimentación, el papel del consumidor y medidas
legislativas.
2. Capítulo II. Dirección básica para la formulación de políticas(artículos11-21): La

aplicación de la evaluación del efecto de los alimentos en la salud, formulación de
políticas sobre la base de los resultados de la evaluación del efecto de los alimentos
sobre la salud en consideración de las condiciones de los hábitos dietéticos de los
ciudadanos y otras circunstancias, promoción de intercambio de información y
opiniones, establecimiento de un sistema para hacer frente a emergencia y otras
situaciones, cooperación cercana y mutua entre cuerpos administrativos relacionados,
establecimiento de investigación y otros sistemas, colección, organización y utilización
de información interna y externa, asegurar el etiquetado apropiado, educación y
68
aprendizaje referente a la inocuidad de los alimentos, consideración de los efectos en el

ambiente y la determinación y publicación de los asuntos básicos relativos a la
aplicación de las medidas.
3. Capítulo III. Comisión de seguridad alimentaria (artículos22-38): establecimiento,

obligaciones oficiales bajo la jurisdicción de la comisión, opinión de la comisión,
requerimiento de materiales, misión de la investigación, requerimientos en
emergencias, organización, nombramiento de los miembros de la comisión, plazo,
despido, servicio, salario de un miembro de la comisión, presidente, reuniones,
miembro experto de la comisión, secretario y la delegación de orden ministerial.
I.1.5. Programa Nacional de Inocuidad de los Alimentos, Ministerio de Salud Pública,

Viceministerio de Higiene y Epidemiología, Dirección Nacional de Salud Ambiental, Cuba 2001
Este programa se basa en el principio de integrar todos los factores tanto dentro del sector salud
como extrasectorialmente en función de la inocuidad de los alimentos para garantizar una mejor
salud para los consumidores y facilitar el comercio y exportación.
Como objetivos contempla:
1. Actualizar las actividades de vigilancia de las enfermedades transmitidas por alimentos

(ETA) integrando otros factores intra y extrasectorialmente.
2. Desarrollar la inspección sanitaria en coordinación con los organismos rectores
vinculados, productores y de servicio para la aplicación de medidas efectivas y
coherentes para la eliminación de los factores de riesgo detectados.
3. Desarrollar e impulsar la capacitación para la prevención de las ETA, entre el personal
de salud, los organismos productores, comercializadores y de servicio, asi como a la
población.
4. Desarrollar la comunicación de riesgos y la participación comunitaria para la
prevención de los ETA.
5. Establecer una red de laboratorios para profundizar en el estudio de las ETA y el
control de los alimentos en general.
6. Establecer las normas y procedimientos que correspondan para el desarrollo del
sistema, mediante la normalización y el control de calidad.
7. Coordinar y desarrollar las investigaciones necesarias entre los organismos
involucrados de investigación y docentes paraobtener información necesaria para el
control, así como la tecnología que conlleva a la reducción de ETA.
Este trabajo está orientado a atender y evaluar los riesgos que se presenten en agua, carne y
productos cárnicos (mataderos y fábricas de embutidos), alimentación colectiva, alimentación en el
hogar, distribución y conservación de alimentos y producción primaria (leche, frutas y vegetales,
otros).
I.1.6. Canadian Food Inspection Agency. Food Safety Enhancement Program Manual. Canadá.
El Gobierno de Canadá basa sus estrategias en

materia de inocuidad alimentaria en el Manual del
Programa de Mejoramiento de la Seguridad
Alimentaria (FSEP), el cual a través de la Agencia
Canadiense de Inspección Alimenticia (CFIA)
69
especifica los requisitos mínimos necesarios para una gestión de un sistema efectivo en seguridad
alimentaria.
El FSEP proporciona un mecanismo para que los operadores de los establecimientos demuestren su
capacidad para controlar los riesgos para mantener la inocuidad alimentaria con el fin de asegurar
que los alimentos sean inocuos para el consumidor. Además, ayuda a mejorar las habilidades de
producción de los establecimientos para alcanzar y mantener el cumplimiento de las disposiciones
reglamentarias.
El FSEP se basa en los principios del sistema de análisis de peligros y puntos críticos de control
(Hazard Analysis and Critical Control Point (HACCP)) desarrollado por la Comisión del Codex
Alimentarius. HACCP es un sistema de reconocimiento internacional, basado en la ciencia de los
alimentos y su seguridad, diseñado para prevenir, reducir o eliminar las posibles amenazas
biológicas, químicas o físicas para alcanzar la inocuidad en los alimentos.
El sistema de HACCP es responsabilidad de los establecimientos. El fabricante de los alimentos

tiene el control máximo sobre el producto y de este modo puede tener el mayor impacto en la
seguridad de los alimentos producidos.
El FSEP especifica los requisitos para un sistema de HACCP eficaz que combina la siguiente clave
de elementos para garantizar la producción de alimentos seguros:
 Programas de requisitos previos
 Planes HACCP (puede incluir controles de procesos vinculados a un punto crítico de
control)
 Validación de los puntos críticos de control
 Mantenimiento y reevaluación de procedimientos
Aunque la adopción de sistemas de HACCP en todo el mundo se debe principalmente a la seguridad
alimentaria y a la protección de los consumidores, existen otros beneficios para la industria de
alimentos que se pueden realizar mediante la implementación del sistema exitoso de HACCP.
El sistema de HACCP formalmente incorpora los principios de inocuidad de los alimentos como
medidas integrales de los procesos de producción. La implementación y el mantenimiento de
medidas de control desempeñan un papel fundamental en la sensibilización de la gestión frente a la
línea de producción y el personal.
Los establecimientos que han implementado un sistema HACCP ofrecen a los consumidores un
mayor grado de confianza debido a que demuestra que el objetivo de la empresa es producir un
producto alimenticio seguro.
El mercado sigue impulsando la aplicación del HACCP en la industria alimentaria. En muchos de

los casos, las exigencias del comprador y los gobiernos extranjeros requieren la aplicación del
HACCP para mantenerse en el mercado y/o acceder a los mercados antes inaccesibles. Como los
sistemas de HACCP son aceptados en todo el mundo, el FSEP ayuda a la industria Canadiense a
mantener y ampliar sus mercados internacionales.
70
RECOMENDACIONES PARA
ESTABLECER UN PROGRAMA DE
VERIFICACIÓN INTERNO EN
MÉXICO
I. JUSTIFICACIÓN DE POSIBLE IMPLEMENTACIÓN EN MÉXICO
En materia de inocuidad de los alimentos, México actualmente basa sus estrategias en el Programa
Nacional de Desarrollo 2007-2012, Objetivo 8. “Abastecer el mercado interno con alimentos de
calidad, sanos y accesibles provenientes de nuestros campos y mares”, Estrategia 8.1., que
contempla proteger al país de plagas y enfermedades, mejorar la situación sanitaria, garantizar la
aplicación de la normatividad vigente en materia de sanidad e inocuidad alimentaria y mantener el
reconocimiento y estatus sanitario en los mercados globales.
La Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA) a

través del Servicio Nacional de Sanidad Inocuidad y Calidad Agroalimentaria (SENASICA) realiza
actividades siguiendo los lineamientos del Programa Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad
Agroalimentaria (2007-2012) que incluye estrategias para la regulación, la protección, la difusión
y la capacitación en materia de inocuidad con el objetivo de beneficiar a los consumidores y a los
productores de la industria agroalimentaria que permite la exportación de diversos productos a otros
países.
Como lo señala el Programa de Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria se

requieren mejores herramientas para lograr un refuerzo continuo en el área de notificación
de plagas y enfermedades, la capacitación de grupos de vigilancia y el aumento de laboratorios
de diagnóstico públicos y privados.
Con el objetivo de mejorar la difusión de alertas al público consumidor en

el país, en noviembre de 2010, el Gobierno Federal apoyado por la
European Commission lanzó el portal de internet:
Red de Alerta Rápida (RAR, www.alertas.gob.mx)
RAR es considerado el medio oficial de comunicación de alertas para los consumidores en el cual
se emiten alertas de las diferentes dependencias del Gobierno Federal en materia de salud,
protección al consumidor, sanidad, inocuidad y calidad agroalimentaria.
El alcance de esta herramienta es fortalecer los derechos de los consumidores como camino para
elevar el bienestar de los mexicanos y aumentar la eficiencia en los mercados.
En este sitio se encuentran alertas de:

 la Comisión Federal de Protección contra Riesgos Sanitarios (COFEPRIS),
 de la Procuraduría Federal del Consumidor (PROFECO) y
71
 del Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria (SENASICA).
La sección de Información al Consumidor de RAR está conformada por noticias de COFEPRIS,

PROFECO, SENASICA, Administración General de Aduanas, Noticias internacionales y CPSC.
Desafortunadamente, la sección de denuncias y contacto no están disponibles por el momento, así
como la asesoría a proveedores y preguntas frecuentes.
Este sitio web también ofrece la notificación de alertas vía correo electrónico y se encuentra
disponible en Facebook y twitter.
Se recomienda realizar una campaña más ambiciosa para dar a conocer RAR y sus
aplicaciones, esto a través de los diferentes medios de comunicación con la finalidad de invitar a
los consumidores a apoyarse en esta herramienta oficial. Un mejor soporte técnico y la
incorporación de un chat en línea que pueda resolver dudas en tiempo real enriquecerían este
portal.
Es importante que la población conozca RAR para que evite confiar en alertas con información
confusa o errónea a través de medios de comunicación no oficiales.
Sería de gran relevancia que RAR publicara el seguimiento a las denuncias presentadas por los
ciudadanos especialmente en materia de intoxicación por alimentos en mal estado y su
recurrencia.
El bajo impacto de difusión entre la población fue demostrado en el análisis de la campaña de

promoción de cultura sanitaria agroalimentaria de SENASICA en 2010. En este documento se
destaca que aunque gran parte de la población asegura tener conocimientos sobre la sanidad e
inocuidad de los alimentos, tienen poco o escaso conocimiento sobre el SENASICA. Entre las
recomendaciones de los entrevistados se incluía que era indispensable una mayor difusión de la
dependencia y sus programas a través de la radio, internet y algunos medios impresos de circulación
nacional o local. Esto brinda una excelente oportunidad a este órgano desconcentrado para
difundirse como autoridad e normativa en la materia a través de la oferta de información oportuna,
veraz y clara para la población.
En materia de vigilancia, el Gobierno Federal a partir de 2011 implementó la Red de Alerta

Rápida Interna (RARI-SENASICA) que funciona como una herramienta tecnológica que permite
obtener y analizar información de manera rápida y en tiempo real, para detectar oportunamente
amenazas que pudieran poner en riesgo el patrimonio agroalimentario del país.
La RARI-SENASICA conjunta la información que emiten las diferentes áreas

técnicas de este órgano desconcentrado de la SAGARPA: Sanidad vegetal,
salud animal, inocuidad agroalimentaria e inspección fito-zoosanitaria. En
72
tiempo real se concentra información a la RARI-SENASICA de los 232 laboratorios que integran la
red de laboratorios del SENASICA; los 322 puntos de verificación e inspección interna del
territorio nacional y de la red de vigilancia interna y externa a nivel federal que consta de 36 puntos
de verificación en inspecciones federales, 19 cruces fronterizas, 15 puertos marítimos y 29
aeropuertos.
Es por ello que en caso de que se presentara alguna emergencia sanitaria relacionada con el sector
agroalimentario de nuestro país, esta infraestructura ofrece la posibilidad de actuar eficaz y
oportunamente en su contención, pues permitiría al grupo multidisciplinario de expertos del
SENASICA analizar a detalle y en forma inmediata, la información para medir el riesgo y de esta
manera implementar rápidamente las medidas y operativos pertinentes.
Esta plataforma promueve la utilización de medidas sanitarias y de procedimientos de evaluación

acordes con la Organización Mundial de Comercio (OMC). Fue diseñada con base en los estándares
establecidos por otros organismos internacionales como la Organización de las Naciones Unidas
para la Alimentación y la Agricultura (FAO), la Organización Mundial de la Salud (OMS), la
Organización Norteamericana de Protección a las Plantas (NAPPO) y la Organización Mundial de
Sanidad Animal (OIE).
RARI es compatible con la Red de Alerta Rápida Nacional (RAR) y con las principales redes de la
Unión Europea en materia de protección al consumidor: European Rapid Alert System for non-food
consumer products (RAPEX), que funciona para productos inseguros no alimenticios; y Rapid Alert
System for Food and Feed (RASFF), para alimentos y forrajes e insumos para la producción
agropecuaria, considerados potencialmente peligrosos.
Se recomienda que RARI incorpore a un número mayor de instituciones de investigación y

académicas, así como laboratorios de servicios con el objetivo de incrementar la probabilidad de
detectar un hallazgo. Es importante que el sitio web contenga información sobre los requisitos
necesarios para ser incorporado a esta red. Un adecuado soporte técnico es la base para el
funcionamiento eficaz de este sitio.
En general, para el control en materia de inocuidad alimentaria se debe reforzar constantemente

los recursos de inspección en las instalaciones nacionales, incrementar el número de
laboratorios acreditados, hacer más eficiente la rastreabilidad, mejorar la capacitación a niveles
estatales y locales y optimizar el registro de incidentes sanitarios. Es importante, aumentar la
seguridad de la comida importada, la detención administrativa de alimentos y el retiro obligatorio.
Para dar soporte a todos estos controles es indispensable la actualización de las normas oficiales
mexicanas.
Un punto de gran relevancia para la mejora continua en materia de inocuidad en alimentos es el

papel de la investigación y la transferencia de tecnología. El Programa Sectorial de Desarrollo
Agropecuario y Pesquero SAGARPA 2007-2012, punto 1.1.4. “Investigación, transferencia de
tecnología e innovación” señala que existe un fuerte rezago en el gasto interno en investigación y
desarrollo experimental (GIDE), pues solo se aplica un 0.44 % del PIB promedio en todas las áreas
y 0.17 % en el sector agropecuario, lo cual incide en la baja competitividad de los sistemas de
producto. En el sector agropecuario se cuenta con 0.6 investigadores por cada 10 mil habitantes, lo
cual está muy por debajo de los estándares internacionales.
73
A esto es necesario agregar la edad promedio de los investigadores que es de alrededor de 50 años
con 25 años de servicio, por lo que es urgente establecer programas de formación e
incorporación de investigadores jóvenes.
La mayoría de las instituciones de investigación y educación superior, presentan un fuerte

rezago en infraestructura, equipo, renovación y formación de recursos humanos en temas de
vanguardia. No existen esquemas de capital de riesgo que estimulen la innovación tecnológica en
el sector rural. El Sistema Nacional de Investigación y Transferencia Tecnológica para el Desarrollo
Rural Sustentable (SNITT) ha organizado instrumentos importantes de trabajo, pero no ha
alcanzado la fortaleza y estructura necesaria para cumplir a cabalidad las funciones que considera la
Ley de Desarrollo Rural Sustentable.
La agenda de transferencia tecnológica del campo mexicano, se lleva a cabo a través del modelo de
las fundaciones Produce, del cual han resultado algunas innovaciones relevantes, que es necesario
replicar, para lograr mayores impactos en el medio rural.
Actualmente las instituciones de investigación y educación superior mantienen una débil

vinculación con la Secretaría de Agricultura, Ganadería Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación
(SAGARPA), con la Asociación Mexicana de Secretarios de Desarrollo Agropecuario (AMSDA) y
con el sector productivo y empresarial del sector agropecuario, lo que provoca una falta de
alineamiento de la comunidad científica con los requerimientos actuales del país.
Los sistemas de administración de las instituciones de investigación y educación superior presentan

problemas burocráticos que limitan su capacidad de respuesta. Es necesario redoblar los esfuerzos
de transferencia de tecnología para hacer llegar a los productores los resultados de la
investigación.
Se recomienda implementar un programa nacional de ensayos de aptitud, y la disposición de

materiales de referencia certificados nacionales, para la medición de los organismos
microbiológicos causantes de ETAs que coadyuven en la validación de metodología y al
aseguramiento de la calidad del resultado de una medición.
Proveedores de ensayos de aptitud acreditados
Se presenta a continuación un listado con los datos generales y de contacto de proveedores de

ensayos de aptitud acreditados para laboratorios de ensayo de metodologías de detección de
microorganismos patógenos en alimentos, con el propósito de reforzar las recomenadaciones
y brindar opciones a los laboratorios de análisis y detección de microorganismos patógenos
de los alimentos para que pueden establecer un programa de verificación interno. Estas
recomendaciones atraerán clientes a dichos laboratorios certificados para usar sus servicios
de análisis y detección y asu vez, los clientes tendrán la certeza de que los resultados de los
análisis son confiables.
74
Proveedores de Ensayos de aptitud acreditados para laboratorios de ensayo de metodologías

de detección de microorganismos patógenos en alimentos
Proveed
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Patógeno Prueba Matriz ensayo Localización Página Web que los
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Salmonella (FSIS cárnico de
Morelos, C.P. _ILACG13_2007 reconocimient
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78
PROPUESTAS DE MEJORA A LA
NORMATIVIDAD
Observaciones y propuestas de modificación a la normativa Nacional de productos del mar
Los resultados del análisis de la normativa nacional e internacional sobre las metodologías
empleadas en la actualidad, para la detección de microorganismos patógenos responsables de las
enfermedades de transmisión por alimentos (ETAs) de origen acuático, las investigaciones sobre los
mecanismos de virulencia de los principales patógenos relacionados con las ETAs de este tipo de
alimentos, así como el conocimiento y experiencia que se tiene sobre las prácticas que se llevan a
cabo en los diferentes eslabones desde la cadena productiva o de captura hasta el consumidor, nos
permite plantear las siguientes consideraciones y recomendaciones a la Normatividad en México
relacionada con el aseguramiento de la inocuidad de productos derivados de la pesca y la
acuicultura:
Observaciones:
a) Se requiere una revisión de los criterios microbiológicos concertados en la NOM-242-

SSA1-2009 ya que no considera en algunos casos, el efecto del procesamiento del alimento,
sobre los microorganismos potencialmente presentes. Lo anterior puede ser considerado
como una posible sobrerregulación.
b) Debería aplicarse el mismo criterio microbiológico de Coliformes fecales y E. coli para
pescados, crustáceos y moluscos en la presentación de frescos, refrigerados y congelados.
c) Algunos aspectos biológicos de los patógenos, conjuntamente con la presentación de los
productos (ahumados, enlatados, envasados al vacío, frescos, congelados etc.) y los hábitos
alimenticios son considerados de manera muy superficial y posiblemente implique
modificación de los criterios, considerando principalmente la actual situación de la
acuicultura y las prácticas de pesca.
d) La normativa nacional debe estar acorde con los avances en la implantación de buenas
prácticas de pesca y producción acuícola, para poder ser homologadas con las de los países
de primer mundo en cuanto a los criterios microbiológicos.
e) La norma debería establecer de manera clara y sin ambigüedades el esquema de muestreo
para los diferentes productos, con base en un criterio científico (tamaño de muestra,
aleatoriedad, procedimiento, etc.,).
f) La búsqueda de la toxina botulínica y la enterotoxina estafilocóccica solo está considerada
para emergencias sanitarias y no están consideradas otras toxinas termoestables. Deberían
realizarse estudios epidemiológicos para sustentar lo anterior para los productos derivados
de la pesca (continental, ribereña y altamar) y acuicultura.
g) No se hace diferenciación de los criterios microbiológicos en productos ahumados en frio o
en calor, ni considera la importancia del empaque.
h) Se debería considerar el análisis de ausencia de toxina botulínica en productos salados y
seco-salados así como de Pseudomonas.
i) Debería existir una definición clara para las diferentes presentaciones de los alimentos
(crudos, semipreparados, listos para comer y diferentes combinaciones).
79
Propuestas
1. Incorporación de métodos alternos para la detección de genes relacionados con entero

toxinas en alimentos acuáticos contaminados. Por ejemplo; el gen stx1 (para Shiga
toxinas), el hlyA (para hemolisina de V. cholerae), el tdh-1 (hemolisina termoestable de
V. parahaemolyticus, el hly (para hemolisina de Listeria monocytogenes), el nuc (para
nucleasa termoestable de Staphylococcus aureus), entre otros. La determinación
específica puede estar ligada a la detección primaria del patógeno con métodos
normalizados. Importante que no represente una sobrerregulación pero si un incremento
en el nivel de seguridad para el consumidor. La generación de la capacidad diagnóstica
de las cepas toxigénicas debe o puede ser realizada por laboratorios de investigación
con procedimientos de validación estrictos y aplicarse en un estudio epidemiológico y
en casos de emergencias sanitarias.
2. Generar mecanismos que de manera rápida y transparente, sin la tramitología que
implica actualmente la modificación de normas, permitan incluir nuevos patógenos o
variantes microbiológicas a los programas de vigilancia epidemiológica en productos
acuáticos.
3. Diseño y ejecución de un programa anual (o bianual) de pruebas de desempeño y
ensayos interlaboratorios, considerando: 1) muestras de referencia, 2) métodos
convencionales (normados) y métodos alternos, 3) participación de laboratorios de
ensayos que demuestren contar con sistema de calidad implementado y que cuenten con
las técnicas estandarizadas y validadas para detección de patógenos en productos
derivados de la pesca y acuicultura, 4) los alcances específicos de cada uno de los
laboratorios involucrados y 5) participación de las autoridades correspondientes.
4. Desarrollo e implementación de un programa de prevención de ETAs, mediante la
aplicación y supervisión de leyes y normas relacionadas con la aplicación de buenas
prácticas en la producción y/o captura de organismos acuáticos. Debe contemplar la
capacitación del personal involucrado y las certificaciones correspondientes.
5. Promover y exigir sistema de trazabilidad en la producción, distribución y venta de
alimentos de origen acuático.
6. Aseguramiento de la calidad e inocuidad de los productos, mediante la supervisión
efectiva a plantas de procesamiento, transporte y venta al público (incluyendo pequeños
establecimientos). Lo anterior bajo el esquema de certificación y autorización de las
autoridades correspondientes.
7. Solicitar una revisión de la norma para evaluar vigencia de los criterios microbiológicos
y la conveniencia de incluir la identificación especifica del patógeno y/o Enterotoxina.
8. Evaluar la conveniencia de incrementar el nivel de seguridad en productos
pasteurizados con respecto a Salmonella (ausente/100g).
9. Considerando los hábitos alimenticios de un importante número de personas y los
problemas de contaminación en diferentes cuerpos de agua, donde se realizan
actividades de pesca y acuicultura, debería incluirse V. cholerae en los análisis
obligatorios para peces y crustáceos (ya que solo se consideran bajo emergencia
sanitaria) y no solo para moluscos bivalvos.
10. Debido a los cada vez mas brotes detectados de V. parahaemolyticus en camarón de
cultivo y relacionado con ETAs, que este patógeno debería ser considerado para su
incorporación como análisis obligatorio.
11. Analizar la conveniencia de crear una RED de laboratorios cuyo papel principal sea
estar a la vanguardia en las metodologías de detección de cepas patogénicas emergentes
en diferentes matrices. Dicha RED participaría, de manera obligatoria, en el programa
de evaluación de desempeño y ejercicios interlaboratorios.
80
CÁRNICOS
Propuesta para la Detección de Vibrio cholerae, V. vulnificus y V. parahaemolyticus.
Existen documentos internacionales validados para el monitoreo de las especies de Vibrio

patógenas al humano en alimentos en general y en México solo es aplicable para alimentos de
cárnicos de origen marino, que es donde la literatura refleja la mayor importancia de monitorearlos.
La revisión realizada respecto a la necesidad de monitorear especies de Vibrio patógenas al

humano, refleja que ésta es indispensable para productos cárnicos de origen marino. En el resto de
los alimentos, la contaminación con especies de Vibrio patógenas al humano es menos frecuente y
se da por contaminación cruzada con agua o alimentos de origen marino. Por tanto, no hay
evidencia contundente que conduzca a sugerir la necesidade implementar el monitoreo de estos
microorganismos en productos cárnicos diferentes al los de origen marino.
Propuesta para la detección de Salmonella spp
Con base a las validaciones y certificaciones internacionales (AOAC) de las plataformas y los
sistemas de detección comercial existentes para diagnóstico y en el hecho que son ampliamente
utilizados en la industria alimentaria para monitoreo interno de las plantas procesadoras de carne y
en que están siendo utilizadas por Estados Unidos y la Unión Europea como pruebas rápidas de
detección de microorganismos, que les permite hacer detenciones para posterior confirmación con
métodos de referencia oficial del país, se sugiere el uso de las siguientes plataformas comerciales
para la detección de Salmonella en productos cárnicos:
1) Sistema de detección genética (GDS, siglas en inglés). Biocontrol. Este sistema acopla la
detección de los microorganismos basados en anticuerpos y en la técnica de PCR en tiempo real.
2) Sistema Bax. Dupont. Este sistema de detección se basa en PCR en tiempo real.
3) ICycler. BioRad. Basado en PCR en tiempo real
4) Pathatrix pooling for Salmonella testing
FRUTAS Y HORTALIZAS
Propuesta para la detección de Salmonella spp
Es necesario hacer actualizaciones de la norma y que tenga concordancia con al menos uno de los
métodos establecidos por normas extranjeras o técnicas validadas por organismos internacionales.
Recientemente, algunas normas extranjeras hicieron actualizaciones en su esquema de análisis

microbiológicos en los medios de cultivo empleados y disponibles, así como en los métodos de
confirmación, ya que se incluyen algunos medios de cultivo (a continuación se enunciarán) y
métodos rápidos como reacciones bioquímicas rápidas (kits), métodos moleculares (principalmente
las que se basan en hibridación del ADN, incluyendo PCR) y reacciones inmunológicas (ELISA,
RIA y Aglutinación en látex), entre otras modalidades de dichos métodos. No obstante, la NOM en
cuestión no ha considerado el uso de dichos medios de cultivos nuevos (más selectivos y sensibles)
81
y los métodos rápidos de confirmación. Es importante considerar al menos uno de estos medios de
cultivo alternativos y métodos para la confirmación de Salmonella.
En el caso de los medios de cultivo, uno de los cambios recientes en la metodología del BAM/DFA
es el uso de caldo RV para la detección de Salmonella en alimentos con altos y bajos niveles de
microbiota competente. El medio Rappaport-Vassiliadis (RV) reemplaza al medio Selenito Cistina
(SC) en todos los alimentos, excepto para goma Guar. Además, el medio RV reemplaza al caldo
Lauril Triptosa (LT) para ser utilizado cuando hay levaduras activas en el alimento. El caldo
Tetrationato (TT) sigue siendo de selección como un segundo medio selectivo; sin embargo, el TT
se deberá incubar a 43 °C cuando se sospeche que la carga microbiana sea alta y a 35 °C cuando la
carga microbiana sea baja, incluyendo goma Guar. También se ha sugerido el uso del medio
selectivo Rambach (Rambarch agar, CHROMAGARTM) como alternativa a los descritos en la
norma.
El segundo cambio es la posibilidad refrigerar el medio de preenriquecimiento o los medios (caldos)

selectivos por 72 h como máximo. Este punto es importante tomarlo en cuenta, ya que por ejemplo,
si una muestra se comienza a analizar en fin de semana, permite hacer una pausa y retomar la
identificación de Salmonella al inicio de la siguiente semana (FDA/BAM, 2011).
En el caso de los métodos de confirmación, particularmente se recomienda el uso de PCR acoplado

a reacciones de serotipificación (Ésta recomendación se justifica en base a que el PCR es un método
ampliamente utilizado, rápido, sensible, específico, relativamente barato cuando se cuenta con el
equipo y en la actualidad muchos laboratorios de prueba ya cuentan con la tecnología).
En la NOM-114-SSA1-1994 se establecen una diversidad de alimentos que pueden ser analizados;

sin embargo, para frutas y hortalizas aunque están considerados, no se especifican algunos aspectos
como el que por ser la superficie de éstos la que se contamina se debe analizar de manera diferente
que la mayoría de los alimentos (Tal y como se describe en BAM/FDA, actualización al 2011, y en
APHA, 2001). Particularmente en este aspecto, se recomienda realizar el análisis por medio de
lavado del(os) fruto(s) en una cantidad de solución diluyente (Agua peptonada tamponada al 0.1 %)
igual al peso de la muestra a analizar, tal como se describe en FDA/BAM, 2011. Además,
FDA/BAM, 2011 recomienda la búsqueda de Salmonella en frutas y hortalizas en las que
recientemente se ha encontrado incidencia de la bacteria y ha sido causa de brotes epidemiológicos.
Tal es el caso de alimentos como coco (rallado), jugo de naranja, cidra y jugo de manzana, así como
el análisis de frutas y hortalizas enteras, tales como melón, mango y tomate. Es importante
considerar además a las frutas y hortalizas frescas cortadas o mínimamente procesadas y a los
vegetales de hoja verde, incluyendo especias.
Es importante también tomar en cuenta los métodos rápidos que se ofrecen en pruebas bioquímicas
como alternativas en la identificación bioquímica de Salmonella.
NOM-114-SSA1-1994. Bienes y servicios para la determinación de Salmonella en alimentos
Es necesario hacer actualizaciones de la norma y que tenga concordancia con al menos uno de los
métodos establecidos por normas extranjeras o técnicas validadas por organismos internacionales.
1. Es necesario que en la norma nacional se incluyan las frutas y hortalizas, pero que se
especifiquen aspectos como:
a) Como evaluar frutas y hortalizas enteras.
b) Como evaluar frutas y hortalizas frescas cortadas o mínimamente procesadas.
82
2. Es necesario que se actualicen los medios de cultivo empleados en la norma nacional, ya

que al menos en BAM/FDA y APHA se han incluido nuevos medios de cultivo, ya que se ha
demostrado que ofrecen resultados confiables y más reproducibles.
3. Es importante también tomar en cuenta los métodos rápidos que se ofrecen en pruebas
bioquímicas como alternativas en la identificación bioquímica de Salmonella.
4. Se sugiere también considerar el uso de métodos moleculares para la confirmación de

Salmonella, incluyen pruebas de hibridación del ADN como PCR, pruebas inmunológicas (ELISA,
RIA, AL, entre otros), ya que éstos han demostrado mayor especificidad, selectividad, límite de
detección y demás atributos necesarios para considerarlos aptos para su uso. Tomando en cuenta lo
que se expone en BAM/FDA, en el que una reacción que resulta negativa se acepta como tal; si ésta
resulta positiva se deberá confirmar por el método de referencia oficial. No obstante, para los
laboratorios de prueba (internos y externos) es importante reducir los tiempos de análisis y
considerando que la presencia de patógenos como Salmonella en alimentos es baja, comparado con
el número de muestras que se analizan podrían aportar apoyo en términos de reducción en los
tiempos de análisis.
Propuesta para la Detección de Listeria monocytogenes
La detección de Listeria monocytogenes en frutas y hortalizas no está firmemente sustentada debido

a que la presencia de este patógeno no ha sido ampliamente reportado, esto puede ser debido a las
altas poblaciones de microbiota del alimento las cuales constituyen una barrera biótica para el
establecimiento y desarrollo de microorganismos patógenos. Sin embargo, se recomienda que
Listeria monocytogenes sea detectada en este tipo de alimentos cuando su consumo vaya a ser
efectuado por personas con enfermedades crónicas o inmunosupresivas, ya que este estrato de la
población es más susceptible a la adquisición de enfermedades y por consecuencias más drásticas.
Con la información disponible y consultada hasta este momento, se puede argumentar que en base a
la Norma Oficial Mexicana que actualmente se encuentra, la cual describe la detección de Listeria
monocytogenes en alimentos, para lo que se especifica en queso y leche pasteurizados y en base a la
literatura consultada, Listeria ha sido altamente asociada a otros alimentos como lo son la carne,
pollo y embutidos, lo cual ya es considerado y tomado en cuenta por algunos métodos de referencia
como lo son el de la USDA-FSIS. Por lo que la recomendación emitida es ampliar la gama de
alimentos, como los anteriormente mencionados, en los que se busque la presencia de Listeria
monocytogenes.
Los métodos basados en determinaciones moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa

(PCR) constituyen una herramienta útil, sensible, y de relativamente fácil uso para la detección de
Listeria monocytogenes. En este sentido, se propone este método como método alternativo de
confirmación con la utilización de primers específicos para la especie monocytogenes y de esta
manera tener la certeza que se está detectando la especie de interés que es la que tiene un impacto
directo para la salud del humano. Es posible proponer este método como un método confirmatorio
de las muestras presuntivas que han sido procesadas a través de los métodos convencionales, ya que
estos dos métodos en conjunto se complementarían para de una manera tener un resultado en menor
tiempo y al mismo tiempo asegurar que el microorganismo detectado se encuentra viable.
Finalmente, otra recomendación como método alternativo de confirmación seria el Qualicon

(Wilmington, DE) que ha desarrollado dos sistemas de identificación de Listeria basados en el
ADN, uno que es un sistema de caracterización microbiana de ribotipificación automatizado, el cual
identifica todos los cultivos puros de Listeria a nivel especie basado en el análisis de ribotipo.
83
Propuesta para la Detección de E. coli O157 y productoras de shiga toxinas
En la detección de este género, de manera general, se ha propuesto a través del tiempo la detección
de E. coli. Posteriormente, E. coli O157:H7 se presentó como uno de los serotipos principales
causando gastroenteritis transmitida por alimentos como frutas y hortalizas. Sin embargo, no
únicamente este serotipo tiene la capacidad de causar daño ya que existen otros serotipos diferentes
a éste que contienen en su genoma los genes que codifican para las shiga toxinas, las cuales son las
responsables de la severidad en los cuadros gastroentéricos. Es por tanto, que se propone la
introducción de este grupo de Escherichia. Por lo que la propuesta seria la complementación de los
métodos de cultivo que involucran el uso de medios selectivos como el agar Rainbow acoplado a la
detección de genes de shiga toxina a través de la utilización de la técnica de PCR. Estos genes no
únicamente pueden involucrar los genes stx1 y stx2 si no también el gen de intimina que es otro
factor de virulencia importante dentro de las STEC, de esta manera se ampliaría el espectro de
cepas de E. coli STEC a ser detectadas mediante esta técnica.
Propuesta para la Detección de Staphylococcus aureus
NOM-115-SSA1-1994. Bienes y servicios. Método para la determinación de Staphylococcus aureus

en Alimentos
Se considera necesario hacer algunas consideraciones para modificación de la NOM en cuestión.
1. Es necesario considerar el empleo de los tres métodos para la identificación de

Staphylococcus en alimentos descritas en las normas UNE-EN ISO 6888-1:1999, ISO 6888-2:1999,
ISO 6888-3: 2003/AC, que incluye diluciones y siembra directa en el medio de cultivo Baird-
Parker, siembra en el medio de agar de plasma de conejo y fibrinógeno y por el método de NMP.
2. Se debe considerar además la inclusión de las especies de Staphylococcus intermedius y

Staphylococcus hyicus, ya que son también potencialmente patógenos al igual que Staphylococcus
aureus.
3. En todas las normas y métodos internacionales validados se descarta el análisis de

Staphylococcus en frutas y hortalizas ya que se considera que su presencia es ocasional y en bajas
concentraciones. La presencia de dicha bacteria en frutas y hortalizas se debe a la contaminación
por contacto con las manos de trabajadores o por contaminación cruzada con alimentos en los que la
presencia de Staphylococcus es común y en concentraciones mayores a 100 células por gramo de
muestra. Sin embargo, las frutas y hortalizas frescas cortadas y mínimamente procesadas llevan un
proceso de manipulación, en el que se exponen más a la posible contaminación por Staphylococcus
en las tres especies descritas. Por lo tanto, se debe considerar la inclusión de estos alimentos en las
normas nacionales para la detección de las especies de Staphylococcus de interés.
4. También se deben considerar los métodos moleculares como alternativas para la

identificación o confirmación, ya que se reducen los tiempos de análisis y rápida liberación de lotes
del alimento cuando se determina la ausencia de la bacteria.
84
PROPUESTA DE NORMAS
A continuación se compara la normatividad nacional con lo descrito por el Manual Analítico
Bacteriológico publicado por la FDA. Se sugiere que debido a la similitud entre el objetivo,
fundamento, procedimiento, reactivos y medios de cultivo, aparatos e instrumentos, preparación de
la muestra, expresión de resultados, e informe de la prueba se emitirá la concordancia de la
normatividad nacional con lo descrito en el Manual Analítico Bacteriológico reconocido
internacionalmente.
85
INFORME TÉCNICO DEL PROYECTO SECTORIAL SAGARPA CONACYT-2011-09-172352 DEMANDA 6. “Desarrollo de normatividad y métodos para detección y
medición de organismos microbiológicos en alimentos”.
Microorgan
Apartado BAM Chapter 5 NOM-114-SSA1-1994
ismo
Establecer un método general para la

Objetivo Identificación de Salmonella en alimentos.
determinación de Salmonella en alimentos.
Salmonella Basada en 5 pasos básicos: preenriquecimiento,
Preparación de la muestra, aislamiento de cepas con
enriquecimiento selectivo, selección en medios
Fundamento medios selectivos, identificación de cepas con
sólidos, identificación bioquímica y
pruebas bioquímicas y serológicas.
serotipificación.
86
1. Preparación de la muestra (incluye la

Aislamiento de la muestra: Mezclar suavemente la
incubación. 2. Aislamiento de Salmonella:
dilución con muestra, inocular en medio selectivo
Transferir 1 ml del cultivo de preenriquecimiento
RV, TT o SC por 24 h a 35 °C, 42 °C o 43 °C
a un tubo con 10 ml de caldo de tetrationato y a
dependiendo de la muestra. A partir del inóculo
otro con 10 ml de caldo selenito cistina (Se puede
anterior, sembrar en agar BS, XLD y HE e incubar
usar el medio VR para sustituir el caldo de
24 h ± 2 h a 35 °C. Examinar morfología típica y
tetrationato). Incubar 18 h -24 h a 35°C o para
atípica. Inocular colonias presuntivas en agar
alimentos altamente contaminados 42 °C. Mezclar
selectivo TSI y LIA e incubar a 24 h ± 2 h a 35 °C.
el tubo con caldo selenito cistina y estriar en XLD,
A los cultivos que viren alcalino el medio ensayar
VB y en un medio selectivo adicional ( Hektoen,
las pruebas bioquímicas. 2. Identificación de
agar sulfito de bismuto o agar SS). Efectuar lo
Salmonella: Para mezcla de cultivos (inocular en
mismo para el caldo tetrationato. Incubar las placas
agar MacConkey, agar HE, o agar XLD, incubar las
por 24 h + 2 h a 35°C. Examinar las placas
cajas durante 24 h ± 2 h a 35°C. Cultivos puros
investigando la presencia de Salmonella de
(prueba de ureasa convencional o rápida). Prueba
acuerdo a características específicas. 3.
serológica olivalente flagelar. Prueba serológica
Identificación bioquímica: Seleccionar al menos 2
Spicer-Edwards. Prueba para muestras ureasa
Procedimiento colonias de cada medio selectivo, inocular tubos,
negativa (caldo lisina decarboxilasa, caldo fenol
uno con TSI y otro con LIA por estría en superficie
rojo dulcitol o caldo base púrpura con 0.5 %
inclinada y punción en el fondo, incubar por 24 h +
dulcitol. Caldo triptona (caldo cianida de potasio,
2 h a 35°C. Considerar positivas las que dan
caldo malonato, prueba de indol, prueba serológica
reacciones específicas . Realizar la prueba de
flagelar (H) para Salmonella). Prueba serológica
ureasa. 4. Identificación serológica por medio del
somática (O) para Salmonella (prueba somática
ensayo de los antígenos somáticos de Salmonella
polivalente O, prueba de grupo somática O).
(Antisuero polivalente O) y cuando la aglutinación
Pruebas bioquímicas adicionales caldo lactosa rojo
es positiva en el suero polivalente O, puede
fenol lactosa o caldo púrpura lactosa. Caldo rojo
determinarse el subgrupo empleando antisueros
fenol sacarosa o caldo púrpura sacarosa, caldo MR-
para los diferentes subgrupos. Practicar si se
VP. Agar citrato de Simons. Clasificación de
requiere el ensayo de antígenos flagelares de
cultivos. Identificación genérica presuntiva de
Salmonella (Antisuero polivalente H). 5. Pruebas
Salmonella (kits de pruebas bioquímicas
bioquímicas complementarias:Agar citrato
miniaturizadas). Tratamiento de cultivos negativos
Simmons, medio SIM, caldo RM-VP, prueba de
a la prueba flagelar (H). Envío de cultivos para
Voges-Proskauer, prueba de rojo de metilo, caldo
serotipificación a las oficinas de la FDA.
malonato, caldo manitol.
87
Caldo lactosa (M74), leche en polvo descremada

(reconstituida) (M111), caldo selenito cistina (SC)
(M134), caldo tetrationato (TT) (M145), medio
Rappaport-Vassiliadis (RV) (M132). NOTA: Medio
RV debe ser preparado de ingredientes individuales.
Formulaciones comerciales no son aceptables., agar
xilosa lisina desoxicolato (XLD) (M179), agar Medios de pre-enriquecimiento: Agua de peptona
Hektoen entérico (HE) (M61), agar sulfato de bismuto tamponada y caldo lactosado. Caldos de
(BS) (M19), agar triple azúcar hierro (TSI) (M149), enriquecimiento: Caldo selenito-cistina, caldo
caldo triptona (triptofano) (M164), caldo tripticasa de tetrationato, Vassiliadis-Rappaport, caldo de soya
soya (M154), caldo tripticasa de soya con sulfato de tripticasa, leche descremada reconstituida, caldo
hierro (M186), caldo tripticasa triptosa de soya soya tripticasa estéril adicionado con sulfito de
(M160), caldo MR-VP (M104), agar citrato de potasio. Medios de aislamiento: Agar verde
Simmons (M138), caldo urea (M171), caldo urea brillante (VB), agar con sulfito de bismuto, agar
(rápido) (M172), caldo malonato (M92), agar lisina xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar para
hierro (LIA) (M89), caldo lisina decarboxilasa (M87), Salmonella y Shigella (SS), agar entérico Hektoen.
Reactivos y prueba en medio de movilidad (semisólido) (M103), Medios para pruebas bioquímicas: Agar de tres
medios de caldo cianidina de potasio (KCN) (M126), caldo fenol azúcares y hierro (TSI), agar de hierro y lisina
cultivo rojo carbohidrato (M121), caldo púrpura carbohidrato (LIA), agar nutritivo, medio de SIM (para sulfuro,
(M130), agar MacConkey (M91), caldo nutriente indol y movilidad), agar citrato de Simmons, caldo
(M114), caldo infusión cerebro corazón (BHI) (M24), MR-VP, caldo manitol, caldo malonato, caldo
solución de papaina 5 % (M56a), solución de celulasa urea, caldo de urea rápido, caldo infusión cerebro
1 % (M187), agar base triptosa sangre (M166), caldo corazón. Soluciones: verde brillante al 0.1 %,
universal de preenriquecimiento (M188), caldo yodo-yoduro, salina al 0.85 %, salina formalizada,
universal de preenriquecimiento (sin citrato amónico reactivo de Kovac, alfa-naftol al 5 %, rojo de
de hierro) (M188a), agua peptonada amortiguada metilo, hidróxido de potasio al 40 %, gelatinasa al
(M192), caldo Dey-Engley (M193), sulfito de potasio 5 %. Antisueros: Antisuero polivalente somático
anhídrido, solución de cloro, 200 ppm, conteniendo 0.1 (O), antisuero polivalente flagelar (H), antisuero
% dodecil sulfato de sodio (R12a), etanol, 70 % (R23), Vi.
reactivo de Kovacs (R38), reactivo de prueba Voges-
Proskauer (VP) (R89), cristales de fosfato de creatina,
solución de hidróxido de potasio, 40 % (R65), solución
hidróxido de sodio (R73), ácido clorhídrico 1 N (R36),
solución de tinción verde brillante, 1 % (R8), solución
de tinción púrpura de bromocresol, 0.2 % (R9),
88
indicador rojo de metilo (R44), agua destilada estéril,

tergitol aniónico 7 (R78), triton X-100 (R86), solución
salina fisiológica, 0.85 % (R63), solución salina
fisiológica formalinizada (R27), antisuero Salmonella
(O) somático polivalente, antisuero Salmonella (H)
flagelar polivalente, antisuero Salmonella grupo
somático (O): A, B, C1, C2, C3, D1, D2, E1, E2, E3,
E4, F, G, H, I, Vi, y otros grupos apropiados, antisuero
Salmonella Spicer-Edwards flagelar (H).
Horno (180 °C), incubadora con termostato,
autoclave con termómetro, baño maría con
termostato, baño maría con termostato y
Hornos, autoclaves, incubadoras, licuadora, termómetro, balanza granataria, licuadora,
Aparatos e
microscopio, tubos, cajas Petri, pipetas, varillas mechero Bunsen o Fisher, potenciómetro, matraces
instrumentos
vidrio, pH metro. Erlenmeyer (500 ml), cucharas, bisturíes, cuchillos
y pinzas, tubos de ensaye, tubos para serología,
pipetas, asa de platino o nicromel, papel pH,
ángulos de vidrio, recipientes de boca ancha.
Los siguientes métodos se basan en el análisis de una Pesar asépticamente 25 g (relación 1:9 muestra-
unidad analítica de 25 g en relación 1:9 muestra: caldo) de la muestra en un vaso estéril de licuadora
caldo. Dependiendo de la composición, añadir caldo o en bolsa estéril para trabajar en homogeneizador
suficiente para mantener esta relación 1:9 a menos peristáltico (stomacher). Adicionar 225 ml del
que se indique lo contrario. Para las muestras medio de preenriquecimiento estéril (generalmente
analizadas en una base de peso no exacto, por caldo lactosado) y licuar si es necesario durante un
ejemplo, ancas de rana, seguir las instrucciones min. Transferir asépticamente la mezcla
particulares. Éstas existen para los siguientes homogeneizada a un recipiente estéril de boca
Preparación de
productos: Yema de huevo, clara de huevo secos, ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60
la muestra
huevos enteros secos, leche líquida (leche min a temperatura ambiente con la tapa bien
descremada, 2 % de grasa de leche, leche entera y enroscada. Mezclar bien y determinar el pH
suero de leche), mezclas preparadas en polvo aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario,
(pasteles, galletas, donas, galletas y pan), leche a un pH 6.8 ± 0.2 con hidróxido de sodio 1N o
maternizada y alimentación por vía oral o un tubo ácido clorhídrico 1N estériles. Mezclar y cubrir el
que contiene huevo. Huevos en diferentes recipiente enroscando suavemente la tapa. Incubar
presentaciones. Leche en polvo. Leche entera en 24 h ± 2 h a 35 ºC. Se especifica el procedimiento
polvo. Caseína. Harina de soya. Productos que para los siguientes productos: huevo en polvo,
89
contienen huevo (fideos, rollos de huevo, claras de huevo en polvo, yema de huevo en polvo,
macarrones, espaguetis), queso, pasta, ensaladas huevos líquidos pasteurizados y congelados,
preparadas (jamón, huevo, pollo, atún, pavo), frutas y fórmulas infantiles y mezclas preparadas en polvo
verduras frescas, congeladas o secas, carnes de frutos (harinas para hotcakes, galletas, donas, bisquets y
secos, crustáceos (camarones, cangrejo, cigalas, pan). Productos no pasteurizados congelados de
langostinos, langosta), y pescado. Levadura seca huevo. Leche en polvo entera, semidescremada o
(levadura activa e inactiva). Coberturas para helado. descremada. Queso. Caseína. Coco. Levadura seca.
Especias. Revestimiento de dulces y golosinas Carnes, sustitutos de carnes, derivados cárnicos,
(incluido el chocolate). Coco. Colorantes de los sustancias de origen animal, productos glandulares
alimentos y sustancias alimenticias para colorear. y harinas (pescado, carne y hueso). Dulces y
Gelatina. Carnes, sustitutos de carne, subproductos dulces cubiertos (incluyendo chocolate). Especias.
de la carne, sustancias de origen animal, productos Gelatina.
glandulares y harinas (pescado, carne, hueso). Las
ancas de rana. Esqueleto o carcasas de conejo. Goma
guar. Jugo de naranja (pasteurizado y no
pasteurizado), sidra de manzana (pasteurizada y no
pasteurizada), jugo de manzana (pasteurizada).
Orejas de cerdo y otros tipos de alimento para perro.
Melones. Mangos. Tomates. Ensayos ambientales.
Semillas de alfalfa y frijol. Pulpa de mamey.
Vegetales de hojas verdes y hierbas (espinaca,
lechuga romana, cilantro, perejil rizado, perejil
italiano, culantro, repollo y albahaca).
Expresión de Presencia o ausencia de Salmonella por g o ml de Presencia o ausencia de Salmonella por g o ml dela
resultados producto. muestra.
Informe de la Informar presencia o ausencia de Salmonella por g
No especifíca.
prueba o ml de la muestra.
Esta norma no tiene concordancia con normas
Concordancia
internacionales.
con normas No especifíca.
Puede sugerirse: Esta norma tiene concordancia
internacionales
con el capítulo 5 del BAM.
90
BAM Capítulo 4 NOM-113-SSA1-1994 Método para la

NOM-112-SSA1-1994 Determinación bacterias
Apartado bacterias Coliformes cuenta de microorganismos Coliformes
Coliformes técnica número más probable
y Escherichia coli totales en placa
Establecer el método microbiológico para estimar el Establecer el método microbiológico para

Enumeración de número de coliformes presentes en productos determinar el número de microorganismos
Objetivo Escherichia coli y alimenticios, por medio del cálculo del número más coliformes totales presentes en productos
bacterias Coliformes. probable (NMP) después de la incubación a 35 °C alimenticios por medio de la técnica de
de la muestra diluida en un medio líquido. cuenta en placa.
Basado en el uso de un medio selectivo

(agar rojo violeta bilis) en el que se
Fermentación de Se basa en que las bacterias coliformes, fermentan
desarrollan bacterias a 35 °C en
lactosa y cálculo de la lactosa incubadas a 35 °c ± 1 °C durante 24 h a
Fundamento aproximadamente 24 h, dando como
número más probable 48 h, resultando una producción de ácidos y gas el
resultado la producción de gas y ácidos
NMP. cual se manifiesta en las campanas de fermentación.
orgánicos, los cuales viran el indicador de
pH y precipitan las sales biliares.
91
1. Colocar en cajas Petri por duplicado 1 ml

de la muestra líquida directa o de la dilución
primaria, utilizando para tal propósito una
pipeta estéril. 2. Repetir el procedimiento
tantas veces como diluciones decimales se
requiera, sembrar, utilizando una pipeta
1. Prueba presuntiva: Inoculación (tomar tres tubos
estéril diferente para cada dilución. 3. Vertir
General: Dilución, de concentración sencilla del medio selectivo de
de 15 ml a 20 ml del medio RVBA fundido
NMP (inoculación e enriquecimiento, usar una pipeta estéril para
y manteniendo a 45 °C + 1 °C en baño de
incubación, transferir a cada uno de estos tubos 1 ml de la
agua. 4. Mezclar el inóculo con el medio con
aislamiento en placa, muestra si es líquida o 1 ml de la dilución primaria
seis movimientos de derecha a izquierda,
selección de colonias y en el caso de otros productos. Para las diluciones
seis en sentido de las manecillas del reloj,
confirmación), conteo subsecuentes, continuar usando una pipeta diferente
seis al contrario de las manecillas del reloj,
en placa (inoculación e para cada dilución. Mezclar suavemente el inóculo
seis de atrás para adelante, sobre una
Procedimien incubación, conteo y con el medio). Incubación (incubar los tubos a 35
superficie lisa y nivelada y dejar que
to selección de colonias), °C + 0.5 °C por 24 h + 2 h y observar si hay
solidifique. 5. Preparar una cajas control con
confirmación formación de gas, en caso contrario prolongar la
15 ml de medio para verificar la esterilidad.
(subcultivo, incubación hasta 48 h +2 h. 2. Prueba confirmativa:
6. Una vez solidificado el medio verter 4 ml
confirmación De cada tubo que muestre formación de gas, tomar
del medio RVBA a 45 °C + 1 °C en la
bioquímica). una asada y sembrar en un número igual de tubos
superficie del medio inoculado, dejar que
confirmación en medio con medio de confirmación. Incubar a 35 °C + 0.5
solidifique. 7. Invertir las placas y colocarlas
sólido y filtración por °C por 24 h + 2 h o si la formación de gas no se
en la incubadora a 35°C durante 24 h +2 h.
membrana. observa en este tiempo, prologar la incubación por
8. Contar las colonias con el contador de
48 h +2 h.
colonias. 9. Seleccionar las placas que
contengan entre 15 colonias y 150 colonias.
Las colonias típicas son de color rojo
oscuro, rodeadas por un halo de
precipitación debido a las sales biliares,
color rojo claro o rosa.
Caldo verde brillante
bilis lactosa (BGLB) Soluciones diluyentes: solución reguladora de Soluciones diluyentes: solución reguladora
Reactivos y
(M25), caldo lauril fosfatos (solución concentrada), agua peptonada. de fosfatos (solución concentrada), agua
medios de
triptosa (LST)(M76), Medios de cultivo: caldo lactosado, caldo lauril peptonada. Medios de cultivo: agar-rojo-
cultivo
caldo EC (M49), azul sulfato triptosa, caldo lactosa bilis verde brillante. violeta-bilis-lactosa (RVBA).
Levin de metileno-
92
eosina (L-EMB), agar

(M80), caldo triptona
(triptofano) (M164),
caldo MR-VP (M104),
caldo citrato de Koser
(M72), agar para
cuenta en placa
método estándar
(PCA) (M124), agua
Butterfield de tampon
de fosfatos (R11) o
diluyente equivalente
(excepto para
crustáceos), reactivo
de Kovacs (R38),
reactivo Voges-
Proskauer (VP) (R89),
reactivos para tinción
de Gram (R32),
indicador rojo de
metilo (R44), agar
bilis rojo violeta
(VRBA) (M174), agar
VRBA-MUG (M175),
medio EC-MUG
(M50), caldo lauril
triptosa MUG (LST-
MUG) (M77),
diluyente de peptona,
0.1 % (R56).
93
Materiales: pipetas bacteriológicas, frascos

de vidrio, tubos, utensilios esterilizables
para la obtención de muestras
Hornos, autoclaves, Materiales: pipetas microbiológicas, frascos de (cuchillos,pinzas, tijeras, cucharas,
incubadoras, tubos, vidrio con tapón de rosca (250 ml), utensilios espátulas, etc), cajas Petri. Aparatos e
cajas Petri, pipetas, esterilizables (cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, instrumentos: horno para esterilizar,
Aparatos e varillas vidrio, asas, espátulas, tubos de cultivo, campanas de autoclave con termómetro y manómetro,
instrumentos pHmetro, contador de fermentación (tubos de Durham), pipetas baño de agua con control de temperatura,
colonias, licuadora, bacteriológicas, gradillas, asa de platino. Aparatos: licuadora, un vaso para licuadora con tapa
frascos de dilución, horno para esterilizar, incubador con termostato, esterilizables o bolsas estériles para
lámpara UV. termómetro, autoclave, potenciómetro. homogeneizador peristáltico, incubadora con
termostato, contador de colonias de campo
oscuro, registrador mecánico o electrónico,
microcopio óptico, potenciómetro.
La preparación de la muestra debe ser de

Las muestras deben prepararse y diluirse de acuerdo acuerdo a lo establecido en la NOM-110-
Preparación
a la NOM-110-SSA1-1994. Preparación y Dilución SSA1-1994 "Preparación y Dilución de
de la Diluciones decimales.
de Muestras de Alimentos para su Análisis Muestras de Alimentos para su Análisis
muestra
Microbiológico. Microbiológico".
Tabla del Número Más

Probable (NMP),
Expresión de
número de Expresar en NMP/g o ml para alimentos Coliformes/g o coliformes /ml
resultados
Enterobacteriaceae x
gramo o por mililitro.
94
Informar: UFC/g o ml en placa de agar rojo

violeta bilis, incubados a 35 °C durante 24 h
± 2 h.
En caso de emplear diluciones y no observar

Informe de Informar "Número más probable (NMP) de crecimiento, informar utilizando como
No especifíca.
la prueba Coliformes por gramo o mililitro de muestra" referencia la dilución más baja utilizada, por
ejemplo dilución 10-1.
En caso de no observar crecimiento en la

muestra sin diluir se informa: "no desarrollo
de Coliformes por ml".
Concordanci
Esta norma no tiene concordancia con normas Esta norma no tiene concordancia con
a con
internacionales. normas internacionales.
normas No especifíca.
Puede sugerirse: Esta norma tiene concordancia Puede sugerirse: Esta norma tiene
internacional
con el capítulo 4 del BAM. concordancia con el capítulo 4 del BAM.
es
Microorganis Apartado BAM Chapter 12 NOM-115-SSA1-1994

mo
Staphylococcus
Objetivo Estimar el contenido de Staphylococcus aureus en Establecer el método microbiológico para

alimentos. determinar la cuenta de Staphylococcus aureus
aureus
presente en alimentos nacionales o de

importación.
95
Fundamento Detección de Satphylococcus spp. por el método Estimación del contenido de Staphylococcus
del número más probable (NMP) en muestras con aureus en alimentos, se efectúa directamente en
un número bajo esperado de Staphylococcus y placas de medio de cultivo selectivo y
contenido de especies competitivas. diferencial, con la confirmación mediante las
Identificación y confirmación por medio de pruebas de coagulasa y termonucleasa.
pruebas bioquímicas.
Procedimiento Determinación del NMP. Dilución, inoculación 1. Incubación de 0.1 ml de cada dilución sobre la
en medio selectivo líquido, medio selectivo superficie del agar Baird-Parker a 35 °C de 45 h a
sólido, aislar en medio selectivo sólido, transferir 48 h. 2. Seleccionar las placas que tienen entre 15
a medio selectivo líquido para recuento, colonias y 150 colonias típicas de S. aureus. 3.
identificación y confirmación de S. aureus por Sembrar las colonias en tubos con 0.5 ml de
prueba de coagulasa, prueba de catalasa, caldo de infusión cerebro-corazón. Incubar a 35
utilización anaeróbica de glucosa, utilización °C durante 24 h. 4. Prueba de coagulasa. 5.
anaeróbica de manitol, sensibilidad a Prueba de termonucleasa.
lisostafina, producción de nucleasa
termoestable, identificación de alguna
característica típica de 2 cepas de S. aureus, S.
epidermidis, y micrococci. Reportar de
acuerdo a tablas de NMP.
Reactivos y Medio Baird-Parker (M17), agar tripticasa soya Soluciones diluyentes : solución reguladora de
medios de cultivo (TSA) (M152), caldo infusión cerebro corazón fosfatos, agua peptonada. Medios de cultivo:
(M24), agar plasma (conejo) coagulasa con EDTA Medio de Baird-Parker, caldo de infusión de
toluidina azul-ADN (M148), agar lisostafina cerebro-corazón (BHI), ácido
triptona extracto de levadura (M165), aceite de desoxirribonucleico helicoidal de timo de ternera.
parafina, tampón salino de fosfato 0.02 M (R61) Reactivo biológico: plasma de conejo.
conteniendo 1 % NaCl, prueba de catalasa (R12),
caldo tripticasa de soya (TSB) conteniendo 10 %
NaCl y 1 % piruvato de sodio (M154a).
96
Aparatos e Hornos, autoclaves, incubadoras, tubos, cajas Materiales: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas,
instrumentos Petri, pipetas, varillas vidrio. espátulas, separador de huevo, tubos de cultivo,
cajas Petri, pipetas bacteriológicas 1ml y 10 ml,
pipetas Pasteur, probetas, varillas de vidrio de 3.5
mm de diámetro aprox. y 20 cm de largo, matraz
Erlenmeyer con perlas de vidrio, cámara húmeda.
Aparatos: horno para esterilizar, autoclave con
termómetro, baño de agua con regulador de
temperatura, balanza 2500 g, incubadora 35 °C +
1 °C.
Preparación de la Dependiente de la muestra. Conforme a lo establecido en la NOM-110-

muestra SSA1-1994 "Preparación y Dilución de Muestras
de Alimentos para su Análisis Microbiológico".
Expresión de NMP x gramo o por mL En UFC/g o UFC/g valor estimado.

resultados
Informe de la No especifíca Si las pruebas confirmativas resultan negativas en
prueba todas las colonias probadas, informar como: 0
UFC/g en muestras directas, 10 UFC/g en
muestras de dilución 1:10 y 100 UFC/g en
muestras de dilución 1:100.
Concordancia con AOAC 987.09. No especifíca.
normas Puede sugerirse: Esta norma tiene
internacionales concordancia con el capítulo 12 del BAM en
las pruebas bioquímicas de identificación del
microorganismo.
97
Microorg Norma
Apartado
anismo
BAM Chapter 9 NOM-242-SSA1-2009
Establecer los requisitos sanitarios para las

instalaciones de toda la cadena productiva de
Objetivo Determinación de V. cholerae en alimentos productos marinos y las especificaciones
sanitarias de dichos productos y métodos de
prueba.
Basado en las siguientes técnicas: crecimiento en

Enriquecimiento, crecimiento en medio selectivo,
medio selectivo salino, pruebas bioquímicas, kit
aislamiento, diferenciación, identificación y
Fundamento de diagnóstico rápido API 20E, identificación por
confirmación mediante pruebas bioquímicas y
medio de sondas de ADN, identificación por
serológicas.
medio de PCR.
Enriquecimiento y siembra, detección y
Vibrio cholerae
confirmación, pruebas bioquímicas, diferenciación

Preparación de la muestra, incubación, resiembra
de biotipos el Tor y clásico, determinación de
Procedimiento y aislamiento, diferenciación e identificación,
enterotoxigenicidad, detección genotípica del gen
confirmación.
de la toxina del cólera mediante la reacción en
cadena de la polimerasa.
98
Agua peptonada alcalina (APW) (M10), Medio

AKI (M7), placas de arginina glucosa (AGS)
(M16), agar sangre (M20), caldo de extracto de
levadura casaminoácidos (CAYE) (M34), agar
modificado celobiosa polimixina colistina
(mCPC) (M98), agar celobiosa colistina (CC)
(M189), medio de prueba de movilidad-1 % NaCl Agua peptonada alcalina, agar tiosulfato citrato
(M103), reactivo de oxidasa (N,N,N,N'-tetrametil- sales biliares y sacarosa (TCBS), agar
p-fenilenediamina-HCl en dH2O) (R54), diluyente modificado con celobiosa polimixina B y
peptona-Tween-sal (PTS) (90), tampón salino de colistina (mCPC), solución stock de colorantes
fosfatos (PBS) (R59), discos de polimixina B (50 1000 X, agar T1N1 (Agar triptona y sal), agar
U Difco o equivalente) (R64), solución salina 0.85 gelatina, agar gelatina con sal (GS), caldo glucosa
% en dH2O (R63), solución NaCl al 2 % (R71), de Hugh-Leifson, medio base de descarboxilasa
desoxicolato de sodio - 0.5% en dH2O (R91), agar (Arginina, lisina y ornitina), caldo triptona y
Reactivos y medios de
tiosulfato citrato sales biliares sacarosa (TCBS) caldos triptona sal T1N0, T1N1, T1N3, T1N6,
cultivo
(M147), agar T1N1 y T1N3 (1 % triptona y 1 % o T1N8, T1N10, agar soya tripticasa (TSA), agar
3 % NaCl respectivamente) (M163), Caldo T1N0, de hierro Kligler (KIA), agar arginina glucosa
T1N3, T1N6, T1N8, T1N10 (M161), agar tripti inclinado (AGS), agar triple azúcar y hierro (TSI),
soya sulfato de magnesio – 3 % NaCl (TSAMS) agar de hierro y lisina (LIA), caldo rojo de metilo
(32), caldo y agar tripticasa de soya (TSB) (TSA) y Vogues Proskauer (RM-VP), medio para prueba
(M152) (con NaCl, 2 %), TSB-1 % NaCl-24 % de movilidad (Semisólida), prueba de rojo de
glicerol, caldo urea (M171) o agar urea metilo, prueba de Vogues-Proskauer, prueba de
Christensen (M40) con NaCl (2 %) (R71), anti oxidasa, reactivo de Kovac.
suero V. cholerae polivalente O1 y O139, kit de
detección de enterotoxina VET-RPLA TD920A
(Oxoid, Inc.), agar sacarosa Vibrio
parahaemolyticus (VPSA) (M191), agar Vibrio
vulnificus (VVA) (M190), reactivos y tiras
reactivas de diagnóstico API 20E (BioMerieux).
99
Licuadora, frascos de vidrio boca ancha tipo tarro

500 ml, varilla vidrio 3 mm y 20 cm largo,
balanza granatria 2000g, balanza analítica 120 g,
Hornos, autoclaves, incubadoras, tubos, cajas Petri, incubadoras 39-40°C, baño de agua 42+ 0.2°C y
pipetas, varillas vidrio, asa, microscopio, pHmetro, 35-37°C, cucharas estériles, cajas Petri estériles
microondas, incubadoras con agitación, filtros, 15x100 mm de plástico, pipetas estériles 1, 5 y 10
Aparatos e
membranas de naylon, pantallas de malla de fibra ml (0.1 ml) 5 , asas bacteriológicas 3 mm
instrumentos
de vidrio, palillos, soluciones extracción de diámetro, tubos ensayo 16x150 mm y 20x150
proteínas y ácidos nucleicos, agentes bloqueadores, mm, tubos ensaye 10x75 mm o 13x100 mm,
reactivos para inmunoensayos. tijeras y pinzas estériles, lámpara, mecheros,
papel pH, potenciómetro, bolsas polietileno
28x37, aparato de filtración membranas 0.45
micras.
Pescado ahumado: Incubación de las muestras a
35 °C -37 °C: De cada submuestra tomar 25 g,
cortar piezas pequeñas y colocarlo en vaso de
licuadora de 500 ml de capacidad y que contenga
La muestra debe ser enfriada inmediatamente 225 ml de agua peptonada alcalina, homogenizar
después de ser colectada (alrededor de 7 ⁰C a 10 2 min a velocidad máxima, hacer 2 diluciones e
⁰C), las muestras deben ser analizadas tan pronto incubarlas a 35 °C -37 °C. Incubación 35 °C -
como sea posible. Se debe evitar el contacto 37°C y 42°C: homogenizar 50 g en 450 ml de
directo con el hielo para maximizar la agua peptonada alcalina, verter 250 ml a un
Preparación de la
supervivencia y la recuperación de los vibrios. Los recipiente estéril. Preparar dos series de
muestra
vibrios pueden ser dañados por el enfriamiento diluciones 1:100 y 1:1000. Incubar una serie a 35
rápido, pero crecen rápidamente en productos del °C -37°C y otra a 42 °C. Moluscos bivalvos:
mar a temperatura ambiente. De ser necesario, se Desconchar 10 piezas-12 piezas, incluir el
recomienda congelar las muestras a una líquido. Verter 50 g en 450 ml de agua peptonada
temperatura de -80 ⁰C. alcalina, licuar para homogenizar durante 2 min a
alta velocidad (Dilución 1:10). Colocar 250 g de
esta dilución en un segundo recipiente estéril,
preparar diluciones 1:100 y 1:1000. Incubar una
serie a 35 °C -37°C y la otra a 42°C.
100
Expresión de resultados Resultado positivo o negativo. No especifíca
El informe final para V. cholerae debe incluir la

Informe de la prueba identificación bioquímica y serológica de la cepa y No especifíca
los resultados de enterotoxicidad.
No especifíca.
Concordancia con
No especifíca Puede sugerirse: Esta norma tiene
normas internacionales
concordancia con el capítulo 9 del BAM.
Microorg
Apartado BAM Capítulo 28 NOM-242-SSA1-2009
anismo
Detectar Vibrio cholerae enterotoxigénico por

Objetivo
PCR
Fundamento Basado en la reacción en cadena de la polimerasa.

Vibrio cholerae enterotoxigénico
Enriquecimiento en agua peptonada alcalina, No se incluye la detección de V. cholerae por

Procedimiento
procedimiento PCR. medio de PCR.
Agua peptonada alcalina (APW), primers de la
toxina de cólera, Taq ADN polimerasa, 2'-
Desoxinucleósido-5'-trifosfatos, 10X buffer PCR,
aceite mineral ligero, agua deionizada estéril, 10X
cultivo
TBE, agarosa, solución de bromuro de etidio, 6X
buffer de carga de muestras, marcadores de ADN
de peso molecular.
101
Termociclador programable automático, aparato de

electroforesis en gel horizontal, fuente de poder de
voltage para electroforesis, parrilla de
Aparatos e
calientamiento, tubos de microcentrifuas,
instrumentos
micropipetas digitales, pipetas, microcentrífuga,
transluminador UV, cámara polaroide, film
polaroide.
Pesar 25 g de la muestra en un recipiente tarado
(de capacidad aproximada de 500 ml). Los
productos tales como marinos o verduras puede ser
licuado o cortado en pequeñas porciones utilizando
tijeras estériles. La muestra debe ser enfriada
inmediatamente después de ser colectada
(alrededor de 7 ⁰C a 10 ⁰C), las muestras deben ser
Preparación de la
analizadas tan pronto como sea posible. Se debe
muestra
evitar el contacto directo con el hielo para
maximizar la supervivencia y la recuperación de
los vibrios. Los vibrios pueden ser dañados por el
enfriamiento rápido, pero crecen rápidamente en
productos del mar a temperatura ambiente. De ser
necesario, se recomienda congelar las muestras a
una temperatura de -80 ⁰C.
Expresión de resultados Positivo o negativo.
Informe de la prueba No especifíca.
Concordancia con
No especifíca.
102
Microorg Apartado BAM Capítulo 9 NOM-242-SSA1-2009

anismo
Objetivo
Crecimiento en medio selectivo salino, pruebas

bioquímicas, kit de diagnóstico rápido API 20E,
Fundamento
identificación por medio de sondas de ADN,
identificación por medio de PCR.
Vibrio parahaemolyticus
No se incluye en esta norma

1. Enriquecimiento, aislamiento y enumeración, 2.
Detección y confirmación (identificación
bioquímica de los aislados, procedimiento de
cuenta por filtración en membrana hidrofóbica
Procedimiento
(HGMF), tipificación serológica), 3.
Determinación de patogenicidad (detección
genotípica de los genes de hemolisina de V.
parahaemolyticus).
103
Agua peptonada alcalina (APW) (M10), medio

modificado celobiosa polimixina colistina (mCPC)
(M98), agar celobiosa colistina (CC) (M189),
medio de prueba de movilidad-1 % NaCl (M103),
reactivo de oxidasa (N,N,N,N'-tetrametil-p-
fenilenediamina-HCl en dH2O) (R54), diluyente
peptona-Tween-sal (PTS) (90), tampón salino de
fosfatos (PBS) (R59), discos de polimixina B (50
U Difco o equivalente) (R64), solución salina 0.85
% en dH2O (R63), solución NaCl al 2 % (R71),
desoxicolato de sodo - 0.5 % en dH2O (R91), agar
tiosulfato citrato sales biliares sacarosa (TCBS)
cultivo
(M147), agar T1N1 y T1N3 (1 % triptona y 1 % o
3 % NaCl respectivamente) (M163), caldo T1N0,
T1N3, T1N6, T1N8, T1N10 (M161), agar tripti
soya sulfato de magnesio – 3 % NaCl (TSAMS)
(32), caldo y agar tripticasa de soya (TSB) (TSA)
(M152) (con NaCl, 2 %), TSB-1 % NaCl-24 %
glicerol, caldo urea (M171) o agar urea
Christensen (M40) con NaCl (2 %) (R71), Anti
Hornos, autoclaves, incubadoras, tubos, cajas Petri,
pipetas, varillas vidrio, asa, microscopio, pHmetro,
Aparatos e microondas, incubadoras con agitación, filtros,
instrumentos membranas de naylon, pantallas de malla de fibra
de vidrio, palillos, soluciones extracción de
proteínas y ácidos nucleicos, agentes bloqueadores,
104
reactivos para inmunoensayos..
La muestra debe ser enfriada inmediatamente

después de ser colectada (alrededor de 7 ⁰C a 10
⁰C), las muestras deben ser analizadas tan pronto
como sea posible. Se debe evitar el contacto
directo con el hielo para maximizar la
Preparación de la
supervivencia y la recuperación de los vibrios. Los
muestra
vibrios pueden ser dañados por el enfriamiento
rápido, pero crecen rápidamente en productos del
mar a temperatura ambiente. De ser necesario, se
recomienda congelar las muestras a una
temperatura de -80 ⁰C.
Expresión de resultados Resultado positivo o negativo.
Concordancia con
No especifíca.
Microor
ganismo
Productos para consumo humano de origen

Objetivo
marino.
Vibrio vulnificus
No se incluye en esta norma

Crecimiento en medio selectivo salino, pruebas
bioquímicas, kit de diagnóstico rápido API 20E,
Fundamento
identificación por medio de sondas de ADN,
identificación por medio de PCR.
105
Método de identificación y recuento: 1.

Enriquecimiento, aislamiento y cuenta, 2.
Identificación bioquímica de los aislados, 3.
Identificación del gen específico de especies
Procedimiento
específicas del gen citolisina vvhA por medio de
sonda de ADN, 4. Recuento de V. vulnificus por
sondas de ADN, 5. Confirmación de V. vulnificus
por reacción en cadena de polimerasa.
Agua peptonada alcalina (APW) (M10), medio
modificado celobiosa polimixina colistina (mCPC)
(M98), agar celobiosa colistina (CC) (M189),
medio de prueba de movilidad-1 % NaCl (M103),
reactivo de oxidasa (N,N,N,N'-tetrametil-p-
fenilenediamina-HCl en dH2O) (R54), diluyente
peptona-Tween-sal (PTS) (90), tampón salino de
fosfatos (PBS) (R59), discos de polimixina B (50
U Difco o equivalente) (R64), solución salina 0.85
% en dH2O (R63), solución NaCl al 2 % (R71),
desoxicolato de sodo - 0.5 % en dH2O (R91), agar
cultivo
tiosulfato citrato sales biliares sacarosa (TCBS)
(M147), agar T1N1 y T1N3 (1 % triptona y 1 % o
3 % NaCl respectivamente) (M163), caldo T1N0,
T1N3, T1N6, T1N8, T1N10 (M161), agar tripti
soya sulfato de magnesio – 3 % NaCl (TSAMS)
(32), caldo y agar tripticasa de soya (TSB) (TSA)
(M152) (con NaCl, 2 %), TSB-1 % NaCl-24 %
glicerol, caldo urea (M171) o agar urea
Christensen (M40) con NaCl (2 %) (R71), anti
106


pipetas, varillas vidrio, asa, microscopio, pHmetro,
microondas, incubadoras con agitación, filtros,
Aparatos e
membranas de naylon, pantallas de malla de fibra
instrumentos
de vidrio, palillos, soluciones para extracción de
proteínas y ácidos nucleicos, agentes bloqueadores,
reactivos para inmunoensayos.
La muestra debe ser enfriada inmediatamente
después de ser colectada (7 a 10) °C, las muestras
deben ser analizadas tan pronto como sea posible.
Se debe evitar el contacto directo con el hielo para
Preparación de la maximizar la supervivencia y la recuperación de
muestra los vibrios. Los vibrios pueden ser dañados por el
enfriamiento rápido, pero crecen rápidamente en
productos del mar a temperatura ambiente. De ser
necesario, se recomienda congelar las muestras a
una temperatura de -80 °C.
Expresión de resultados Resultado positivo o negativo.
Concordancia con
No especifíca.
Microor-
ganismo
107

Estimar el contenido de Staphylococcus aureus
Objetivo productos marinos y establecer las
en alimentos.
especificaciones sanitarias de dichos productos y
métodos de prueba.
Detección de Satphylococcus spp. por el Método
del número más probable (NMP) en muestras con
Crecimiento en medio de cultivo selectivo y
un número bajo esperado de Staphylococcus y
Fundamento diferencial y confirmación con pruebas de
contenido de especies competitivas. Identificación
coagulasa y termonucleasa.
y confirmación por medio de pruebas
bioquímicas.
Determinación del NMP. Dilución, inoculación en
medio selectivo líquido, medio selectivo sólido,
aislar en medio selectivo sólido, transferir a medio
selectivo líquido para recuento, identificación y
confirmación de S. aureus por prueba de Incubación en agar Baird-Parker, selección de
coagulasa, prueba de catalasa, utilización colonias y siembra en caldo de infusión cerebro
Procedimiento
anaeróbica de glucosa, utilización anaeróbica de corazón, incubación, prueba de coagulasa y
manitol, sensibilidad a lisostafina, producción de termonucleasa.
nucleasa termoestable, identificación de alguna
característica típica de 2 cepas de S. aureus, S.
epidermidis, y micrococci. Reportar de acuerdo a
tablas de NMP.
Medio Baird-Parker (M17), agar tripticasa soya
Staphylococcus aureus
(TSA) (M152), caldo infusión cerebro corazón

Soluciones diluyentes : solución reguladora de
(M24), agar plasma (conejo) coagulasa con EDTA
fosfatos, agua peptonada. Medios de cultivo:
toluidina azul-ADN (M148), agar lisostafina
Reactivos y medios de Medio de Baird-Parker, medio base de Baird-
triptona extracto de levadura (M165), aceite de
cultivo Parker, caldo de infusión de cerebro-corazón
parafina, tampón salino de fosfato 0.02 M (R61)
(BHI), ácido desoxirribonucleico helicoidal de
conteniendo 1 % NaCl, prueba de catalasa (R12),
timo de ternera.
caldo tripticasa de soya (TSB) conteniendo 10 %
NaCl y 1 % piruvato de sodio (M154a).
108
Materiales: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas,

espátulas, separador de huevo, tubos de cultivo,
cajas Petri, pipetas bacteriológicas 1ml y 10 ml,
pipetas Pasteur, probetas, varillas de vidrio de 3.5
Aparatos e Hornos, autoclaves, incubadoras, tubos, cajas Petri, mm de diámetro aprox. y 20 cm de largo, matraz
instrumentos pipetas, varillas vidrio. Erlenmeyer con perlas de vidrio, cámara húmeda.
Aparatos: horno para esterilizar, autoclave con
termómetro, baño de agua con regulador de
temperatura, balanza 2500 g, incubadora 35 °C +
1 °C.
De acuerdo a lo establecido en el método de
Preparación de la
Dependiente de la muestra. preparación y dilución de muestras de alimentos
muestra
En UFC/g. Si las pruebas confirmativas resultan
negativas en todas las colonias probadas, informar
Expresión de resultados NMP x gramo o por mL como: 0 UFC/g en muestras directas, 10 UFC/g
en muestras de dilución 1:10 y 100 UFC/g en
muestras de dilución 1:100.
Informe de la prueba No especifica No especifíca
No especifíca
Puede sugerirse: Esta norma tiene
concordancia con el capítulo 12 del BAM en
Concordancia con
AOAC 987.09. las pruebas bioquímicas de identificación del
microorganismo.
También puede sugerirse que se refiera a la
NOM-115-SSA1-1994.
Microorg
anismo

monocytogen

Detectar y enumerar L. monocytogenes en
Listeria
alimentos
métodos de prueba.
es
109
Procedimientos de muestreo y de enriquecimiento,

procedimiento de aislamiento, procedimiento de
Basada en el aislamiento y la diferenciación de
identificación (PCR tiempo real, kits),
especies de Listeria spp., principalmente por la
Fundamento subtipificación de aislados de L. monocytogenes,
fermentación de carbohidratos y la actividad
prueba de patogenicidad del ratón
hemolítica de los miembros de este género.
inmunodeficiente, interpretación de los datos de las
pruebas, recuento.
1. Procedimientos de muestreo y de
enriquecimiento: Tratamiento de la muestra, pre-
enriquecimiento y enriquecimiento,
enriquecimiento con conteo, métodos alternativos
prescritos para el cribado de las muestras
enriquecidas. 2. Procedimiento de aislamiento:
Enriquecimiento, aislamiento, identificación,
medios selectivos. 3. Procedimiento de
prueba de movilidad en fresco, prueba de
identificación: Morfología, tinción de Gram,
catalasa, tinción de Gram, prueba de hemólisis,
prueba de catalasa, fermentación de
Procedimiento prueba de reducción de nitratos, prueba de
carbohidratos, medio selectivo, prueba de
movilidad en agar, prueba de utilización de
reducción de nitrato, pruebas de movilidad,
carbohidratos, prueba de Cristie-Atkins-
pruebas con kits, PCR en tiempo real, métodos
Munch-Peterson (CAMP) y serología.
rápidos alternativos, prueba de CAMP. 4.
Subtipificación de aislados de L. monocytogenes
(obligatorio): serológica y genéticamente. 5.
Prueba de patogenicidad del ratón
inmunodeficiente (opcional). 6. Interpretación de
los datos de las pruebas. 7. Recuento (requerido).
110
Ácido acético 5 N, monohidroclorido de

acriflavina, agar, N-(1-naftil) etilen diamina (R48),
reactivo α-Naftol (R48), agar base sangre No. 2,
cicloheximida, natamicina, sangre de cordero
defibrinado, etanol absoluto, tampón de anticuerpo
fluorescente, glicina anhidra, kit de tinción de
Gram, solución de peróxido de hidrogeno 3 % para
prueba de catalasa (R12), solución de KOH 40 %
(R65), juego sera Listeria-typing, agar cloruro de Tinción de Gram (Alcohol-acetona, cristal
litio feniletanol moxalactam (LPM) (M81) con violeta, solución de yodo, solución de safranina),
esculina y hierro (M82), ácido nalidíxico (sal de reactivos para la determinación de nitritos
sodio), medio de reducción de nitrato (M108) y (Reactivo A, reactivo B, reactivo C, solución de
reactivo de detección de nitrato (R48), caldo sulfato de cadmio al 20 %). Medios de cultivo:
nutritivo (M114), solución salina fisiológica 0.85 Caldo soya tripticaseína con 0.6 % de extracto de
Reactivos y medios de % (R63), caldo base fermentación carbohidrato levadura (CSTEL), caldo de enriquecimiento
cultivo púrpura (M130) conteniendo soluciones 0.5 % de (EB) pH 7.3, medio de cloruro de litio
dextrosa, esculina, maltosa, ramnosa, manitol, y feniletanol-moxolactam (LMP), medio Oxford,
xilosa, medio SIM (M137) o medio de prueba de agar soya tripticaseína con 0.6 % de extracto de
movilidad (M103), reactivo de ácido sulfanilico levadura (ASTEL), agar sangre de carnero, caldo
(R48), agar tripticasa de soya con 0.6 % de nitratos, medio para la prueba de movilidad
extracto de levadura (TSAye) (M153), caldo (Medio de SIM, medio MTM), caldo púrpura para
tripticasa de soya con 0.6 % extracto de levadura fermentación de carbohidratos.
(TSBye) (M157), medio Oxford (OXA) (M118),
caldo de enriquecimiento amortiguado para
Listeria (BLEB) (M52), agar PALCAM (M118a),
carragenina, agar BCM (M17a), agar MOX
(M103a), agar ALOA (M10a), agar Listeria
cromogénico (M40b), Rapid L'mono (M131a),
CHROMagar Listeria (M40a), agar y caldo
triptosa (M167).
Cajas Petri, asas bacteriológicas, aceite de
Hornos, autoclaves, incubadoras, tubos, cajas Petri, inmersión, cubreobjetos, matraces Erlenmeyer
Aparatos e
pipetas, varillas vidrio, microscopio de contraste de 500 ml, lámpara de luz blanca, lápiz graso, lupa
instrumentos
fases, licuadora o mezcladora peristáltica. de bajo aumento, pipetas volumétricas,
portaobjetos escabado, porta asas, tubos, sistemas
111
de filtración de membranas, incubadoras,

miscroscopio.
Refrigerar la muestra a 4°C. Muestras compuesta.

Una muestra de un lote de alimento debe constar
de 10 sub-muestras, porciones de 50 g o ml de
cada sub-muestra se utilizan para hacer dos
muestras compuestas (250 g cada una) con
Seguir lo mencionado en el método preparación y
Preparación de la mezcladoras peristálticas y medio de
dilución de muestras de alimentos para su análisis
muestra enriquecimiento sin agentes selectivos. Muestras
microbiológico.
no compuestas. Si no se requieren muestras
compuestas porciones analíticas simples de 25 g se
mezclan con 225 ml de medio basal de pre-
enriquecimiento/enriquecimiento BLEB en una
licuadora o mezcladora peristáltica.
De acuerdo a las características bioquímicas se
puede determinar el género y especie de las cepas
Expresión de resultados UFC por gramo o por mL.
aisladas. La correspondencia de resultados con
dichas características indica el género Listeria.
Cuando los resultados son positivos informar
presencia en 25 g o 25 ml de muestra. Si son
negativos informar ausencia en 25 g o 25 ml de
muestra.
AOAC 992.18. 2000, AOAC 992.19. 2000, AOAC No especifíca
993.09. 2000, AOAC 993.12. 2000, AOAC Puede sugerirse: Esta norma tiene
Concordancia con
994.03. 2000, AOAC 995.22. 2000, AOAC concordancia con el capítulo 10 del BAM en
996.14. 2000, AOAC 997.03. 2000, AOAC las pruebas de medios selectivos y bioquímicas
999.06. 2000, AOAC 2003.12. 2005. de identificación del microorganismo.
Microorg
anismo
112

Objetivo Identificación de Salmonella en alimentos. productos marinos y establecer las
métodos de prueba.
Basada en 5 pasos básicos: preenriquecimiento,

Preparación de la muestra, aislamiento de cepas
enriquecimiento selectivo, selección en medios
Fundamento con medios selectivos, identificación de cepas con
sólidos, identificación bioquímica y
pruebas bioquímicas y serológicas.
serotipificación.
1. Aislamiento de la muestra: Mezclar suavemente

la dilución con muestra, inocular en medio
selectivo RV, TT o SC por 24 h a 35 °C, 42 °C o
43 °C dependiendo de la muestra. A partir del
inóculo anterior,sembrar en agar BS, XLD y HE e
incubar 24 h ± 2 h a 35 ⁰C. Examinar morfología
típica y atípica. Inocular colonias presuntivas en
agar selectivo TSI y LIA e incubar a 24 h ± 2 h a
35 ⁰C. A los cultivos que viren alcalino el medio
ensayar las pruebas bioquímicas. 2. Identificación
de Salmonella: Para mezcla de cultivos (inocular
Preparación de la muestra, aislamiento,
en agar MacConkey, agar HE, o agar XLD,
identificación bioquímica, identificación
Procedimiento Incubar las cajas durante 24 h ± 2 h a 35 °C.
serológica, pruebas bioquímicas
Cultivos puros (prueba de ureasa convencional o
complementarias.
rápida). Prueba serológica polivalente flagelar.
Prueba serológica Spicer-Edwards. Prueba para
muestras ureasa negativa (caldo lisina
decarboxilasa, caldo fenol rojo dulcitol o caldo
base púrpura con 0.5 % dulcitol. Caldo triptona
(caldo cianida de potasio, caldo malonato, prueba
de indol, prueba serológica flagelar (H) para
Salmonella
Salmonella). Prueba serológica somática (O) para

Salmonella (prueba somática polivalente O, prueba
de grupo somática O). Pruebas bioquímicas
adicionales. Caldo lactosa rojo fenol lactosa o
113
caldo púrpura lactosa. Caldo rojo fenol sacarosa o

caldo púrpura sacarosa, caldo MR-VP. Agar citrato
de Simons. Clasificación de cultivos.
Identificación genérica presuntiva de Salmonella
(kits de pruebas bioquímicas miniaturizadas).
Tratamiento de cultivos negativos a la prueba
flagelar (H). Envío de cultivos para
serotipificación a las oficinas de la FDA.
114
Caldo lactosa (M74), leche en polvo descremada

(reconstituida) (M111), caldo selenito cistina (SC)
(M134), caldo tetrationato (TT) (M145), medio
Rappaport-Vassiliadis (RV) (M132). NOTA:
Medio RV debe ser preparado de ingredientes
individuales. Formulaciones comerciales no son
aceptables, agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) Medios de pre-enriquecimiento: Agua de peptona
(M179), agar Hektoen entérico (HE) (M61), agar tamponada y caldo lactosado. Caldos de
sulfato de bismuto (BS) (M19), agar triple azúcar enriquecimiento: Caldo selenito-cistina, caldo
hierro (TSI) (M149), caldo triptona (triptofano) tetrationato, Vassiliadis-Rappaport, caldo de soya
(M164), caldo tripticasa de soya (M154), caldo tripticasa, leche descremada reconstituida,
tripticasa de soya con sulfato de hierro (M186), caldo soya tripticasa estéril adicionado con sulfito
caldo tripticasa triptosa de soya (M160), caldo de potasio. Medios de aislamiento: Agar verde
MR-VP (M104), agar citrato de Simmons (M138), brillante (VB), agar con sulfito de bismuto, agar
caldo urea (M171), caldo urea (rápido) (M172), xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar para
caldo malonato (M92), agar lisina hierro (LIA) Salmonella y Shigella (SS), agar entérico
(M89), caldo lisina decarboxilasa (M87), prueba en Hektoen. Medios para pruebas bioquímicas: Agar
medio de movilidad (semisólido) (M103), caldo de tres azúcares y hierro (TSI), agar de hierro y
cultivo
cianidina de potasio (KCN) (M126), caldo fenol lisina (LIA), agar nutritivo, medio de SIM (para
rojo carbohidrato (M121), caldo púrpura sulfuro, indol y movilidad), agar citrato de
carbohidrato (M130), agar MacConkey (M91), Simmons, caldo MR-VP, caldo manitol, caldo
caldo nutriente (M114), caldo infusión cerebro malonato, caldo urea, caldo de urea rápido, caldo
corazón (BHI) (M24), solución de papaina 5 % infusión cerebro corazón. Soluciones: verde
(M56a), solución de celulasa 1 % (M187), agar brillante al 0.1 %, yodo-yoduro, salina al 0.,85%,
base triptosa sangre (M166), caldo universal de salina formalizada, reactivo de Kovac, alfa-naftol
preenriquecimiento (M188), caldo universal de al 5 %, rojo de metilo, hidróxido de potasio al 40
preenriquecimiento (sin citrato amónico de hierro) %, gelatinasa al 5 %. Antisueros: Antisuero
(M188a), agua peptonada amortiguada (M192), polivalente somático (O), antisuero polivalente
Caldo Dey-Engley (M193), sulfito de potasio flagelar (H), Antisuero Vi.
anhídrido, solución de cloro, 200 ppm,
conteniendo 0.1 % dodecil sulfato de sodio (R12a),
etanol, 70 % (R23), reactivo de Kovacs (R38),
reactivo de prueba Voges-Proskauer (VP) (R89),
cristales de fosfato de creatina, solución de
hidróxido de potasio, 40 % (R65), solución
115
hidróxido de sodio (R73), ácido clorhídrico 1 N

(R36), solución de tinción verde brillante, 1 %
(R8), solución de tinción púrpura de bromocresol,
0.2 % (R9), indicador rojo de metilo (R44), agua
destilada estéril, tergitol aniónico 7 (R78), triton
X-100 (R86), solución salina fisiológica, 0.85 %
(R63), solución salina fisiológica formalinizada
(R27), antisuero Salmonella (O) somático
polivalente, antisuero Salmonella (H) flagelar
polivalente, antisuero Salmonella grupo somático
(O): A, B, C1, C2, C3, D1, D2, E1, E2, E3, E4, F,
G, H, I, Vi, y otros grupos apropiados, antisuero
Salmonella Spicer-Edwards flagelar (H).
Horno (180 °C), incubadora con termostato,

autoclave con termómetro, baño maría con
termostatoaño maría con termostato y
termómetro, balanza granataria, licuadora,
Hornos, autoclaves, incubadoras, licuadora,
Aparatos e mechero Bunsen o Fisher, potenciómetro,
microscopio, tubos, cajas Petri, pipetas, varillas
instrumentos matraces Erlenmeyer (500 ml), cucharas,
vidrio, pH metro.
bisturíes, cuchillos y pinzas, tubos de ensayo,
tubos para serología, pipetas, asa de platino o
nicromel, papel pH, ángulos de vidrio, recipientes
de boca ancha.
Los siguientes métodos se basan en el análisis de Pesar 25 g de muestra en vaso estéril de
una unidad analítica de 25 g en relación 1:9 licuadora/bolsa stomacher y agregar 225 ml del
muestra: caldo. Dependiendo de la composición, medio de preenriquecimiento. Licuar durante 1
añadir caldo suficiente para mantener esta relación min. Transferir a un recipiente con rosca, dejar
1:9 a menos que se indique lo contrario. Para las reposar 60 min y ajustar a pH 6.8 con NaOH 1 N
Preparación de la
muestras analizadas en una base de peso no exacto, o HCl 1 N. Incubar a 24 h a 35°C. Productos con
muestra
por ejemplo, ancas de rana, seguir las instrucciones huevo, frutas, crustáceos y pescado: no
particulares. Éstas existen para los siguientes descongelar la muestra, usar caldo lactosado y
productos: Yema de huevo, clara de huevo seca, licuar 2 min. Carnes y derivados cárnicos secos y
huevos enteros secos, leche líquida (leche procesados térmicamente: si la muestra está en
descremada, 2 % de grasa de leche, leche entera y polvo el licuado puede omitirse; para emulsionar
116
suero de leche), mezclas preparadas en polvo las grasas se puede agregar un detergente. Carnes
(pasteles, galletas, donas, galletas y pan), leche crudas o altamente contaminadas: pesar 25 g de
maternizada y alimentación por vía oral o un tubo producto en dos vasos de licuadora, agregar 225
que contiene huevo. Huevos en diferentes ml de caldo selenito cistina o de caldo
presentaciones. Leche en polvo. Leche entera en tetrationato, licuar por 2 min y pasar a matraces
polvo. Caseína. Harina de soya. Productos que Erlenmyer de 500 ml, dejar reposar y ajustar pH.
contienen huevo (fideos, rollos de huevo,
macarrones, espaguetis), queso, pasta, ensaladas
preparadas (jamón, huevo, pollo, atún, pavo),
frutas y verduras frescas, congeladas o secas,
carnes de frutos secos, crustáceos (camarones,
cangrejo, cigalas, langostinos, langosta), y
pescado. Levadura seca (levadura activa e
inactiva). Coberturas para helado. Especias.
Revestimiento de dulces y golosinas (incluido el
chocolate). Coco. Colorantes de los alimentos y
sustancias alimenticias para colorear. Gelatina.
Carnes, sustitutos de carne, subproductos de la
carne, sustancias de origen animal, productos
glandulares y harinas (pescado, carne, hueso). Las
ancas de rana. Esqueleto o carcasas de conejo.
Goma guar. Jugo de naranja (pasteurizado y no
pasteurizado), sidra de manzana (pasteurizada y no
pasteurizada), jugo de manzana (pasteurizada).
Orejas de cerdo y otros tipos de alimento para
perro. Melones. Mangos. Tomates. Ensayos
ambientales. Semillas de alfalfa y frijol. Pulpa de
mamey. Vegetales de hojas verdes y hierbas
(espinaca, lechuga romana, cilantro, perejil rizado,
perejil italiano, culantro, repollo y albahaca).
Presencia o ausencia de Salmonella por g o ml de Presencia o ausencia de Salmonella por g o ml de
Expresión de resultados
producto. la muestra.
Informe de la prueba No especifíca. No especifíca.
Concordancia con No especifíca.
No especifíca.
normas internacionales Puede sugerirse: Esta norma tiene
117
concordancia con el capítulo 10 del BAM en

las pruebas de medios selectivos y bioquímicas
de identificación del microorganismo
Microorg NOM-242-SSA1-2009 Diluciones en tubo
Apartado BAM Capítulo 4
anismo múltiple
Enumeración de Escherichia coli y bacterias
coliformes.
métodos de prueba.
Basado en la propiedad de los microorganismos
coliformes para producir gas a partir de glucosa y
Fermentación de lactosa y cálculo de número
Fundamento fermentación de lactosa dentro de las 48 h de
más probable.
incubación a 35 °C (coliformes ) y 44.5 °C
(Coliformes fecales y E. coli).
Prueba presuntiva, prueba confirmatoria
Escherichia coli y bacterias coliformes
(Confirmar en por lo menos el 10 % de las

pruebas con resultados positivos a coliformes
fecales por cultivo en placas de agar McConkey a
General: Dilución, NMP (inoculación e partir de los tubos que demostraron la presencia
incubación, aislamiento en placa, selección de de gas en la prueba confirmativa. Incubar las
colonias y confirmación), conteo en placa placas a 35 °C ± 0.5 °C durante 24 h ±2 h,
Procedimiento (inoculación e incubación, conteo y selección de observar las colonias típicas fermentadoras de
colonias), confirmación (subcultivo, confirmación color rojo rodeadas de un halo opaco de
bioquímica), confirmación en medio sólido y precipitación de sales biliares.Seleccionar una o
filtración por membrana. más colonias aisladas y pasar a tubos de
fermentación con caldo lauril triptosa. Hacer
tinción de Gram para observación de la
morfología de las
colonias.
118
Caldo verde brillante bilis lactosa (BGLB) (M25),

caldo lauril triptosa (LST)(M76), caldo EC
(M49), azul Levin de metileno-eosina (L-EMB),
agar (M80), caldo triptona (triptofano) (M164),
caldo MR-VP (M104), caldo citrato de Koser Caldos: Caldo lauril, caldo EC, agar McConkey,
(M72), agar para cuenta en placa método estándar agar eosina azul de metileno de Levin (EMB-L),
(PCA) (M124), agua Butterfield de tampon de caldo triptona al 1 % (triptofano), caldo MR-VP,
fosfatos (R11) o diluyeente equivalente (excepto caldo citrato de Koser. Reactivos: reactivo de
cultivo
para crustáceos), reactivo de Kovacs (R38), Kovacs, para prueba de indol, prueba de Voges-
reactivo Voges-Proskauer (VP) (R89), reactivos Proskauer, coloración de Gram, indicador rojo
para tinción de Gram (R32), indicador rojo de de metilo, medio EC-MUG
metilo (R44), agar bilis rojo violeta (VRBA)
(M174), agar VRBA-MUG (M175), medio EC-
MUG (M50), caldo lauril triptosa MUG (LST-
MUG) (M77), diluyente de peptona 0.1 % (R56).
Baño de agua con agitación cubierto y con
termostato, termómetro, tubos de cultivo,
Aparatos e pipetas, varillas vidrio, asas, pHmetro, contador de
campanas de fermentación (tubos Durham),
instrumentos colonia, licuadora, frascos de dilución, lámpara
gradillas, asas, lámpara de luz ultravioleta, lentes
UV.
protectores.
Preparar la muestra como se indica en el método
Preparación y dilución de muestras de alimentos
para análisis microbiológico; y de acuerdo con el
Preparación de la
Diluciones decimales. tipo de producto, utilizar las diluciones
muestra
apropiadas, según se indica en el procedimiento
de la densidad microbiana por la técnica del
número más probable.
Tabla del número más probable (NMP),
Expresión de resultados número de Enterobacteriaceae x gramo o por Expresar en NMP/g o ml para alimentos
mililitro.
Informe de la prueba No especifíca. No especifica
No especifica.
Concordancia con
No especifíca. Puede sugerirse: Esta norma tiene
concordancia con el capítulo 4 del BAM.
Apartado BAM Capítulo 4A Escherichia coli
119
Microorg diarreogénica
anismo
Identificar y aislar cepas patógenas de E. coli en

Objetivo base a sus propiedades únicas de virulencia en los
alimentos para consumo humano.
Enriquecimiento en medio líquido, selección de
cepas fermentadoras de lactosa, caracterización
primaria y secundaria por pruebas bioquímicas,
Fundamento pruebas mediante cultivo de tejidos, sondas de
ADN, PCR en tiempo real de enterotoxigénicidad,
enteroinvasivadad, enteropatógenicidad, detección
sistemática de E. coli serotipo O157:H7.
A. Enriquecimiento de cepas patógenas de E. coli.
Caldo BHI, caldo de doble fuerza TP incubar 20 h
a 44.0 ⁰C ± 0.2 ⁰C. Plaquear en medio selectivo,
incubar 20 h a 35 ⁰C. B. Selección. Características
fenotípicas en medio selectivo. C. Análisis e
identificación bioquímica. Primera y segunda
inspección con pruebas bioquímicas tradicionales o
como alternativa, API20E o el ensayo de pruebas
bioquímicas automatizado VITEK. D. Pruebas de
E. coli enterotoxigénica (ETEC), por análisis de
hibridación de colonias con sondas de ADN,
Procedimiento
cultivo de tejidos, prueba del ratón lactante,
pruebas comerciales de RPLA y ELISA para
detectar toxinas, ensayos de PCR. E. Pruebas de E.
coli enteroinvasiva (EIEC), por la prueba de
Sereny o el ensayo queratoconjuntivitis con
Escherichia coli
cobayos, ensayo de tejido de células HeLa , técnica

de tinción en vitro usando naranja de acridina,
sondas de ADN y PCR. F. Pruebas de Escherichia
coli enteropatógena (EPEC), por cultivo de tejidos,
PCR y sondas. G. Detección de E. coli serotipo
O157: H7. Medio de enriquecimiento, medio
120
sólido selectivo, identificación fenotípica,

serología y la prueba de genes de la Shiga toxina
por PCR y PCR en tiempo real. H. Preparación de
la muestra, enriquecimeinto. I. Análisis de PCR en
tiempo real. Preparación del molde de ADN,
controles de PCR positivo y negativo, protocolo de
la reacción del Smart Cycler II y análisis de datos.
J. Análisis y detección de los cultivos aislados. De
positivos por el ensayo de PCR en tiempo real.
Proceso de aislamiento. Diluir y crecer en medio
sólido selectivo y agar cromógeno, identificar
fenotípicamente, pruebas de antígenos, ensayar en
medio selectivo y pruebas bioquímicas, pruebas
confirmatorias (bioquímicas, con antígenos,
antisueros comerciales, PCR tiempo real). K.
Métodos de análisis para cepas STECno-O157.
Enriquecimiento, aislamiento en medio selectivo,
pruebas confirmatorias de los aislados por API20E
o VITEK, PCR, electroforesis en gel en campos
pulsados.
Caldo triptona fosfato (TP) (M162), caldo infusión
cerebro corazón (BHI) (M24), agar azul Levine
azul de eosina-metileno (L-EMB) (M80), agar
MacConkey (M91), agar triple azúcar hierro(TSI)
(M149), agar base sangre(BAB) (M21), caldo
triptona (triptofano) (M164), caldo púrpura de
bromocresol (M26) suplementado individualmente
con 0.5 % (w/v) de cada uno de los azúcares:
cultivo
glucosa, adonitol, celobiosa, sorbitol, arabinosa,
manitol y lactosa, caldo urea (M171), caldo
Falkow lisina decarboxilasa (M87), caldo cianida
de potasio (KCN) (M126), caldo MR-VP (M104),
medio indol nitrito (nitrato triptico) (M66), agar
acetato (M3), caldo mucato (M105), caldo mucato
control (M106), caldo malonato (M92), caldo
121
citrato de Koser (M72), solución acuosa de

bicarbonato de sodio 10 % (R70), Discos de
ONPG (o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido) (R53),
solución salina amortiguador de fosfatos (PBS)
(R60), agua diluyente de Butterfield amortiguador
de fosfatos (BPBW) (R11), reactivo de Kovac
(R38), reactivo VP (R89), reactivo de prueba de
oxidasa (R54), reactivo de detección de nitritos
(R48), acite mineral pesado (R46), reactivos de
tinción de Gram (R32). Para pruebas en PCR
tiempo real: Agua peptonada amortiguada con
piruvato (mBPWp) y suplemento de acriflavin-
Cefsulodin-Vancomicina (ACV) (M192a),
oligonucleótidos iniciadores y sondas para
STEC/O157 específicos para la plataforma de PCR
en tiempo real, OmniMix-HS o SmartMix HM
reactivos de esferas para PCR (Cepheid o Fisher),
LightCycler FastStart DNA Master Hybridization
Probes M-Grade (Roche Applied Science, Catalog
#3 383 393), Agar MacConkey telurito cefixima-
sorbitol (TC-SMAC) (M194), agar cromogénico
selectivo: Agar E. coli O157:H7 R&F® agar (R&F
Laboratories), agar Rainbow® O157 (BIOLOG),
agar Levin azul de eosin-metileno (L-EMB) (M80)
(solo sección R), agar tripticasa de soya con
extracto de levadura (TSAYE) (M153),
amortiguador de fosfato Butterfield (R11) (pH 7.2
± 0.2), agua destilada, agua grado molecular,
solución fisiológica salina (0.85 % NaCl),
ColiComplete Discs - conteniendo sustrato
fluorogénico MUG para GUD y X-gal
cromogénico para GAL (BioControl), reactivo
Anti-O157 and anti-H7 latex (Remel), API20E o
VITEK GNI (BioMerieux).
122

pipetas, varillas vidrio, licuadora, estomaquer,
mezclador rotatorio, vortex, separador magnético
Aparatos e con gradilla magnética, Baño de agua,
instrumentos microscopio, pHmetro, microcentrífuga,
Termociclador SmartCycler II, tubos para PCR,
instrumento LightCycler 2.0 PCR tiempo real,
capilares LightCycler para PCR tiempo real.
Refrigere las muestras inmediatamente después de
su recepción. No congelar, excepto para mantener
los productos congelados hasta justo antes del
análisis. Analizar las muestras tan pronto como sea
posible. Si el recuento lo requiere, preparar un
homogeneizado de 25 g en 225 ml de PBS o
BPBW. Realizar diluciones decimales (en PBS o
BPBW) de la placa de homogeneizado e inocular
en cajas directo en agar MacConkey para obtener
colonias aisladas. Después de incubar las placas
durante 20 horas a 35°C, realizar levantamiento de
las colonias y pruebas de hibridación con sondas
genéticas específicas para los genes de virulencia.
Preparación de la
Pruebas con sondas y PCR: Productos con hojas -
muestra
añade un peso igual de amortiguador fosfato de
Butterfield a por lo menos 200 g de producto en un
recipiente estéril o bolsa resellable de plástico y
agitar suavemente durante 5 minutos. Pesar 125 g
del producto enjuagado en 125 ml de (2X)
mBPWp doble fuerza. Jugo, leche u otras muestras
de bebidas turbias - asépticamente centrifugar 200
ml de muestra a 10.000 xg durante 10 min.
Después de decantar el sobrenadante, resuspender
el material precipitado en 225 ml de mBPWp.
Agua embotellada u otros líquidos no turbios -
pesar 125 ml en 125 ml de mBPWp 2X. También
seguir este procedimiento con líquidos en el que no
123
sea visible un precipitado después de la

centrifugación. Todos los demás alimentos - pesar
25 g de alimento en 225 ml de mBPWp. Licuar o
mezclar con un stomaquer según sea necesario.
Preparación del molde de ADN: Enriquecer la cepa
durante una noche, centrifugar, resuspender el
precipitado en NaCl al 0.85 %, centrifugar,
resuspender el precipitado en agua estéril,
mantener a 100 °C durante 10 min, centrifugar,
retirar y guardar el sobrenadante como molde de
ADN (Esto puede ser congelado, mínimo a -20 °
C, para las futuras pruebas de PCR), hacer una
dilución 1:10 de este molde.
Expresión de resultados Número de E. coli por gramo o por mililitro.
Concordancia con
No especifíca.
124
Propuesta de Norma Oficial Mexicana, bienes y servicios.
Método para la cuenta e identificación de Escherichia coli
diarreogénica.
PREFACIO
En la elaboración de la presente propuesta de norma participaron los siguientes Organismos e

Instituciones:
CENAM
ÍNDICE
Contenido
1. Objetivo y campo de aplicación
2. Fundamento
3. Referencias
4. Definiciones
5. Símbolos y abreviaturas
6. Reactivos y materiales
7. Equipo
8. Preparación de la muestra
9. Procedimiento
10. Expresión de los resultados
11. Concordancia con normas internacionales
12. Cepas de referencia
13. Bibliografía

1.1 Esta Norma Oficial Mexicana establece un método general para el enriquecimiento y el
aislamiento de E. coli en base a sus propiedades únicas de virulencia en los alimentos para consumo
humano.
1.2 Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las
personas físicas y morales que requieran efectuar este método en productos nacionales y de
importación, para fines oficiales.
125
2. Fundamento
2.1 Enriquecimiento en medio líquido, selección de cepas fermentadoras de lactosa, caracterización
por pruebas bioquímicas, PCR en tiempo real para determinar enterotoxigénicidad,
enteroinvasivadad, enteropatógenicidad, detección de E. coli serotipo O157:H7.
3. Referencias
Esta norma se complementa con lo siguiente:
NOM-109-SSA1-1994 Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos
NOM-110-SSA1-1994 Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis
microbiológico.
4. Definiciones
Para fines de esta norma se entiende por:
Coliformes: bacilos Gram negativos, no esporulados aerobios o anaerobios facultativos, que a 35
°C fermentan la lactosa con la producción de gas bajo las condiciones especificadas en NOM-112-
SSA1-1994 o bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos que a 35
°C fermentan la lactosa con formación de ácido, ocasionando en las colonias desarrolladas el vire
del indicador rojo neutro presente en el medio y la precipitación de las sales biliares según lo
especificado en la NOM-113-SSA1-1994.
Dilución primaria: es la solución, suspensión o emulsión obtenida después de pesar o medir una
cantidad del producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporción de
diluyente.
Diluciones decimales adicionales: las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un
determinado volumen de la dilución primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que
por repetición de esta operación con cada dilución así preparada, se obtiene la serie de diluciones
decimales adecuadas para la inoculación de medios de cultivo.
Diluciones decimales sucesivas: suspensiones o disoluciones obtenidas al mezclar un volumen
determinado de la suspensión inicial con un volumen nueve veces superior de disolvente y
repitiendo esta operación con diluciones decimales sucesivas hasta llegar a un nivel de dilución
adecuado para la inoculación del medio de cultivo.
126
Escherichia coli: Bacteria que a 44 ⁰C forma colonias indol positivas (color rosa) bajo las
condiciones descritas en la presente norma.
Enterobacteriaceae: Microorganismo que fermenta la glucosa y muestra reacción negativa a
oxidasa cuando la prueba se lleva a cabo de acuerdo al método especificado.
Escherichia coli O157; E.coli O157: Microorganismos que forman colonias características en la
superficie del medio en placa empleado en esta norma, y que producen indol y aglutinan
específicamente con antisuero frente al antígeno O157.
Método: es un proceso o camino sistemático establecido para realizar una tarea o trabajo con el fin
de alcanzar un objetivo predeterminado. Procedimiento científico seguido en la ciencia para hallar
la verdad. Un procedimiento que se usa para realizar una tarea específica en la clase o módulo.
Muestra para el laboratorio: muestra preparada para ser enviada al laboratorio y destinada a ser
utilizada para inspección o para análisis.
Muestra representativa: es un número de unidades tomadas de un lote, que han sido
seleccionadas en forma aleatoria y cuyas características son lo más similar posible a las del lote del
que procede.
Norma específica: Norma internacional o documento de apoyo que describe el análisis de un
producto determinado (o de un grupo de productos) para la detección o la determinación del número
de un microorganismo específico (o de un grupo de microorganismos).
Porción para análisis: muestra representativa medida (volumen o masa) tomada a partir de la
muestra para el laboratorio para emplearse en la preparación de la suspensión inicial.
Procedimiento: es un término que hace referencia a la acción que consiste en proceder de alguna
forma. El concepto, por otra parte, está vinculado a un método ó una manera de ejecutar algo. Un
procedimiento, en este sentido, consiste en seguir ciertas etapas predefinidas para desarrollar una
labor de manera eficaz.
Suspensión inicial (dilución base): suspensión, disolución o emulsión obtenida cuando un peso o
volumen determinados del producto en examen (o de una muestra de ensayo preparada a partir del
producto) ha sido mezclado con una cantidad nueve veces superior de disolvente, dejando que las
partículas grandes, si las hubiera, queden sedimentadas.
Suspensión inicial (dilución primaria): suspensión, disolución o emulsión obtenida cuando un
peso o volumen determinados del producto en examen (o de una muestra de ensayo preparada a
partir del producto) ha sido mezclado con una cantidad nueve veces superior de disolvente, dejando
que las partículas grandes, si las hubiera, queden sedimentadas.
127
Toma de muestra: es el procedimiento que se requiere para elegir el material a analizar a partir de
la totalidad del lote o partida.
± más menos
/ por
⁰C grado Celsius
% por ciento
cm centímetro
g gramo
h hora
kg kilogramo
l litro
μl microlitro
M molar
ml mililitro
mm milímetro
min minuto
p peso
PCR reacción en cadena de la polimerasa
seg segundo
UFC unidades formadoras de colonias
v volumen
x signo de multiplicación
En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas, se deben seguir las instrucciones
impresas en la etiqueta respectiva para su preparación.
Las sustancias químicas usadas para preparar los medios de cultivo y los reactivos deben ser grado
analítico.
6.1 Reactivos
128
Caldo triptona fosfato (TP) (M162)

Triptona 20 g
K2HPO4 2 g
KH2PO4 2 g
NaCl 5 g
Polisorbato 80 (Tween 80) 1.5 ml
Agua destilada 1 litro.
Preparación
Disolver los componentes en agua, calentando si es necesario. Esterilizar por 15 min at 121 °C. pH
final , 7.0 ± 0.2.
Caldo infusión cerebro corazón (BHI) (M24)
Medio 1:
Infusión de cerebro de ternera 200 g
Infusión de corazón de res 250 g
Peptona proteosa (Difco) o polipeptona (Bioquest) 10 g
NaCl 5 g
Na2HPO4* 2.5 g
Dextrosa 2.0 g
Agua destilada 1 litro.
*Difco no especifica aguas de hidratación.
Medio 2:
Infusión cerebro corazón 6.0 g
Digerido péptico de tejido animal 6.0 g
NaCl 5.0 g
Dextrosa 3.0 g
Digerido pancreático de gelatina 14.5 g
Na2HPO4** 2.5 g
Agua destilada 1 litro
**BBL no especifica aguas de hidratación.
Preparación
Medio 1: Disolver los ingredientes del medio 1 en agua destilada con calentamiento suave.
129
Medio 2: Suspender los ingredientes del medio 2 en agua destilada y hervir durante 1 min hasta
disolver completamente. Para ambos medios 1 y 2, verter el caldo dentro de botellas o tubos para su
almacenamiento. Esterilizar 15 min a 121°C. pH final , 7.4 ± 0.2.
El medio BHI comercial también es aceptable.
Agar azul Levine azul de eosina-metileno (L-EMB) (M80)

Peptona 10 g
Lactosa 10 g
K2HPO4 2 g
Agar 15 g
Eosin Y 0.4 g
Azul de metileno 0.065 g
Agua destilada 1 L.
Preparación
Disolver la peptona, el fosfato y el agar en el agua por ebullición si es necesario. Añadir agua para
obtener el volumen original. Distribuir en porciones de 100 ml o 200 ml y esterilizar en autoclave
por 15 minutos a 121 °C. pH final 7.1 ± 0.2
Agar MacConkey (M91)

Peptona proteosa o polipeptona 3 g
Peptona o gelisado 17 g
Lactosa 10 g
Sales biliares No. 3 o mezcla de sales biliares 1.5 g
NaCl 5 g
Rojo neutro 0.03 g
Cristal violeta 0.001 g
Agar 13.5 g
Agua destilada 1 L.
Preparación
Suspender los ingredientes y calentar con agitación hasta disolver. Hervir 1 min -2 min. Esterilizar
15 min a 121 °C, enfriar a 45 °C – 50 °C y verter en porciones de 20 ml dentro de cajas Petri
130
estériles de 15 mm x 100 mm. Secar a temperatura ambiente con la tapa cerrada. No usar cajas
húmedas, . pH final 7.1 ± 0.2.
Agar triple azúcar hierro (TSI) (M149)

Medio 1:
Extracto de carne 3 g
Extracto de levadura 3 g
Peptona 15 g
Peptona proteosa 5 g
Cloruro sódico (NaCl) 5 g
Lactosa 10 g
Sacarosa 10 g
Glucosa 1 g
Sulfato férrico 0.2 g
Tiosulfato sódico 0.3 g
Rojo fenol 0.024 g
Agar 12 g
Agua 1 L
Medio 2:
Polipeptona 20 g
NaCl 5g
Lactosa 10 g
Sacarosa 10 g
Glucosa 1 g
Fe(NH4)2(SO4)2Â·6H2O 0.2 g
Na2S2O3 0.2 g
Rojo fenol 0.025 g
Agar 13 g
Agua destilada 1 L
Preparación (Puede utilizarse cualquiera de los dos medios).
131
Medio 1: Se disuelven los componentes o el medio completo deshidratado en el agua, calentando si

fuera necesario. Se reparte el medio en tubos de ensayo. Se esteriliza en autoclave regulado a 118
°C durante 15 min. pH 7.3 ± 0.2.
Medio 2: Se prepara de la misma manera que el medio 1 pero se esteriliza en autoclave regulado a
121 °C durante 15 min. pH 7.4 ± 0.2.
Agar base sangre (BAB) (M21)

Infusión de 375 g de músculo de corazón
Tiotona 10 g
NaCl 5 g
Agar 15 g
Agua destilada 1 L
Preparación
Calentar suavemente hasta disolver. Esterilizar 20 min a 121°C. pH final 7.3 ± 0.2. También puede
utilizarse agar de infusión de corazón deshidratado comercial.
Caldo triptona (triptofano) (M164)

Triptona o tripticasa 10 g
Agua destilada 1 L
Preparación
Disolver y verter porciones de 5 ml en tubos de ensayo de 16 mm x 125 mm o 16 mm x 150 mm.
Esterilizar 15 min a 121 °C. pH final 6.9 ± 0.2.
Caldo púrpura de bromocresol (M26) suplementado individualmente con 0.5 % (w/v) de cada uno
de los azúcares: glucosa, adonitol, celobiosa, sorbitol, arabinosa, manitol y lactosa, caldo urea
(M171)
Base:
Peptona 10 g
Extracto de carne de res 3 g
NaCl 5 g
Púrpura de Bromocresol 0.04 g
132
Agua destilada 1 L
Preparación
Verter porciones de 2.5 ml de solución base dentro de tubos de ensayo de 13 mm x 100 mm
conteniendo tubos de fermentación invertidos de 6 mm x 50 mm. Esterilizar 10 min a 121°C. pH
final 7.0 ± 0.2. Esterilizar en autoclave, por separado, soluciones madre de carbohidratos (50 % p/v)
o preferentemente por filtración (0.2 µm tamaño de poro). Adicionar 0.278 ml ± 0.002 ml de la
solución madre de carbohidratos a 2.5 ml de medio basal para dar una concentración final de
carbohidratos de 5 % p/v.
Caldo urea (M171)

Urea 20 g
Extracto de levadura 0.1 g
Na2HPO4 9.5 g
KH2PO4 9.1 g
Rojo de fenol 0.01 g
Agua destilada 1 L
Preparación
Disolver los ingredientes en agua destilada. No calentar. Esterilizar por filtración a través de una
membrana de 0.45 µm. Verter asépticamente porciones de 1.5 ml - 3.0 ml dentro de tubos de ensayo
de 13 mm x 100 mm. pH final 6.8 ± 0.2.
Caldo Falkow lisina decarboxilasa (M87)

Peptona 5 g
Glucosa 1 g
L-lisina 5 g
Púrpura de bromocresol 0.02 g
Agua destilada 1 L
Preparación
133
Calentar hasta disolver. Distribuir en porciones de 5 ml en tubos con tapón de rosca de 16 mm x

125 mm. Esterilizar en autoclave 15 min a 121 °C. pH final 6.8 ± 0.2.
Caldo cianuro de potasio (KCN) (M126)

Cianuro de potasio (KCN) 0.5 g
Proteasa peptona Nº 3 o polipeptona 3 g
NaCl 5 g
KH2PO4 0.225 g
Na2HPO4 5.64 g
Agua destilada 1 L
Preparación
Disolver los ingredientes excepto el cianuro de potasio. Esterilizar en autoclave 15 min a 121 °C.
Enfriar y refrigerar entre 5 °C y 8 °C. pH final 7.6 ± 0.2. Preparar el KCN disolviendo 0.5 g de
KCN en 100 ml de agua destilada estéril y a una temperatura entre 5 °C y 8 °C. Pipetear 15 ml de
la solución fría de KCN a 1 L del medio base estéril y frío. Mezclar y distribuir porciones de 1 ml -
1.5 ml en tubos de ensayo estériles. Utilizando una técnica aséptica tapar los tubos con tapones de
corcho impregnados con parafina. Almacenar los tubos a 5 °C - 8 °C. No pipetear con la boca.
Usar guantes. No almacenar por más de 2 semanas.
Caldo MR-VP (M104)

Medio 1:
Agua peptonada amortiguada en polvo 7 g
Glucosa 5 g
K2HP04 5 g
Agua destilada 1L
Medio 2:
Digerido pancreático de caseína 3.5 g
Digerido péptico de tejido animal 3.5 g
Dextrosa 5 g
Fosfato de potasio 5 g
Agua destilada 1 L
Medio 3:
134
Peptona 5 g
Glucosa 5 g
Amortiguador de fosfato 5 g
Agua destilada 1 L
Preparación
Medio 1 y 2: Disolver los ingredientes en agua con agitación y calentamiento moderado. Distribuir
porciones de 10 ml en tubos de 16 mm x 150 mm. Esterilizar en autoclave durante 15 min a 118 °C
-121 °C. pH final 6.9 ± 0.2.
Medio 3: Disolver los ingredientes en agua. Verter 10 ml dentro de tubos de ensayo de 16 mm x
150 mm y esterilizar en autoclave 15 min a 121°C. pH final , 7.5 ± 0.2.
Medio indol nitrito (nitrato tríptico) (M66)

Tripticasa 20 g
Na2HPO4 2 g
Dextrosa 1 g
KNO3 1 g
Agar 1 g
Agua destilada 1 L
Preparación
Calentar con agitación suave. Mezclar y verter porciones de 11 ml dentro de tubos de 16 mm x 150
mm. Esterilizar en autoclave durante 15 min a 118°C. pH final 7.2 ± 0.2.
Agar acetato (M3)

Acetato de sodio 2 g
NaCl 5g
MgSO4 (anhidro) 0.2 g
Fosfato de amonio 1 g
K2HPO4 1 g
Azul de bromotimol 0.08 g
Agar 20 g
Agua destilada 1 L
135
Preparación
Adicionar todos los ingredientes excepto MgSO4 a un litro de agua destilada. Calentar a ebullición
con agitación. Adicionar MgSO4 y ajustar el pH. Verter porciones de 8 ml dentro de tubos de 16
mm x 150 mm. Esterilizar 15 min a 121°C. Inclinar los tubos para obtener inclinación de 5 cm, pH
final 6.7.
Caldo mucato (M105)

Peptona 10 g
Ácido mucico 10 g
Agua destilada 1 L
Preparación
Disolver la peptona. Disolver el ácido mucico añadiendo lentamente NaOH 5 N y agitando. Verter
porciones de 5 ml dentro de tubos con tapón de rosca de 13 mm x 100 mm. Esterilizar 10 min a
121°C. pH final 7.4 ± 0.1.
Caldo mucato control (M106)

Peptona 10 g
Agua destilada 1 L
Preparación
Disolver los ingredientes. Verter porciones de 5 ml dentro de tubos de tapón de rosca de 13 mm x
100 mm. Esterilizar 10 min a 121°C. pH final 7.4 ± 0.1.
Caldo malonato (M92)

(NH4)2SO4 2 g
K2HPO4 0.6 g
KH2PO4 0.4 g
NaCl 2 g
136
Malonato de sodio 3 g
Glucosa 0.25 g
Agua destilada 1 L
Preparación
Disolver calentando si es necesario. Verter porciones de 3 ml dentro de tubos de ensayo de 13 mm
x 100 mm. Esterilizar 15 min a 121°C. pH final , 6.7 ± 0.2.
Caldo citrato de Koser (M72)

NaNH4HPO4·4H2O 1.5 g
KH2PO4 (monobásico) 1 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
Citrato de sodio·2H2O 3 g,
Agua destilada 1 L
Preparación
Verter el medio dentro de tubos de tapón de rosca como se desee. Esterilizar 15 min a 121°C. pH
final 6.7 ± 0.2. Esta formulación se enlista en los Métodos Oficiales de Análisis de la AOAC
Internacional y los métodos estándar para la examinación de aguas residuales de la APHA. La
composición difiere del medio deshidratado comercial. Este último es satisfactorio.
Caldo lauril sulfato triptosa (LST)

Triptosa 20 g
Lactosa 5 g
K2HPO4 2.75 g
KH2PO4 2.75 g
NaCl 5g
Lauril sulfato de sodio 0.1 g
Agua destilada 1 L
Preparación
137
Disolver los componentes en 1 L de agua. Distribuir en volúmenes de 10 ml en tubos con

dimensiones de 16 mm x 160 mm, cada tubo debe tener campana de fermentación. Esterilizar en
autoclave por 15 minutos a 121 °C ± 1.0 °C. pH final 6.8 ± 0.2
Agar recuento en placa (métodos estándar)

Triptona 5 g
Dextrosa 1 g
Agar 15 g
Agua destilada 1 L
Preparación
Calentar para disolver los ingredientes. Colocar el medio en tubos o frascos. Esterilizar 15 min a
121 °C, pH final 7.0 ± 0.2.
Solución acuosa de bicarbonato de sodio 10 % (R70)

Bicarbonato de sodio 100 g
Agua destilada para aforar a 1 L
Discos de ONPG (o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido) (R53)

Solución de fosfato monosódico 1.0 M pH 7:
NaH2PO4·H20 6.9 g
Agua destilada 45 ml
Solución NaOH 30 % (p/v) 3 ml
o-Nitrofenil-D-galactosido (ONPG) 0.0133 M:
ONPG 80 mg
Agua destilada a 37°C 15 ml
Solución de fosfato de monosodio 1.0 M pH 7 5 ml.
Preparación
Solución de fosfato monosódico 1.0 M pH 7: disolver el NaH2PO4·H2O en agua destilada.
Adicionar la solución de 30 % NaOH y ajustar a pH 7. Aforar a 50 ml con agua destilada y
almacenar en refrigeración (alrededor de 4 °C).
138
0.0133 M o-Nitrofenil-D-galactosido (ONPG): disolver el ONPG en agua destilada a 37 °C.

Adicionar la solución 1.0 M de NaH2PO4. La solución no debe tener color. Almacenar en
refrigeración (alrededor de 4 °C). Calentar una porción suficiente para el número de pruebas a 37
°C antes de usar.
Solución salina amortiguador de fosfatos (PBS) (R60)

Solución Madre (Stock, 0.1 M):
Na2HPO4 (anhidro) 12.0 g
NaH2PO4 · H20 2.2 g
NaCl 85 g
Agua destilada 1 L
Preparación
Disolver los ingredientes en agua destilada y aforar a 1 litro. Diluir la solución madre 1+9 en agua
doble destilada. Mezclar bien. Ajustar pH a 7.5 con 0.1 N HCl o 0.1 N NaOH si es necesario. Se
encuentra disponible comercialmente en Difco Laboratories y BBL en su forma deshidratada.
Agua diluyente de Butterfield amortiguador de fosfatos (BPBW) (R11)

KH2PO4 34 g
Preparación
Ajustar pH a 7.2 con NaOH 1 N. Aforar a 1 litro con agua destilada. Esterilizar 15 min a 121 °C.
Almacenar en el refrigerador. Blancos de dilución: Tomar 1.25 ml de la solución madre descrita
anteriormente y aforar a 1 litro con agua destilada. Verter dentro de frascos a 90 ml o 99 ml ± 1
ml. Esterilizar 15 min a 121 °C.
Reactivo de Kovacs (R38)

p-Dimetilaminobenzaldehido 5g
Alcohol Amílico (normal) 75 ml
HCl (concentrado) 25 ml
Preparación
139
Disolver el p-dimetilaminobenzaldehido en alcohol amílico normal. Lentamente adicionar HCl.

Almacenar a 4 °C. Para la prueba de indol, adicionar 0.2 ml -0.3 ml del reactivo a 5 ml de un
cultivo de 24 h en caldo triptona. Una capa color rojo oscuro en la superficie es una prueba positiva
para la prueba de indol.
Reactivo VP (R89)
Solución 1:
α-Naftol 5 g
Alcohol (absoluto) 100 ml
Solución 2:
Hidróxido de potasio 40 g
Preparación
Transferir 1 ml del cultivo de 48 h y añadir 0.6 ml de la solución 1 ml y 0.2 ml de la solución 2.
Agitar después de cada adición. Para intensificar y apresurar la reacción, añadir unos cristales de
creatina a la mezcla. Dejar a temperatura ambiente. Observar los resultados después de 4 h de
adicionar los reactivos.
Reactivo de prueba de oxidasa (R54)

N,N,N',N'-Tetrametil-p-fenilenediamina·2HCl 1 g
Preparación
Usar un preparado fresco. Sin embargo, el reactivo puede ser usado hasta por 7 días si es
almacenado en un frasco de vidrio oscuro en refrigeración. Aplicar la solución recientemente
preparada (fresca) directamente a un cultivo joven (24 h) en cajas Petri o tubos inclinados. Las
colonias oxidasa-positivas desarrollan un color rosa que progresivamente se torna púrpura oscuro.
Transferir las colonias fuera del reactivo dentro de 3 min, si es que los cultivos se van a conservar
debido a que el reactivo es tóxico para los organismos. Método opcional: Transferir una pequeña
cantidad de cultivo a un papel filtro impregnado con el reactivo. Un color púrpura oscuro dentro de
10 s indica una prueba positiva. Usar un asa de platino, un aplicador de madera o un palillo estéril
debido a que las asas que contienen hierro (ejemplo asa de nicromo) dan reacciones falsos positivos.
140
Alternativamente, la prueba se puede hacer con una solución al 1 % de hidroclórido de N,N-dimetil-

p-fenilenediamina. Aplicar la solución directamente al cultivo en caja o tubo inclinado.
Reactivo de detección de nitritos (R48)

Reactivo ácido sulfanilico: Ácido sulfanílico 1 g
Ácido acético 5 N 125 ml
Reactivo N-(1-naftil)etilendiamina:
N-(1-naftil)etilendiamina dihidrocloruro 0.25 g
Reactivo α-Naftol:
α-Naftol 1 g
Reactivos alternativos para la prueba:
El ácido sulfónico 5-Amino-2-naftileno (Ácido de Cleve) y N,N-dimetil- 1-naftilamina han sido
recomendados como sustitutos para la preparación del reactivo B. Etanol absoluto puede ser
sustituido por ácido acético en el reactivo C. Sin embargo, se deberán realizar evaluaciones
comparativas antes de sustituir los reactivos originales.
Preparación
Para preparar el ácido acético 5 N, adicionar 28.75 ml de ácido acético glaciar a 71.25 ml de agua
destilada. Almacenar los reactivos en frascos color ámbar. Almacenar los reactivos en frascos de
vidrio color café con tapón. Para realizar la prueba adicionar 0.1 ml -0.5 ml de los reactivos A y
reactivos B o reactivos C (según lo descrito en el método) a un cultivo en medio líquido o
semisólido. El desarrollo de un color rojo-violeta con los reactivos A y B o un color naranja con los
reactivos A y C indica que el nitrato ha sido reducido a nitrito. Debido a que el color producido por
los reactivos A y B puede desvanecerse o desaparecer en muy pocos minutos, la reacción debe
registrarse tan pronto como el color aparezca. Si no se desarrolla color, la prueba de presencia de
nitrato por la adición de una pequeña cantidad de polvo de zinc. Si se desarrolla color, el nitrato no
ha sido reducido. Prueba de reducción del nitrato para E. coli enteropatogénica. Para 3 ml de un
cultivo de 18 h -24 h en medio indol-nitrito, adicionar 2 gotas de los reactivos A y B. Un color rojo-
violeta indica que el nitrato ha sido reducido a nitrito. Revisar las pruebas negativas añadiendo
pequeñas cantidades de polvo de zinc; si el color rojo-violeta no aparece, el nitrato ha sido reducido.
141
Aceite mineral pesado (R46)

Esterilizar 30 min a 121°C. Usar contenedores con tapón de rosca a la mitad de su capacidad con 20
ml -50 ml.
Reactivos de tinción de Gram (R32)

Cristal violeta de Hucker
Solución A: Cristal violeta (90 %) 2 g, Etanol (95 %) 20 ml
Solución B: Oxalato de amonio 0.8 g, Agua destilada 80 ml.
Preparación
Mezclar las soluciones A y B. Almacenar 24 h y filtrar con papel filtro.
Lugol
Yodo 1 g
Yoduro de potasio (KI) 2 g
Preparación
Colocar el yoduro de potasio en el mortero, añadir el yodo, moler de 5 min a 10 min. Añadir de
manera espaciada 1 ml de agua, 5 ml de agua y 10 ml de agua, moler entre cada aplicación. Verter
esta solución en una botella, lavar el mortero con el resto del agua destilada y adicionar a la botella
del reactivo.
Contraste de Hucker (solución stock)

Safranina O 2.5 g
Preparación
Solución de trabajo: añadir 10 ml de la solución stock a 90 ml de agua destilada.
Tinción de Gram
Transferir a una laminilla la muestra del cultivo. Pasar la laminilla por la flama varias veces muy
rápido y esperar que la muestra se seque. Añadir una gota de cristal violeta, esperar 1 min a que
142
seque. Lavar con agua. Esperar a que se seque. Colocar una gota de LUGOL, dejar secar y lavar con
agua. Secar. Decolorizar con etanol al 95 %. Lavar con agua. Dejar secar. Agregar una gota de
safranina, dejar secar aprox. 1 min, lavar con agua, secar nuevamente. Observar al microscopio.
Agua peptonada amortiguada con piruvato (mBPWp) (M192a)

Peptona 10 g
NaCl 5 g
Na2HPO4 3.6 g
KH2PO4 1.5 g
Casaminoácidos 5 g
Lactosa 10 g
Piruvato de sodio 1 g
Agua destilada 1 L
Preparación
Esterilizar en autoclave. pH 7.2 ± 0.2.
Suplemento de acriflavin-Cefsulodin-Vancomicina (ACV) (M192a)

Acriflavin 1.125 g
Cefsulodin 1.125 g
Vancomicina 0.90 g
Preparación
Disolver cada uno de los suplementos en 500 ml de agua destilada. Esterilizar por filtración. Añadir
1 ml de cada uno a 225 ml de mBPWp.
Agar MacConkey sorbitol (SMAC) (M139)

Peptona proteosa o polipeptona 3 g
Peptona o gelisado 17 g
Sorbitol 10 g
Sales biliares No. 3 o mezcla de sales biliares 1.5 g
NaCl 5g
143
Rojo neutro 0.03 g

Cristal violeta 0.001 g
Agar 13.5 g
Agua destilada 1 L
Preparación
Disolver los ingredientes en agua destilada, con calentamiento y agitación. Esterilizar en autoclave
15 min a 121 °C. pH final, 7.1 ± 0.2.
Agar MacConkey telurito cefixima-sorbitol (TC-SMAC) (M194)

Telurito de potasio 2.5 mg/L
Cefixima 0.05 mg/L
Preparación
Preparar Agar MacConkey sorbitol (SMAC) (M139) como se indica. Después de esterilizar y
temperar añadir los 2 aditivos. Esterilizar por filtración.
Agar Levin azul de eosin-metileno (L-EMB) (M80)

Peptona 10 g
Lactosa 10 g
K2HPO4 2 g
Agar 15 g
Eosina Y 0.4 g
Azul de metileno 0.065 g
Agua destilada 1 L
Preparación
Hervir para disolver la peptona, el fosfato y el agar en 1 litro de agua. Añadir agua para completar
el volumen original. Distribuir en porciones de 100 ml o 200 ml cada vez y esterilizar en autoclave
15 minutos a no más de 121 ºC. Antes de su uso, añadir a cada porción de 100 ml: 5 ml de solución
estéril de lactosa al 20 %; 2 ml de solución acuosa de eosina y al 2 %; y 4.3 ml de solución acuosa
de azul de metileno al 0.15 %. Cuando se usa el producto deshidratado completo, hervir para
144
disolver todos los ingredientes en un litro de agua. Distribuir porciones de 100 ml o 200 ml.
Esterilizar en autoclave 15 min a 121 °C. El pH final 7.1 ± 0.2.
Agar tripticasa de soya con extracto de levadura (TSAYE) (M153)

Agar soya tripticaseína 40 g
Agua destilada 1 L
Preparación
Pesar los ingredientes, adicionar agua y mezclar. Esterilizar en autoclave 15 min a 121 °C. pH final
7.3 ± 0.2.
Amortiguador de fosfato Butterfield (R11)

KH2PO4 34 g
Preparación
Ajustar el pH a 7.2 con NaOH 0.1 N. Ajustar el volumen a un litro con agua destilada. Esterilizar
15 min a 121 °C. Almacenar en refrigeración. Dilución de los blancos: Tomar 1.25 ml de la
solución madre anterior y ajustar el volumen a un litro con agua destilada. Distribuir en botellas de
90 ml o 99 ml ± 1 ml. Esterilizar 15 minutos a 121 °C.
Reactivo de Kovacs (R38)

ρ-dimetilaminobenzaldehido 5 g
Alcohol amílico 75 ml
HCl (concentrado) 25 ml
Preparación
Disolver el ρ-dimetilaminobenzaldehido en alcohol amílico. Lentamente adicionar HCl. Almacenar
a 4 °C. Para la prueba de indol, adicionar 0.2 ml -0.3 ml del reactivo a 5 ml de cultivo bacteriano de
24 h en caldo triptona.
Para pruebas en PCR tiempo real:
145
Agua peptonada amortiguada con piruvato (mBPWp) y suplemento de acriflavin-Cefsulodin-

Vancomicina (ACV) (M192a), oligonucleótidos iniciadores y para STEC/O157 específicos para la
plataforma de PCR en tiempo real, OmniMix-HS o SmartMix HM reactivos de esferas para PCR
(Cepheid o Fisher), LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Probes M-Grade (Roche
Applied Science, Catalog #3 383 393), agar MacConkey telurito cefixima-sorbitol (TC-SMAC)
(M194), agar cromogénico selectivo: Agar E. coli O157:H7 R&F® agar (R&F Laboratories), agar
Rainbow® O157 (BIOLOG), agar Levin azul de eosin-metileno (L-EMB) (M80) (solo sección R),
agar tripticasa de soya con extracto de levadura (TSAYE) (M153), amortiguador de fosfato
Butterfield (R11) (pH 7.2 ± 0.2), agua destilada, agua grado molecular, solución fisiológica salina
(0.85 % NaCl), ColiComplete Discs - conteniendo sustrato fluorogénico MUG para GUD y X-gal
cromogénico para GAL (BioControl), reactivo Anti-O157 and anti-H7 latex (Remel), API20E o
VITEK GNI (BioMerieux).
Tabla 2. Secuencias de oligo/sonda para su uso en la plataforma SmartCycler II.

Oligos1 GenBank # Bases 5' → 3' Secuencia
Stx1F934 M19473 26 gTg gCA TTA ATA CTg AAT TgT CAT CA
Stx1R1042 M19473 21 gCg TAA TCC CAC ggA CTC TTC

Stx2F1218 X07865 24 gAT gTT TAT ggC ggT TTT ATT TgC
Stx2R1300 X07865 26 Tgg AAA ACT CAA TTT TAC CTT Tag CA
UidAF241 AF305917 21 CAg TCT ggA TCg CgA AAA CTg
UidAR383 AF305917 22 ACC AgA CgT TgC CCA CAT AAT T
IAC55F2 17 ATg ggT gCC gTT CgA gc
2
IAC186R 19 Cga gaC gAT gCa gCC aTT C
Sonda 1
GenBank # Bases 5' → 3' Secuencia
TxRd-TgA TgA gTT TCC TTC TAT gTg TCC ggC AgA
Stx1P990 M19473 31
T-BHQ2
Stx2P1249 X07865 25 6FAM-TCT gTT AAT gCA ATg gCg gCg gAT T-BHQ1
UidAP266 AF305917 15 TET-ATT gAg CAg CgT Tgg-MGB/NFQ
ICP-Cy52,3 26 Cy5- TCT CAT gCg TCT CCC Tgg TgA ATg Tg-BHQ2
1
Nombre de oligo / sonda compuesto por gen de interés (stx1, stx2 o uidA), oligo directo (F), oligo
reverso (R) o sonda (P), posición de la base 5' del oligonucleótido en la respectiva secuencia del gen
especificada en la columna 2.
146
2
Los oligos y sondas para control interno de amplificación (IAC) están cubiertos por U.S. Patent
Application 0060166232.
Tabla 3. Secuencias de los oligos y sondas para su uso en la plataforma LightCycler 2.0.
Oligos1 GenBank # Bases 5' → 3' Secuencia
uidA F 241 AF305917 21 CAg TCT ggA TCg CgA AAA CTg
uidA R
AF305917 22 ACC AgA CgT TgC CCA CAT AAT T
383
stx1 F 406 M19573 25 gAg gAA ggg Cgg TTT AAT AAT CTA C
CAC TAT gCg ACA TTA AAT CCA gAT
stx1 R 667 M19573 27
AAg
gTT TTg ACC ATC TTC gTC TgA TTA TTg
stx2 F 492 X07865 28
A
stx2 R 737 X07865 22 ACT CCA TTA ACg CCA gAT ATg A
Sondas1 GenBank # Bases 5' → 3' Secuencia

uidA 705 LC LCRed705-CTT TCC CAC CAA CgC TgC TCA ATT
AF305917 27
288 CCA-Phosphate
CAC AgC AAT TgC CCg gCT TTC TTg TAA Cg-
uidA FL P 319 AF305917 29
Fluoroscein
LCRed610-gTC Tgg TgA CAg TAg CTA TAC CAC
stx1 610 LC 552 M19573 32
gTT ACA gC-Phosphate
CCT TTC CAg gTA CAA CAg Cgg TTA CA-
stx1 FL P 524 M19573 26
Fluoroscein
LCRed670-gCT ggA ACg TTC Cgg AAT gCA AAT
stx2 670 LC 670 X07865 28
CAg T-Phosphate
gTT ATA CCA CTC TgC AAC gTg TCg CA-
stx2 FL P 642 X07865 26
Fluoroscein
1
Nombre del oligo / sonda compuesto por el gen de interés (stx1, stx2 o uidA), oligo directo (F),
oligo inverso (R) o una sonda (610LC, 670LC, 705LC, o P FL), posición de la base 5 ' de los
oligonucleótidos en el secuencia del gen respectivo especificado en la columna 2.
Reactivos para pruebas de PCR

Agua peptonada alcalina (APW)
Peptona 10.0 g
NaCl 10.0 g
Preparación:
Ajustar el pH de manera que después de la esterilización sea de 8.5 ± 0.2. Distribuir en tubos con
tapón de rosca. Esterilizar 10 min a 121 °C.
147
Solución maestra de oligos para PCR 10 pmol/µl (ver sección específica)

Taq ADN polimerasa (nativa disponible de múltiples proveedores) o Amplitaq® (Perkin-Elmer)
Solución maestro de 2'-Deoxinucleosido-5'-trifosfato (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); 1.25 mM de
cada dNTP
Amortiguador de PCR 10X (100 mM Tris-HCl, pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2)
Aceite mineral ligero
Agua desionizada estéril
10X TBE (0.9 M Tris-borate, 0.02 M EDTA, pH 8.3)
Agarosa (grado electroforesis de ácidos nucleicos)
Solución de bromuro de etidio, 10 mg/ml
Amortiguador de carga de muestra 6X [10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 0.0 3% azul de bromofenol, 0.03
% cianol xileno FF, 60 % glicerol, 60 mM EDTA, Sambrook y col. 1989]
Marcadores de peso molecular de ADN (ejem., escalera 123 bp, Bethesda Research Laboratories,
Gaithersburg, MD)
7. Equipo
Balanza, ≥ 2 kg con 0.1 g de sensibilidad
Licuadora, Waring o modelo equivalente con operación a baja velocidad a 8000 rpm, con vaso de
vidrio o metal de 1 litro
Incubadoras, 35 °C ± 0.5 °C y 44 °C ± 1 °C
Cajas Petri 20 mm x 150 mm
Pipetas Pasteur
Potenciómetro o tiras reactivas de pH, intervalo 6.0-8.0
Frascos esterilizables para enriquecimiento
Opcional: homogeneizador tipo estomaquer con bolsas plásticas de 250 ml
Bolsas plásticas resellables de 200 g de capacidad
Incubadoras: 36 °C ± 1 °C y 42 °C ± 1 °C
Cajas Petri de 20 mm x 150 mm
Tubos para centrífuga (0.5 ml a 2.0 mL)
Tubos cónicos para centrífuga (50.0 mL)
Micropipetas (0.5 µL -20 µL, 20 µL -200 µL, 200 µL -1000 µL)
Microcentrífuga (capacidad de 15000 x g)
Pipetas (1 ml a 10 ml)
148
Puntas para pipeta (0.2 µl a 1000 µl) (puntas resistentes a aerosol)

Mezclador Vortex
Papel filtro
Baño de agua o bloque de calentamiento capaz de mantener 100 °C
Termociclador SmartCycler II PCR (Cepheid, Sunnyvale, CA) capaz de llevar a cabo los
parámetros de ciclos descritos y detección simultánea de la secuencia en tiempo real para colorantes
FAM, TET, Texas Red y Cy5
Tubos de reacción para PCR SmartCycler (volumen mínimo de reacción de 25 µl) y racks
compatibles con el termociclador
Microcentrífuga con adaptadores capilares (#11909312001) o centrífuga LC Carousel 2.0 (#03 709
507 001) (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)
Instrumento de PCR en tiempo real LightCycler (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) capaz
de llevar a cabo los parámetros de ciclos descritos y detección simultánea de la secuencia en tiempo
real para colorantes LightCycler LC610, LC670 y LC705
Tubos capilares para PCR LightCycler (volumen mínimo de reacción de 20 µl, #04929292001) y
bloque de enfriamiento (#11909339001) compatible con el termociclador
Hielo
Pinzas estériles
Guantes de látex o equivalentes
Termociclador automático programable
Aparato para gel de electroforesis horizontal
Fuente de poder para electroforesis con voltaje constante
Transiluminador UV
Cámara Polaroid o digital
Película Polaroid
8.1 Preparación de los alimentos para el aislamiento de E.coli patógena. Las muestras deben
prepararse y diluirse, siempre que sea posible, de acuerdo a la NOM-110-SSA1-1994. Preparación y
dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.
8.2 Procedimiento general para la preparación de muestras
149
Refrigere las muestras inmediatamente después de su recepción. No congelar las muestras, excepto
para mantener los productos congelados hasta justo antes del análisis. Analizar las muestras tan
pronto como sea posible. Si el recuento lo requiere, preparar un homogeneizado de 25 g en 225 ml
de PBS o BPBW. Realizar diluciones decimales (en PBS o BPBW) del homogeneizado y plaquear
directo en agar MacConkey para obtener colonias aisladas. Después de incubar las placas durante
20 horas a 35 °C, realizar levantamientos de las colonias y pruebas de hibridación con sondas
genéticas específicas para los genes de virulencia. Este procedimiento de recuento es más eficaz si
E. coli constituye al menos el 10 % del crecimiento microbiano en agares de aislamiento y está
presente a un nivel de > 1 000 células/g.
8.3 Pruebas con sondas y PCR

Productos de hojas - añade un peso igual de amortiguador fosfato de Butterfield a por lo menos 200
g de producto en un recipiente estéril o en una bolsa resellable de plástico y agitar suavemente
durante 5 minutos. Pesar 125 g del producto enjuagado con el amortiguador fosfato de Butterfield y
adicionarlo en 125 ml de mBPWp doble fuerza (2X).
Jugo, leche u otras muestras de bebidas turbias - asépticamente centrifugar 200 ml de muestra a 10
000 x g durante 10 min. Resuspender el material precipitado en 225 ml de mBPWp después de
decantar el sobrenadante.
Agua embotellada u otros líquidos no turbios - pesar 125 ml en 125 ml de mBPWp 2X. También
seguir este procedimiento con líquidos en los que no sea visible un precipitado después de la
centrifugación.
Todos los demás alimentos - pesar 25 g de alimento en 225 ml de mBPWp. Licuar o mezclar con un
estómaquer según sea necesario.
Preparación del ADN molde: Enriquecer la cepa durante una noche, centrifugar, resuspender el
precipitado en NaCl al 0.85 %, centrifugar, resuspender el precipitado en agua estéril, mantener a
100 ⁰C durante 10 min, centrifugar, retirar y guardar el sobrenadante como ADN molde (Esto puede
ser congelado, mínimo a -20 ° C, para las futuras pruebas de PCR), hacer una dilución 1:10 de este
molde.
150
9. Procedimiento
9.1 Enriquecimiento
9.1.1 Enriquecimiento para cepas patógenas de E. coli
Lo que aquí se recomienda permite la determinación cualitativa de la presencia de cepas patógenas
de E. coli patógena. Pesar asépticamente 25 g de muestra en 225 ml de caldo BHI (factor de
dilución de 1:10). Dependiendo de la disponibilidad de la muestra, si es necesario el tamaño de la
muestra puede variar de los 25 g, siempre y cuando el diluyente se ajuste proporcionalmente.
Mezclar o colocar brevemente el homogeneizador tipo estomacher. Incubar el homogeneizado
durante 10 min a temperatura ambiente con agitación periódica, luego dejar asentar la muestra por
gravedad durante 10 minutos. Decantar el medio cuidadosamente en un recipiente estéril e incubar
durante 3 horas a 35 °C para resucitar las células dañadas. Transferir el contenido de 225 ml de
caldo TP de concentración doble en un recipiente estéril e incubar durante 20 horas a 44.0 °C ± 0.2
°C. Después de la incubación, estriar en agar L-EMB y agar MacConkey. Incubar estos agares
durante 20 horas a 35 °C.
9.1.2 Enriquecimiento para pruebas con PCR
Incubar estáticamente el homogenizado a 37 °C ± 1 °C durante 5 horas, luego adicionar 1ml de cada
suplemento ACV e incubar estáticamente a 42 °C ± 1 °C durante toda la noche (18-24 h).
Se debe realizar el enriquecimiento para las cepas control: 465-97 del USDA (stx1-, stx2- uidA+).
Como alternativa, utilice ATCC43890 (stx1+, stx2-, uidA+), ATCC 43888 (stx1, stx2- uidA+) o su
equivalente si 465-97 no está disponible. Nota: estas cepas carecen de ambos genes stx y no debe
utilizarse como controles en la PCR.
OPCIONAL: El uso de separación inmunomagnética (IMS) previo a la etapa de selección puede

resultar útil cuando se sospecha de la contaminación con O157:H7, sobre todo en los alimentos con
altos niveles de la flora microbiana competidora tales como los brotes o carnes crudas. Varios
procedimientos de IMS están disponibles, incluyendo Dynabeads® anti-E.coli O157 (Invitrogen
Corp, Carlsbad, CA) y sistema de inmunocaptura Pathatrix de E. coli O157 (Matriz de Micro Ltd.,
Reino Unido) y algunos de ellos ya han sido probados en alimentos seleccionados. Realizar la IMS
en el enriquecimiento de 5 h o de toda la noche (dependiendo del sistema IMS utilizado). Sembrar
en placa o ensayar el PCR en tiempo real desde la suspensión final de las esferas de IMS
(aproximadamente 100 µl), tal como se describe más adelante.
151
9.2 Selección
Las colonias típicas que fermentan lactosa en agar L-EMB aparecen con centro color negro, planas
con o sin brillo metálico. Las colonias típicas en agar MacConkey que fermentan lactosa presentan
color rojo ladrillo. Los biotipos no fermentadores de lactosa en ambos agares producen colonias
incoloras o ligeramente rosado.
NOTA: Algunas colonias de EIEC no fermentan la lactosa y pueden haber cepas atípicas no
fermentadoras de lactosa en otros grupos de E. coli patógenos, por lo tanto, deberán seleccionarse al
menos 20 colonias (10 típicas y 10 atípicas) para su posterior caracterización.
9.3 Detección bioquímica convencional e identificación de E. coli

Realizar la tinción de Gram. Todos los cultivos que aparezcan como bacilos cortos Gram-negativos
deben ser ensayados con las reacciones IMViC y se deberán inocular en caldo LST para confirmar
la producción de gas. Sin embargo, debido a que muchas bacterias entéricas también puede crecer
en el caldo de enriquecimiento TP, además también se debe considerar la realización de pruebas
adicionales para aquellas cepas de E. coli anaerogénicas, no móviles y no fermentadoras o
lentamente fermentadoras de lactosa. Algunas de estas nuevas o modificadas reacciones se discuten
a continuación.
9.3.1 Pruebas bioquímicas tradicionales:

Producción de indol. Inocular un tubo de caldo triptona e incubar por 24 horas ± 2 horas a 35 °C.
Ensayar para prueba de indol mediante la adición de 0.2 ml -0.3 ml de reactivo de Kovacs. La
aparición de un distintivo color rojo en la capa superior es positiva para la prueba.
Reactivo Voges-Proskauer (VP). Inocular un tubo de caldo MR-VP e incubar 48 horas ± 2 horas a
35 °C. Transferir 1 ml a un tubo de 13 mm x 100 mm. Añadir 0.6 ml de α-naftol y 0.2 ml de KOH
al 40 % y agitar. Añadir unos pocos cristales de creatina. Agitar y dejar reposar durante 2 horas. La
prueba es positiva si se desarrolla eosina color rosa.
Reactivo rojo de metilo. Después de la prueba VP, incubar un tubo adicional de MR-VP por 48
horas ± 2 horas a 35 °C. Agregar 5 gotas de la solución de rojo de metilo a cada tubo. Un color rojo
característico indica una prueba positiva. Un color amarillo indica una reacción negativa.
152
Citrato. Inocular ligeramente tubos de caldo citrato de Koser, evitar una turbidez detectable. Incubar
durante 96 horas a 35 °C. El desarrollo de turbidez distintiva indica una reacción positiva.
Producción de gas de lactosa. Inocular un tubo de LST e incubar 48 horas ± 2 horas a 35 °C. La
producción de gas (desplazamiento del medio en el vial interno) o efervescencia después de una
ligera agitación indica una reacción positiva.
Interpretación: Todos los cultivos que (a) fermentan la lactosa con producción de gas dentro de 48
horas a 35 °C, (b) aparecen como bacilos Gram-negativos no formadores de esporas y (c) dan
patrones de IMViC ++-- (biotipo 1) o -+-- (biotipo 2) se considerarán como E. coli.
NOTA: Como alternativa, en lugar de realizar la prueba de IMViC puede utilizar API20E o las
pruebas bioquímicas automatizadas VITEK para identificar el organismo como E. coli. Utilizar el
crecimiento en los cultivos inclinados de PCA y realizar estos ensayos como lo describe el
fabricante.
9.3.2 Pruebas no tradicionales:

a) Inspección primaria. Transferir las colonias sospechosas a agar TSI, agar BAB, caldo triptona,
caldo arabinosa y caldo urea. Incubar por 20 horas a 35 °C. Rechazar las cepas H2S-positivas,
ureasa positivas, arabinosa no fermentadora, e indol-negativa. Para probar la reacción ONPG,
suspender el crecimiento obtenido en el medio TSI en solución salina al 0.85 % para dar turbidez
detectable. Añadir un disco impregnado con ONPG e incubar 6 horas a 35 °C. El color amarillo
indica una reacción positiva. Rechazar las cepas aerogénicas ONPG-negativas. Algunas cepas
Alcalescens-Dispar (es decir, E. coli anaerogénica) son ONPG-negativas.
b) Inspección secundaria (48 h de incubación a 35 °C a menos que se especifique lo contrario). Para
identificar los cultivos y subdividir Escherichia spp se deben ensayar las reacciones adicionales que
se muestran en las Tablas 3 y 4.
c) Como alternativa, puede utilizar API20E o el ensayo de pruebas bioquímicas automatizadas
VITEK para identificar el organismo como E. coli.
Tabla 3. Lista parcial de los kits bioquímicos miniaturizados y sistemas automatizados para la
identificación de las bacterias transmitidas por los alimentos *.
Sistema Formato Fabricante Organismos
153
Enterobacteriaceae, Listeria,
b
API Bioquímica bioMerieux Staphylococcus, Campylobacter,
No-fermentadoras, anaerobias
Cobas IDA Bioquímica Hoffmann LaRoche Enterobacteriaceae
Micro-IDb Bioquímica REMEL Enterobacteriaceae, Listeria
EnterotubeII Bioquímica Roche Enterobacteriaceae
Spectrum 10 Bioquímica Austin Biological Enterobacteriaceae
RapID Bioquímica Innovative Diag. Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae, Vibrionaceae,
BBL Crystal Bioquímica Becton Dickinson
No-fermentadoras, anaerobias
Minitek Bioquímica Becton Dickinson Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae, Gram
Microbact Bioquímica Microgen negativas, No-fermentadoras,
Listeria
Vitekb Bioquímicaa bioMerieux
negativas, Gram positivas
Microlog Oxidación de Ca Biolog
negativas, Gram positivas
b a
MIS Ácidos grasos Microbial-ID Bacillus, Staphylococcus,
Campylobacter
a
Walk/Away Bioquímica MicroScan Bacillus, Staphylococcus,
Campylobacter
Replianalyzer Bioquímicaa Oxoid Bacillus, Staphylococcus,
Campylobacter
Salmonella, Staphylococcus,
Riboprinter Ácidos nucleicosa Qualicon
Listeria, Escherichia coli
Cobas Micro-ID Bioquímicaa Becton Dickinson
negativas, No-fermentadoras
Malthusb Conductanciaa Malthus Salmonella, Listeria,
154
Campylobacter, E. coli,
Pseudomonas, coliformes
a
Bactometer Impedancia bioMerieux Salmonella
* Tabla modificada de: Feng, P., App.I., FDA Bacteriological Analytical Manual, 8A ed.
a
Sistemas automatizados.
b
Sistemas adoptados por la AOAC.
NOTA: Esta tabla es solamente una referencia general y enlista métodos disponibles conocidos. La
presencia en esta lista no indica la verificación, endose o la aprobación de la FDA para su uso en
análisis de alimentos.
Tabla 4. Lista parcial de ensayos de ácidos nucleicos comercialmente disponibles utilizados para la
detección de bacterias patógenas transmitidas por los alimentos.
Organismo Nombre comercial Formato Fabricante
Clostridium botulinum Probelia PCR BioControl
Campylobacter AccuProbe Prueba GEN-PROBE
GENE-TRAK Prueba Neogen
Escherichia coli GENE-TRAK Prueba Neogen
BAX PCRa Qualicon
E. coli O157:H7
Probelia PCR BioControl
GENE-TRAKc Prueba Neogen
AccuProbe Prueba GEN-PROBE
Listeria
BAX PCR Qualicon
c
BAX PCR Qualicon
Salmonella
BINDb Fago BioControl
AccuProbe Prueba GEN-PROBE
Staphylococcus aureus
Yersinia enterocolitica GENE-TRAK Prueba Neogen
a
Reacción en cadena de la polimerasa.
b
Diagnóstico bacteriano por nucleación de hielo.
155
c
Adoptado por AOAC.
NOTA: Esta tabla es solamente una referencia general y enlista métodos disponibles conocidos. La
presencia en esta lista no indica la verificación, endose o la aprobación de la FDA para su uso en
9.4 Pruebas de detección de genes de virulencia de E. coli mediante PCR punto final.
9.4.1 Pruebas para E. coli enterotoxigénica (ETEC), genes de enterotoxina termo-lábil (LT) y genes
de enterotoxina estable al calor (ST)
Existen pruebas comerciales disponibles de RPLA y ELISA para la detección de toxinas LT y ST

(Tabla 5), así como también se pueden realizar ensayos de PCR punto final con los oligos
específicos tomados de Nataro y Kaper, 1998
.
STI
5'-TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG-3'
5'-CTTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC-3'
LT
5'-GGCGACAGATTATACCGTGC-3'
5'-CCGAATTCTGTTATATATGTC-3'
Las enterotoxinas termo-lábiles (LT) de E. coli son un grupo de proteínas estrechamente

relacionado que se distinguen de enterotoxinas termoestables (ST) por ser inmunogénicas y por ser
inactivadas por calentamiento a 60 °C durante 10 min. Las toxinas estimulan la adenilato ciclasa y
pueden ser detectadas mediante ensayos de cultivo de tejidos de células de ovario de hámster chino
o células suprarrenales de ratón Y-l.
La enterotoxina estable al calor (ST) de E. coli se distingue de la LT (arriba) por la estabilidad al

calor y falta de inmunogenicidad. Puede ser detectada por el bioensayo de ratón lactante y actúa
mediante la estimulación de guanilato ciclasa. Hay al menos dos tipos diferentes: ST I (también
conocido como STa y STP) y ST II (también conocido como STb y STH). La última toxina no es
activa en el ensayo del ratón lactante. Estos genes se han clonado y las secuencias de nucleótidos de
la región codificante STa y STb se ha determinado.
156
Tabla 5. Lista parcial de pruebas comercialmente disponibles basadas en ensayos de anticuerpos

para la detección de patógenos y toxinas*.
Escherichia coli
EHEC**c O157:H7 RIM LA REMEL
E. coli O157 LA Unipath
Prolex LA PRO-LAB
Ecolex O157 LA Orion Diagnostica
Wellcolex O157 LA Murex
E. coli O157 LA TechLab
O157&H7 Será Difco
PetrifilmHEC Ab-blot 3M
EZ COLI Tube-EIA Difco
Dynabeads Ab-beads Dynal
EHEC-TEK ELISA Organon-Teknika
e
Assurance ELISA BioControl
HECO157 ELISA 3M Canada
TECRA ELISA TECRA
E. coli O157 ELISA LMD Lab
Premier O157 ELISA Meridian
E. coli O157:H7 ELISA Binax
E. coli Rapitest ELISA Microgen
Transia Card E. coli O157 ELISA Diffchamb
E. coli O157 EIA/capture TECRA
e
VIP Ab-ppt BioControl
Reveal Ab-ppt Neogen
Quix Rapid O157 Ab-ppt Universal HealthWatch
ImmunoCardSTAT Ab-ppt Meridian
VIDAS ELFAb bioMerieux
EiaFOSS ELISAb Foss
Shiga toxina (Stx) VEROTEST ELISA MicroCarb
Premier EHEC ELISA Meridian
Verotox-F RPLA Denka Seiken
157
ETECc
Toxina labil (LT) VET-RPLA RPLA Oxoid
Toxina estable E. coli ST ELISA Oxoid
(ST)
Enterotoxina SET-EIA ELISA Toxin Technology
SET-RPLA RPLA Unipath
TECRAe ELISA TECRA
Transia Plate SE ELISA Diffchamb
RIDASCREEN ELISA R-Biopharm
b
VIDAS ELFA bioMerieux
b
OPUS ELISA TECRA
VET-RPLAd RPLA Unipath
a
Abreviaturas: ELISA, ensayo por inmunoabsorción ligado a enzima; ELFA, ensayo por
fluorescencia ligado a enzima; RPLA, aglutinación pasiva reversa de látex; LA, aglutinación de
látex; Ab-ppt, inmunoprecipitatión.
b
ELISA automatizada.
Reacción en cadena de la polimerasa.
b
Diagnóstico bacteriano por nucleación de hielo.
c
EHEC - E. coli Enterohemorágica; ETEC - E. coli enterotoxigénica.
d
También detecta la enterotoxina LT de E. coli.
e
Adoptado por AOAC.
** ATENCION: a menos que los ensayos afirmen que son específicos para el serotipo O157: H7, la
mayoría de estas pruebas sólo detectan el antígeno O157, por lo que también reaccionan con las
cepas O157 que no son del serotipo H7. Estas cepas O157 no H7, por lo general no producen Shiga
toxinas y son consideradas como no patógenas para los humanos. Además, algunos anticuerpos para
O157 también pueden producir reacciones cruzadas con Citrobacter, E. hermanii y otros
organismos entéricos.
NOTA: Esta tabla es solamente una referencia general y enlista los métodos disponibles conocidos.
La presencia en esta lista no indica la verificación, endose o la aprobación de la FDA para su uso en
9.4.2 Pruebas para E. coli enteroinvasiva (EIEC)
158
Si un aislado es sospechoso de ser EIEC, el potencial invasivo de la cepa puede ser probado
mediante la prueba de PCR punto final usando la secuencia del gen invA de EIEC.
Oligos tomados de Lampel y col. (1990):

KL1 (5'-TAATACTCCTGAACGGCG-3', oligo sentido) 18 bases de longitud, temperatura de
disociación 54 °C.
KL8 (5'-TTAGGTGTCGGCTTTTCTG-3', oligo antisentido) 19 bases de longitud, temperatura de
disociación 52 °C.
Precaución: Dado que tanto EIEC y Shigella darán resultados positivos en las reacciones de PCR
con esas sondas, es fundamental que los organismos sean identificados primero como E. coli.
Oligos tomados de Nataro y Kaper, 1998

5'-CTGGATGGTATGGTGAGG-3'
5'-GGAGGCCAACAATTATTTCC-3'
9.4.3 Pruebas para E. coli enteropatógena (EPEC)

Las cepas EPEC se identifican a partir de 3 características fundamentales: la adherencia, la eficacia
de la lesión (A/E), la adherencia localizada en las células y la ausencia de producción de Shiga
toxina (Stx). Este último rasgo también se utiliza para distinguir las cepas de EPEC de las cepas
EHEC. Existen sondas de PCR para el plásmido EAF que codifica para la adherencia localizada y el
gen eae que codifica para la intimina que causa el fenotipo A/E. Precaución: Existen múltiples
variantes del gen eae y algunas cepas EPEC llevan variantes del gen eae idénticos a los serotipos de
EHEC, por lo que estas pruebas detectan las cepas patógenas de ambos grupos.
Oligos tomados de Nataro y Kaper, 1998

EAF 5'-CAGGGTAAAAGAAAGATGATAA-3'
5'-TATGGGGACCATGTATTATCA-3'
9.5 Procedimiento para la amplificación de secuencias de genes tóxicos de E. coli usando caldo de
enriquecimiento APW mediante PCR de punto final.
Preparación de las muestras y enriquecimiento con APW
9.5.1 Preparación del lisado enriquecido en APW. Preparar lavados o mezclas con APW. Muestrear
y congelar de manera inmediata. Después del enriquecimiento (6 h – 24 h), preparar lisados crudos
159
de APW para PCR mediante el calentamiento a ebullición de 1 ml de las muestras en tubos de 1.5
ml durante aproximadamente 5 min. Los lisados deberán ser usados para el ensayo de PCR de
manera inmediata o almacenar en congelamiento a -20 °C hasta su uso.
NOTA: Debido a las enormes posibilidades de amplificación con PCR, pequeñas cantidades de
contaminación podrían generar falsos positivos. Es recomendable que la preparación de la muestra,
preparación de la reacción y el análisis de los productos de PCR deben estar separados físicamente
uno de otro para minimizar la contaminación. Usar puntas de pipetas resistentes a aerosol para
preparar las muestras y los reactivos para las reacciones de PCR y si es posible separar un juego de
pipetas para el análisis de los productos de reacción.
9.5.2 Preparación de la reacción de PCR. Para minimizar la contaminación cruzada de los reactivos
de PCR es recomendable que las mezclas de soluciones maestras sean separadas en alícuotas y
almacenadas en congelamiento. Las mezclas maestras deberán contener todos los reactivos excepto
la Taq polimerasa y los lisados a amplificar. Las reacciones finales deberán contener 10 mM Tris-
HCl, pH 8.3; 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 µM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP; de 2 % a
5% (v/v) del lisado APW; 0.5 µM de cada oligo (ver 9.4.1-9.4.3) y 2.5 U Taq polimerasa por 100
µl; los volúmenes de reacción de 25 µl -100 µl pueden ser utilizados. Adicionar la Taq polimerasa a
la mezcla maestra y adicionar el lisado hasta homogeneizar, todo dentro de un tubo de reacción de
0.6 ml. Cubrir con aproximadamente 50 µl -70 µl de aceite mineral.
9.5.3 Temperatura de los ciclos. Mientras exista cierta variabilidad en la dinámica del calentamiento
y la refrigeración de los termocicladores de diferentes fabricantes, el uso del régimen de ciclos de
temperatura siguiente, debe producir una amplificación eficaz del fragmento del gen ctx:
desnaturalización durante 1 min a 94 °C, la hibridación del oligo durante 1 minuto a 55 °C y la
extensión del oligo a 72 °C durante 1 min, repetido durante no más de 35 ciclos. El aumento en el
número de ciclos más allá de 35 ciclos a menudo conduce a la formación de productos de
amplificación no específicos, incluyendo dímeros de cebadores.
9.5.4 Análisis en gel de agarosa de los productos de PCR. Mezclar porciones de 10 µl -20 µl de las
reacciones de PCR con amortiguador de carga de gel 6X y cargar en los pocillos de muestra del gel
de agarosa 1.5 %-1.8% sumergido en 1X TBE conteniendo 1 mg/ml de bromuro de etidio. Después
de la apropiada migración con un voltaje constante de 5 V/cm -10 V/cm, iluminar el gel de agarosa
160
con un transiluminador UV y visualizar las bandas en relación a la migración del marcador de peso
molecular. Tome fotografías Polaroid o digitales de los geles para documentar los resultados.
9.5.5 Controles adecuados. No se puede exagerar la necesidad de una serie de reacciones de control
para garantizar una interpretación precisa de los resultados de PCR. Como mínimo, para el análisis
por PCR de tipos de alimentos previamente optimizados para este método, incluir un control de
contaminación con mezcla maestra que no contiene lisado y un control positivo de E. coli APW en
todos los análisis. Para cada mezcla nueva de alimento para ser analizado por este método de PCR,
se deben determinar los posibles efectos inhibitorios de estos los alimentos. Mínimamente, esto
implica la adición de 1 ml de una dilución 1:10 y 1:100 de la mezcla APW post-enriquecimiento
con aproximadamente 5 x 106 organismos por ml (o una cantidad equivalente de lisado de control
positivo). Una comparación directa de estas muestras enriquecidas con el lisado APW (sin
alimento) que contenga números idénticos de células ctx+, permitirá determinar si se produce
cualquier inhibición en cualquiera de las dos concentraciones de alimento y prevendrá la aparición
de falsos negativos. Es poco probable que los alimentos lavados (por ejemplo, frutas y verduras)
inhiban la reacción de PCR a menos que los frutos están magullados y el lavado aporte acidez
excesiva para el APW lavado.
9.6 Método de detección para E. coli del serotipo O157:H7 a partir de los alimentos.
Este método de detección utiliza agua peptonada amortiguada modificada con piruvato (mBPWp),
la cual contiene varios reactivos antimicrobianos que inhiben efectivamente el crecimiento de la
flora normal y los competidores no objetivo, sin embargo, permite el crecimiento de las células
viables de O157:H7 (incluyendo otras STEC) y es capaz de detectar <1 ufc/g en los alimentos.
El ensayo de PCR en tiempo real configurado tanto para las plataformas del SmartCycler II o
LightCycler® 2.0, es específico para los genes stx1 y stx2 y para el polimorfismo de un solo
nucleótido +93 en el gen uidA que codifican para la enzima β-D-glucuronidasa (GUD). El SNP +93
está altamente conservado en las cepas O157:H7 y O157:H- que producen Stx y sirve como un
marcador para la identificación precisa de estos patógenos. El ensayo de PCR en tiempo real
también detecta otras cepas STEC, algunas de las cuales son conocidos patógenos humanos.
Las muestras que son positivas en la detección por PCR en tiempo real, requieren la confirmación
por cultivo, involucrando el crecimiento en placas con agar diferencial para establecer la
161
incapacidad de la cepa para fermentar el sorbitol, identificar el aislado como E. coli, y tipificar
serológicamente para los antígenos O157 y H7. También es aconsejable que los aislados se pongan
a prueba una vez más por PCR para los genes stx1 y stx2 para confirmar su potencial toxicológico.
9.7 Detección con PCR en tiempo real

A continuación se describe el montaje de PCR en tiempo real y los protocolos de análisis de datos
para dos plataformas de instrumentos; SmartCycler II y Light Cycler 2.0. El uso de otras
plataformas y protocolos debe ser validado primero.
1. Preparación del ADN plantilla:

a. Transferir 1 ml del enriquecimiento de toda la noche a un tubo de microcentrífuga y
centrifugarlo a 12 000 x g por 3 min.
b. Retirar el sobrenadante y resuspender la pastilla completamente en 1 ml 0.85 % NaCl.
c. Centrifugar a 12 000 x g por 3 min.
d. Retirar el sobrenadante y resuspender la pastilla completamente en 1 ml de agua estéril.
e. Colocar en un baño de agua o bloque de calentamiento a 100 °C por 10 min.
f. Centrifugar a 12 000 x g por 1 minuto, retirar y guardar el sobrenadante como ADN
plantilla (éste puede congelarse para pruebas futuras de PCR mínimo a -20 °C).
g. Hacer una dilución 1:10 de esta plantilla y usar 1 µl para la prueba de PCR en tiempo real.
h. Para los cultivos puros (incluyendo los cultivos control), suspender 1 ml del caldo de
cultivo o una colonia crecida en agar, en solución salina 0.85 % y prepararlos como se
indicó anteriormente (pasos a-g). Las plantillas pueden ser congeladas para su posterior uso
a mínimo -20 °C.
2. Controles de PCR:
a. Para un control positivo de PCR incluir una plantilla de E. coli O157:H7 de la cepa ATCC
43895 (EDL 933) o ATCC 43894, ambas cepas poseen los tres genes de interés (stx1+, stx2+
y uidA+).
b. Si no se incorpora un control de amplificación interno en la reacción, preparar un tubo de
reacción incluyendo 1 µl de una dilución 1:10 de la plantilla control EDL 933 y 1 µl de una
dilución 1:10 de la plantilla de la muestra del alimento.
c. Incluir siempre un tubo de control negativo sin plantilla (agua) en cada corrida.
3. Smart Cycler II – Ensamble de reacción y protocolo de análisis de datos:
a. Ensamble de la reacción
162
i. Preparar una mezcla maestra de PCR a partir de los componentes de reacción y las
concentraciones finales para STEC/O157 enlistadas en la Tabla 4. Mantenga todas
las reacciones y los reactivos descongelados en hielo. Alternativamente se puede
preparar una mezcla maestra de PCR mediante el paquete inserto para STEC/O157
CSR y OmmiMix HS o SmartMix HM.
ii. Añadir 24 µl de mezcla maestra a cada tubo SmartCycler y taparlo libremente.
iii. Añadir 1 µl de la plantilla de muestra o control y taparlo con fuerza.
iv. Centrifugue brevemente para llevar todo el líquido a la parte inferior del tubo y
colocarlo en el termociclador.
v. Crear una "corrida" en la SmartCycler II. Dé a cada corrida un nombre de corrida
única, seleccione el conjunto de colorante FTTC25, seleccione el protocolo de PCR
de 2 pasos como se describe a continuación y asigne los lugares apropiados en el
bloque SC.
Paso Criterio
Activación inicial 60 s a 95 °C
10 s a 94 °C, (óptica apagado)
40 ciclos 40 s a 63 °C, (óptica encendido)
Tabla 4. Componentes de reacción para el protocolo de amplificación Smart Cycler II1.

Concentración
Volumen/rxn Componente
final
Ajustar a 25 µl 2 Agua destilada estéril
0.625 µl Oligo stx1F934 (10 µM solución de trabajo) 0.25 µM
0.625 µl Oligo stx1R1042 (10 µM solución de trabajo) 0.25 µM
0.375 µl Oligo IAC55F (10 µM solución de trabajo) 0.15 µM
0.625 µl Oligo uidAF241 (10 µM solución de trabajo) 0.25 µM
0.625 µl Oligo uidAR383 (10 µM solución de trabajo) 0.25 µM
0.375 µl Oligo IAC186R (10 µM solución de trabajo) 0.15 µM
163
Sonda stx1PTxRd990 (10 µM solución de

0.375 µl 0.15 µM
trabajo)
Sonda stx2PFAM1249 (10 µM solución de
0.0625 µl 0.025 µM
trabajo)
Sonda uidAPTET-MGB266 (10 µM solución de
0.25 µl 0.1 µM
trabajo)
0.375 µl Sonda ICPCy5 (10 µM solución de trabajo) 0.15 µM
3
Plantilla de ADN IAC
0.5 esferas OmniMix-HS o SmartMix-HS
1-5 µl Plantilla (Muestra o control)
1
Todos los oligos, sondas así como también los oligos y sondas de ADN IC se encuentran
liofilizados en las esferas CSR STEC/O157.
2
Se adicionará el volumen de agua estéril adecuado dependiendo del volumen de plantilla a utilizar.
3
Molécula de ácido nucleico de longitud completa (252 pb) de control interno como se describe en
U.S. Patent Application 0060166232. La cantidad de plantilla IAC necesita ajustarse dependiendo
de la concentración de la solución madre para reportar el umbral de ciclo en alrededor de 25 ciclos-
35 ciclos cuando ningún inhibidor está presente en la reacción.
4. Análisis de datos cualitativos

En el instrumento SmartCycler II, establezca los siguientes parámetros de análisis para FAM, TET,
TxRd y canales Cy5. Actualice los parámetros de análisis si éstos se cambian antes de registrar los
resultados. Nota: El umbral de ciclo (Ct) del control interno (CI) es específico para cada lote de
CSR (Ct = 25-35). Si el Ct no se presenta consistentemente en la IC (Cy5, canal 4) dirija el tubo de
control negativo sólo a 15 fsu. Recomendaciones específicas del lote para el establecimiento manual
del umbral para el Cy5 pueden ser solicitadas.
Usage: Assay
Curve Analysis: Primary
Threshold Setting: Manual
Manual Threshold Fluorescence Units: 15.0
Auto Min Cycle: 5
Auto Max Cycle: 10
Valid Min Cycle: 3
Valid Max. Cycle: 60
164
Background subtraction: ON
Boxcar Avg. Cycles: 0
Background Min. Cycle: 5
Background Max. Cycle: 40
Las curvas de fluorescencia principales que cruzan el umbral será registrado como "POS" y el
número del ciclo cuando se cruzó el umbral se mostrará en la tabla de resultados (Figura 1A). Los
resultados negativos se muestran como "NEG". Los FAM, TET, TxRd y los canales de Cy5 se
correlacionan con stx2, +93 uidA, stx1 y los IC objetivo, respectivamente. Los resultados también
se pueden ver de forma gráfica. Por ejemplo, la Figura 1B representa una gráfica de los cuatro
canales para una cepa aislada EDL 933 de E. coli O157:H7 que lleva los 3 objetivos.
Figura 1. Ejemplo del resultado de salida del Smart Cycler II. A. Resultados vistos en forma de
tabla, B. representación gráfica de los resultados.
A. Resultados de la vista de tabla
B. Vista gráfica de los resultados
5. Protocolo LightCycler 2.0
165
a. Archivo de compensación de color: Antes de la configuración es necesario ejecutar un

archivo de compensación de color para los múltiples tintes [para una de las sondas de
fluoresceína marcadas utilizadas en este experimento (es decir stx1 FL P524), stx1 610LC
552, stx2 670LC 670, uidA 705LC 288 o tener archivos de compensación equivalentes en el
instrumento. Consultar el manual de instrucciones para la corrida y almacenamiento de un
archivo de compensación de color. Si el archivo de compensación del color ya existe para
los canales adecuados, proceder a continuación con la ejecución del programa de la
muestra.
b. Ensamble de la reacción:
i. Preparar una mezcla maestra de acuerdo con la Tabla 5 para obtener el número
deseado de reacciones.
Tabla 5. Componentes de reacción para el protocolo de amplificación LightCycler 2.0
Volumen/rxn Componente Concentración final
1
Ajustar a 18 µl Agua destilada estéril
0.54 µl Oligo uidAF241 (10 µM solución de trabajo) 0.30 µM
0.36 µl Oligo uidAR383 (10 µM solución de trabajo) 0.20 µ M
0.36 µl Sonda stx1 610LC552 (10 µM solución de trabajo) 0.20 µM
0.36 µl Sonda stx1 FL524 (10 µM solución de trabajo) 0.20 µM
0.36 µl Sonda stx2 670LC670 (10 µM solución de trabajo) 0.20 µM
0.36 µl Sonda stx2 FL642 (10 µM solución de trabajo) 0.20 µM
0.36 µl Sonda uidA 705LC288 (10 µM solución de trabajo) 0.20 µM
0.36 µl Sonda uidA FL319 (10 µM solución de trabajo) 0.20 µM
1.44 µl MgCl2 (25 mM) 3.0 mM
1.8 µl FastStart DNA Master2
1-5 µl Plantilla (muestra o control)
1
El volumen de reacción se ajusta a 18 µl en lugar de los 20 µl estándares. La cantidad apropiada
de agua destilada estéril se añade en función del volumen de la plantilla muestra utilizada.
2
Preparar las mezclas de sondas de hibridación grado M FastStart DNA Master según lo
especificado por el fabricante.
166
ii. Asegure una completa mezcla en el tubo pipeteando suavemente o con agitación lento,
y centrifugue rápidamente el tubo para que el contenido se vaya al fondo.
iii. Pipetear 17 µl de la mezcla maestra al número deseado de tubos capilares de vidrio (de
20 µl de capacidad), incluidos los controles.
iv. Añadir 1 µl de ADN plantilla a cada uno de los capilares para completar un volumen
total de 18 µl y colocar la tapa.
v. Crear un nuevo experimento LightCycler.
vi. Programe la corrida en 4 segmentos (Tabla 6) en su instrumento LightCycler.
vii. Introducir la información de programación como se indica::
Canal por defecto: 530
Temperatura de solicitud: 30
Max. Pos Solicitud: Número de muestras a ser analizadas en el instrumento: 6 Ch.
Capacidad del capilar: 20 µl
viii. Cargar los capilares dentro del carrusel de tubos de 20 µl y coloque el carrusel en la
centrífuga para bajar las muestras contenidas en los tubos. Nota: Los tubos pueden ser
centrifugados de manera individual usando adaptadores apropiados.
ix. Coloque el carrusel en el LightCycler y en el módulo de “corrida” “comience la
corrida".
x. Introduzca un nombre de corrida único y continúe. Dentro del módulo “muestras”,
introduzca un identificador en el lugar del capilar.
Tabla 6. Parámetros de programa para LightCycler
Temperatura de los objetivos

Retra
Nombre Tama
Cicl Modo de Velocid so en
del Objeti Manten Objeti ño de Modo de
os Análisis ad de la la
programa vo er vo Sec la adquisici
rampa etapa
(°C) (m o s) (°C) etapa ón
(°C/s) (ciclos
(°C)
)
Activación 1 ninguno 95 10 m 20 0 0 0 Ninguno
Amplificaci cuantificaci 95 10 s 20 0 0 0 Ninguno
40
ón ón 63 40 s 20 0 0 0 Único
fundido 95 0s 20 0 0 0 Ninguno
Fundido 1 55 15 s 20 0 0 0 Ninguno
curvas
95 0s 0.1 0 0 0 Continuo
167
Enfriamient
1 ninguno 40 30 s 20 0 0 0 Ninguno
o
c. Análisis cuantitativo de los datos:

i. Seleccionar “Análisis” de la barra del menú. Escoger “Detección Cualitativa” bajo el título
“Análisis de amplificación”.
ii. Bajo la "Compensación de color" del menú desplegable, seleccionar el archivo de
compensación de color previamente creado por este ensayo.
iii. Seleccionar el canal 610 en el menú desplegable que corresponderá con el gen stx1
objetivo. Haga clic en la pestaña "Avanzado" y amplié la barra de la ventana que le
permitirá ver el CP (punto de cruce) y la puntuación de los valores asignados a la llamada.
Los datos pueden ser registrados capturando la pantalla e importar en Excel o Word a través
de las instrucciones del fabricante o siguiendo los procedimientos establecidos.
iv. Seleccione el canal 670 (stx2) en el menú desplegable y repita el paso 3.
v. Seleccione el canal 705 (uidA) en el menú desplegable y repita el paso 3.
d. Análisis de la curva de fusión de stx1, stx2 y uidA +93 SNP (O157: H7):
i. Seleccione "Análisis" en la barra de menú superior. Seleccione la opción "Llamar Tm" en la
sección "Análisis de la curva de fusión"
ii. Bajo la "Compensación de color" del menú desplegable, seleccione el archivo de
compensación del color creado previamente para este ensayo.
iii. Seleccione el canal 610 en el menú desplegable de canal que corresponderá con los genes
stx1 objetivo. En la sección del menú desplegable "Display" seleccione la pestaña con la
opción "Altura máxima". Ajuste la ventana para ver los datos si es necesario.
iv. Un pico predominante de fusión alrededor de 68 °C es indicativo de stx1.
v. Seleccione el canal 670 (stx2) del menú desplegable. stx2 exhibe un pico de fusión
predominante alrededor de 70 °C.
vi. Seleccione el canal 705 (uidA) del menú desplegable. Los picos de fusión predominante
son los siguientes:
E. coli Tm ≈ 65 °C
E. coli O157:H7 Tm ≈ 71 °C
Nota: Si hay un pico de fusión a ~ 71 °C es positivo para O157: H7. También puede haber
un pico de fusión a ~ 65 °C cuando alguna otra E. coli pueda estar presente.
168
Si la muestra contiene el gen stx1 y stx2, se le denomina "positivo" en el módulo de

detección cualitativo para el canal 610 y 670 respectivamente. Ninguno de los genes está
presentes si es "negativo" en ambos canales.
La muestra es positiva para el +93 uidA SNP indicativo de O157:H7 si el módulo de
detección cualitativo para el canal 705 muestra "positivo" y un pico de fusión se observa en
~ 71 °C. Otros E. coli serán "positivos" en el canal 705 del módulo de detección cualitativo,
pero no presentará un pico de fusión a 71 °C.
Figura 2. Ejemplo del resultado de salida de Light Cycler 2.0. A. Resultados de amplificación, B.
Resultados de la curva de fusión.
A. Llamada de resultados, punto de cruce (CP) y gráfico de la curva de amplificación para stx2
(Canal 670). Pantallas de resultados similares para stx1 en el canal 610.
B. Vista de resultados del análisis de la curva de fusión para uidA +93 SNP, (canal 705).
O157: H7 tienen una temperatura de fusión (Tm) de ~ 71 °C en comparación con una Tm de ~ 65
°C para E. coli.
169
6. Interpretación de los resultados del PCR en tiempo real (Smart Cycler II y LightCycler 2,0)
i. Muestras negativas: Los tres genes objetivo - stx1, stx2 y +93 uidA SNP son "negativos" y
los picos de control de PCR son positivos para uno o más objetivos. Si un control interno
(IC) se incorpora en la reacción como esferas CSR y es positivo, indicaría que las
reacciones funcionaron correctamente. No se necesitan más análisis.
ii. Probables muestras O157 positivas: Si el +93 uidA SNP objetivo es positivo por sí mismo
o en combinación con cualquier positivo de stx1, stx2 o ambos. Proceda a la sección 9.8
para el aislamiento del cultivo y la confirmación.
iii. Probables muestras STEC positivas: Si el +93 uidA SNP objetivo es negativo pero
cualquiera o ambos stx1 y stx2 son positivos, la muestra puede contener un STEC no-O157
o posiblemente el +93 uidA SNP objetivo no se amplificó por encima del ruido de fondo.
Continúe con la sección 9.8. También vea la sección 9.9, para obtener información
adicional.
NOTA: Es posible tener una IC negativa cuando uno o más genes objetivos son positivos,
la amplificación de los genes objetivo puede competir con el control interno de los
reactivos disponibles. En esos casos, el análisis sigue siendo válido, siempre que la
amplificación del gen objetivo haya cruzado el umbral para indicar el éxito de la PCR.
Continúe con la sección P para el aislamiento. Sin embargo, si todos los genes objetivos
son negativos, así como los picos del control de los alimentos o IC se invalida el análisis
de PCR. Solucionar los problemas de la reacción y vuelva a ejecutar el ensayo o estríe en
medio de enriquecimiento como se describe en la sección 9.8.
170
9.8 Asilamiento del cultivo y análisis presuntivo del aislado.

Para las muestras enriquecidas durante la noche que se encuentran como probable positivo mediante
el ensayo de PCR en tiempo real, se requiere la confirmación del cultivo. Del mismo modo, para las
muestras que no han sido analizadas por PCR en tiempo real siga estos procedimientos para el
aislamiento del cultivo.
9.8.1 Aislamiento del cultivo.
a. Realice diluciones seriadas de la muestra enriquecida durante la noche en amortiguador
fosfato de Butterfield (R11) y siembre en placa las diluciones apropiadas (normalmente
0.05 mL de las diluciones 10-2 y 10-4 debe producir aproximadamente 100 colonias-300
colonias aisladas) por duplicado en TC-SMAC y un agar cromógeno (agar Rainbow ®
O157 o agar R&F® E. coli O157: H7). También, de manera opcional se puede incluir una
caja estriada.
b. Incubar las placas a 37 °C ± 1 °C durante 18 h a 24 h. Las colonias O157:H7 típicas en
TC-SMAC son incoloras o neutro/gris con un centro color humo y de 1 mm-2 mm de
diámetro. Bacterias fermentadoras de sorbitol tales como la mayoría de E. coli aparecen
como colonias de color rosa a rojo. En agar Rainbow® O157 o agar R&F® E. coli O157:
H7, las colonias de E. coli O157H7 debe aparecer como colonias color negro o negro
azulado.
171
Figura 3. Apariencia típica de E. coli O157:H7 en TC-SMAC, agar Rainbow® O157 y agar
R&F® E. coli O157:H7.
Colonias típicas de E. coli O157:H7 en agar selectivo
c. Analice colonias típicas tomando una porción de cada colonia sospechosa aislada del agar
de aislamiento y realice pruebas para el antígeno O157 por aglutinación de látex (Remel
kit).
d. Tome todas las colonias típicas que den positivo (hasta 10, si > 10 están presentes) en el
agar de aislamiento y estríe en placas TSAYE para comprobar su pureza.
e. Coloque un disco ColiComplete (CC, BioControl, Bellevue, WA) en el área más densa
del estriado en la placa TSAYE. Preparar una placa de TSAYE similar utilizando una cepa
de E. coli MUG-positiva como control positivo. Incubar las placas 18 horas-24 horas a 37
°C ± 1 °C. CC posee un ensayo cromogénico para galactopiranosidasa (X-gal) y un ensayo
fluorogénico para glucuronidasa (MUG) en el mismo disco. El control positivo debe
mostrar color azul sobre y alrededor del disco (indicativo de coliformes) y fluorescencia
azul alrededor del disco bajo luz UV de onda larga (365 nm) (indicativo de E. coli). Las
cepas O157:H7 son X-gal (+) pero MUG (-).
172
Figura 4. Resultados del disco ColiComplete (CC) para E. coli y E. coli O157:H7
f. Prueba de la mancha de indol: Ponga en contacto el crecimiento de la placa TSAYE con

un papel filtro humedecido con el reactivo de Kovac. E. coli O157:H7 es indol positivo.
173
Figura 5. Resultados indol positivos típicos para E. coli O157:H7.
9.9 Pruebas confirmatorias del aislado

9.9.1 Para las colonias típicas que muestran ser X-gal positivo, MUG negativo e indol positivo,
realice las siguientes pruebas de confirmación de la colonia aislada en TSAYE.
a. Confirmar la presencia de la O157 y antígenos H7 utilizando antisueros comerciales y
siguiendo las instrucciones del fabricante. RIM E. coli O157:H7 Latex Test (Remel,
Lenexa, KS, 800-255-6730), o equivalente proporciona resultados satisfactorios.
NOTA: Si el aislamiento es O157 y H7 positivo, es evidencia de que el aislado es del
serotipo O157:H7. Pero si el aislado es O157 (+) pero H7 (-), proceder con pasos de
confirmación descritos a continuación, ya que puede ser una variante no móvil (O157:NM),
por lo tanto, tiene que ser ensayado mediante PCR para determinar su potencial toxigénico.
El aislamiento también se puede subcultivar en agar sangre para inducir la motilidad y
reanalizar la reacción H7.
Precaución: Asegúrese de probar el aislamiento con el látex de control suministrado con el
kit, para descartar la posibilidad de cepas de E. coli autoaglutinantes que reaccionarán con
los dos reactivos. Además, no utilice el reactivo látex H7 sin probar primero con el reactivo
O157 debido a que otros serotipos de E. coli también puede llevar el antígeno H7.
174
Figura 6. Resultado de aglutinación de latex típico para E. coli O157:H7.
b. Pruebe las cepas O157 y H7 positivas con API20E o VITEK para identificar como E.
coli.
NOTA: Un aislado que es sorbitol (-), indol (+), MUG (-), serológica (+) para O157 y H7 y
se identifica como E. coli es un positivo confirmado para E. coli O157: H7.
c. Los aislados que han sido confirmados como cepas O157:H7 y cepas que son O157 (+)
pero H7 (-), deben ser reexaminados para verificar su potencial toxigénico. Hay varios
ensayos que se pueden utilizar como el PCR en tiempo real (Smart Cycler II o LightCycler
2.0) y el otro es 5P PCR multiplex que simultáneamente ensaya para stx1, stx2, el +93 uidA
SNP, así como otros 2 factores de virulencia O157:H7: los de los genes de enterohemolisina
(ehxA) y el alelo gamma (γ) intimina (eae), que se encuentra principalmente en O157:H7 y
otros pocos serotipos. El protocolo 5P se describe a continuación.
9.9.2 5P PCR Multiplex para la confirmación de O157:H7.

i. Las secuencias de los oligos y los tamaños esperados de los amplicones de 5P PCR se
muestran en la Tabla 7.
175
ii. Para el control positivo, usar el ADN de una cepa O157:H7, tal como EDL933 o
cualquier otra cepa O157:H7 que se conoce como portadora de todos los 5 genes objetivos.
iii. Preparar una mezcla maestra de oligos 10X que contenga concentraciones 2 000 nM de
cada uno de los 10 cebadores. La mezcla maestra de cebadores se puede almacenar
congelado a -20 °C. Usar 5 µl por 50 µl de volumen de reacción para producir una
concentración de uso final de 200 nM de cada cebador.
iv. Usar el crecimiento de la placa en el paso TSAYE 9.9.1 para preparar moldes de ADN
para el análisis de PCR. Preparar el molde de ADN mediante la resuspensión de una colonia
o una asada de la siembra crecida en TSAYE en 100 µl de agua. Mezclar y calentar durante
5 min en un baño de agua hirviendo. Centrifugar para peletizar los desechos. Utilizar 2 µl
de reacción por sobrenadante. Las plantillas pueden ser almacenadas congeladas a -20 °C.
v. La mezcla de PCR de 50 µl contienen amortiguador de Taq polimerasa 1X (Qiagen,
Valencia, CA), 3 mM MgCl2, 250 mM de dNTP, 2 µl de plantilla de ADN crudo, mezcla
maestra de oligos 1X, 3.75 U de HotStarTaq (Qiagen) y agua estéril. Las condiciones de
PCR son: 95 ºC durante 15 min, luego los 25 ciclos, consistiendo cada ciclo de: 95 ºC
durante 1 min, 56 ºC por 1 min y 72 ºC durante 1 min y una extensión final a 72 ºC de 5
min. Examinar los amplicones en electroforesis en gel de agarosa (1 %) en 1X TBE (Tris-
borato-EDTA) pH 8.2. Los resultados esperados se muestran en la figura 7.
Tabla 7. Secuencias de los oligos 5P PCR y tamaños esperados del amplicón.
Gen Oligo Secuencia Amplicón

stx1 LP30 5' - CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG - 3' 348 pb
LP31 5' - CACCAGACAATGTAACCGCTG - 3'
stx2 LP43 5' - ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG - 3' 584 pb
LP44 5' - GCGTCATCGTATACACAGGAGC - 3'
+93 uidA PT-2 5' - GCGAAAACTGTGGAATTGGG - 3' 252 pb

PT-3 5' - TGATGCTCCATCACTTCCTG - 3'
γ - eaeA AE22 5'- ATTACCATCCACACAGACGGT - 3' 397 pb

AE20-2 5'- ACAGCGTGGTTGGATCAACCT - 3'
ehxA MFS1Fb 5'- GTTTATTCTGGGGCAGGCTC - 3' 166 pb
176
MFS1R 5'- CTTCACGTCACCATACATAT - 3'
Figura 7. Gel de agarosa de los amplicones 5P PCR. Las muestras son: 1. O157:H7 y 2. Genéricos
de E. coli (control negativo).
NOTA: Un aislado O157:H7 y O157:NM que lleva stx es considerado patógeno. Sin
embargo, una cepa O157:NM que no lleva stx u otros factores de virulencia de EHEC
probablemente no es patógena. Hay muchos serotipos de E. coli O157 que llevan antígenos
distintos al H7 (es decir: H3, H12, H16, H38, H45, etc.), y estos a menudo no tienen
factores de virulencia de EHEC. Pero las variantes de estos NM han sido aisladas.
a. La posterior caracterización de la cepa aislada puede hacerse por electroforesis en

campo pulsado (PFGE). Utilice los protocolos estandarizados para PFGE de PulseNet
para subtipificar todas las cepas de E. coli O157:H7 y O157:NM.
9.10 Método de análisis para las cepas STEC no-O157.

Tanto los genes stx1 y stx2 como las formas alélicas de estos genes se encuentran en ~ 200 serotipos
STEC, pero muchos de ellos no han sido implicados en la enfermedad y pueden ser encontrados en
la flora intestinal de los seres humanos sanos. Tenga en cuenta que el ensayo de PCR en tiempo
real, que se describe en la sección 9.7 también detectará estas cepas STEC. Así, un resultado para
177
uidA +93 (-), pero stx1 y/o stx2 (+) de PCR en tiempo real, es sólo indicativo de que la muestra
posiblemente contiene un STEC, pero no se debe interpretar que es una STEC patógena.
Las EHEC como grupo son un subconjunto de STEC y se compone de cepas patógenas, de las
cuales la O157:H7 es la cepa prototípica (seropatotipo A). Se conocen varias cepas de EHEC que
han causado enfermedad en todo el mundo: O26, O111, O121, O103, O145, O45, etc (seropatotipo
B). Pueden darse situaciones, como en análisis de alimentos asociadas con un brote de
enfermedades no-O157 de EHEC, donde el analista tendrá que perseguir el aislamiento de esta
probable STEC (+). La siguiente sección describe los procedimientos de aislamiento y la
confirmación de la no-O157 STEC.
NOTA: El procedimiento de enriquecimiento y el ensayo de análisis de PCR en tiempo real descrito
en las secciones 9.1 y 9.8 también se han validado para la detección y la recuperación de otros
productos STEC no O157. Consulte las secciones 6, 7, 9.1, 9.6 y 9.7 para el equipo necesario, los
medios y reactivos, preparación de muestras, enriquecimiento y los procedimientos de detección de
PCR en tiempo real.
1. Procedimiento de aislamiento.
Se requiere la confirmación en cultivo para las muestras de enriquecimiento durante la
noche que se encontraron como presuntos positivos para STEC (positivo para uno o ambos
de los genes objetivo de stx) por el ensayo de PCR en tiempo real. Del mismo modo, para
las muestras que no han sido seleccionadas por PCR en tiempo real debido a la falta de
instrumentación, siga estos procedimientos para el aislamiento de cultivo.
a. Diluya las muestras enriquecidas durante la noche de manera seriada en amortiguador
fosfato de Butterfield (R11) y siembre en placa las diluciones apropiadas (normalmente
0.05 ml de las diluciones 10-2 y 10-4 deben producir aproximadamente 100 colonias-300
colonias aisladas) por duplicado en agar L-EMB (M80) y un agar cromogénico como se
describe en la sección 9.8. De manera opcional también se puede incluir una placa
estriada.
b. Incubar las placas a 37 °C ± 1 °C durante 18 h a 24 h. En L-EMB, las colonias típicas
de E. coli aparecen como colonias planas y con centro oscuro, con o sin un brillo
metálico.
c. Elegir colonias típicas de E. coli a partir de L-EMB (hasta 10) y la placa estriada en
TSAYE con CC (véase la Sección 9.8.1.e.). E. coli será X-gal (+), pero puede ser MUG
(+) o (-).
178
Figura 8. Apariencia típica de colonias de E. coli en agar L-EMB
d. Pruebe los aislamientos X-gal positivos con la prueba mancha de indol (Sección
9.8.1.f.).
2. Pruebas confirmatorias de los aislados.
Confirmar los aislados que aparecen como E. coli típicos en L-EMB y son X-gal (+), MUG
(+) o (-) e indol positivo.
b. Identificar los aislados como E. coli utilizando API20E o VITEK siguiendo las
instrucciones del fabricante.
c. Los aislados identificados como E. coli necesitan ser reexaminados para el potencial
toxigénico (ver sección 9.9.1.c.).
d. La posterior caracterización de la cepa aislada puede hacerse por electroforesis en
campo pulsado (PFGE). Utilice los protocolos estandarizados de PulseNet para PFGE.

Informar resultado negativo o positivo con UFC/g o ml de muestra.
179

Esta norma es prácticamente una traducción del capítulo 4A y capítulo 28 del Bacteriological
Analytical Manual (2011).

E. coli 465-97 USDA (stx1-, stx2- uidA+), ATCC43890 (stx1+, stx2-, uidA+), ATCC 43888 (stx1-,
stx2- uidA+) o equivalente, ATCC 43895 (EDL 933) o ATCC 43894 (stx1+, stx2+ and uidA+).
13. Bibliografía
FDA. 2011. Capítulo 4A. Diarrheagenic Escherichia coli. Bacteriological Analytical Manual.
Nataro, J. P. and J. B. Kaper. 1998. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin. Microbiol. Rev. 11:132-
201.
Lampel, K.A., J.A. Jagow, M. Trucksess, and W.E. Hill. 1990. Polymerase chain reaction for
detection of invasive Shigella flexneri in food. Appl. Environ. Microbiol. 56:1536-1540.
Weagant, S. D., K. C. Jinneman, and J. H. Wetherington. 2000. Use of multiplex polymerase chain
reaction for identification of enterotoxigenic Escherichia coli. FDA LIB 4227.
Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed.
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
180
Propuesta de Norma Oficial Mexicana, bienes y servicios.

Método para la detección de Vibrio cholerae enterotoxigénico.
PREFACIO
En la elaboración de la presente propuesta de norma participaron los siguientes organismos e
instituciones:
CENAM
ÍNDICE
Contenido
2. Fundamento
3. Referencias
4. Definiciones
7. Equipo
9. Procedimiento
13. Bibliografía
14. Anexo

1.1 Esta Norma Oficial Mexicana establece un método general para el enriquecimiento, detección y
confirmación de Vibrio cholerae enterotoxigénico, V. parahaemolyticus y V. vulnificus en base a
sus propiedades únicas de virulencia en los alimentos para consumo humano mediante la técnica de
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y crecimiento en medios selectivos.
181
1.2 Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las
personas físicas y morales que requieran efectuar este método en productos nacionales y de
importación, para fines oficiales.
2. Fundamento
2.1 Enriquecimiento de la muestra, detección por medio de PCR y confirmación morfológica en
medio selectivo.
3. Referencias
Esta norma se complementa con lo siguiente:
NOM-109-SSA1-1994 Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos
NOM-110-SSA1-1994 Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis
microbiológico.
NOM-112-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Determinación de bacterias coliformes. Técnica del
número más probable.
NOM-242-SSA1-2009, Productos y servicios. Productos de la pesca frescos, refrigerados,
congelados y procesados. Especificaciones sanitarias y métodos de prueba.
4. Definiciones
Para fines de esta norma se entiende por:
Dilución primaria: es la solución, suspensión o emulsión obtenida después de pesar o medir una
cantidad del producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporción del
diluyente.
Diluciones decimales adicionales: las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un
determinado volumen de la dilución primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que
por repetición de esta operación con cada dilución así preparada, se obtiene la serie de diluciones
decimales adecuadas para la inoculación de medios de cultivo.
Diluciones decimales sucesivas: suspensiones o disoluciones obtenidas al mezclar un volumen
determinado de la suspensión inicial con un volumen nueve veces superior de disolvente y
repitiendo esta operación con diluciones decimales sucesivas hasta llegar a un nivel de dilución
adecuado para la inoculación del medio de cultivo.
182
Método: es un proceso o camino sistemático establecido para realizar una tarea o trabajo con el fin
de alcanzar un objetivo predeterminado. Procedimiento científico seguido en la ciencia para hallar
la verdad. Un procedimiento que se usa para realizar una tarea específica en la clase o módulo.
Muestra para el laboratorio: muestra preparada para ser enviada al laboratorio y destinada a ser
utilizada para inspección o para análisis.
Muestra representativa: es un número de unidades tomadas de un lote, que han sido
seleccionadas en forma aleatoria y cuyas características son lo más similar posible a las del lote del
que procede.
Norma específica: Norma internacional o documento de apoyo que describe el análisis de un
producto determinado (o de un grupo de productos) para la detección o la determinación del número
de un microorganismo específico (o de un grupo de microorganismos).
Porción para análisis: muestra representativa medida (volumen o masa) tomada a partir de la
muestra para el laboratorio para emplearse en la preparación de la suspensión inicial.
Procedimiento: es un término que hace referencia a la acción que consiste en proceder de alguna
forma. El concepto, por otra parte, está vinculado a un método ó una manera de ejecutar algo. Un
procedimiento, en este sentido, consiste en seguir ciertas etapas predefinidas para desarrollar una
labor de manera eficaz.
Suspensión inicial (dilución base): suspensión, disolución o emulsión obtenida cuando un peso o
volumen determinado del producto en examen (o de una muestra de ensayo preparada a partir del
producto) ha sido mezclado con una cantidad nueve veces superior de disolvente, dejando que las
partículas grandes, si las hubiera, queden sedimentadas.
Suspensión inicial (dilución primaria): suspensión, disolución o emulsión obtenida cuando un
peso o volumen determinado del producto en examen (o de una muestra de ensayo preparada a
partir del producto) ha sido mezclado con una cantidad nueve veces superior de disolvente, dejando
que las partículas grandes, si las hubiera, queden sedimentadas.
Toma de muestra: es el procedimiento que se requiere para elegir el material a analizar a partir de
la totalidad del lote o partida.
± más menos
/ signo de división
⁰C grado Celsius
% por ciento
183
cm centímetro
g gramo
h hora
kg kilogramo
l litro
μl microlitro
M molar
ml mililitro
mm milímetro
min minuto
p peso
pb pares de bases
PCR reacción en cadena de la polimerasa
UFC unidades formadoras de colonias
v volumen
x signo de multiplicación
En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas, se deben seguir las instrucciones
impresas en la etiqueta respectiva para su preparación.
Las sustancias químicas usadas para preparar los medios de cultivo y los reactivos deben ser grado
analítico.
6.1 Reactivos
Agua peptonada alcalina (APW)
Peptona 10.0 g
NaCl 10.0 g
Agua destilada 1 000 ml
Preparación:
Ajustar el pH de manera que después de la esterilización sea de 8.5 ± 0.2. Distribuir en tubos con
tapón de rosca. Esterilizar por 10 min a 121 °C.
184
Agar tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa (TCBS)

Peptona 10.0 g
Sacarosa 20.0 g
Tiosulfato de sodio 10.0 g
Citrato de sodio 10.0 g
Bilis seca de bovino 8.0 g
NaCl 10.0 g
Citrato férrico 1.0 g
Azul de timol 0.04 g
Agar 8.0 a 18.0 g
Preparación:
Añadir los ingredientes al agua destilada y calentar para disolver. Llevar a ebullición y retirar
inmediatamente del fuego. NO UTILIZAR AUTOCLAVE. Enfriar a 50 °C y verter en cajas Petri.
Ajustar el pH a 8.6 ± 0.2
Caldo soya tripticasa (TSB-2 % NaCl).

Peptona de tripticasa (triptona) 17.0 g
Peptona de fitona (soytona) 3.0 g
Cloruro de sodio 20.0 g
Fosfato dipotásico 2.5 g
Dextrosa 2.5 g
Preparación:
Suspender los ingredientes en agua destilada y calentar suavemente hasta su completa disolución.
Distribuir 225 ml en matraces de 500 ml. Esterilizar en autoclave durante 15 min a 121 °C. El pH
final debe ser de 7.3 ± 0.2.
Solución salina fisiológica 0.85 % (estéril)
185
NaCl 8.5 g
Preparación:
Disolver el NaCl en el agua. Esterilizar en autoclave por 15 min a 121 °C. Almacenar a temperatura
ambiente.
Amortiguador fosfato salino (PBS), pH 7.4

NaCl 7.65 g
Na2HPO4 anhidro 0.72 g
KH2PO4 0.210 g
Preparación:
Disolver los ingredientes en agua destilada. Ajustar el pH a 7.4 (con NaOH 0.1 N). Esterilizar por
15 min a 121 °C.
Agar tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa (TCBS)

Peptona 10.0 g
Sacarosa 20.0 g
Tiosulfato de sodio 5•H2O 10.0 g
Citato de sodio 2•H2O 10.0 g
Colato de sodio 3.0 g
Oxgall 5.0 g
NaCl 10.0 g
Citrato férrico 1.0 g
Azul de timol 0.04 g
Preparación:
186
Preparar en un matraz de al menos 3 veces más grande que el volumen requerido de medio. Añadir
los ingredientes al agua destilada y calentar para disolver. Llevar a ebullición y retirar
inmediatamente del fuego. NO UTILIZAR AUTOCLAVE. Enfriar a 50 °C y verter en cajas Petri.
Agar modificado celobiosa-polimixina B-colistina (mCPC)

Solución 1:
Peptona 10.0 g
Extracto de carne 5.0 g
NaCl 20.0 g
Solución stock de colorante 1000X 1.0 ml
Agar 15.0 g
Solución 2:
Celobiosa 10.0 g
Colistina 400 000 unidades
Polimixina B 100 000 unidades
Preparación:
Solución 1: ajustar el pH a 7.6. Hervir para disolver el agar. Enfriar a 48 °C -55 °C. Solución 2:
disolver la celobiosa en agua destilada con calentamiento suave. Enfriar. Añadir los antibióticos.
Adicionar la solución 2 a la solución 1 enfriada. Mezclar y distribuir en cajas Petri. Color final:
verde oscuro a verde marrón.
Solución stock de colorante 1000X: Azul de bromotimol 4 g, rojo de cresol 4 g, etanol al 95 % 100
ml. Disolver los colorantes en etanol para una solución stock al 4 % (p/v). Utilizando 1 ml de esta
solución por litro de agar mCPC da 40 mg de azul de bromotimol y 40 mg de rojo de cresol por
litro.
Solución 2: Disolver la celobiosa en agua destilada calentando suavemente. Enfriar. Adicionar los
antibióticos y esterilizar por filtración. Adicionar la solución 2 a la solución 1 enfriada, mezclar, y
distribuir en cajas Petri. El color final es de un verde oscuro a un verde café.
NOTA: Este medio como el TCBS es muy inhibitorio y no requiere esterilización por autoclave. El
medio puede ser almacenado 2 semanas a temperatura de refrigeración.
187
Agar celobiosa-colistina (CC)

Solución 1:
Peptona 10.0 g
Extracto de carne 5.0 g
NaCl 20.0 g
Solución stock colorante 1000X 1.0 ml
Agar 15.0 g
Solución 2:
Celobiosa 10.0 g
Colistina 400 000 unidades
Preparación:
Solución 1: ajustar el pH a 7.6. Hervir para disolver el agar. Enfriar a 48 °C -55 °C. Solución 2:
disolver la celobiosa en agua destilada con calentamiento suave. Enfriar. Añadir el antibiótico.
Adicionar la solución 2 a la solución 1 enfriada. Mezclar y distribuir en cajas Petri. Color final:
verde oscuro a verde marrón.
Solución stock de colorante 1000X: Azul de bromotimol 4 g, rojo de cresol 4 g, etanol al 95 % 100
ml. Disolver los colorantes en etanol para una solución stock al 4 % (p/v). Utilizando 1 ml de esta
solución por litro de agar mCPC da 40 mg de azul de bromotimol y 40 mg de rojo de cresol por
litro.
Solución 2: Disolver la celobiosa en agua destilada calentando suavemente. Enfirar. Adicionar los
antibióticos y esterilizar por filtración. Adicionar la solución 2 a la solución 1 enfriada, mezclar y
distribuir en cajas Petri. El color final es de un verde oscuro a un verde café.
NOTA: Este medio como el TCBS es muy inhibitorio y no requiere esterilización por autoclave. El
medio puede ser almacenado 2 semanas a temperatura de refrigeración.
Tiras reactivas de diagnóstico y reactivos API 20E (BioMerieux)

Solución maestra de oligos de Vibrio cholerae enterotoxigénico para PCR 10 pmol/µl ((5'-
TGAAATAAAGCAGTCAGGTG-3', 5'-GGTATTCTGCACACAAATCAG-3')
Taq ADN polimerasa (nativa disponible de múltiples proveedores) o Amplitaq® (Perkin-Elmer)
188
Solución maestra de 2'-Deoxinucleosido-5'-trifosfato (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); 1.25 mM de

cada dNTP
Amortiguador de PCR 10X (100 mM Tris-HCl, pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2)
Aceite mineral ligero
Agua desionizada estéril
10X TBE (0.9 M Tris-borato, 0.02 M EDTA, pH 8.3)
Agarosa (grado electroforesis de ácidos nucleicos)
Solución de bromuro de etidio, 10 mg/ml
Amortiguador de carga de muestra 6X [10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 0.03 % azul de bromofenol, 0.03
% cianol xileno FF, 60 % glicerol, 60 mM EDTA, Sambrook y col. 1989]
Marcadores de peso molecular de ADN (p. ejem., escalera 123 pb, Bethesda Research Laboratories,
Gaithersburg, MD)
7. Equipo
Microondas
Cajas Petri
Homogeneizador
Termociclador programable automático
Aparato de electroforesis en gel horizontal
Fuente de poder de voltaje para electroforesis
Parrilla de calentamiento
Tubos para microcentrífuga
Micropipetas digitales
Pipetas
Microcentrífuga
Transiluminador UV
Cámara Polaroid o digital
Film Polaroid
8.1 Preparación de los alimentos para la identificación de Vibrio cholerae enterotoxigénico. Las
muestras deben prepararse y diluirse, siempre que sea posible, de acuerdo a la NOM-110-SSA1-
189
1994. Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.
8.2 Procedimiento general para la preparación de muestras

Refrigere las muestras inmediatamente después de su recepción. No congelar las muestras, excepto
para mantener los productos congelados hasta justo antes del análisis. Analizar las muestras tan
pronto como sea posible.
9. Procedimiento
9.1.1 Procedimiento para el enriquecimiento de la muestra presuntiva de V. cholerae
Pesar 25 g de muestra en un frasco tarado (capacidad de aproximadamente 500 ml). Los productos
tales como mariscos o verduras se pueden mezclar o se pueden cortar en trozos pequeños con tijeras
estériles.
Añadir 225 ml de APW al frasco o recipiente del homogeneizador. Mezclar la muestra durante 2
min a alta velocidad.
Incubar el APW a 35 ºC ± 2 ºC durante 6 horas a 8 horas. Volver a incubar el frasco durante la
noche si la muestra hubiera sido procesada de alguna forma. Para el análisis de ostras crudas, incluir
un segundo matraz tarado con 25 g de producto con 2 475 ml APW. Este matraz se incubará de 18
horas a 21 horas a 42 ºC ± 0.2 ºC en un baño de agua.
9.1.2 Procedimiento para el enriquecimiento de la muestra presuntiva de V. parahaemolyticus

Pesar 50 g de muestra de mariscos en recipiente de licuadora. Obtener la superficie de los tejidos,
las agallas y el intestino de los peces. Las muestras de mariscos son la carne y el líquido propio de
la muestra. Normalmente se mezclan 12 animales a alta velocidad durante 90 segundos y 50 g de
este homogeneizado será utilizado para el análisis. Para los crustáceos como el camarón debe usarse
el animal entero, si es posible y si es demasiado grande, se debe seleccionar la parte central que
incluye las branquias y el intestino. Nota: lo mismo se recomienda para V. vulnificus
Añadir 450 ml de TSB-2 % NaCl y mezclar durante 1 min a 8 000 rpm. Esto constituye la dilución
1:10. De ser necesario preparar diluciones 1:100, 1:1 000, 1:10 000 o superiores en TSB-2 % NaCl.
Para los moluscos mezclar 12 animales durante 90 segundos con un volumen igual de TSB-2 %
NaCl (dilución 1:2). Prepare una dilución 1:10 transfiriendo 20.0 g (se recomienda que se utilice el
peso porque las burbujas de aire en la dilución 1:2 evita una transferencia volumétrica precisa) de la
dilución 1:2 a 80 ml de TSB-2 % NaCl. Pueden prepararse diluciones decimales adicionales
volumétricamente; es decir, 1 ml de 1:10 a 9.,0 ml de TSB-2 % NaCl para una dilución de 1:100.
190
Para el producto que ha sido procesado, es decir calentado, secos, o congelado, inocular porciones
de 3 x 10 ml de la dilución 1:10 en 3 tubos con 10 ml de TSB-2 % NaCl 2X. Esto representa la
porción de 1 g. Del mismo modo, inocular 3 x 1 ml de las diluciones 1:10, 1:100, 1:1 000 y 1:10
000 en 10 ml de concentración simple de TSB-2 % NaCl. Si se espera un número elevado de V.
parahaemolyticus, la exploración puede comenzar en la dilución 1:10 del producto.
Incubar durante toda la noche a 35 ºC ± 2 ºC.
Centrifugar un ml de cultivo en un tubo de microcentrífuga durante 3 min a 15.000 x g.
Lavar el sedimento dos veces con solución salina fisiológica.
Resuspender el precipitado en 1.0 ml dH20 y hervir durante 10 min.
Almacenar la plantilla o molde a -20 ºC hasta su uso.
9.1.3 Procedimiento para el enriquecimiento de la muestra presuntiva de V. parahaemolyticus

Preparar una dilución inicial 1:10 de la muestra en PBS siguiendo el procedimiento descrito para V.
parahaemolyticus. Preparar diluciones decimales en PBS. Preparar una dilución 1:10 a partir del
homogeneizado de ostra como se describe a continuación: pesar 20 gramos del homogeneizado en
un frasco estéril y añadir PBS para diluir hasta un peso final de 100 g. Mezclar por agitación.
Diluciones decimales adicionales pueden prepararse volumétricamente (es decir, 1 ml de 1:10 a 9.0
ml de PBS para una dilución 1:100).
Inocular porciones x 3 de 1 ml de las diluciones en 3 tubos que contengan 10 ml de APW. Si se
espera un número bajo, porciones de 2 g (1 g de ostra) pueden ser inoculadas directamente desde el
homogeneizador en 3 x 100 ml APW.
Incubar los tubos durante 18 horas a 24 horas a 35 ºC ± 2 ºC.
Centrifugar un ml de cultivo en un tubo de microcentrífuga durante 3 min a 15.000 x g.
Lavar el sedimento dos veces con solución salina fisiológica.
Resuspender el precipitado en 1.0 ml dH20 y hervir durante 10 min.
Almacenar la plantilla o molde a -20 ºC hasta su uso.
9.2 Preparación del lisado del enriquecimiento APW para detectar V. cholerae
Preparar los lavados o mezclas con APW. Tomar las muestras y congelarlas inmediatamente
(aproximadamente 1 ml). Preparar lisados crudos del APW para la PCR después del
enriquecimiento (6 h -24 h) mediante la ebullición de las muestras de 1 ml en tubos para
microcentrífuga de 1.5 ml durante aproximadamente 5 min. Los lisados pueden ser utilizados para
la PCR inmediatamente o almacenarse en un congelador a -20 ºC hasta su posterior uso.
191
NOTA: Debido a la enorme amplificación posible con la PCR, los niveles de contaminación que
pueden dar lugar a falsos positivos deben ser minimizados. Se recomienda que la preparación de las
muestras, la puesta en marcha de la PCR y el análisis del producto de PCR deban estar separados
físicamente, uno del otro, para minimizar la contaminación. Como mínimo es absolutamente
necesario el uso de una técnica aséptica en el manejo de todos los reactivos de PCR. Usar puntas de
pipeta aerosol resistente para la preparación de muestras y reactivo para la PCR y si es posible,
deberá utilizar un juego de pipetas diferente para el análisis de productos de la PCR.
9.3 Preparación de la reacción de PCR para detectar V. cholerae

Para minimizar la contaminación cruzada de los reactivos de PCR es recomendable que las mezclas
de soluciones maestras sean separadas en alícuotas y almacenadas en congelamiento. Las mezclas
maestras deberán contener todos los reactivos excepto la Taq polimerasa y los lisados a amplificar.
Las reacciones finales deberán contener 10 mM Tris-HCl, pH 8.3; 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200
µM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP; de 2 % a 5 % (v/v) del lisado APW; 0.5 µM de cada oligo
y 2.5 U Taq polimerasa por 100 µl; los volúmenes de reacción de 25 µl -100 µl pueden ser
utilizados. Adicionar la Taq polimerasa a la mezcla maestra y adicionar el lisado hasta
homogeneizar, todo dentro de un tubo de reacción de 0.6 ml. Cubrir con aproximadamente 50 µl -
70 µl de aceite mineral.
9.4 Temperatura de los ciclos para detectar V. cholerae

Mientras exista cierta variabilidad en la dinámica del calentamiento y la refrigeración de los
termocicladores de diferentes fabricantes, el uso del régimen de ciclos de temperatura siguiente,
debe producir una amplificación eficaz del fragmento del gen ctx: desnaturalización durante 1 min a
94 °C, la hibridación del oligo durante 1 min a 55 °C y la extensión del oligo a 72 °C durante 1 min,
repetido durante no más de 35 ciclos con una extensión final durante 3 min a 72 ºC. El aumento en
el número de ciclos más allá de 35 ciclos, a menudo conduce a la formación de productos de
amplificación no específicos, incluyendo dímeros de cebadores.
9.5 Análisis en gel de agarosa de los productos de PCR para detectar V. cholerae
Mezclar porciones de 10 µl -20 µl de las reacciones de PCR con amortiguador de carga de gel 6X y
cargar en los pocillos de muestra del gel de agarosa 1.5 %-1.8 % sumergido en 1X TBE
conteniendo 1 mg/ml de bromuro de etidio. Después de la apropiada migración con un voltaje
constante de 5 V/cm -10 V/cm, iluminar el gel de agarosa con un transiluminador UV y visualizar
192
las bandas en relación a la migración del marcador de peso molecular. Los oligos iniciadores
generan un fragmento de 777 pb. Tome fotografías Polaroid o digitales de los geles para
documentar los resultados.
9.6 Controles adecuados para detectar V. cholerae

No se puede exagerar la necesidad de una serie de reacciones de control para garantizar una
interpretación precisa de los resultados de PCR. Como mínimo, para el análisis por PCR de tipos de
alimentos previamente optimizados para este método (por ejemplo, lavados vegetales, ostras,
cangrejos y camarones mezclas; Koch, et al. 1993) deben incluir en todos los análisis una mezcla
maestra de control de contaminación que no contenga lisado y un control de APW V. cholerae
positivo. Determinar los posibles efectos inhibitorios para cada mezcla de alimento nuevo a ser
analizados por este método PCR. Como mínimo se deberá realizar la adición de 1 ml de una
dilución 1:10 y 1:100 de la mezcla APW post-enriquecimiento con aproximadamente 5 x 106
organismos por ml (o una cantidad equivalente de lisado de control positivo). Una comparación
directa de estas muestras enriquecidas con el lisado APW (sin alimento) que contenga números
idénticos células ctx+, permitirá determinar si se produce cualquier inhibición en cualquiera de las
dos concentraciones de alimento y prevendrá la aparición de falsos negativos. Es poco probable que
los alimentos lavados (por ejemplo, frutas y verduras) inhiban la reacción de PCR a menos que los
frutos están magullados y el lavado aporte acidez excesiva para el APW lavado.
9.7 Confirmación por crecimiento en medio selectivo y pruebas bioquímicas para detectar V.
cholerae.
Se recomienda que los caldos de enriquecimiento con agua peptonada alcalina (APW) utilizados
para el análisis de PCR también se siembren en medio selectivo y se ensayen las pruebas
bioquímicas descritas en el anexo B.19 Técnicas y procedimientos para la investigación de Vibrio
cholerae de la NOM-242-SSA1-2009 para el aislamiento y la confirmación directa de la presencia
de V. cholerae en muestras que den resultados positivos de PCR.
9.7.1 Aislamiento en medio selectivo para detectar V. cholerae

Preparar placas secas de agar TCBS.
Transferir una asada (con asa de 3 mm) de la película en la superficie del cultivo en APW a la
superficie de una placa seca TCBS y estriar de una manera que producirá colonias aisladas.
Incubar las placas con el agar TCBS estriadas durante toda la noche (18 h a 24 h) a 35 ºC ± 2 ºC.
193
Las colonias típicas de V. cholerae en agar TCBS son grandes (2 mm a 3 mm), lisas, de color
amarillo y ligeramente aplanadas con centro opaco y de periferia translúcida.
9.8 Otros Vibrios

9.8.1 Detección de V. parahaemolyticus mediante PCR Multiplex
Preparar plantillas o moldes a partir de un cultivo crecido durante toda la noche a 35 ºC ± 2 ºC en
TSB-2 % NaCl.
El conjunto de oligos iniciadores que deben utilizarse para la detección de V. parahaemolyticus son
los siguientes:
Oligos iniciadores
Genes tlh espcíficos de la especie (450 pb) L-TL 5' aaa gcg gat tat gca gaa gca ctg 3'
R-TL 5' gct act ttc tag cat ttt ctc tgc 3'
Gen trh (500 pb) VPTRH-L 5' ttg gct tcg ata ttt tca gta tct 3'
VPTRH-R 5' cat aac aaa cat atg ccc att tcc g 3'
Gen tdh (270 pb) VPTDH-L 5' gta aag gtc tct gac ttt tgg ac 3'
VPTDH-R 5' tgg aat aga acc ttc atc ttc acc 3'
Se recomiendan los siguientes reactivos de PCR para la detección de V. parahaemolyticus

Volumen de reacción
Reactivo
(concentración final)
H2O desionizada 28.2 µl
10× Buffer.MgCl2 5.0 µl
dNTPs 8.0 µl
Mezcla de oligos (6 oligos) 7.5 µl
Templado o molde 1.0 µl
Taq polimerasa 0.3 µl
Volumen total 50.0 µl
Se deberán usar las siguientes condiciones de PCR para la detección de V. parahaemolyticus:

Condiciones de PCR:
94 °C 3 min
Desnaturalización
94 °C 1 min
194
Alineamiento 60 °C 1 min
Extensión 72 °C 2 min
Extensión final 72 °C 3 min
Mantener 8 °C Indefinido
25 ciclos
Análisis en gel de agarosa de los productos de PCR para la detección de V. parahaemolyticus

Mezclar 10 µl de producto de PCR con 2 µl de amortiguador de carga 6X y cargar en los pocillos de
muestra del gel de agarosa 1.5 %-1.8 % sumergido en 1X TBE conteniendo 1 mg/ml de bromuro de
etidio. Después de la apropiada migración con un voltaje constante de 5 V/cm -10 V/cm, iluminar el
gel de agarosa con un transiluminador UV y visualizar las bandas en relación a la migración del
marcador de peso molecular. Tome fotografías Polaroid o digitales de los geles para documentar los
resultados. Se deben incluir tanto los controles positivos como negativos del cultivo así como
también un control de reactivo con cada corrida de PCR.
9.8.2 Detección de V. vulnificus por PCR

Partir de las plantillas obtenidas en el procedimiento para el enriquecimiento de la muestra
presuntiva de V. parahaemolyticus (9.1.3).
Los oligos iniciadores para PCR vvhA son parte del gen de citolisina de la posición 785 a la 1 303.
Los oligos a utilizar son los siguientes:
Vvh-785F 5' ccg cgg tac agg ttg gcg ca 3'
Vvh-1303R 5'cgc cac cca ctt tcg ggc c 3'
Se recomiendan los siguientes reactivos de PCR para la detección de V. vulnificus:

Volumen de reacción
Reactivo
(concentración final)
H2O desionizada 28.2 µl
10× Buffer.MgCl2 5.0 µl
dNTPs 8.0 µl
Mezcla de oligos (6 oligos) 7.5 µl
Templado o molde 1.0 µl
Taq polimerasa 0.3 µl
195
Volumen total 50.0 µl

Se deberán usar las siguientes condiciones de PCR para la detección de V. vulnificus
Condiciones de PCR:
94 °C 10 min
Desnaturalización
94 °C 1 min
Alineamiento 62 °C 1 min
Extensión 72 °C 1 min
Extensión final 72 °C 10 min
Mantener 8 °C Indefinido
25 ciclos
Análisis en gel de agarosa de los productos de PCR para la detección de V. vulnificus

Mezclar 10 µl de producto de PCR con 2 µl de amortiguador de carga 6X y cargar en los pocillos de
muestra del gel de agarosa 1.5 %-1.8 % sumergido en 1X TBE conteniendo 1 mg/ml de bromuro de
etidio. Después de la apropiada migración con un voltaje constante de 5 V/cm -10 V/cm, iluminar el
gel de agarosa con un transiluminador UV y visualizar las bandas en relación a la migración del
marcador de peso molecular. Tome fotografías Polaroid o digitales de los geles para documentar los
resultados. Se deben incluir tanto los controles positivos como negativos del cultivo así como
también un control de reactivo con cada corrida de PCR.
9.9 Confirmación por crecimiento en medio selectivo y pruebas bioquímicas para detectar V.
parahaemolyticus y V. vulnificus
Se recomienda que los caldos de enriquecimiento utilizados para el análisis de PCR también se
siembren en medio selectivo y se ensayen las pruebas bioquímicas para el aislamiento y la
confirmación directa de la presencia de V. parahaemolyticus y V. vulnificus en muestras que den
resultados positivos de PCR.
Estriar con un asa de 3 mm desde 1 cm de la parte superior de los tubos con APW con las tres
diluciones más altas de la muestra que mostraron crecimiento en TCBS (y agares mCPC o CC para
el aislamiento de V. vulnificus).
Incubar las placas de TCBS a 35 ºC ± 2 ºC (y las placas de mCPC o CC preferiblemente a 39 ºC -
40 ºC o 35 ºC -37 ºC si no es posible a 39 ºC -40 ºC) durante toda la noche.
196
El crecimiento de colonias típicas de V. parahaemolyticus en agar TCBS aparece como colonias

redondas, opacas, verde o azul, de 2 mm a 3 mm de diámetro. Colonias interferentes competitivas
de V. alginolyticus son grandes, opacas y de color amarillo. La mayoría de las cepas de V.
parahaemolyticus no crece en agar MCPC o CC. Si se produce el crecimiento, las colonias serán de
color verde-púrpura debido a la falta de fermentación celobiosa.
Purificar los aislados y almacenarlos.
La identificación bioquímica de los aislados puede ser realizada utilizando las pruebas diagnósticas
API 20E preparando una suspensión de células de los cultivos sospechosos en 2 % de NaCl (Anexo
1).
Cuando las colonias sean identificadas bioquímicamente finalmente como V. parahaemolyticus se

deberán referir a las diluciones positivas originales en el caldo de enriquecimiento y aplicar las
tablas de NMP para 3 tubos descritas en la NOM-112-SSA1-1994 para el recuento final del
organismo.

Informar resultado negativo o positivo con UFC o NMP por g o ml de muestra.

Esta norma es prácticamente una traducción y adaptación del capítulo 9 y 28 del Bacteriological
Analytical Manual (2011).

Cepa de colección de Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus y V. vulnificus.
13. Bibliografía
FDA. 2001. Capítulo 28. Detection of enterotoxigenic Vibrio cholerae in foods by the polymerase
chain reaction. Bacteriological Analytical Manual.
FDA. 2004. Capítulo 9. Vibrio. Bacteriological Analytical Manual.
197
Koch, W.H., W.L. Payne, B.A. Wentz, and T.A. Cebula. 1993. Rapid polymerase chain reaction
method for detection of Vibrio cholerae in foods. Appl. Environ. Microbiol. 59:556-560.
Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed.
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
14. Anexo
198
Tabla 1. Características bioquímicas de Vibrionaceae patogénico para el humano comúnmente encontrado en alimentos marinos.
V. alginolyticus V. cholerae V. fluvialis V. furnissii V. hollisae V. metschnikovii V. mimicus V. parahaemolyticus V. vulnificus A. hydrophilia P. shigelloides
** **
Agar TCBS Y Y Y Y NG Y G G G Y G
Agar mCPC NG P NG NG NG NG NG NG Y NG NG
Agar CC NG P NG NG NG NG NG NG Y NG NG
AGS KA Ka KK KK Ka KK KA KA KA KK nd
Oxidasa + + + + + − + + + + +
Arginina dihidrolasa − − + + − + − − − + +
Ornitina descarboxilasa + + − − − − + + + − +
Lisina descarboxilasa + + − − − + + + + V +
0 % NaCl − + − − − − + − − + +
3 % NaCl + + + + + + + + + + +
Crecimiento
6 % NaCl + − + + + + − + + + −
en (p/v):
8 % NaCl + − V + − V - + - - -
10 % NaCl + − − − − − − − − − −
Crecimiento a 42 °C + + V − nd V + + + V +
Sacarosa + + + + − + − − − V −
D-
− − + − − − − V + + −
Celobiosa
Lactosa − − − − − − − − + V −
Ácido a Arabinosa − − + + + − − + − V −
partir de: D-Manosa + + + + + + + + + V −
D-Manitol + + + + − + + + V + −
ONPG − + + + − + + − + + −
Voges-
+ V − − − + − − − + −
Proskauer
10 µg
R S R R nd S S R S R S
O/129
Sensibilidad 150 µg S S S S nd S S S S R S
a: O/129
Gelatinasa + + + + − + + + + + −
Ureasa − − − − − − − V − − −
** Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides
Abreviatyras: TCBS, tiosulfato-citrato-sales biliares -sacarosa; mCPC, celobiosa-polimixin B-colistina modificado; AGS, placa arginina-glucosa;
Y = amarillo NG = nulo o pobre crecimiento S = susceptible nd = no determinado G = verde V = variable entre las cepas R = resistente P = púrpura, V = variable ,
KK = Placa alcalina / Fondo alcalino KA = Placa alcalina /Fondo ácido, Ka = Placa alcalina / Fondo ligeramente ácido
199
CONCLUSIONES
Con la realización del presente informe correspondiente a la Demanda 6.- “Desarrollo de
normatividad y métodos para detección y medición de organismos microbiológicos en alimentos”
del proyecto CONACYT SAGARPA-2011-09-172352 “Desarrollo de materiales de referencia
certificados, validación de métodos y fortalecimiento de la infraestructura de las redes de
laboratorios para la Inocuidad y Calidad Alimentaria” se puede concluir de manera resumida lo
siguiente:
10. En el estado actual, las metodologías microbiológicas nacionales para el análisis

microbiológico de productos cárnicos, frutas, verduras y marinos, en comparación con las
internacionales, (metodologías propuestas y validadas por organismos de reconocimiento
internacional ISO, AOAC, BAM) no son concordantes en el uso de técnicas de biología
molecular, pruebas automáticas y ensayos rápidos mediante kits comerciales, pero si son
concordantes ó parcialmente concordantes, dependiendo del caso, con las metodologías
tradicionales de identificación bioquímica y medios selectivos.
11. Se expone la oferta y la demanda de proveedores de ensayos para análisis de
microorganismos patógenos de los alimentos y se proporciona el fundamento científico y la
factibilidad técnica en relación a la actualización de la normatividad nacional y su
aplicación referente a estudios microbiológicos en productos cárnicos, frutas, verduras y
marinos.
12. Se informa acerca de los programas internacionales implementados en materia de inocuidad
de los alimentos, y se sugiere su adopción en México.
13. Una vez considerado que la presentación de las normas internacionales se realiza por
patógeno y que tenemos dos dos modelos a seguir, el de los Estados Unidos de
Norteamérica y el de la Comunidad Europea. a) En el caso de seguir el modelo utilizado
por Estados Unidos de Norteamérica, se sugiere elaborar un manual con los métodos de
determinación de los patógenos en las diferentes matrices, al cual se podría hacer referencia
en las normas, lo que facilitaría y mantendría actualizados los métodos de medición sin la
necesidad de esperar los largos periodos de tiempo que implican la actualización de una
norma. Dicho manual como el presentado por CENAM en este informe podría contener los
métodos estandarizados por nuestros principales socios comerciales (en este caso Estados
Unidos de Norte América, la Comunidad Europa y Reino Unido) de tal forma que el
usuario pueda elegir el adecuado para su propósito, sin restringirlo a un kit, equipo ó
método especifico, sin embargo sería un requisito el utilizar patrones de medición ó
Materiales de Referencia Certificados con los cuales se garantice la trazabilidad,
incertidumbre y calidad del resultado de la medición realizada. b) En el caso de seguir el
modelo de la Comunidad Europea se sugiere tener una norma por patógeno para las
diferentes matrices alimentarias de interés, en lugar de tener una norma por producto para
los diferentes patógenos.
14. Considerando lo anterior, se presentan dos propuestas de norma para la evaluación,
validación y aplicación de nuevos métodos para la detección de Vibrio cholerae, Vibrio
paraemoliticus, Vibrio vulnificus y E. coli productora de shiga toxinas (STEC) en las
diferentes matrices alimentarias, tomando como base lo expuesto en el BAM de los Estados
Unidos de Norteamérica.
15. Se realizó un comparativo de normas nacionales y extranjeras de aplicación actual y un
estudio de factibilidad (en base a la consulta con las instituciones nacionales de
200
investigación, laboratorios de ensayo, laboratorios de gobierno federal y del sector

productivo que requieren u ofrecen el servicio de evaluación de la inocuidad de los
alimentos nacionales e internacionales) para introducir modificaciones en las normas
nacionales sobre la detección y/o cuantificación de microorganismos patógenos en
alimentos en sus diferentes matrices.
16. Se sugiere que las normas nacionales sean concordantes con la correspondiente sección del
BAM y con los métodos de análisis reconocidos a nivel internacional para la determinación
de los patógenos de interés requeridos para los productos exportables hacia los Estados
Unidos de Norteamérica y/o los distintos socios comerciales de México.
17. Se sugiere la implementación de pruebas interlaboratorio nacionales, tomando la
experiencia de proveedores de ensayos de análisis de microorganismos patógenos de los
alimentos internacionales.
18. Se propone trabajar en las comparaciones del recién formado grupo de trabajo de
microbiología del CCQM con el objetivo de desarrollar materiales de referencia nacionales
tomando la experiencia del proceso de desarrollo de los MRC internacionales para la
determinación de los patógenos motivo de este estudio en alimentos.
19. A continuación se propone la ruta ó cadena de trazabilidad al mol de las mediciones en
microbiología usando el procedimiento de PCR digital, el cual es considerado como
potencialmente primario.
201
BIBLIOGRAFÍA
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Salmonella isolated from apparently healthy slaughtered cattle in ethiopia. Tropical animal health
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3. Arroyo G. and Arroyo J.A. 1995. Detection of Salmonella serotypes in edible organ meats
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Del proyecto sectorial

Justificación del proyecto 8

Discusion y guía del manual integrado de la normatividad y métodos de detección y 17

de Vibrio cholerae, V. vulnificus, V. parahaemolyticus 79

Centro Nacional de Metrología

Compilado y escrito por:

Esta publicación ha sido revisada por:

®2013 por el Centro Nacional de Metrología

Primera Edición consta de 500 ejemplares

Ninguna parte de esta publicación puede ser reproducida, almacenada en un sistema o

Agradecimientos por su contribución en la elaboración del presente informe técnico

Dra. Blanca García Almendarez profesor-investigador de la Universidad Autónoma de Querétaro

Dr. Cristóbal Chaidez Quiroz

Dra. Josefina León Félix

Dr. Osvaldo López Cueva

Dra. Hilda Karina Ramírez Medina

QFB Célida Isabel Martínez Rodríguez

QFB Jesús Hector Carrillo Yáñez

Dra. Nohelia Castro del Campo

Dr. Miguel Betancourt Lozano

M.C. Leobardo Montoya Rodriguez

M.C. Jesus Efren Astorga Rodriguez

Dr. Bruno Gómez-Gil Rodríguez Salas

Dra. Sonia Araceli Soto Rodríguez

Dr. Omar Calvario Martínez

Dra. Lorena Olivia Noriega Orozco

Dra. Maribel Jiménez Edeza

M. en C. Maria Eugenia Ménez Robles

Dr. Yoshito Mitani Director General de Metrología de Materiales

Q.en A. Judith Sainz Uribe Coordinador Científico

Dra. Mariana Arce Osuna Director de Análisis Orgánico

Con el apoyo de los ayudantes de proyecto y tesistas de licenciatura:

p.IBQ Marycarmen Merino Sanchez. Instituto Tecnológico de Celaya

p.IBQ Alma Liliana Villarreal Cásares. Instituto Tecnológico de Durango

Las conclusiones y sugerencias resultado del Proyecto

1. En el estado actual, las metodologías microbiológicas nacionales para el análisis

nacionales sobre la detección y/o cuantificación de microorganismos patógenos en

1. Revisión de normas nacionales e internacionales sobre las metodologías microbiológicas

c. Algunas Propuestas adicionales. Ver propuestas en las páginas 76-197

Los entregables son:

Compendio de las normas y métodos estandarizados en México y las traducciones al

JUSTIFICACIÓN DEL PROYECTO

Tabla 1. Fecha de publicación de algunas Normas Oficiales Mexicanas para el análisis de

Normas Oficiales Mexicanas Fecha de Tiempo en años

NOM-113-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método para la 10 de mayo de 17

La LFMN en el Artículo 51-A establece que:

Para la elaboración de las normas mexicanas se realizará lo siguiente:

Tabla 2. Comparación de la fecha de revisión de las Normas para detección de microorganismos

Aplicación de Norma Oficial Comité Europeo Bacteriological British Standard

Las normas Mexicanas aplicables a la detección de microorganismos patógenos en alimentos para

La alta especificidad de la unión anticuerpo-antígeno y la versatilidad de esta reacción, ha facilitado

La inmunoprecipitación o inmunocromatografía es otro formato de anticuerpo. Es un procedimiento

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método en el que fragmentos cortos de ADN

Los métodos de detección e identificación de patógenos microbianos, basados en el ADN y en la

Esta metodología convenientemente estandarizada y con adecuados controles de calidad, tiene la

Siguiendo la tendencia de implementar metodología molecular al análisis de microorganismos

Capítulo de Vibrio (BAM, 1998).

Adicionalmente en la página oficial de la FDA se encuentra descrito, además de la metodología

Capitulo Listeria y pruebas alternativas.

Asimismo, revisando las características relevantes en la aplicación de análisis molecular de

Tabla 3. Análisis de fortalezas, oportunidades, debilidades y amenazas del análisis molecular de

microorganismo en menos de 24 horas). cuantitativos.