Arrazola Paternina Guillermo

Análisis de glucósidos cianogénicos en variedades de almendro... Guillermo Arrázola Paternina.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 2002

Consejo Superior de
Universidad de Alicante
Investigaciones Científicas
Umm
Centro de Edafología y Biología

Facultad de Ciencias
Aplicada del Segura
Departamento de Química
Departamento de Mejora y
Analítica
Patología Vegetal
Análisis de glucósidos cianogénicos

en variedades de almendro:
implicaciones en la mejora genética
Tesis Doctoral
Guillermo Arrazola Paternina
2002

ECRI
Z
~srras
UNIVERSIDAD DE ALICANTE
FACULTAD DE CIENCIAS
Departamento de Química Analítica

Apartado 99 - 03080 ALICANTE
Fax: 96 1 590 34 64
D. GUILLERMO LÓPEZ CUETO, Director del Departamento de Química Analítica

de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Alicante
CERTIFICA :
Que D. GUILLERMO ARRAZOLA PATERNINA ha realizado bajo la dirección de

los Doctores D. Nuria Grané Teruel, María Luisa Martín Carratalá y Federico
Dicenta López-Higuera, el trabajo bibliográfico y experimental correspondiente
a la obtención del Grado de Doctor sobre el tema "Análisis de glucósidos
cianogenicos en variedades de almendro: implicaciones en la mejora genética"
Alicante, Enero 2002
Fdo . D . Guillermo López Cueto.

.
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0
UNIVERSIDAD DE ALICANTE
FACULTAD DE CIENCIAS
Departamento de Química Analítica

Apartado 99 -03080 ALICANTE
Fax: 96 1 590 34 64
Los Doctores Federico Dicenta López-Higuera, Nuria Grane Teruel y María Luisa
Martín Carratalá certificamos que D . GUILLERMO ARRAZOLA PATERNINA ha
llevado a cabo bajo nuestra dirección el trabajo bibliográfico y experimental
para la obtención del grado de Doctor sobre el tema "Análisis de glucósidos
cionogenicos en variedades de almendro : implicaciones en la mejora genética ."
Alicante, Enero de 2002
Federico Dicenta López-Higuera Ñu la Grane Teruel
María Luisa Martín Carratalá

A Sixty mi esposa
Melissa, Oriana y Jonathan
A mis queridos padres y hermanos

Estoy persuadido á que esta especie (el almendro amargo)

está menos distante de su origen que los almendros dulces .
Si nos referimos á lo que dicen los viajeros, solo hablan
de almendros de frutos amargos ; _y los mismos Romanos antes
del tiempo de Caton no conocían otro, .y se gloriáron en
delante de haber hecho desaparecer la amargura de su fruto,
segun explica Plinio .
Diccionario Universal de Agricultura .

Escrito en francés por una sociedad de agrónomos
y ordenado por el Abate Rozier
Madrid, en la Imprenta Real, Año de 1798 .

Índice general
Pág.
1 . Introducción . 1
1 .1 . El almendro. 3
1 .1 .1 . Clasificación taxonómica y origen . 3
1 .1 .2 . Importancia económica . 5
1 .1 .3. Composición química de la almendra. 6
1 .1 .4. Utilización industrial de la almendra. 10
1 .1 .5. Consideraciones sobre el sabor amargo de la almendra 12
en la mejora genética .
1 .2 . Los compuestos cianogénicos . 14
1 .2 .1 . Naturaleza química . 14
1 .2.1 .1 . Tipos de compuestos cianogénicos . 16
1 .2.1 .2. Biosíntesis . 18
1 .2.1 .3 . Hidrólisis. 22
1 .2 .2 . Presencia y función en la naturaleza . 25
1 .2.2.1 . Presenci a en el reino vegetal . 25
1 .2.2.2. Presenci a en hongos y bacterias . 25
1 .2.2.3. Presenci a en animales. 28
1 .2.2.4. Función de los compuestos. 28
1 .2.2.5. Toxicidad . 30
1 .2 .3 . Métodos analíticos de determinación . 31
1 .2.3.1 . Microdifusión . 32
1 .2.3.2. Técnicas cromatográficas . 34
1 .2.3.3. Otras técnicas de análisis. 36
1 .3 . Objetivos del trabajo . 37
2. Material vegetal . 39
2 .1 . Variedades estudiadas . 41
2 .1 .1 . Variedades españolas . 42
2 .1 .2 . Variedades francesas . 44
2 .1 .3. Variedades italianas . 44
2 .1 .4 . Variedades americanas . 45
2 .1 .5. Otras variedades . 45
2 .2 . Descendientes estudiados. 46

3 . Puesta a punto de métodos analíticos .

3 .1 . Introducción . 49
3 .2 . Material y métodos. 54
3.2.1 . Toma, acondicionamiento y conservación de la
54
muestra.
3.2.2. Preparación de las muestras. 56
3.2.3. Puesta a punto de la determinación de glucósidos
58
cianogénicos por HPLC .
3.2.3.1 . Extracció n de los glucósidos cianogénicos. 58
3.2.3.2 . Determinación de los glucósidos cianogénicos 59
por HPLC.
3 .2 .4 . Puesta a punto del método de microdifusión. 60
3 .2.4.1 . Hidrólisi s y microdifusión. 61
3 .2 .4.2. Determinació n colorimétrica . 62
3 .2 .4 .3. Determinació n por valoración gravimétrica . 63
3.2 .5 . Comparación de métodos analíticos . 64
3 .3. Resultados y discusión . 65
3.3.1 . Conservación de la muestra por liofilización . 65
3.3.2 . Optimización de la preparación de la muestra
66
para su análisis.
3.3.3. Determinación de glucósidos cianogénicos por HPLC 69
3 .3 .3.1 . Extracció n de los glucósidos cianogénicos. 69
3.3 .3 .2 . Condicione s cromatográficas . 74
3.3.3 .3. Determinació n cuantitativa. 75
3.3.4. Determinación de glucósidos cianogénicos por
77
microdifusión .
3.3 .4 .1 . Hidrólisi s y microdifusión . 77
3.3.4 .2 . Determinació n colorimétrica . 79
3.3 .4 .3. Determinació n de cianuro por valoración 80
gravimétrica .
3.3.5. Comparación de métodos. 81
3.4 . Conclusiones. 85
4. Variabilidad del contenido de amigdalina en variedades

.. .
almendra .
4 .1 . Introducción . 89
4 .3. Resultados y discusión . 92
4 .4. Conclusiones . 103

5 . Herencia del contenido de amigdalina en una descendencia de 5

almendro .
5 .1 . Introducción. 107
5.3. Resultados y discusión . 109
6 . Evolución del contenido de amigdalina y prunasina durante

9
desarrollo de la almendra .
6.1 . Introducción . 121
6.2 . Material y métodos. 124
6.3 . Resultados y discusión . 125
7. Influencia del polinizador en el contenido de amigdalina de la

almendra .
7.1 . Introducción . 143
7.2 . Material y métodos. 144
7.3 . Resultados y discusión . 146
8. Conclusiones generales. 155
9. Bibliografía . 159
10. Anexos . 177


Índice de tablas
Pág.
Capítulo 1
1 .1 Compuestos cianogénicos descritos y referencia bibliográfica . 17
1 .2 Plantas superiores con glucósidos cianogénicos descritas por
Eyjólfsson (1968) . 26
1 .3 Plantas de importancia económica con capacidad cianogénica
descritas por Jones (1998) . 27
1 .4 Defensa frente a depredadores de algunas plantas, atribuida a su
capacidad cianogénica . 29
Capítulo 3
3 .1 Análisis de muestras de almendra variedad Garrigues trituradas y
congeladas con nitrógeno líquido antes de su liofilización y con
grasa o desengrasadas antes del análisis por HPLC y por
microdifusión . 67
3 .2 Contenido cianuro (mg/100g de muestra seca) de almendras de la
variedad Garrigues trituradas antes o después de la liofilización,
determinado mediante HPLC y microdifusión 68
3 .3 Resultados de extracción con diferentes extractantes . 69
3 .4 Valores medios porcentuales de amigdalina y desviación estándar
obtenidos para tres extractos sucesivos. 73
3 .5 Reproducibilidad del método cromatográfico a dos niveles de
concentración . 76
3 .6 Análisis por microdifusión de muestra de la variedad Garrigues con
y sin adición de enzima R-glucosidasa externa . 77
3 .7 Porcentaje de recuperación en el tiempo (horas) del patrón de KCN
de 1 ppm a diferentes temperaturas . 78
3 .8 Reproducibilidad del método colorimétrico a dos niveles de
concentración . 79
3 .9 Reproducibilidad del método de valoración gravimétrica en una
muestra de almendra amarga (S3108). 80
3 .10 Valores medios de contenido de cianuro y desviaciones estándar
obtenidos mediante HPLC (calculados como cianuro equivalente a
amigdalina) y obtenidos mediante microdifusión tanto seguida por
colorimetría como por valoración gravimétrica . Coeficientes de
correlación de Pearson y significación de los mismos . 81

3.11 Parámetros calculados relacionados con el ajuste a los modelos de

regresión propuestos para los dos conjuntos de muestras
estudiados. 82
3.12 Valores de los estimadores calculados para los modelos de
regresión propuestos . 83
Capítulo 4
4.1 Análisis de la varianza del contenido de amigdalina entre
variedades y años, para la totalidad de las variedades estudiadas . 92
4.2 Análisis de la varianza del contenido de amigdalina entre
variedades y años, para las variedades dulces y ligeramente
amargas . 98
Capítulo 5
5.1 Análisis de la varianza de los contenidos de amigdalina obtenidos
para el conjunto de descendientes de Garrigues x Tuono
clasificados según su sabor y año de cosecha. 110
Capítulo 7
7.1 Análisis de varianza del contenido de amigdalina de las almendras
obtenidas mediante cruzamientos entre variedades dulces,
ligeramente amargas y amargas . 146
7.2 Análisis de varianza del contenido de amigdalina de almendras de
la variedad Del Cid polinizada con cuatro variedades de diferente
sabor y genotipo . 148
la variedad Marcona polinizada con cuatro variedades de diferente
7 .4 Análisis de varianza del contenido de amigdalina de almendras de
la variedad Garrigues polinizada con cuatro variedades de diferente
la variedad S3067 polinizada con cuatro variedades de diferente
7.6 Porcentaje de embriones dd "amargos" esperados en los
cruzamientos realizados . 152

Índice de figuras .
Pag.
Capítulo 1
1 .1 Producción de almendra-grano de los principales países
productores en las últimas ocho campañas . 5
1 .2 Producción de almendra-grano de las principales Comunidades
Autónomas. 6
1 .3 Principales componentes nutritivos de la almendra. 7
1 .4 Estructura general de un glucósido cianogénico . 15
1 .5 Estructura química de la amigdalina y la prunasina. 16
1 .6 Estructura de algunos compuestos cianogénicos. 19
1 .7 Etapas de la biosíntesis de los glucósidos cianogénicos . 21
1 .8 Etapas de la hidrólisis de los glucósidos cianogenicos. 23
1 .9 Etapas de la hidrólisis enzimática de la amigdalina . 24
1 .10 Dispositivo para medición del ácido cianhídrico con papel picrato . 34
Capítulo 3
3.1 Esquema del acondicionamiento de muestras de almendras para su
conservación . 56
3 .2 Pérdida de humedad durante el liofilizado de una muestra de
almendra de Garrigues en función del tiempo de liofilizado, tipo de
congelación previa y tamaño de partícula de la muestra. 65
3 .3 Variación del contenido de amigdalina expresado como mg de
cianuro/100g muestra seca extraída con metano¡ 100%, en función
del tiempo de extracción . 71
3 .4 Variación del contenido de amigdalina, prunasina y cianuro total
expresado como mg de cianuro/100g muestra seca utilizando el
sistema extractante metanol :agua (80:20), en función del tiempo de
extracción . 71
3 .5 Estabilidad del extracto obtenido con metano¡ 100% y con
metanol:agua (80 :20) expresado en mg de cianuro/100g muestra
seca . Comparación con el contenido obtenido por microdifusión. 73
3.6 Cromatograma de una mezcla patrón de amigdalina y prunasina. 75
3 .7 Esquema del equipo utilizado para la determinación de cianuro por
microdifusión . 78
3 .8 Valores medios de contenido de cianuro obtenidos a partir de la
aplicación de los métodos de HPLC y microdifusión con
determinación colorimétrica junto con el modelo de regresión lineal
propuesto. 84
3 .9 Valores medios de contenido de cianuro obtenidos a partir de la
aplicación de los métodos de HPLC y microdifusión con
determinación con valoración gravimétrica junto con el modelo de
regresión lineal propuesto . 84

Capítulo 4
4.1 Subconjuntos de varianza homogénea respecto al contenido de
amigdalina para la totalidad de las variedades estudiadas en 1997 93
amigdalina para la totalidad de las variedades estudiadas en 1998. 94
amigdalina para la totalidad de las variedades estudiadas en 1997 y
1998, conjuntamente. 95
amigdalina para las variedades dulces y ligeramente amargas
estudiadas en 1997 . 99
4 .5 Subconjuntos de varianza homogénea respecto al contenido de
estudiadas en 1998. 100
estudiadas en 1997 y 1998, conjuntamente . 101
Capítulo 5
5 .1 Valores medios de amigdalina de los descendientes
correspondientes a los dos años de estudio conjuntamente, en
función de su sabor dulce, ligeramente amargo o amargo . 110
5 .2 Valores medios de amigdalina de los descendientes dulces
correspondientes a los dos años de estudio conjuntamente . 112
5.3 Valores medios de amigdalina de los descendientes ligeramente
amargos correspondientes a los dos años de estudio
conjuntamente . 113
5 .4 Valores medios de amigdalina de los descendientes amargos
correspondientes a los dos años de estudio conjuntamente . 113
Capítulo 6
6 .1 Curvas de crecimiento de los distintos componentes del fruto según
Kester (1976) . 122
6 .2 Variación del la humedad relativa (%) de la almendra a lo largo de
la maduracion, determinada a partir de los valores obtenidos de las
variedades amargas, en 1998 . 125
6.3 Evolución del contenido de cianuro calculado a partir de las
concentraciones de amigdalina y prunasina determinadas mediante
HPLC para muestras amargas por cada 100 g de peso seco y peso
fresco, a lo largo del periodo de desarrollo de la almendra. 126

6.4 Variación del contenido de cianuro calculado a partir del contenido

de amigdalina (HPLC) y mediante microdifusión en almendras
dulces (Marcona, Del Cid, Peraleja, Ferragnès y Atocha) recogidas
en 1998. 127
6.5 Evolución del contenido de cianuro calculado a partir del contenido
de amigdalina y prunasina (HPLC) y mediante microdifusión en
almendras ligeramente amargas (S3065, Garrigues, Tuono y
Genco). 127
6.6 Evolución del contenido de cianuro calculado a partir del contenido
de amigdalina y prunasina (HPLC) y mediante microdifusión en
almendras amargas (S3056, S3062 y S3067) . 128
6.7 Porcentaje del cianuro total debido a la amigdalina y a la prunasina
(determinadas con HPLC) durante el desarrollo de la almendra para
muestras amargas . 129
6.8 Porcentaje del cianuro total debido a la amigdalina y a la prunasina
(determinadas con HPLC) durante el desarrollo de la almendra para
muestras ligeramente amargas . 130
6 .9 Evolución del contenido de cianuro real (calculado a partir de las
concentraciones de amigdalina y prunasina obtenidas por HPLC) y
del contenido estimado por el modelo propuesto, para la variedad
amarga S3056. 134
6.10 Evolución del contenido de cianuro real (calculado a partir de las
amarga S3062. 134
amarga S3067 . 135
ligeramente amarga S3065. 135
Garrigues. 136
Genco . 136
Tuono. 137


Marcona . 137
Del Cid . 138
Ferragnès. 138
Peraleja . 139
Atocha . 139
Capítulo 7
7.1 Valores medios de amigdalina de cada madre polinizada con padres
de diferente sabor y genotipo . 147
7.2 Valores medios de amigdalina de las semillas de las cuatro madres
conjuntamente, al ser polinizadas con cada uno de los padres
indicados en la figura . 147
7 .3 Contenido de amigdalina de las almendras, para cada cruzamiento
realizado con la variedad Del Cid como madre en combinación los
cuatro padres indicados, de diferente sabor y genotipo . 150
7.4 Contenido de amigdalina de las almendras, para cada cruzamiento
realizado con la variedad Marcona como madre en combinación con
los cuatro padres indicados, de diferente sabor y genotipo . 150
realizado con la variedad Garrigues como madre en combinación
con los cuatro padres indicados, de diferente sabor y genotipo . 151
realizado con la variedad S3067 como madre en combinación con
los cuatro padres indicados, de diferente sabor y genotipo . 151

1 . INTRODUCCIÓN


Introducción / 3
1 . INTRODUCCIÓN
1 .1 . EL ALMENDRO
El almendro, Prunus dulcis Miller, es una especie con una gran

variabilidad genética . El árbol tiene una raíz pivotante y su porte es muy
variable, desde el tipo llorón de Desmayo Largueta, hasta portes muy erectos
como el de la variedad Atocha . Las hojas son planas, estrechas y alargadas .
Las flores son hermafroditas, generalmente con cinco sépalos, cinco pétalos,
un número de estambres variable y un único ovario .
El fruto es una drupa, con su parte exterior formada por el pericarpio y el

mesocarpo (pelarza). En la madurez el mesocarpo se separa del endocarpo
(cáscara), dentro del cual se encuentra la semilla, la almendra (parte comercial
del fruto) . La semilla es rica en aceite, proteínas y sales minerales, y puede ser
única o doble según las variedades .
1 .1 .1 . Clasificación taxonómica y origen .
Existen diferentes hipótesis sobre el origen de almendro, que se ponen

de manifiesto en las distintas clasificaciones taxonómicas . Su primera
denominación, Amygdalus communis, se debe a Linnaeaus (1753) . En 1768,
Miller utiliza la denominación Prunus dulcis para identificar el almendro dulce
cultivado (Webb 1967) . Posteriormente la especie fue designada Prunus
amygdalus por Batsch (1801), designación ampliamente aceptada por diversos
autores, y Prunus communis por Archangeli (1882) . En 1964, el General
Committee of Botanical Nomenclature of the International Botanical Congress
(Punt 1964), asignó al almendro dulce cultivado el nombre de Prunus dulcis
(Miller), aceptando como sinónimos Prunus amygdalus Batch y Prunus
communis Archangeli . A pesar de ello, posteriormente algunos autores han
seguido utilizando otras denominaciones .

4 / Introducción
Si se aceptan las clasificaciones de Schneider (1904), Rehder (1947) y
otros, que la engloban en el género Prunus, subgénero Amygdalus, debe
adoptarse la denominación Prunus dulcis Miller . Si se sigue la clasificación de
Spach (1843), que considera Amygdalus como género, resulta adecuado el
nombre Amygdalus communis, aceptado también por los investigadores de la
escuela rusa (Vavilov 1930, Serafimov 1971, Richter 1962, Browicz 1974) y por
los mismos Grasselly y Crossa-Raynaud (1980).
Kester y col. (1990) aceptaron la pertenencia del almendro al género
Prunus, la denominación Prunus dulcis para el almendro cultivado y el nombre

Prunus communis para la antigua especie silvestre de la que derivaría la
actualmente cultivada .
Actualmente se admite que Prunus communis es el resultado de

hibridaciones naturales en las que han intervenido varías especies silvestres
(Prunus bucharica, Prunus ténzliana y Prunus kuramica) que todavía existen en

el centro y sudoeste de Asia (Vavilov 1930, Wilsie 1966, Grasselly y Crossa-
Raynaud 1980). Todas ellas poseen almendras amargas, si bien se han
encontrado algunos tipos con semillas dulces.
La multiplicación por semilla tras cruzamientos espontáneos, dio lugar a
nuevas formas todavía silvestres que, después de las etapas de cultivo en
zonas más alejadas de su centro de origen, han permitido la expansión
geográfica y diversificación biológica de la especie Prunus communis, sometida
no sólo a la selección natural, sino también a la ejercida por los cultivadores .
Este proceso, mantenido durante siglos, ha propiciado la aparición de diversas
poblaciones geográficas o ecotipos que, pese a la multiplicación por semilla,
conservan características comunes .
A mediados del siglo XIX, cuando se generaliza la práctica del injerto en

los países mediterráneos y en California, se produce la estabilización del
material vegetal, multiplicándose numerosas variedades locales. Muchas de

Introducción / 5
ellas han llegado hasta nosotros y han constituido el material de partida para
los diferentes programas de mejora sobre la especie, que se inician durante la
segunda mitad del siglo XX en diversos países.
1 .1 .2 . Importancia económica .
La Figura 1 .1 muestra la producción de almendra-grano de las últimas

ocho campañas de los principales países productores de almendra del mundo.
Destaca claramente la producción de Estados Unidos (concentrada
principalmente en California) que representa cerca del 73% de la producción
mundial . España, segundo país productor, con cerca del 15%, se aleja
bastante de EEUU. En comparación con EEUU y España la aportación del
resto de los países a la producción mundial es muy pequeña .
500-
450-i
40 :
350-
0
0
0 300-
x
0 250 ,,
cm
m 200+
-0
150-
E
m
0 100-
E Milk
50-
0,
93-94 94-95 95-96 96-97 97-98 98-99 99-00 00-01
" Grecia " Turquía " Italia OEspaña I]EEUU
Figura 1 .1 . Producción de almendra-grano de los principales países productores en las últimas

ocho campañas. Fuente : International Nut Council (2001) .

6 / Introducción
En la Figura 1 .2 se ha representado la producción de almendra-grano

acumulada entre 1994 y 2000 de las principales Comunidades productoras
españolas. Vemos cómo las Comunidades de Andalucía, Valencia y Murcia
destacan sobre el resto de Comunidades .
50
0
°0 40
0
c
m
30
c
0
E
20
a
E
H
10
IMP
Valencia Murcia Andalucía Cataluña Aragón C . Mancha Baleares Resto
094-95 1395-96 " 96-97 ® 97-98 1398-99 " 99-00
Figura 1 .2. Producción de almendra-grano de las principales Comunidades Autónomas

productoras . Fuente : Confederación de Cooperativas Agrarias (2001) .
1 .1 .3. Composición química de la almendra .
El conocimiento de la composición química de la almendra permite tener

información sobre el valor alimenticio o nutritivo y de las posibles aplicaciones
industriales de ésta (Saura y col. 1988).
Las principales fracciones que encontramos en la almendra son :

fracción proteica, fracción lipídica, azúcares solubles, fracción mineral y
fracción fibrosa . Aunque la composición varía en función de las variedades y
del tipo de cultivo (Prats 2000), en la Figura 1 .3 se muestran los valores
medios de los componentes principales de la almendra.

Introducción / 7
Proteinas
22 .6%
Agua
4.5%
Cenizas 3.2% .
Elementos minerales
2.5%
Grasa
59 .8% \ Carbohidratos
7.4%
Figura 1 .3 . Principales componentes nutritivos de la almendra
A. Fracción lipídica
Los lípidos suponen más del 50% del peso de la semilla, haciendo de la
almendra un alimento energético excelente, sin aporte de colesterol, ya que en
su composición predominan los ácidos grasos insaturados, Martín y col 1998,
García y col 1999, Grané y col 2001)
Los triglicéridos superan el 95% del total de la fracción, siendo el oleico

y el linoleico los ácidos grasos mayoritarios (Martín y col 1999) . Por el
contrario los contenidos en fosfolípidos, glicolípidos y materia insaponificable
no suelen alcanzar el 2% del contenido de lípidos totales de las semillas
(Canellas 1986, Saura y col. 1988) .
El contenido en grasa tiene un gran interés en nuestro país para la

industria elaboradora de turrón y mazapán, ya que la legislación determina el
contenido mínimo de grasa que deben tener cada una de las diferentes
elaboraciones . El contenido mínimo recomendable de grasa en la almendra
oscila entre 53.3% y 56 .5% (Riquelme y col. 1982) .

8 I Introducción
B . Fracción proteica
La fracción proteica de la almendra oscila entre 18 .4 y 29.84% según la

variedad (Casares y López Herrera 1952) .
Entre las proteínas predominan las globulinas, que suponen un 73 .61
del contenido proteico total . Las albúminas representan el 21 .13% del total, y
en menor proporción se encuentran las glutelinas y prolaminas con el 3.63% y
1 .57% respectivamente . Esta distribución presenta un gran interés para su uso

por la industria alimentaria y farmacéutica, ya que al ser las fracciones de
albúmina y globulinas solubles en agua, los procesos de extracción y

purificación no exigen tecnologías complejas .
El contenido de aminoácidos libres en la almendra es muy bajo y sólo
suponen el 1 % de los totales, siendo glutámico, aspártico (incluyendo

glutamina y asparagina) y arginina los que se encuentran en mayor proporción
(Saura y col. 1988, Serán y col 1998, Grané y col 1999)
C . Hidratos de carbono
Los frutos secos se caracterizan por presentar contenidos bajos en
azúcares solubles. Así, la almendra tiene un contenido de azúcar entre el 2 y

el 7% . En los frutos maduros, carece o presenta contenidos muy bajos de
azúcares reductores, aunque en estadios de maduración incompleta el
contenido de azúcares totales es mucho más elevado y la presencia de
azúcares reductores es mayor.
La distribución de los hidratos de carbono presentes en la almendra es:
84-91 % sacarosa, 5-12% rafinosa, 0.9-1 .9% inositol y trazas de sorbitol,

glucosa y fructosa .

Introducción / 9
D . Fracción mineral
La composición mineral de la almendra presenta una gran variabilidad

en función de las condiciones de cultivo, composición del suelo, factores
ambientales y aportes nutritivos .
En cuanto a los macronutrientes, el potasio es el elemento mayoritario

con valores que oscilan entre 600 y 1000 mg/100 g de materia seca según la
variedad . El fósforo es el segundo elemento cuantitativamente más importante
con valores que rondan los 600 mg/100 g de materia seca . El calcio y el
magnesio le siguen en importancia cuantitativa, ambos presentando valores
próximos entre sí, que oscilan entre 250 y 300 mg/100 g de materia seca .
Finalmente el azufre, presente en las cenizas en forma de sulfato, se
encuentra así mismo en cantidades elevadas que oscilan entre 96 y 164
mg/100 g de materia seca (Saura y col. 1988) .
Entre los micronutrientes, son el sodio y el cloro los que se presentan en

mayor proporción, con 10 .8 y 14 .0 mg/100 g de materia seca respectivamente.
El hierro y el zinc son los siguientes en importancia con valores que oscilan
entre 4 .7 y 3.2 mg/100 g . A continuación cobre y manganeso con valores entre
1 .0 y 1 .9 mg/100 g y finalmente el boro, presente en las cenizas en forma de
borato con valores en torno a 0 .2 mg/100 g de materia seca (Saura y col.
1988) .
E. Fracción fibrosa
El estudio de la fracción fibrosa es de gran interés debido a sus efectos

beneficiosos sobre la salud humana . Los contenidos medios de fibra oscilan
entre 2 .16% (Casares y López Herrera 1952) y 2.62% (Romojaro 1977) .
La fibra cruda es el residuo que queda al someter el producto

desengrasado a la acción sucesiva de un ácido y un álcali diluidos a ebullición,
según el método de Weende (sistema de análisis del Centro de investigación
Weende de Alemania). Dicha fibra cruda contiene básicamente celulosa,

10 / Introducción
lignina y hemicelulosa. La fibra neutro-detergente se obtiene por tratamiento

con una disolución neutra detergente que da lugar a dos fracciones, una con
los componentes solubles y nutritivamente utilizables y otra con los
componentes de la pared celular, básicamente celulosa, hemicelulosa y lignina
(Saura y col. 1988) .
En la almendra los niveles de fibra neutro-detergente son superiores a

los de fibra cruda, oscilando entre 4 .63% y 4 .92% . El fraccionamiento de sus
diferentes componentes muestra altos contenidos de hemicelulosa y celulosa,
y bajos de lignina . Esta composición le confiere a la fibra de la almendra un
interés nutricional, ya que el bajo contenido en lignina asegura un elevado
aprovechamiento alimenticio (Saura y col. 1988) .
F. Otros compuestos
Una característica importante en las almendras amargas es la presencia

del glucósido amigdalina, responsable del sabor amargo, cuya proporción en el
grano es del 2 al 4%, (Ibar, 1985) . Por acción del enzima emulsina, la
amigdalina se desdobla en dos moléculas de glucosa, una de benzaldehído y
una de ácido cianhídrico .
1 .1 .4. Utilización industrial de la almendra .
Las almendras, sean dulces o amargas, tienen diferentes usos

industriales tanto en alimentación como en el sector farmacéutico y cosmético .
El uso principal de la almendra dulce es la alimentación humana, ya sea sola o
formando parte de otros productos (Bainbridge 1996).
Almendras enteras: La almendra es el ingrediente fundamental de

numerosos productos. Las almendras tostadas ocupan un primer lugar entre
los frutos secos utilizados como aperitivo . Las peladillas se elaboran con
almendras tostadas que se recubren uniformemente de una delgada capa de

Introducción / 1 1
azúcar. Las almendras garapiñadas son almendras tostadas y cubiertas de

azúcar.
Bebidas: En estos momentos la industria láctea esta tratando de

introducir en el mercado preparados de almendras liofilizados en diferentes
presentaciones, que están teniendo muy buena aceptación entre los
consumidores de productos naturales . Además son consumidas como jarabes,
horchatas, leches, concentrados y en yogures . Algunos licores, como el
Amaretti italiano, presentan un característico sabor a almendras amargas .
Postres navideños (turrón, mazapán): En los países mediterráneos, en

los postres navideños como el turrón y el mazapán, las almendras son el
ingrediente principal llegando a representar entre un 55-60% del producto .
Elaboración de dulces: En repostería se utilizan grandes cantidades de

almendras, que junto con el azúcar, la miel y la harina, constituyen los
principales ingredientes de numerosos pasteles . También se utilizan extractos
de almendras para agregar a productos de pastelería.
Cosmética : El aceite de almendra es muy utilizado en la industria

cosmética y sirve de base para humectantes, lociones, perfumes y emulgentes
de uso dermatológico como champú, jabones y cremas (Schwarz 1940, Fisher
1983).
Otros usos: Sus ácidos grasos se utilizan para la producción de

margarina y aceite comestible, obtenidos a partir de almendras amargas previa
eliminación del ácido cianhídrico (Abd El-Aal y col. 1987) . Las almendras
también se utilizan como ingredientes en cremas de helados blandos y en
diversos platos de cocina, como el italiano "Caponata" de almendra y pescado .
Los ácidos grasos de la almendra se utilizan como preventivo de

aglomeración y conservante externo en los aperitivos extruídos (Kobayashi y
Hisamatsu 1978) .

1 2 / Introducción
Finalmente, en la industria de piensos se aprovecha el tegumento y

parte de las cáscaras para obtener suplementos que contengan fibra,
carbohidratos, minerales y vitaminas (Bath 1983, Aguilar y col. 1984, Saura-
Calixto y Cañellas 1988) .
1 .1 .5. Consideraciones sobre el sabor amargo de la almendra en la mejora

genética.
Dado que la semilla del almendro es la parte comercial del cultivo, los
árboles con semillas amargas han sido tradicionalmente descartados por los
agricultores, y más recientemente por los investigadores en los programas de
mejora . Consecuencia de este proceso selectivo, ha sido la disminución
progresiva de genotipos amargos .
El sabor amargo de la semilla del almendro se debe al glucósido

amigdalina (McCarty y col. 1952, Conn 1980, Polesello y Rizzolo 1989, Frehner
y col. 1990) . Diversos estudios han demostrado que el sabor dulce o amargo
de la almendra es un carácter monogénico, siendo el amargo el homocigoto
recesivo (Heppner 1923, Heppner 1926, Dicenta y García 1993, Vargas y col.
1999) . El caso de los heterocigóticos no está completamente claro, ya que
unos son dulces y otros ligeramente amargos .
Teniendo en cuenta que tanto los genes paternos como los maternos
contribuyen a la formación genética de la semilla, cabría esperar que un árbol
pudiera dar lugar a almendras con diferentes niveles de amargor, dependiendo
del genotipo del polinizador . Así, algunos autores indicaron que un árbol de
almendra dulce puede dar frutos amargos cuando se poliniza con polen de
árboles amargos (Crane y Lawrence 1952, Simms 1996).

Introducción / 13
Sin embargo, se ha demostrado que el sabor dulce o amargo de la
almendra es una característica de la variedad y no está influenciado por el tipo

de polen que polinizó la flor (Dicenta y col. 2000). Esto es lógico ya que la
amigdalina no es producida en la semilla, sino que es transportada desde la
planta madre, que es la que tiene el "genotipo amargo" (Frehner y col. 1990).
Una gran parte de las variedades que son utilizadas en los programas
de mejora como genitores son heterocigóticas respecto al sabor amargo, de
manera que cuando dos de ellas se cruzan, el 25% de los descendientes serán
amargos y en consecuencia eliminados del proceso selectivo . Ello supone una
pérdida de esfuerzos y una disminución de la eficiencia del proceso de mejora .
Por ello, determinado el modo de herencia, el conocimiento previo del genotipo
de los genitores es fundamental para evitar los individuos amargos. Dado que
muchos de los heterocigóticos son completamente dulces, hasta la fecha la
única manera de determinar el genotipo es realizando previamente
cruzamientos de prueba.
Por otro lado, ocasionalmente se han utilizado determinados genitores

amargos, interesantes por otros caracteres. Tal es el caso de especies
silvestres como Prunus webbïi, que han sido utilizadas en programas de
mejora americanos por su autocompatibilidad y resistencia a plagas y
enfermedades (Ledbetter y col. 2000, Gradziel y col. 2001) . En estos casos, la
utilización del otro genitor homocigótico dulce, garantiza el sabor dulce en el
100% de los descendientes . Algunos genotipos amargos han sido
seleccionados por su resistencia a enfermedades (Kochba y Spiegel-Roy 1976)
o por su elevada productividad (Spiegel-Roy y Weinbaum 1985).
Algunos trabajos parecen mostrar una relación entre la presencia del

glucósido cianogénico prunasina en raíces y la resistencia al gusano cabezudo
(Capnodis tenebrionis L .) (Malagón y col. 1990). Si el amargor de la semilla
estuviera relacionado con un elevado contenido en prunasina en la parte
vegetativa, la selección de estos árboles sería fácil, simplemente determinando
el sabor de las almendras .

14 / Introducción
Finalmente, las semillas amargas han sido tradicionalmente utilizadas

para la obtención de patrones sobre los que injertar las variedades . A estos
patrones se les atribuye diversas cualidades (mayor vigor, resistencia a plagas
y enfermedades) . Otras razones que justifican su uso como fuente de patrones
son que no tienen otra utilidad importante para el hombre y que no son
comidas por mamíferos y roedores en el vivero.
1 .2. LOS COMPUESTOS CIANOGÉNICOS
Los compuestos cianogénicos son compuestos químicos que tienen la

capacidad de producir ácido cianhídrico en condiciones determinadas y en
presencia de enzimas específicos . Este proceso se conoce como cianogenesis
(Bennet 1968) .
Los compuestos cianogénicos son producidos por numerosas especies,

principalmente vegetales, habiendo sido descritos en más de 1000 especies
pertenecientes a unas 80 familias (Conn 1979, Jones 1998).
1 .2 .1 . Naturaleza química
Hay dos tipos principales de compuestos cianogénicos : glucósidos y

lípidos cianogénicos, ambos derivados de los a-hidroxinitrilos . La diferencia
principal entre un glucósido y un lípido cianogénico es que este último lleva
unido un grupo carboxilo . Dado que los compuestos cianogénicos de la
almendra, amigdalina y prunasina, son glucósidos, en adelante centraremos
nuestra atención en este tipo de compuestos .
Los primeros estudios sobre glucósidos cianogénicos se deben a

Schrader (1803), Robiquet y Boutron-Charlard (1830) y Dillimann (1958),
quienes trabajaron con almendras amargas . Desde entonces se han ido
identificando otros compuestos cianogénicos, como componentes secundarios
del metabolismo tanto vegetal como animal .

Introducción / 15
La estructura general de un glucósido cianogénico es un azúcar D-P-
glucosa, unido por un enlace O-R-glucosídico a una aglicona (Figura 1 .4). En
algunos casos, entre los que se cuenta la amigdalina, un segundo azúcar se

une al C6 de la glucosa mediante un enlace O-P-glucosídico . Este enlace
estabiliza el grupo nitrilo cuando es hidrolizado por P-glucosidasa. El glucósido
resultante puede ser a o (3, dependiendo del enzima específico que catalice la
reacción (Belitz y col. 1988, Guardiola 1990).
Rz 0- R- Azúcar
R, CN
Figura 1 .4. Estructura general de un glucósido cianogénico .
Conn (1969, 1980) y Vetter (2000) realizaron una revisión sobre diversos
aspectos de la cianogánesis, donde se detalla la estructura de numerosos
glucósidos, su distribución, los mecanismos de biosíntesis y su transporte en la
planta . También estudiaron su papel en los procesos fisiológicos y su función
como mecanismo de defensa de las plantas, así como sus efectos en animales
y en el organismo humano .
Las almendras, principalmente las amargas, contienen amigdalina en

una proporción variable dependiendo de la variedad . Como veremos
posteriormente, al hidrolizarse la amigdalina en presencia de la enzima

emulsina se desdobla en dos moléculas de glucosa (que representa el 71% de
la molécula) y una de benzaldehído cianhídrina, que a su vez se desdobla en
una molécula de benzaldehído (que constituye el 23%) y una de ácido
cianhídrico (que supone el 6%) (¡bar 1985) .

1 6 / Introducción
1 .2.1 .1 . Tipos de compuestos cianogénicos
El primer glucósido cianogénico estudiado fue la amigdalina, extraída a

partir de almendras amargas (Robiquet y Boutron-Charland 1830). Desde
entonces han sido descritos numerosos glucósidos cianogénicos (Tabla 1 .1).
Según Eyjólfsson (1969), los glucósidos cianogénicos se clasifican en cuatro
grupos en función de la estructura química de la aglicona .
1 . Glucósidos derivados de la 2-hidroxi-2-fenilalanina o derivados de

ésta . Se trata de compuestos que tienen sustituyentes o grupos
hidroxi o alquilo en el anillo aromático, como es el caso de la
amigdalina .
2. Glucósidos derivados de las agliconas alifáticas saturadas.
3. Glucósidos con la aglicona que contiene un doble enlace en

posición a o (3 al grupo nitrilo .
4. Glucósidos con la aglicona alicíclica insaturada, como por ejemplo

la ginocardina .
Como podemos ver, los glucósidos cianogénicos conocidos hasta el

momento son muy parecidos estructuralmente, cambiando en algunos casos la
posición de los radicales . En la Figura 1 .5 se muestra la estructura química de
la amigdalina y la prunasina.
ÇH20H
O
O-ÇH 2 ÇH20H
OH
OH 0-C-H o O-C-H
OH C-N
OH C=N OH
OH ~ I OH ~-~
OH OH
Amigdalina Prunasina
Figura 1 .5. Estructura química de la amigdalina y de la prunasina .

Introducción / 1 7
Tabla 1 .1 . Compuestos cianogénicos descritos y referencia bibliográfica.
Compuesto Investigadores Año
Amigdalina Robiquet y Boutron-Charlard 1830
Linamarina Jorissen y Hairs 1891
Durrina Dunstan y Henry 1902
Ginocardina Power y Gornal 1904
Sambunigrina Bourquelot y Danjou 1905
Viacianima Bertrand 1906
Prunasina Hérissey 1907
Acacipetalina Steyn y Rimington 1935
Nandina gluc6sido Finnemore y Large (?) 1936
Abrol, Conn y Stoker 1966
Taxipilina Finnemore, Reichard y Large (?) 1936
Towers, McInnes y Neis 1964
Zierina Finnemore y Cooper 1936
Acalipina Rimington y Roets 1937
Lotaustralina Finemore y Cooper (?) 1938
Bissett, Clapp, Coburn, Ettlinger y Long Jr 1969
Polídesmus Pallares 1946
Lucumina Bachstez, Prieto y Gaja 1948
Proteacima Young y Hamilton 1966
Barteriosida Paris, Bouquet y París 1969
Triglochinina Eyjólfsson 1969
Elaboración propia a partir de Eyjólfsson (1969), Conn (1969, 1980), Jones (1998), Selmar
(1988) Poulton (1990), Halkier y Moller (1991), Aikman (1996) y Vetter (2000) .
(?) = Estos autores no habían determinado la estereoquimica del compuesto .

1 8 / Introducción
La amigdalina es el a (6-0-(i-D-glucopiranosil-(i-D-glucopiranosil
benceno) acetonitrilo . La prunasina es el D-mandelonitrilo R-D-glucósido. Las

variaciones estructurales entre los glucósidos cianogénicos dependen de la
naturaleza del azúcar. Todos tienen D-glucopiranosa unida mediante un enlace
R con la aglicona . Las tres excepciones son amigdalina, vicianina y lucumina,

los cuales integran como glucósidos los disacáridos gentiobiosa, vicianosa y
primaverosa, respectivamente .
La purificación de los glucósidos cianogénicos en las plantas presenta

dificultades debido a la presencia de otros glucósidos . No obstante, las nuevas
técnicas analíticas como la cromatografía de gases, la cromatografía líquida de
alta resolución (HPLC) y la resonancia magnética nuclear, hacen posible la
determinación de su estructura .
En la Figura 1 .6 se presenta la estructura química de algunos de los

compuestos cianogénicos más representativos.
1 .2.1 .2 . Biosíntesis .
La obtención de un compuesto cianogénico a partir de sus precursores

ha sido estudiada por diferentes autores (Conn 1973, Conn 1980, Selmar y col.
1988, Cardona y col. 1992, Bokanga y col. 1993, Gruhnert y col. 1994,
Nakanishi y col. 1994, Du y col. 1995, McMahon y col. 1995, Chassagne y col.
1996) .
Los principales precursores para la biosíntesis de los compuestos

cianogénicos son los aminoácidos valina, leucina, isoleucina, fenilalanina y
tirosina (Bove y col. 1961) . En el caso de la amigdalina y la prunasina, el
aminoácido precursor es la fenilalanina (Seigler 1975).

Introducción / 19
OH
W,M
ÇH20H CH20H
PA
C=N
O-C-CH3 o O-C-H
OH CH3 OH C-N
OH ~--~ OH
OH OH
Linamarina Taxipilina
ÇH20H
C=N CH20H
O-C-H C=N
O-CH
OH MA a
OH OH
OH \I OH ~-r
OH \_
OH OH
Durrina Zierina
CH20H
CH 2 0H
O-C- C= N11
I C=N
o
1
OH CH O-C-H
OH CH ~OH
OH C-000H OH
CH2-000H OH
Triglochinina Sambunigrina
Figura 1 .6. Estructura de algunos compuestos cianogénicos .

20 / Introducción
ÇH20H
C=N
OH Ara -0-Ara- 0-CH
C=N
OH
OH
OH _
Ginocardina Lucumina
CH20H Ç =N
CH s
--o. O-CH
a
CH20H ÇH2
-o O-CH FA,
OH
OH C= N
OH
HO
OH
Lotaustralina Polidesmus
CH2 0H Ç=N
--o. O-CH
OH PIVAMW
OH
OH INN
j
PP, M
OH 0 O-CH2
CH20H 0
1
o OH O O-C-H
r--f - ~-f
OH OH C=N
H
OH OH
OH OH
Proteacina Vicianina
Figura 1 .6 (Continuación). Estructura de algunos compuestos cianogénicos.

Introducción / 2 1
Las rutas de biosíntesis comprenden la formación de hidroxi-

aminoácidos, aldoximas y otros productos intermedios desconocidos
(Eyjólfsson 1969, Guardiola 1990). Estas rutas se han estudiado con detalle en
el caso de la durrina del sorgo (Halkier y col. 1989, Poulton 1990, Sibbesen y
col. 1994). Vetter (2000) analiza estas rutas mediante la incorporación de C1a
en los aminoácidos precursores en la biosíntesis de la durrina del sorgo .

Hughes y col. (1992), Koch y col. (1992), McMahon y Sayre (1993) y McMahom
y col. (1995) estudiaron la biosíntesis de la linamarina en la yuca (Manihot
esculenta Crantz) (Conn 1979) .
En otras plantas los pasos intermedios son aún desconocidos en gran

medida, por lo que se siguen estudiando . Este es el caso de la semilla de la
Hevea brasiliensis (Mallika y col. 1991), determinados pastos (Aikman y col.
1996) y en algunas legumbres (Makkar y col. 1997) .
La Figura 1 .7 muestra con detalle los pasos de la biosíntesis de los

glucósidos cianogénicos según Eyjólfsson (1969).
NOH NHOH ?
RR' CH-C F ( T RR' CH-C;
~COOH COOH
N -Hidroxiamino ácido Oxíamino ácido

Glucósido
Cianogénico
NHZ
~ NOH C-N C=N C -_
-N
RR' CH-CH --Am- -Iw- RR' CH- C RR C -jo- RR ~ --P- RR C
COOH \H \H CH O -Azúcar
L- Amino ácido Aldoxima Nitrilo (x-Hidroxinitrilo i
NOH NOH
RR C -C
'H RR' C- C
OH
H O-Azúcar
Figura 1 .7 . Etapas de la biosíntesis de los glucósidos cianogénicos .
Fuente : Eyjólfsson (1969) .

22 / Introducción
Los glucósidos cianogénicos contienen un monosacárido o un disacárido

y un hidroxinitrilo aromático . Este último es el caso de la amigdalina . Tal como
ocurre en otras síntesis de compuestos como los glucosinolatos, inicialmente
se forma una aldoxima a partir de un aminoácido que a continuación es
transformada en un nitrilo, seguido de un a hidroxinitrilo . Finalmente se obtiene
el glucósido cianogénico mediante diferentes etapas, muchas de ellas aún
desconocidas, como se señala en la Figura 1 .7.
En el caso de la linamarina en la yuca, se parte de un (x-aminoácido que

se hidroliza a N-hidroxiaminoácido, aldoxima, y después a nitrilo (McFarlane y
col. 1975). Éste es hidrolizado a a-hidroxinitrilo para después convertirse en el
correspondiente glucósido cianogénico (Tapper y Reay 1973) .
1 .2 .1 .3. Hidrólisis .
Como hemos comentado anteriormente la hidrólisis de los compuestos

cianogénicos, la cianogénesis, conduce a la liberación de ácido cianhidrico .
El proceso de cianogénesis tiene una gran importancia en alimentación

ya que muchos de los alimentos de gran consumo animal y humano contienen
glucósidos cianogénicos (Jones 1998). Este proceso ha sido estudiado en la
amigdalina de la almendra amarga (Campbell y Haworth 1924), en la durrina
del sorgo (Robinson 1930) y en la linamarina de la judía (Corkill 1942) .
Eyjólfsson (1969) realizó un estudio detallado tanto de la biosíntesis

(como ya hemos señalado) como de la hidrólisis, estudiando la estructura, las
propiedades químicas y la degradación enzimática de estos compuestos . En la
Figura 1 .8 se describen las etapas generales de la hidrólisis de un glucósido
cianogénico .
Durante la hidrólisis, dependiendo del medio en el cual se desarrolle la

degradación, se obtienen como productos finales compuestos diferentes . En
medio ácido concentrado se obtiene un compuesto ácido y amonio. La
hidrólisis en medio ácido diluido (pH 5 .5) produce como compuesto intermedio

Introducción l 23
cianhídrina y el azúcar correspondiente, para luego seguir la degradación hasta

ácido cianhídrico y un compuesto que depende del aminoácido precursor. En
un medio básico, como producto intermedio se produce hidroxiácido
esterificado y amoniaco, y finalmente ácido y azúcar (Conn 1988) (Figura 1 .8).
OH
+ NH4+
RRi c
~000H
H20
Ácido concentrado
OH
O-Azú c a r - + Azúcar » RR'C=0 + HCN
RRIC
RR1C Ácido diluido \C_N
\C=N
H20
O- Azúcar O H
RR~C + NH3 H RR1C + Azúcar
Medio básico
Figura 1 .8. Etapas de la hidrólisis de los glucósidos cianogénicos .
Durante la hidrólisis de la amigdalina actúan tres enzimas (Figura 1 .9) .

Inicialmente la amigdalina se hidrata en un medio con una acidez muy
específica (pH 5.5-6 .0) para que actué la P-glucosidasa, obteniéndose glucosa
y prunasina. Sobre esta prunasina actúa posteriormente la (3-glucosidasa para

producir cianhídrina y otra glucosa . Finalmente la cianhídrina se descompone
en benzaldehído y ácido cianhídrico mediante la acción de una hidroxinitrilo-
liasa.
Dado que los glucósidos cianogénicos y los enzimas responsables de su

hidrólisis se encuentran en compartimentos diferentes en la planta, la
producción de cianuro sólo tiene lugar cuando los tejidos se rompen y sustrato
y enzima entran en contacto en unas condiciones adecuadas de pH (Poulton y
Li 1994, Swain y Poulton 1994). Esta compartimentación del enzima y del
sustrato impide la propia muerte de las plantas cianogénicos y supone la base

del posible mecanismo de defensa frente a fitófagos .

24 / Introducción
Amigdalina
ÇH20H
J--- O
', C=N
H0 H y0 Ç -
O H ~ 0 H
(i - glucosidasa
H 20
Prunasina
CH20H CI~0H C=N
H
0,~ O H j 0
0 H 0 H
CFJOH C=N
H
U
1-11 00- \ 0 - glucosidasa
0 H
0 H
Cianhidrina
C H
C=N
0-', 9H + H
0
0 H
C=N
H
Hidroxinitrilo liasa
m SS
Benzaldehído
H
Ácido cianhídrico + O =C~
Figura 1 .9 . Etapas de la hidrólisis enzimática de la amigdalina . Fuente : Conn (1980) .

Introducción / 25
1 .2 .2. Presencia y función en la naturaleza .
Los glucósidos cianogénicos se encuentran fundamentalmente en
numerosas especies de plantas, pero también en animales y microorganismos,

desarrollando diferentes funciones (Eyófsson 1969, Conn 1980, Vetter 2000) .
1 .2.2.1 . Presencia en el reino vegetal.
Eyjólsson (1969) ya citaba un elevado número de especies de plantas

que poseian glucósidos cianogénicos (Tabla 1 .2) . La lista incluye unas 150
especies de Rosaceae, 125 de Leguminosae, 50 de Graminaceae, 50 de
Compositae, 50 de Euphorbiaceae, y 30 de Passifloraceae .
Su presencia es especialmente importante en especies comestibles de

gran consumo como maíz, arroz, trigo, cebada, centeno, judía de lima o yuca
(Tabla 1 .3). Jones (1998) explicó que el elevado número de especies de
plantas comestibles que poseen glucósidos cianogénicos era debido a la
función de defensa de estos compuestos y a su papel como sustancias de
reserva energética .
1 .2.2.2. Presencia en hongos y bacterias.
Aunque la presencia de compuestos cianogénicos es escasa fuera del

reino vegetal, han sido descritos algunos casos entre los hongos y las
bacterias . Así, Knowles y Bunch 1986 y Jones 1998 describen la capacidad de
algunos hongos de producir ácido cianhídrico, como el Rhizobium
leguminosarum. Stevens y Strobel (1968) mostraron la presencia de linamarina
y metillinamarina en un basidiomiceto no identificado, explicando la manera de
producir cianuro .

26 / Introducción
Tabla 1 .2. Plantas superiores con glucósidos cianogénicos descritas por Eyjólsson (1969) .
Especie Familia Compuesto
Acacia lasiopelada y Acacia stolon~era Mimosaceae Acacipetalina
Acalipina indica Euforbiaceae Acalipina

Cydonia, Eriobotria, Prunus, Pyrus Rosaceae Amigdalina, Prunasina
Barteria fistulosa Passifloraceae Bacteriosida
Sorgum vulgare Graminaceae Durrina
Ginocardia odorata, Pangium edule Flacourtiaceae Ginocardina
Dimorphotheca berberiae, Osteospermun jucundun Compositae Linamarina
Cnidoscolus texanus, Hevea braziliensis, M.esculenta Euphorbiaceae Linamarina

Linum usitatissimun Linaceae Linamarina
Papaver nudicaule Papaveraceae Linamarina
Lotus ; Phaseolus lunatus Papilionaceae Linamarina
Lucuma mammosa . Sapotaceae Lucumina

Macadamia integrifolia Protaceae Proteacina
Eremophila maculata Myoporaceae Prunasina
Eucalyptus cladocalyx Myrtaceae Prunasina
Cystopteris fragilis Polypodiaceae Prunasina
Jamesia americana Saxifragaceae Prunasina
Sambucus nigra Caprifoliaceae Sambunigrina

Acacia Mimosaceae Sambunigrina
Ximenia americana Olacaceae Sambunigrina
Phyllanthus gasstroemi Euphorbiaceae Taxipilina
Macadamia temifolia Proteaceae Taxipilina
Taxus Taxaceae Taxipilina
Triglochin maritimun Juncaginaceae Triglochinina
Vicia angustifolia Papilionaceae Vicianina
Davallia Polypodiaceae Vicianina
Ziera laevigata Rutaceae Zierina

Introducción / 2 7
Tabla 1 .3. Plantas de importancia económica con capacidad cianogénica descritas por Jones
(1998) .
Cultivo Especie Glucósido

Trigo Triticum aestivum Linamarina
Trigo Triticum spelta Durrina
Trigo Triticum monococcum Linamarina, lotautralina, epilotaustralina
Cebada Hordeum vulgare Epíheterodendrina
Avena Avena sativa Linamarina
Centeno Secale cereale Durrina
Sorgo Sorghum bicolor Durrina
Yuca Manihot esculenta Linamarina, lotaustralina
Judía de Lima Phaseolus lunatus Linamarina, lotaustralina
Mijo Eleusine coracana Triglochinina
Papaya Carica papaya Prunasina, tetrapillina
Maracuyá Passiflora edulis Prunasina,
Zapote Pouteria sapota Lucumina
Níspero del Japón Eriobotrya japonica Amigdalina
Almendro Prunus dulcis Amigdalina, prunasina
Melocotonero Prunus persica Amigdalina, prunasina
Cerezo dulce Prunus avium Amigdalina, prunasina
Guindo Prunus cerasus Amigdalina, prunasina
Macadamia Macadamia ternifolia Durrina, prunasina
Saúco Sambucus nigra Holocalína, prunasina, sambunigrina
Taro Alocasia macrorriza Isotriglochinina, triglochinina
Bambú Dendrocalamus latiflorus . Taxipilina
Bambú Dendrocalamus giganteus . Taxipilina
Bambú Dendrocalamus hamiltonü Taxipilina
Bambú Bambusa vulgaris Taxipilina
Bambú Bambusa guadua Taxipilina

28 / Introducción
En bacterias es frecuente la producción de cianuro a partir de

aminoácidos, como en el caso de Pseudomonas aeruginosas, P. fluorescens,
P. aureofaciens, P. chlororaphis, en cianobacterias como Anacystis nidulans,
Nostoc muscurum y Plectonema boryamum (Castric 1981, Vennesland y col.
1981, Knowles y col. 1986, Antoun y col. 1998, Blumer y col. 2000).
Algunas cepas de Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides

y Candida tropicalis han sido utilizadas para degradar amigdalina y linamarina
(Le¡ y col. 1999). También han sido utilizados Mucor circinelloides y Penicillum
auroantiogriseum (Brimer y col. 1998) y Rhizopus oligosporus (Tungel y col.
1997) para la degradación de la amigdalina .
1 .2.2 .3 . Presenci a en animales .
En el caso de los animales su incidencia es aún menor. Pallares (1946)

aisló el glucósido cianogénico polidesmus a partir del miriópodo Polydesmus
vicinus L . En estos miriópodos los compuestos cianógenos son producidos en
glándulas especiales y son utilizados como un sistema de defensa y ataque .
1 .2.2.4. Función de los compuestos.
Numerosos autores han señalado la importancia de los compuestos

cianogénicos en las plantas, tanto por su papel de defensa frente a roedores e
insectos (Jones 1979, Kakes 1990, Vetter 2000) como por su implicación en el
metabolismo secundario (Fraenkel 1959, Jones 1979, McKey 1974, Swain
1992, Seigler 1980) .
Según McKey (1974), estos metabolitos, como consecuencia de su

misión defensiva, se acumulan en el tejido epidérmico, si bien su concentración
varía en función del genotipo y de ciertos factores ambientales . Con este fin
concentran los glucósidos cianogénicos en partes vitales como semillas, hojas
y tallos tiernos . Además del poder tóxico de los compuestos cianogénicos para

Introducción / 29
muchos depredadores, el característico sabor amargo ayuda a alejar aves y

herbívoros.
En la Tabla 1 .4 se describen algunas especies de plantas con su

principal compuesto cianogénico que actúa como medio de defensa ante el
ataque de pequeños insectos, roedores y algunos herbívoros .
Tabla 1 .4. Defensa frente a depredadores de algunas plantas, atribuida a su capacidad

cianogénica .
Especie Compuesto Defensa
Acacia spp Acacipetalina Insectos
Amelanchier alnifolia Linamarina Mamíferos
Cynodon plectostachys Taxipilina Insectos y mamíferos
Lotus comiculatus Linamarina Moluscos e insectos
Manihot esculenta Linamarina Cerdos, puerco-espines, ratas e insectos
Pteridium aquilinum Taxipilina Ciervos, ovejas y algunos insectos
Simmondsia chinensis Sambunigrina Roedores
Sorghum bicolor Durrina Aves, insectos y ratones
Trifolium repens Triglochinína Babosas, caracoles y roedores

Fuente : Jones (1998)
En el caso del almendro, tradicionalmente se ha asociado el carácter
amargo de las semillas con la rusticidad de los patrones, lo que podría deberse
a la presencia de glucósidos cianogánicos . Así, Nahrstedt (1985), Malagón
(1990) y Mulas (1996) describen la relación entre el contenido de cianuro
obtenido a partir del compuesto cianogénico (prunasina) presente en las raíces
de diversos Prunus y la resistencia a las larvas del gusano cabezudo.
Además de la función de defensa, parece que estos compuestos

cianogénícos pueden tener un papel fundamental en la síntesis de proteínas,
siendo posiblemente el ácido cianhídrico un producto primitivo del metabolismo
nitrogenado .

30 / Introducción
Los glucósidos cianogénicos también pueden tener funciones de

reserva, que la planta puede utilizar como fuente de energía dependiendo de
sus necesidades metabólicas.
Seigler (1975) estudió el papel de los glucósidos cianogénicos como

metabolitos secundarios importantes en los vegetales superiores,
encaminando sus investigaciones hacia la función que desempeñan en las
plantas .
Fennema (1993) afirmó que otra función de estos compuestos puede

ser la de hacer más hidrosolubles las agliconas, lo que permite su transporte
en medio acuoso en forma de glucósido.
1 .2.2.5. Toxicidad.
La toxicidad de los compuestos cianogénicos se debe

fundamentalmente al ácido cianhídrico que se libera durante su hidrólisis .
La acción primaria del ácido cianhídrico consiste en la inhibición de la

citocromoxidasa, lo que bloquea la respiración celular. La dosis letal de ácido
cianhídrico en humanos es de 0 .5 a 3.5 mg/kg de peso corporal en una sola
toma (Wong 1995) .
Respecto a la sintomatología, una persona con envenenamiento ligero

por cianuro sufre dolor de cabeza, nauseas y debilidad, debido a la privación
del oxigeno. Cuando la intoxicación es importante se producen convulsiones,
parada respiratoria y finalmente la muerte . El primer órgano afectado y el más
sensible a los efectos del cianuro es el cerebro .
La toxicidad está condicionada por la concentración del compuesto y por

el tiempo de exposición al mismo. Cuando ingerimos pequeñas cantidades de
compuestos cianógenos, la ruta más común para la desintoxicación es la
conversión del HCN a tiocianato en el hígado y en los riñones, que es
excretado posteriormente en la orina (Wong 1995). La reacción de
desintoxicación es la siguiente :

Introducción / 3 1
CN- + S2032- ->SCN- + S03
Otros mecanismos de desintoxicación implican ciertos aminoácidos

como la metionina y la cisteina para dar lugar también a tiocianatos que se
eliminan en la orina o a la vitamina B12 por vía tiroidea (Oke 1980) .
En el caso de la alimentación animal el problema es parecido . La

cianogénesis también ha sido estudiada en algunas plantas forrajeras o
destinadas a la fabricación de piensos, que producen de forma natural el ácido
cianhídrico Tjan Sie Fat y Van Valen (1978) .
1 .2 .3. Métodos analiticos de determinación.
Los primeros métodos desarrollados para la determinación de cianuro

se basaron en la formación de ácido cianhídrico y posterior destilación del gas,
recogiendo el destilado sobre una disolución de hidróxido sódico (Serfass y col.
1952, Goulden y col. 1992) .
La determinación del contenido del cianuro sódico formado se llevó a

cabo, por lo general, mediante valoraciones argentométricas, métodos
colorimétricos o métodos potenciométricos con electrodos selectivos de
cianuro.
El análisis químico de los compuestos cianogénicos en plantas ha sido

abordado mediante hidrólisis y destilación del ácido cianhídrico producido,
fijando el destilado sobre un álcali o una disolución de nitrato de plata, y
valorando después el exceso de plata por el método de Volhard (Winkler 1958,
A.O .A.C, 1975, Femenia y col. 1995).
Estos métodos son muy poco sensibles, por lo que se han desarrollado
otras técnicas que se podrían clasificar fundamentalmente en :
- Microdifusión
- Técnicas cromatográficas
- Otras técnicas de análisis .

32 / Introducción
1 .2 .3 .1 . Microdifusión .
Estos métodos que tradicionalmente se han venido utilizando para la

determinación de los glucósidos cianogénicos, se basan fundamentalmente en:
1 . Hidrólisis del glucósido cianogénico, generando ácido cianhídrico .
2 . Difusión y recogida del ácido cianhídrico generado sobre una

disolución concentrada de hidróxido sódico.
3 . Determinación del cianuro sódico obtenido .
La hidrólisis del glucósido (primera etapa) puede realizarse de los

siguientes modos :
" Generación de ácido cianhídrico mediante hidrólisis ácida (Bradbury

y col. 1991) .
" A partir de procesos autoenzimáticos, es decir utilizando las enzimas

propias del vegetal .
" Mediante adición de enzimas externas (Brimer y col. 1993, Tungel y

coL 1995)
" Utilizando métodos autoenzimáticos pero controlando y ralentizando

el proceso de generación de ácido cianhídrico mediante la adición de
reactivos que inhiben la hidrólisis.
Una vez generado el ácido cianhídrico mediante hidrólisis, éste difunde

en la célula de microdifusión diseñada para tal fin y se absorbe en una
disolución concentrada de hidróxido sódico dispuesta dentro del dispositivo
donde se lleva a cabo la hidrólisis . En numerosos trabajos se utiliza como
dispositivo la célula de Cronwell modificada por Baar (1966) .
Existen dos metodologías para realizar el análisis cuantitativo del

cianuro absorbido en la disolución alcalina, y la elección de uno u otro

Introducción / 33
dependerá, entre otras causas, del nivel de concentración de cianuro en la

muestra
1 . Concentraciones de hasta 2 p.g /L : Determinación colorimétrica de

cianuro mediante la formación de diversos derivados coloreados,
produciéndose en todos los casos una mejora sustancial de la
sensibilidad.
2. Concentraciones superiores a 10 mg/L . Valoración gravimétrica de

cianuro con nitrato de plata, utilizando generalmente una disolución de
rodanina como indicador (Williams, 1979) .
Para la determinación colorimétrica las reacciones más utilizadas son :
" La reacción con cloramina T y ácido barbitúrico en piridina

(Nahrstedt y col. 1981, Brinker y col. 1989) .
" La correspondiente reacción con cloramina T y 1-fenil-3-metil-

5-pirralozona en piridina (Corradi y col. 1982, O"Brien y col. 1991,
Brimer y Rosling 1993) .
" La utilización de picrato como reactivo de formación de la

especie coloreada isopurpurina (reacción de Guignard). Esta
reacción con picrato es utilizada por algunos autores (Horwitz
1980, Brinker y col. 1992) como un método cualitativo o
semi cuantitativo de ensayo previo antes de proceder a la
determinación cuantitativa .
Para la determinación con picrato se utiliza un recipiente como el de la

Figura 1 .10 (Yeoh y col. 1998), en donde se coloca un soporte que contiene en
un extremo la enzima necesaria para la hidrólisis del compuesto cianogénico y
en el otro extremo, una tira de papel impregnada de picrato sódico (de color
amarillo), que se torna de color naranja cuando se libera cianuro .

34 / Introducción
Este método también se ha utilizado para la determinación cuantitativa,

extrayendo el compuesto formado mediante la reacción de Guignard de la tira
de papel y midiendo la absorbancia del extracto a 520 nm (Lucas y col. 1984).
Egan y col. (1998) han desarrollado una técnica que permite medir la
absorbancia en estado sólido, es decir en la propia tira de papel .
Papel
Picrato
1[CN //-r- Dispositivo
Papel con
emulsina M -t-
Figura 1 .10 . Dispositivo para la medición del ácido cianhídrico con papel picrato .
1 .2.3.2. Técnicas cromatográficas
Otra técnica utilizada para la determinación de compuestos

cianogénicos es la cromatografía . Entre las utilizadas podemos destacar las
siguientes técnicas :
1 . Cromatografía en papel y en capa fina.
2 . Cromatografía de gases.
3 . Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, High Performance

Liquid Chromatography) .
La cromatografía en papel y en capa fina se ha utilizado como método

de separación y determinación semicuantitativa mediante densitometría óptica
(Brimer y col. 1983, Santamour 1998) .
Son pocos los autores que han usado la cromatografía de gases como
método cuantitativo . Basheer y col. (1992) utilizaron una columna de

Introducción / 35
fenildimetisiloxano al 5% de 30 m x 0.32 mm y un detector de espectrometría

de masas para la determinación de compuestos cianogénicos . Frehner y col.
(1990) utilizaron cromatografía de gases con detector de ionización de llama,
previa derivatización precolumna de la muestra con N-N-trimetilclorosilano y
bistrimetilsililfluoroacetamida .
La cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) sin embargo, ha

sido utilizada en la determinación de este tipo de compuestos (Kobaisy y col.
1996) . El procedimiento de análisis consta de varias etapas :
1 . Extracción de los compuestos cianogénicos.
2. Purificación de los extractos obtenidos.
3. Determinación cromatográfica .
El extractante más utilizado ha sido la mezcla de metanol:agua en

diferentes proporciones y con diferentes condiciones de extracción (Kajiwara y
col. 1983, Brimer y col. 1984, Gómez y col. 1998).
Dependiendo del material vegetal sobre el que se realice la extracción

de los glucósidos, será necesaria una purificación de la muestra más o menos
compleja, para lo que se emplean procedimientos como los propuestos por
(Brimer y col. 1984, Usa¡ y col. 1990, Gómez y col. 1998) .
La determinación cromatográfica se realiza mediante HPLC en fase

inversa utilizando generalmente columnas C8 o C18 y como fase móvil
mezclas de metanol :agua, acetonitrilo :agua y metanol :tampón fosfato, en
diferentes proporciones .
La detección fotométrica se realiza entre 210 nm y 265 nm, en la

mayoría de los estudios (Nahrstedt 1978, Frehner y col. 1990) . Sin embargo
existen trabajos como los de Dalgaard y col. (1983), Brimer y col. (1984) y
Dalgaard y col. (1984), en los que se lleva a cabo una reacción enzimática
postcolumna que permite la aplicación de un detector electroquímico, más
selectivo y sensible .

36 / Introducción
1 .2.3.3 . Otras técnicas de análisis .
Además de los métodos de determinación que se han mencionado, en

los últimos años se han desarrollado otros métodos entre los que cabe
destacar la utilización de biosensores, reacciones enzimáticas y resonancia
magnética nuclear.
La actividad catalítica de las enzimas no es solamente específica para

los sustratos que catalizan, sino que también puede ser muy sensible a la
presencia de determinados inhibidores . Uniendo la actividad enzimática a la
sensibilidad de los métodos amperométricos, se ha desarrollado un método
muy sensible para la determinación de compuestos cianogénicos, como el
aplicado por Smit (1990).
Recientemente se han publicado trabajos en los que se han puesto a

prueba con gran éxito diversos biosensores para la determinación de cianuro
(Tatsuma y col. 1996, Merkoci y col. 1999).
. Por otro lado, también se están implantando métodos basados en la

hidrólisis enzimática de los compuestos cianogénicos y su determinación
mediante sistemas sencillos. Éstos se introducen en el recipiente de reacción a
modo de sonda, llevando incorporada la enzima responsable de la hidrólisis
junto con picrato como reactivo formador del color, posibilitando medir de esta
forma la concentración de cianuro liberado .
La resonancia magnética nuclear también se ha utilizado recientemente

para la identificación de la autenticidad del aceite de almendras amargas y de
canela, analizando el benzaldehído que se produce por la hidrólisis de los
compuestos cianogénicos (Remaud y col. 1997) .

Volver al índice/Tornar a l'índex
Introducción / 3 7
1 .3. OBJETIVOS DEL TRABAJO .
El objeto de este trabajo es el estudio de diferentes aspectos

relacionados con la presencia de compuestos cianogénicos, amigdalina y
prunasina, en semillas de almendro y la determinación de sus implicaciones en
los programas de mejora de esta especie. En concreto persigue los siguientes
objetivos :
1 . Poner a punto las técnicas analíticas adecuadas para el análisis de los

compuestos cianogénicos en la almendra.
2 . Estudiar la variabilidad de estos compuestos en semillas de distintas

variedades de almendro, así como determinar la posible utilización de estas
técnicas analíticas para establecer el genotipo para el sabor de una variedad
dada .
3 . Estudiar la herencia de estos compuestos en una descendencia de

almendro, en relación con el sabor de sus semillas .
4 . Determinar la evolución de los compuestos cianogénicos desde el cuajado

del fruto hasta su maduración en semillas de variedades dulces, amargas y
ligeramente amargas .
5 . Estudiar el efecto del genotipo del polinizador (dulce, amargo o ligeramente

amargo) sobre el sabor de la semilla obtenida, en variedades dulces, amargas
y ligeramente amargas .


2 . MATERIAL VEGETAL


Material vegetal/ 41
2. MATERIAL VEGETAL .
El almendro es una especie que presenta una gran variabilidad genética,

consecuencia de su hasta ahora auto¡ncompatibil¡dad generalizada y de su
multiplicación por semilla . Esta variabilidad se pone de manifiesto en el elevado
número de variedades presentes no sólo en los principales países productores
(Estados Unidos y España) sino en todos aquellos donde se cultiva (Grasselly y
Crossa-Raynaud 1980, Monastra 1982, Egea y col. 1985, Micke 1996, Felipe
2000).
Esta riqueza genética le ha permitido adaptarse a condiciones

ecológicas muy diferentes, desde las zonas cálidas y áridas de la cuenca sur
mediterránea a ciertas áreas preandinas de Argentina .
Las variedades utilizadas en este trabajo son una muestra representativa

de la variabilidad de la especie .
2 .1 . VARIEDADES ESTUDIADAS.
Las variedades de almendro estudiadas en el presente trabajo se

encuentran en la finca experimental "Tres Caminos" del Centro de Edafología y
Biología Aplicada del Segura (CEBAS), del Consejo Superior de
Investigaciones Científicas (CSIC). La finca está situada en Santomera
(Murcia), a una altitud media de 130 metros, con veranos muy calurosos e
inviernos suaves y con temperaturas mínimas que no suelen bajar de 0° C.
Los árboles, de edades diferentes, se encuentran con riego localizado y

a diferente marco de plantación según los casos.
A continuación se describen las variedades estudiadas, clasificadas en

función de su origen geográfico. Excepto en las variedades en las que se indica
el sabor de la semilla, el resto son de semilla dulce .

42 /Material vegetal
2.1 .1 . Variedades españolas.
Estas variedades son todas, de cáscara dura y de floración temprana o

media .
Atocha . Oriunda del campo de Ricote (Murcia) . Es autoestéril y su flor

es blanca y de tamaño medio. El árbol presenta un porte muy erecto y una
ramificación media . Es vigoroso y de elevada productividad en su zona de
origen . Su cáscara es muy dura .
Carretas . Originaria del Valle del Guadalentín (Murcia) . Árbol de

floración temprana y maduración media . Su cáscara es dura y su almendra no
es muy grande . Es un árbol muy vigoroso, de buena productividad .
Cebas . Selección obtenida en el CEBAS-CSIC (Murcia) de una semilla

de polinización libre de Garrigues . Es muy productiva, de floración temprana y
maduración media. A pesar de su cáscara relativamente dura tiene un
rendimiento elevado (50%) .
Colorada . Difundida en la Región de Murcia, en las comarcas de Totana

y Campo de Cartagena . Presenta un cierto porcentaje de semillas dobles y su
productividad es alta . Es un árbol de ramificación abundante y fructifica
preferentemente sobre ramos mixtos.
Desmayo Largueta. También llamada Desmayo Blanco . Conocida

desde el siglo XIX en Tarragona, su cultivo se ha extendido en todo el levante
peninsular, cultivándose inclusive en el norte de África . A pesar de su floración
extratemprana es una variedad de maduración muy tardía . Su principal
característica es la calidad de su semilla por la que alcanza elevados precios .
Del Cid . Variedad de origen desconocido y de floración casi coincidente

con la variedad Marcona, por lo que se utiliza como polinizador de ésta . Su
época de maduración es media y su fruto, de cáscara muy dura, presenta
asimismo cierta similitud con el de Marcona.

Material vegetal/ 4 3
Garrigues . Variedad murciana, originaria del valle del Guadalentín . De

floración temprana, muy vigoroso y de productividad elevada . Su semilla,
siempre sencilla, tiene un característico sabor ligeramente amargo . Sus
semillas son utilizadas con frecuencia para la obtención de patrones francos de
almendro.
Malagueña. Se cultiva principalmente en Andalucía. Su fruto alargado

presenta un elevadísimo porcentaje de semillas dobles. Es de maduración
media .
Marcona. Originaria de la provincia de Alicante . De floración y

maduración media . Variedad productiva, algo alternante y de fruto muy
apreciado por su calidad . Se consume frita, tostada, en turrón y en peladillas .
Debido a su elevado precio se comercializa separada de otras variedades .
Pajarera . Variedad de origen desconocido cultivada en la zona de

Fortuna-Abanilla en Murcia. Es de floración media, muy productiva y resistente
a la sequía y a las enfermedades criptogámicas . El fruto es de cáscara dura y
semilla acorazonada.
Peraleja . Originaria del Campo de Cartagena (Sucina) y conocida

también como Cartagenera . De época de floración temprana, maduración
media y muy productiva. Su fruto, de cáscara muy dura y un rendimiento
aproximado del 28%, tiene una semilla alargada y bonita .
Planeta . Se cultiva en la zona de Orihuela, San Miguel, Elche y Alicante .

Árbol vigoroso, de floración precoz y buena productividad . Su fruto, de buena
calidad, carece de semillas dobles.
Ramillete. Variedad murciana . Se le conoce también con el nombre de

Sotera . Árbol muy vigoroso de porte erecto y ramificación media. Su flor es
grande, de pétalos alargados de color rosado . De floración temprana, muy
productiva y con cierta tolerancia a la sequía .

44 / Material vegetal
Rumbeta : Variedad originaria de Alcalalí (Alicante) . Arbol muy florifero y

productivo que presenta una floración coincidente con la variedad Marcona. Su
época de maduración es temprana . Su fruto, de cáscara dura, tiene una
almendra elíptica muy apreciada para la elaboración de peladillas .
La Mona. Originaria de Bullas (Murcia) . Es de floración tardía y

maduración temprana . Es un árbol poco vigoroso y poco productivo. Su fruto de
cáscara dura no presenta semillas dobles.
2 .1 .2. Variedades francesas .
Las variedades francesas utilizadas en este estudio, obtenidas en el

programa de mejora francés, se encuentran muy difundidas en los países
mediterráneos por sus buenas características agronómicas, a pesar de su
incompatibilidad floral .
Ferraduel : Variedad de floración tardía obtenida en la Grande Ferrade

(Burdeos) del cruzamiento Cristomorto x Aï. Muy productiva y de cáscara dura .
Se utiliza como polinizador de Ferragnés .
Ferragnés : Variedad de floración tardía obtenida en la Grande Ferrade

(Burdeos) del cruzamiento Cristomorto x Aï . Muy productiva y de cáscara
semidura, con un rendimiento del 35%. Su semilla es grande, de sabor dulce y
no produce dobles. En la zona mediterránea es una variedad de referencia .
2.1 .3. Variedades italianas.
Las variedades italianas utilizadas en este estudio, originarias de la

región italiana de Apulia, destacan por su floración tardía y autocompatibilidad.
Por estas características han sido utilizadas ampliamente en programas de
mejora.
Genco. Variedad productiva de cáscara dura (30 % de rendimiento). Su

fruto posee un cierto porcentaje de semillas dobles, con un ligero sabor
amargo . El árbol es vigoroso .

Material vegetal/ 45
Tuono. Variedad de cáscara dura (35% rendimiento) . Al igual que

Genco tiene semillas dobles y sabor ligeramente amargo . Presenta una rápida
entrada en producción, es muy productiva y resistente a heladas tardías .
2.1 .4. Variedades americanas .
Las variedades americanas utilizadas son dos variedades de cáscara

blanda, autoincompatibles y de floración tardía.
Tioga . Variedad californiana de floración tardía procedente de una

semilla de polinización libre de un mutante de floración tardía de Nonpareil .
Fruto de tamaño medio y rendimiento del 50%, con pocas semillas dobles .
Titán. Variedad californiana procedente de una semilla de polinización

libre de un mutante de floración tardía de Nonpareil . Es de floración tardía y
maduración temprana, de cáscara blanda y semilla algo pequeña, con pocas
dobles . Se utiliza en Estados Unidos para la obtención de semillas para
patrones, cuando se poliniza con el melocotonero Nemaguard, de floración
coincidente .
2.1 .5. Otras variedades .
Otras variedades utilizadas han sido la soviética Primorskii, la

portuguesa Bonita y la tunecina Achaak .
Primorskii. Proviene del cruzamiento Nikitskii x Princesse obtenido

experimentalmente en 1935 . Variedad de cáscara blanda (rendimiento del 52 al
56%). Árbol de vigor medio, de floración muy tardía, autoincompatible y
resistente a heladas . Buen fruto alargado y sin semillas dobles.
Bonita. Variedad de origen Portugués de porte erecto, floración

temprana y abundante, aunque no es una variedad muy productiva . Su fruto,
de cáscara dura, tiene una semilla de color claro, muy atractiva y sin semillas
dobles.

46 /Material vegetal
Achaak . Variedad de la región de Santa Faz (Túnez), de floración muy

precoz, autoincompatible y de buena productividad. Fruto de cáscara semidura,
semilla alargada sin semillas dobles y de gran contenido de grasa .
2 .2. DESCENDIENTES ESTUDIADOS .
Además de las variedades anteriormente descritas, en este trabajo

también han sido estudiadas descendencias obtenidas en el programa de
mejora del CEBAS.
Se trata de 49 descendientes de Garrigues x Tuono obtenidos mediante

polinización manual en 1985 . Dado que ambos genitores son heterocigóticos
para el sabor amargo de la semilla (de hecho sus semillas son ligeramente
amargas) la descendencia segrega para este carácter .
Al igual que las variedades, estos descendientes se encuentran en la

finca experimental "Tres Caminos" del CEBAS en Santomera (Murcia), con
riego localizado .

3 . PUESTA A PUNTO DE
MÉTODOS ANALÍTICOS


Puesta a punto de métodos analíticos / 49
3. PUESTA A PUNTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS .
3.1 . INTRODUCCIÓN
La fiabilidad de los resultados que se obtienen en cualquier análisis

químico, viene determinada no solo por la etapa de determinación cuantitativa,
sino también por cada una de las etapas que se siguen en la realización del
análisis, y que es necesario optimizar, como son :
La elección del método de análisis .
" La toma, acondicionamiento y conservación de la muestra .
La preparación de la muestra para el análisis .
La determinación cuantitativa .
El tratamiento estadístico de los datos.
Para la elección del método de determinación de los compuestos

cianogénicos en la semilla de almendra, se ha realizado una rigurosa búsqueda
y examen de la bibliografía referente a la determinación de estos compuestos
en diferentes muestras vegetales, tal como se ha expuesto en el Apartado 1 .2 .3
del Capítulo 1 de esta memoria .
En el presente trabajo se pretende aplicar un método fiable y sencillo de

determinación, que además permita cuantificar por separado los compuestos
cianogénicos que pueden estar presentes en la semilla de almendra . Entre los
métodos encontrados en la bibliografía se ha seleccionado la cromatografía de
líquidos de alta resolución (HPLC), por que permite la cuantificación de los
glucósidos por separado, y como método de referencia se eligió la
microdifusión.
Una etapa importante en cualquier análisis es la toma de muestras, ya

que si la muestra no es representativa, las conclusiones que se deriven de los
resultados serán erróneas . Por otro lado las muestras deben acondicionarse de
forma adecuada, teniendo en cuenta los requerimientos del análisis posterior.

50 /Puesta a punto de métodos analíticos
Otro aspecto a tener en cuenta es la conservación de la muestra hasta

su análisis, con objeto de que no sufra alteraciones importantes en relación con
el análisis a efectuar .
Teniendo en cuenta que la almendra tiene un alto grado de contenido

graso, si no se conserva adecuadamente tiende a enranciarse . Hay dos tipos
de enranciamiento, uno oxidativo, en cuyo caso se forman aldehídos o cetonas
por la adición de oxígeno molecular y otro hidrolítico, mediante el cual se
forman ácidos grasos libres por la hidrólisis que presentan los glicéridos. Las
mejores condiciones de conservación de la almendra son oscuridad, baja
temperatura y baja humedad ambiente .
La liofilización es un procedimiento ampliamente utilizado para la

conservación de muestras en química analítica . El primer paso en el proceso
de liofilizado es la congelación de la muestra. Con ella se pretende mantener el
agua de constitución, así como las condiciones idóneas para que se produzca
el proceso de sublimación, parte fundamental de la liofilización .
. El tipo de congelación más adecuado parece depender en gran medida

del tipo de alimento a liofilizar. Así se recomienda una congelación rápida para
alimentos sólidos ya que los cristales de hielo que se forman son mucho más
pequeños y repartidos por igual tanto dentro de las células, como en los
espacios intercelulares . Por otra parte, una congelación lenta puede provocar la
formación de cristales más grandes, deformando y rompiendo las paredes
celulares .
Sin embargo en los líquidos la congelación lenta permite la formación de

una estructura cristalina que da lugar a la formación de canales por donde
pueda escapar el vapor de agua (Fellow 1994) . Este hecho hace recomendable
el estudio de la influencia del tamaño de partícula de la muestra en la
liofilización, así como el tipo de congelación más idóneo .
El tamaño de partícula es determinante en el proceso de liofilización, ya

que una partícula excesivamente grande requiere tiempos mayores de
liofilizado, que deben de ser estimados correctamente .

Puesta a punto de métodos analíticos / 5 1
Dado que ciertos procesos de extracción se ven dificultados por la

presencia de grasa, una de las cuestiones que debemos plantearnos es la
conveniencia o no de desengrasar la muestra. Además, los cromatogramas
que se obtienen cuando la concentración de amigdalina es próxima al límite de
detección, pueden presentar una alteración en la línea base próxima a la
amigdalina, que podría eliminarse con el desengrasando.
El tamaño de partícula de la muestra también puede afectar al propio

resultado analítico. Esto es debido a que la extracción de los glucósidos para el
análisis por HPLC y la hidrólisis en la microdifusión, puede no ser completa si el
tamaño de partícula es demasiado grande. Esto es consecuencia de la
dificultad de poner en contacto toda la muestra con el reactivo extractante, en
un caso, o con la enzima encargada de la hidrólisis en el otro, proporcionando
resultados bajos y poco reproducibles.
También es importante considerar si la trituración de la muestra debe

realizarse antes o después del liofilizado, por si al triturar antes de eliminar la
humedad pudiera tener lugar la hidrólisis de compuestos cianogénicos .
Otro aspecto a tener en cuenta es la conveniencia de trabajar con o sin

el tegumento de la almendra, y su posible interferencia en los resultados
finales. La principal razón a favor de mantener el tegumento es que ensayos
preliminares habían puesto de manifiesto que este factor no interfería en los
resultados analíticos . Por otro lado, en los ensayos de evolución de los
compuestos durante el desarrollo del fruto, fue necesario analizar semillas en
las primeras fases de su desarrollo . En estos casos en donde la semilla
contiene alrededor de un 90% de agua, es imposible eliminar adecuadamente
el tegumento. Finalmente la eliminación del tegumento es un proceso que
alarga innecesariamente el desarrollo del análisis de los compuestos .
El análisis cromatográfico consta fundamentalmente de dos etapas: la

extracción de los glucósidos cianogénicos y su determinación por HPLC .
Ambas fases pueden ser optimizadas para que el método de análisis resulte
sencillo y se pueda realizar en un tiempo de operación breve .

En la bibliografía consultada (que se detalla en la en el Apartado

1 .2 .3.2), los trabajos de Brimer y col. (1984), Frehner y col. (1990), Gómez y
col. (1998), entre otros, proponen diferentes procedimientos de análisis de los
compuestos cianogénicos (diversos agentes extractantes, procedimientos de
extracción y de purificación de los extractos y diversos procedimientos
cromatográficos) .
El primer paso consiste en la elección de un sistema extractante que

resulte adecuado para la matriz con la que se trabaja, es decir para la semilla
de almendra . En segundo lugar es necesario determinar las condiciones
cromatográficas más adecuadas (columna, fase móvil, caudal y detector) .
Finalmente, se han de tener en cuenta aspectos como la reproducibilidad y el
límite de detección, ya que son importantes para una correcta determinación
cuantitativa .
La determinación de cianuro por microdifusión requiere que se realice de

forma cuantitativa la hidrólisis enzimática de los glucósidos cianogénicos
presentes en la almendra. El producto final de la hidrólisis enzimática es ácido
cianhídrico, benzaldehído y glucosa, según la reacción :
C20H27NO11 + 2 H20 --> C6H5CHO + 2 C6H1206+ HCN"
El ácido cianhídrico producido se recoge sobre una disolución

concentrada de hidróxido sódico, formándose cianuro sódico . Éste
posteriormente se determina, bien por colorimetría (para las concentraciones
bajas de cianuro de las almendras dulces y ligeramente amargas), o bien por
valoración gravimétrica (para las concentraciones más altas de las almendras
amargas).
En cuanto a la necesidad de añadir o no P-glucosidasa, existe

controversia . Mientras que algunos autores defienden que la almendra contiene
suficiente cantidad de enzima para lograr la hidrólisis sin necesidad de adición
de enzima externa, otros agregaron R-glucosidasa en sus ensayos de
microdifusión .

Otros factores como la temperatura, el tiempo de difusión, el pH, y la

concentración y volumen de hidróxido sódico, pueden afectar al rendimiento de
la extracción . Igualmente, parece lógico pensar que las dimensiones relativas
del recipiente que contiene la muestra y el recipiente colector que hay en su
interior pueden afectar al rendimiento de la microdifusión .
El método de determinación por colorimetría se fundamenta en la

formación de un compuesto coloreado que absorbe a una determinada longitud
de onda dentro de la zona visible del espectro . Para una correcta
determinación colorimétrica, es necesario determinar la influencia factores
como el orden de adición de los reactivos, la concentración de reactivos, la
estabilidad de los reactivos y del patrón de cianuro, el tiempo necesario para el
desarrollo del color estable, la longitud de onda y la correcta limpieza del
material de vidrio . Finalmente es importante estimar la reproducibilidad y el
límite de detección del método .
La valoración gravimétrica se basa en la reacción del cianuro recogido

en el vial colector con nitrato de plata, según la reacción :
2CN- + Ag' -> Ag(CN)-2
Se utiliza como indicador una disolución al 0 .02% en acetona de 5-

Dimetil (4 aminobecilidenen) Rodanina .
Al igual que en el caso de la colorimetría, es importante determinar las

condiciones más idóneas de aplicación del método, y precisar su
reproducibilidad y límite de detección .
Una vez puestos a punto los diferentes aspectos del análisis de los
compuestos cianogénicos de la almendra por los dos métodos considerados,
es recomendable la comparación de estas técnicas desde el punto de vista de
la fiabilidad en la determinación, facilidad y tiempo, al objeto de verificar si los
resultados obtenidos mediante la aplicación de la técnica cromatográfica
(HPLC), son comparables a los obtenidos por microdifusión .

Teniendo en cuenta las consideraciones anteriores, el objetivo de este

capítulo es la puesta a punto de las diferentes etapas de las técnicas analíticas
de determinación de glucósidos cianogénicos de la almendra, que han sido
aplicadas posteriormente en este trabajo.
3.2. MATERIAL Y MÉTODOS.
3.2.1 . Toma, acondicionamiento y conservación de la muestra.
Las almendras analizadas proceden de árboles cultivados en la finca

experimental "Tres Caminos" del CEBAS-CSIC en Murcia . Se cogieron del
árbol en plena maduración cuando el mesocarpo se encontraba completamente
abierto, salvo en el ensayo de la evolución de los compuestos cianogénicos
durante el desarrollo del fruto. Excepto en los casos en que se especifica, todos
los ensayos del presente Capítulo se realizaron con almendras de la variedad
Garrigues.
Cada muestra está constituida por 50 almendras que se tomaron

aleatoriamente . Las almendras fueron desprovistas del mesocarpo e
introducidas en bolsas de malla, debidamente etiquetadas . Posteriormente las
muestras se llevaron al laboratorio del Departamento de Química Analítica de
la Universidad de Alicante para su análisis .
Una vez en el laboratorio las almendras se descascararon manualmente

con un martillo, teniendo especial cuidado de no dañar la semilla y se
prepararon para su conservación, sin eliminación del tegumento .
En el presente trabajo las muestras se conservaron liofilizadas, con el fin

de garantizar que las características fisicoquímicas y organolépticas no
se alteraran de forma significativa .

Las muestras previamente colocadas en unos viales de vidrio se

introdujeron en un liofilizador Telstar 2000, a una presión de 4x10-2 mbar y una
temperatura entre -79°C y -82°C, con el fin de que no se descongelaran .
Con objeto de determinar las condiciones óptimas de liofilización se han

controlado diferentes parámetros:
" Tamaño de partícula de la muestra .

" Tipo de congelación previa .
" Tiempo de liofilización .
Respecto al tamaño de partícula se ensayaron tres tratamientos,

muestras finamente trituradas (con un tamaño de grano menor a 1 mm),
almendras partidas en trozos irregulares de diferentes tamaños inferiores a 5
mm y almendras enteras.
La trituración de las muestras se realizó en un molino con una velocidad

de giro de 3500 r.p.m . El tiempo de trituración fue inferior a 30 segundos, con el
fin de no calentar la muestra y evitar el apelmazamiento que podría producir el
alto contenido de aceite de almendras . Al objeto de que la muestra se calentara
lo mínimo durante la trituración, las almendras se mantuvieron refrigeradas con
anterioridad .
Respecto al tipo de congelación previa a la liofilización se utilizaron dos

procedimientos :
" Congelación lenta, en un congelador a -18°C, 24 horas.

" Congelación rápida, con nitrógeno líquido a -78°C, 30 segundos.
En cuanto a la optimización del tiempo de liofilización, se han ensayado

diferentes tiempos de liofilización entre 2 y 40 horas, utilizando muestras
trituradas, troceadas y enteras, y con congelación rápida y lenta (Figura 3 .1) .

3.2.2. Preparación de las muestras.
Se ha estudiado el efecto de los siguientes aspectos de la preparación

de la muestra, sobre la determinación analítica :
" Eliminación o no de la grasa de la almendra.
" Tamaño de partícula de la muestra.
Troceado antes o después de la liofilización .
Toma de muestra
Descascarado
División de la
m uestra
Entera I I Troceada I I Triturada
Congelación
Rápida - 78°C Lenta - 18°C
Liofílizaci6n
Figura 3.1 . Esquema del acondicionamiento de muestras de almendras para su conservación .

Para estudiar la influencia que tiene el eliminar o no la grasa de la

almendra, se han analizado muestras con grasa y desengrasadas mediante
HPLC y microdifusión, siguiendo los protocolos detallados en los Anexos 3 .3,
3.4, 3 .5 y 3.6.
En los ensayos de microdifusión se adicionó R-glucosidasa, por si en el

proceso de desengrasado con Soxtec, se hubiera podido producir una
inactivación parcial o total de la emulsina que contiene la almendra, o por si
ésta no fuera suficiente como para producir la hidrólisis de la totalidad de
compuestos cianogénicos presentes .
Para ello 40 alicuotas de muestra triturada fueron congeladas con

nitrógeno líquido y liofilizadas durante 32 horas . 20 se desengrasaron,
utilizando un equipo Soxtec. De ellas 10 se analizaron por HPLC y otras 10 por
microdifusión . De las otras 20 alicuotas restantes sin desengrasar, 10 se
analizaron por microdifusión y las otras 10 por HPLC .
Para realizar el desengrasado de las muestras se ha utilizado un equipo

Soxtec de la casa comercial Selecta . El procedimiento detallado de
desengrasado de las muestras se detalla en el Anexo 3.1 .
Por otro lado se ha estudiado el efecto del tamaño de la partícula de la

muestra (triturada, troceada o entera) en los resultados del análisis, tanto por
cromatografía como por microdifusión .
También se estudió el efecto que podría tener la trituración de la muestra

antes o después de la liofilización sobre la determinación de la concentración
de glucósidos cianogenicos estimada . Para ello se analizaron por HPLC y
microdifusión (con determinación colorimétrica), muestras trituradas antes de
su liofilización y muestras liofilizadas (partidas en trozos) y trituradas
posteriormente .

58 / Puestaa punto de métodosanalíticos
de glucósidoscianogénicospor
3.2.3.Puestaa puntode la determinación
HPLC.
Extracciónde los glucósidoscianogénicos.

3.2.3.1.
de glucósidos
el procesode extracción
En primerlugar,se ha optimizado
cianogénicosen semillade almendra,estudiandolos efectosde diferentes
comoson:agua,metanol10OoA,
sistemasextractantes metanol:agua(80:20).
(20:80) y extracciónSoxtec con
metanol:agua(50:50), acetonitrilo:agua
metanol100%.
de la extracciónde los glucósidoscianogénicos

La optimización se ha
realizadocon la muestra53088,de saborligeramenteamargo,que tiene un
de 9.8 mg de cianuro/1009
contenido de muestraseca.
La extracción de compuestos cianogénicosutilizando diferentes

de 30oC,en un baño con
se realizóa una temperatura
sistemasextractantes
agitación(Memmert)entre 30 minutosy 20 horas,exceptoen el caso de la
con Soxtecque se llevóa caboa 80oCdurante2 horas.
extracción
con aguase efectúade la siguientemanera.A la muestra

La extracción
se le añadeaguahirviendoy posteriormente
se deja en un bañocon agitación
a 30oC.
Por su interés,se han estudiadode forma más detalladalos sistemas

y metanol:agua
metanol1O0oA
extractantes (80:20),observandola influencia
paraamboscasos.
del tiempode extracción
Las experiencias en sometera extraccióncon

realizadasconsistieron
ambos disolventes,alícuotas de una misma muestra durante tiempos
conobjetode optimizarel tiempode extracción.
diferentes,

Puestaa puntode métodosanalíticos/ 59
paracomprobarla
la mismaexperiencia
Así mismose ha aprovechado
estabilidadcon el tiempo de los extractosobtenidoscon ambos sistemas
a 4oC.
mantenidos
extractantes,
de la extracción,
En cuantoal rendimiento se realizaron
tresextracciones
sucesivascon metanolpuro sobre 10 alicuotasde una misma muestra,
el porcentajede amigdalinaen cada extractode la siguiente
obteniéndose
forma:
Porcentajede amigdalinadel extracto= Area g¡¡¿de/Afe?

161¿¡
Afea 1o6¡= Afea extractol+ Afea extracto

Z + Afea extracto3
por HPLG.
de los glucósidoscianogénicos
3.2.3.2.Determinación
ensayosparadeterminar
Se realizaron el tipo de columnamás idóneo.
Se ensayóunacolumnadel tipoC18(SymmetryC18, Waters,250x 4.6 mm,
100 x 4.5 mm, 5 pm).),
5 pm), y una columnaHipercarb(Thermohipersil,
por Chainbault
recomendada (1988),que tienecomofase estacionaria
carbón
se antepusouna precolumna
activo poroso.A la columnacromatográfica
con objetode preservarla
tambiéndel tipo C18 o Hipercarbrespectivamente,
columna.
Tambiénse estudióel efecto de distintoseluyentes(metanol:agua,

y metanol:tampón
acetonitrilo:agua fosfato)sobrela determinación
analítica.
El sistemade detecciónelegidoha sido el fotométrico,ajustandola

longitudde onda de absorcióna 218 nm, longitudde onda que se encuentra
analizado(208nm),perocon la
cercadel máximode absorcióndel compuesto
ventajade presentar
menorabsorción
del eluyente.
El cromatógrafo fue un Watersmodelo600 Controler.

utilizado
Respectoa la determinación se prepararonpatronesde

cuantitativa,
amigdalinaen el intervalode concentración
adecuado,obteniendodos curvas
de amigdalinaentre1 x 10-oy
de calibrado.Unade ellascon concentración
2x10-qM, se empleó para determinarla amigdalinaen muestrasdulces y

ligeramente amargas . La otra, con valores de amigdalina entre 1 .2 x 10-4 y

1 .3 x 10-3 M, se utilizó para la determinación de amigdalina en muestras
amargas .
Además se realizó una curva de calibrado similar para la prunasina con

concentraciones entre 1 .5 x 10-6 y 2.1 x 10-5 M . Como ya se ha indicado, este
glucósido solamente aparece en la almendra en los primeros meses de
desarrollo del fruto, pero nunca se encuentra en semillas maduras . Las curvas
de calibrado se han obtenido a partir de patrones de amigdalina y prunasina
(Sigma), disueltos en metano] .
Por tanto, se aplicó el método de calibrado con patrones externos para la

determinación cuantitativa y un detector "diode array" para la evaluación de la
pureza de los picos cromatográficos .
La reproducibilidad del método cromatográfico se estudió a dos niveles

de concentración de cianuro (equivalente a amigdalina) . La reproducibilidad del
método cromatográfico se ha estudiado con muestras de la variedad Garrigues
(ligeramente amarga) con 1 .31 mg de cianuro/100g de muestra seca, y de la
variedad Titan (dulce), con 0 .03 mg de cianuro/100g de muestra seca.
3.2.4. Puesta a punto del método de microdifusión .
El análisis por microdifusión se divide en dos etapas:
La primera de ellas consiste en la hidrólisis de los glucósidos

cianogénicos de la muestra y la posterior difusión del ácido cianhídrico
generado.
La segunda etapa consiste en la determinación cuantitativa del

cianuro generado por la difusión del ácido cianhídrico, que reacciona con
una disolución de hidróxido sódico contenido en un recipiente colector
dispuesto para tal fin dentro del vaso de reacción . La determinación se
lleva cabo por distintos métodos dependiendo del nivel de concentración
del glucósido cianogénico :

" Para muestras con contenido en cianuro por debajo de 41 .9 mg /100g, se

utiliza la determinación colorimétrica .
Para muestras con contenido en cianuro por encima de 41 .9 mg/100g, se

realiza la determinación mediante valoración gravimétrica .
Se han estudiado y optimizado los diferentes parámetros que influyen

tanto en la etapa de hidrólisis y microdifusión del ácido cianhídrico generado,
como en los métodos posteriores de determinación de cianuro .
3 .2 .4.1 . Hidrólisis y microdifusión .
En esta etapa del análisis por microdifusión se han optimizado los

siguientes parámetros :
1 . Tamaño de partícula .
2 . Tratamiento previo de la muestra (desengrasado) .
3 . Adición de enzima externa (R-glucosidasa) .
5 . Temperatura de extracción .
6 . Tiempo de hidrólisis .
7 . Concentración y volumen de la disolución de hidróxido sódico.
8 . Tamaño del reactor.
Los dos primeros apartados ya fueron explicados anteriormente .
Respecto al apartado tercero, se han analizado por microdifusión

muestras de la variedad Garrigues, unas sin adicionar enzima y otras con
adición de P-glucosidasa .
En cuanto al pH se fijó a 5 .5 (el recomendado en la bibliografía)

añadiendo a la muestra tampón fosfato .

Se estudió el efecto del tiempo en tres condiciones de temperatura:

30°C, 35°C y temperatura ambiente (18-25°C) . Este estudio se llevó a cabo con
un patrón de cianuro potásico 7 .69 x 10-6 M, en las mismas condiciones de pH
en las que se trata la muestra.
Una vez que se hidrolizan los glucósidos cianogénicos presentes en la

muestra, el ácido cianhídrico formado debe difundir dentro del recipiente
cerrado herméticamente, donde se lleva a cabo la hidrólisis, hacia el recipiente
colector que contiene 1 ml de NaOH 0 .2 N .
La concentración y volumen de NaOH también se han optimizado

después de realizar ensayos, variando tanto la concentración de NaOH como
del volumen de disolución que debe introducirse en el recipiente colector .
Las dimensiones del reactor se han variado entre 5.0 y 7.0 cm de alto y
2 .0 y 4.5 cm de diámetro . Así mismo, se han utilizado dimensiones del
recipiente colector entre 2 .5 y 4.5 cm de alto y 1 .0 y 2.5 cm de diámetro .
3 .2 .4.2 . Determinació n colorimétrica .
El método colorimétrico consiste en introducir en un matraz aforado de
25 mi , el volumen NaCN que se recoge del vial colector, utilizando para ello un
cuentagotas . Posteriormente se lava el colector con 4 mide NaOH 0 .2N en
varias porciones, añadiendo también los lavados al matraz.
A continuación se adicionan en este orden, 5 mide KH2PO4, 0.5 mide

cloramina T y 1 mL de barbitúrico en piridina, enrasando finalmente a 25 mi-
con agua destilada. El producto coloreado tiene su máximo de absorción a 580
nm . El espectrofotómetro utilizado fue un Hitachi U-2000.
Ha sido necesario optimizar el orden y la cantidad de reactivos a añadir,

así como controlar de forma cuidadosa la conservación y caducidad de los
reactivos, en particular la disolución de cloramina T.

La obtención de pésimos resultados de reproducibilidad en los primeros

ensayos realizados, motivó el estudio de la estabilidad de los diferentes
reactivos utilizados, así como del patrón de cianuro . Este estudio se llevó a
cabo controlando el tiempo en el que los reactivos y el patrón daban resultados
reproducibles .
El tiempo necesario para el desarrollo del color estable se estudio

midiendo la absorbancia de los extractos entre 10 y 40 minutos después de la
adición de los reactivos.
Además, hay que reseñar también, la necesidad de lavar todo el material

con ácido nítrico, después de su utilización, al objeto de tener resultados
reproducibles .
La reproducibilidad se estudió a dos niveles de concentración con 10

muestras de la variedad Garrigues con contenido de cianuro de 1 .30 mg/100g
muestra seca y con 10 muestras de la variedad Titan con contenido de cianuro
próximo al limite de detección (0 .03 mg /100g muestra seca) .
3.2.4.3 . Determinació n por valoración gravimétrica .
Este método consiste en valorar el cianuro generado adicionando una

disolución patrón de nitrato de plata hasta viraje del indicador Rodanina, que
cambia de amarillo a rojo en cuanto hay un exceso de Ag+. La determinación
de la concentración de CN - en la muestra se obtiene por diferencia de pesada
de la disolución de nitrato de plata, lo cual permite conocer los mililitros
gastados en la valoración.
En este método hay que llevar especial cuidado en la preparación y

conservación de la disolución patrón de nitrato de plata, la conservación del
patrón de cianuro y la preparación del indicador .
Se ha estudiado la reproducibilidad del método con una muestra

amarga, en concreto la S3108 (217 .80 mg de cianuro /100g de muestra seca) .

3 .2 .5. Comparación de métodos analíticos .
El material vegetal utilizado para la comparación de los dos métodos

(HPLC y microdifusión) consiste en un conjunto de 95 muestras de almendras
maduras dulces, amargas y ligeramente amargas, con un amplio rango de
contenido de amigdalina . Corresponden a las muestras de dos años de la
descendencia Garrigues x Tuono, descrita en el Apartado 2 .2 . El análisis de
cada muestra se realizó por triplicado para cada uno de los métodos de
determinación utilizados .
Dado que los resultados obtenidos por HPLC se refieren a amigdalina y

los de microdifusión a cianuro, al objeto de poder compararlos, los resultados
de amigdalina se transformaron a su equivalente en cianuro .
En el Anexo 3 .7 se muestran los valores medios de contenido de cianuro

equivalente a la cantidad de amigdalina determinada por HPLC y los valores de
cianuro obtenidos por microdifusión para cada muestra estudiada junto a sus
respectivas desviaciones estándar. En esta tabla quedan reflejadas las
notables diferencias existentes entre los contenidos de las muestras dulces y
ligeramente amargas frente a las amargas . Estas diferencias son precisamente
las que han motivado el tener que utilizar dos técnicas de determinación
diferentes al aplicar la metodología de microdifusión .
Para las muestras amargas, de contenidos altos en cianuro, se ha

utilizado la valoración gravimétrica, mientras que para las muestras dulces y
ligeramente amargas cuyo contenido en cianuro es notablemente inferior, se ha
utilizado la determinación colorimétrica.
La comparación de los resultados obtenidos aplicando el método de

trabajo de HPLC frente a los obtenidos por microdifusión se realizó mediante
un análisis de regresión lineal entre los valores de amigdalina obtenidos por los
dos métodos . Los resultados obtenidos por ambos métodos serán comparables
cuando los valores de 0 para la ordenada en el origen y 1 para la pendiente
queden incluidos dentro de los intervalos de confianza calculados
respectivamente para cada uno de los estimadores .

Dado que se han utilizado dos técnicas de microdifusión, se realizaron

dos análisis de regresión diferentes uno para colorimetría (para las muestras
dulces y ligeramente amargas) y otro para valoración gravimétrica (para
muestras amargas).
3 .3 . RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3 .3 .1 . Conservación de la muestra por liofilización
En la Figura 3 .2 . se aprecia que el tamaño de partícula de la muestra

influye de forma significativa en la extracción final de agua durante el proceso
de liofilización, obteniéndose el mayor rendimiento en las muestras trituradas.
En este caso, bastaron 32 horas para obtener el rendimiento máximo . Con la
muestras de almendras troceadas se consiguió una pérdida del 88% de
humedad en 40 horas . Finalmente con las almendras enteras, en 40 horas se
perdió solamente el 72% de humedad .
1001
80-11
60-1
20
5 10 15 20 25 30 35 40
Terrpo de lidilizadón (hogs)
+ (Triturada ycongeladón rápida) -m- (Trit urada y~adán lerta)
(Troosada yoorxgeladón rápida) -X (Troceada y~adán lerta)
-~ (Erteray ~ación rápida) -"-- (Erteray ~ación lenta)
Figura 3.2 . Pérdida de humedad durante el liofilizado de una muestra de almendra de

Garrigues en función del tiempo de liofilizado, tipo de congelación previa y tamaño de partícula
de la muestra .

6 6 /Puesta a punto de métodos analíticos
Así mismo, en la Figura 3.2 se observa que tampoco hay una marcada
diferencia en la pérdida de humedad al utilizar una congelación previa rápida
frente a una lenta, en cuanto al tiempo de liofilizado necesario . Dada la mayor
rapidez y seguridad de la congelación con nitrógeno líquido, consideramos que
es el método más adecuado para nuestro trabajo . Con el fin de evitar que las
muestras ya congeladas pierdan algunos grados de temperatura al introducirlas
en el liofilizador, se mantiene la temperatura del equipo a -78 °C.
Hay que indicar que el procedimiento de liofilización que se acaba de

exponer, con muestra triturada y congelada de forma rápida es aplicable
solamente en el caso de que se trabaje con almendra madura . En los ensayos
de evolución, donde la almendra no está cuajada, la liofilización se realizó con
la almendra entera y también con congelación rápida, después de comprobar
que tampoco existe un efecto notorio del tipo de congelación en los resultados
de contenido en compuestos cianogénicos en este tipo de muestras .
El protocolo seguido para la liofilización de las muestras, tanto de

almendra madura como de almendra en diferentes etapas de desarrollo se
encuentra en el Anexo 3.2.
3 .3.2 . Optimización de la preparación de la muestra para su análisis .
Los resultados obtenidos del estudio realizado con muestras con grasa y
desengrasadas se muestran en la Tabla 3 .1 .
Los resultados obtenidos con muestra desengrasada se refieren a

muestra entera, es decir, teniendo en cuenta el porcentaje de grasa extraído
previamente (en torno al 50%).
De los resultados expuestos en la Tabla 3 .1, se concluye que existen

diferencias significativas en cuanto a la determinación de glucósidos
cianogénicos, tanto por microdifusión como por cromatografía, en muestras con
grasa o desengrasadas, siendo los resultados obtenidos con muestras
desengrasada alrededor de un 15% más bajos y mucho menos precisos .

Tabla 3.1 . Análisis de muestras de almendra variedad Garrigues trituradas y congeladas con
nitrógeno líquido antes de su liofilización con grasa o desengrasadas antes del análisis por
HPLC y por microdifusión . Contenido de cianuro expresado como mg/100g de muestra seca .
HPLC Microdifusi6n
Muestras, Con_ grasa Sin rasa.. Con grasa ~, Sin grasa

1~~ 1 .32 1 .20 ~~1 .30 1 .01
2 1 .28 1 .07 1 .33 1 .10
3 1 .36 1 .13 1 .35 0.97
4 1 .28 1 .01 1 .26 1 .24
5 1 .27 1 .25 1 .24 1 .18
6 1 .34 1 .10 1 .29 0.92
7 1 .32 1 .18 1 .34 0.79
8 1 .34 0.80 1 .32 1 .21
9 1 .30 0.96 1 .36 1 .11
10 1 .33 1 .12 1 .24 1 .07
Media 1 .31 1 .08 1 .30 1 .06

Desviación estándar 0.03 0 .13 0.04 0 .14
De estos resultados se deduce que se debe producir una pérdida de

amigdalina en el desengrasado, ya que si solo se hubiera inactivado la enzima,
los resultados no se habrían visto afectados porque, en el análisis por
microdifusión, como se indicó en Material y Métodos se añade enzima.
Por otro lado, tampoco se consigue una mejora sustancial del

cromatograma en el caso de que se lleve a cabo el desengrasado a una
muestra con contenido bajo en amigdalina, por lo que en este trabajo se optó
por analizar las muestras sin desengrasar previamente.
En cuanto a la trituración o no de la muestra, ya se ha comentado en el

apartado dedicado a la conservación de la muestra que el tamaño de partícula
afecta de modo significativo al rendimiento y al tiempo de liofilización .
Además, ensayos preliminares cualitativos mostraron que con la muestra

triturada, se obtienen mejores resultados analíticos . Esto es consecuencia de
que con la muestra triturada se obtiene una mejor extracción de los glucósidos
cianogénicos en metano¡ para su posterior determinación por cromatografía,

así como también una mejor hidrólisis de amigdalina, necesaria para su

determinación por microdifusión .
Por lo tanto, parece claro que es necesario triturar la muestra para

realizar el análisis de los glucósidos cianogénicos .
Los resultados sobre el posible efecto de la trituración de las almendras

antes de la liofilización, sobre la determinación de los glucósidos cianogénicos
por HPLC o por microdifusión se presentan en la Tabla 3 .2 .
Tabla 3.2 . Contenido cianuro (mg/100g de muestra seca) de almendras de la variedad

Garrigues trituradas antes o después de la liofilización, determinado mediante HPLC y
microdifusión .
Microdifusión
_ _
T Triturada T Triturada ~ Triturada Triturada
Muestra Antes después antes después
1 1 .32 1 .30 1 .30 1 .28

2 1 .28 1 .33 1 .33 1 .33
3 1 .36 1 .29 1 .35 1 .37
4 1 .28 1 .26 1 .26 1 .31
5 1 .27 1 .36 1 .24 1 .25
6 1 .34 1 .23 1 .29 1 .23
7 1 .32 1 .34 1 .34 1 .29
8 1 .34 1 .29 1 .32 1 .32
9 1 .30 1 .31 1 .36 1 .35
10 1 .33 1 .25 1 .24 1 .34
Media 1 .31 1 .30 1 .30 1 .31

Desviación estándar 0.03 0 .04 0.04 0.04
Los resultados indican que las concentraciones de amigdalina y cianuro

obtenidas, fueron semejantes con independencia de haber triturado la muestra
antes o después de la liofilización .
Como hemos visto anteriormente que en las muestras trituradas la

liofilización es más eficiente, en este trabajo se ha optado por triturar la muestra
antes de liofilizarla .

3.3 .3 . Determinación de glucósidos cianogénicos por HPLC.
3.3 .3 .1 . Extracción de los glucósidos cianogénicos .
Los extractos obtenidos después de 16 horas de tratamiento a 30°C con

los distintos sistemas extractantes utilizados se analizaron por HPLC,
obteniendo los resultados que se muestran en la Tabla 3 .3 .
Tabla 3.3. Resultados de extracción con diferentes extractantes . Concentración de cianuro

expresada en mg / 100 g de muestra seca.
Extractante Tiempo de retención Concentración

1 Metano¡ Amigdalina: 8.5 min 9 .8 mg cianuro/1 OOg
Cagua
;Agua Amigdalina: 3.3 min =
Cmetanol / 360
No Identificado : 8.2 min Pico ancho y asimétrico
'Metano¡ : Agua Amigdalina: 3.3 min Cmetanol :agua (80:20)=Cmetanol /8
Ï (80:20) Prunasina : 5 .9 min Cmetetanol :agua(80 :20)= 8 .8 mg/1 OOg
`Metanol : Agua Amigdalina: 3.3 min C metanol /36
Cmetanokagua (50:50)=
(50:50) No identificado : 8.3 min Pico ancho y asimétrico

Acetonitrilo : Agua Amigdalina: 3.3 min Cacetonitdlo :agua (20:80) _ Cmetanol 136
(20:80) No identificado 8.3 min Pico ancho y asimétrico
Metanol (Soxtec*) Mezcla sin resolver : 3.3 min Pico ancho y asimétrico
Cmetanol = Concentración usando metano¡ como extractante .

Cagua = Concentración usando agua como extractante.
Cmetanol :agua (80:20) = Concentración usando metanol:agua (80:20) como extractante.
Cmetanol :agua (50:50) = Concentración usando metanol :agua (50:50) como extractante.
Cacetonitrilo:agua (20:80)= Concentración usando acetonitrilo :agua (20:80) como extractante.
* La extracción con Soxtec se realiza durante un tiempo de 2 horas.
Se observó que la extracción con agua no resultó efectiva, ya que

proporcionó un rendimiento muy bajo cualquiera que fuera el tiempo de
extracción .

Así mismo la extracción con acetonitrilo :agua (20 :80) también fue
deficiente y la extracción con Soxtec produjo un pico cromatográfico deforme,

lo que parece indicar que coeluyen otros componentes que también se han
extraído junto con la amigdalina .
Merece especial atención el resultado obtenido con metanol:agua en

diferentes proporciones . El extractante metano¡ 100% proporciona un pico
cromatográfico a 3 .5 minutos que corresponde a amigdalina, con una
concentración de 9.8 mg/100g de muestra seca . Sin embargo, si se emplea la
proporción metanol:agua (80 :20) se obtiene un pico a 3 .3 minutos con una
concentración de amigdalina 8 veces menor.
Además aparece un pico a 5 .9 minutos que se corresponde al tiempo de

retención de la prunasina, con una concentración de 8 .8 mg/100g muestra
seca . Si la mezcla es metanol :agua (50 :50) resulta que el pico correspondiente
a amigdalina ha disminuido en 36 veces su concentración, no aparece ningún
pico al tiempo de retención de la prunasina y sin embargo aparece un pico
ensanchado y deforme a un tiempo de retención de 8 .3 minutos .
Todo ello indica que la presencia de agua en el extractante hace que la

amigdalina extraída vaya degradándose paulatinamente a prunasina, y si la
proporción de agua es suficientemente alta, la degradación continúa
probablemente hasta cianhídrina o incluso benzaldehído.
La suma de amigdalina y prunasina extraída con metanol :agua (80 :20)

coincide prácticamente con la concentración de amigdalina extraída con
metano¡ 100% durante 16 horas de extracción (Figuras 3.3. y 3 .4).
Por otra parte, extrayendo con metano¡ 100% en muestras de almendras

amargas procedentes de los primeros meses de su desarrollo, se ha
comprobado que se extrae amigdalina y prunasina, por lo tanto el metanol
100% es capaz de extraer ambos glucósidos si éstos están presentes en la
muestra.

12
m
8
E
m
0
0
4],
ó
c
c
m
m
E
Tiempo de extracción (horas)

Figura 3 .3. Variación del contenido de amigdalina expresado como mg de cianuro/100g
muestra seca, extraída con metano¡ 100% en función del tiempo de extracción .
O
O
O
C
Tiempo de extracción (horas)

Amigdalina f Prunasina
-*--Amigdalina+Prunasina
Figura 3.4. Variación del contenido de amigdalina, prunasina y cianuro total expresado como
(mg de cianuro/100g muestra seca) utilizando el sistema extractante metanol :agua (80 :20) en
función del tiempo de extracción.
Por ello, se puede afirmar que en almendra madura el único glucósido

cianogénico es la amigdalina, en contra de lo publicado por Usa¡ (1992), que
encontró prunasina . Muy probablemente este resultado fue consecuencia de la

degradación de la amigdalina a prunasina, debido al sistema de extracción

utilizado en dicho trabajo.
A la vista de los resultados obtenidos, decidimos utilizar en este trabajo

metano¡ 100% como extractante de los glucósidos cianogénicos. Se observa
que el extractante metano¡ puro proporcionó una concentración de amigdalina
máxima a partir un tiempo de extracción de 12 horas (Figura 3.3) .
Con la mezcla metanol :agua (80:20) se obtuvo un rendimiento máximo

de extracción a tan solo 4 horas, si se considera la suma de amigdalina y
prunasina (Figura 3 .4). Por lo tanto, ésta también podría ser una alternativa
válida, pero con el inconveniente de que existe una transformación de
amigdalina en prunasina, y por lo tanto solo sería aplicable si lo que interesa es
el contenido total de cianuro, pero nunca para cuantificar amigdalina y
prunasina por separado .
Los resultados sobre la estabilidad del extracto se presentan en la Figura

3 .5 . Se representa el contenido (mg de cianuro/100g de muestra seca) de
amigdalina extraída con metano¡ 100%, amigdalina y prunasina extraídas en
metanol :agua (80:20) y como referencia se muestra el contenido de cianuro
obtenido por microdifusión para la misma muestra.
Se observa que el extracto obtenido en metano¡ puro es más estable,

manteniéndose durante 10 días a 4°C, mientras que el obtenido en la mezcla
metanol :agua (80 :20) se va degradando, prosiguiendo la transformación de
amigdalina en prunasina e incluso llegando con el tiempo a la hidrólisis de la
prunasina .
Por todo lo anteriormente expuesto, se optó por trabajar con metano¡

100% como agente extractante, dejando en contacto la muestra triturada,
congelada con nitrógeno líquido, liofilizada y sin desengrasar durante 16 horas
con agitación y a una temperatura de 30°C, con objeto de asegurar que el
rendimiento de la extracción fuera elevado y reproducible . El extracto obtenido
en estas condiciones es estable durante 10 días mantenido a 4°C .

12
MAmigdalina en metanol MAmigdalina en metanol:agua (80:20)

p Prunasina en metanol:agua (80:20) M Microdifusión
Figura 3.5 Estabilidad dei extracto obtenido con metanol 100% y con metanol:agua (80 :20)
expresado en mg de cianuro/100g muestra seca. Comparación con el contenido obtenido por
microdifusión .
En cuanto al rendimiento de la extracción, en la Tabla 3 .4 puede

observarse que la primera extracción proporcionó un porcentaje elevado y
reproducible de extracción . Por ello se optó por trabajar con el primer extracto,
considerando una recuperación del 91 .2% en el proceso de extracción .
Tabla 3.4. Valores medios porcentuales de amigdalina y desviación estándar obtenidos para
tres extractos sucesivos .
Extracto Porcentaje de extracción Desviación estándar
1° 91 .2 1 .6
2° 7 .7 1 .3
3° 1 .1 0.5

74 / Puesta a punto de métodos analíticos
3.3.3.2. Condicione s cromatográficas .
Las dos columnas utilizadas en este estudio proporcionaron resultados

satisfactorios, tanto para los patrones como con muestra reales, aportando
resultados de mayor calidad sobre todo para muestras con concentraciones
altas de glucósidos cianogénicos. Para muestras dulces, con concentración de
amigdalina cercana al límite de detección, se observa la aparición de
interferencias debidas a sustancias extraídas que eluyen a tiempos de
retención cercanos.
En cuanto a la optimización del eluyente, con la columna Hipercarb el

eluyente más adecuado resultó ser el constituido por metanol :agua (90 :10), que
trabajando a un caudal de fase móvil de 1 .5 mL/min, proporciona los siguientes
tiempos de retención : 2.0 minutos para prunasina y 6.7 para amigdalina.
Con la columna Symmetry el eluyente más adecuado fue el

acetonitrilo :agua (20 :80) que proporciona tiempos de retención de 3.4 minutos
para amigdalina y 5.7 minutos para prunasina. Como se observa el orden de
elución cambia de una columna a otra .
Para el análisis de almendras maduras, donde sólo hay amigdalina, la

columna más adecuada es la Symmetry C18, con la que se consigue
determinar la amigdalina en un tiempo más corto . Además, proporciona una
buena separación de los dos glucósidos (amigdalina y prunasina) presentes en
la almendra durante su desarrollo, en menos de 10 minutos, trabajando a una
velocidad de flujo de 1 .3 mL/min . Además, permite que ambos componentes
eluyan puros, separados de otros componentes del extracto metanólico, pureza
que ha sido contrastada mediante la utilización de un detector fotométrico
"diode array" .
Tan solo cuando la concentración de amigdalina está cercana al límite

de detección, debido a la escala de trabajo, en el cromatograma se observa
una impureza junto al pico correspondiente a amigdalina, que hace que haya
que ajustar la integración según los parámetros de pureza de pico del detector
"diode array" .

En la Figura 3.6 se muestra un cromatograma tipo obtenido a partir de

una mezcla patrón de amigdalina y prunasina. Como se observa el tiempo de
retención para la amigdalina y prunasina es de 3 .4 y 5.7 minutos respectivamente .
Figura 3.6. Cromatograma de una mezcla patrón de amigdalina (3.4 minutos) y prunasina
(5.7 minutos) obtenido utilizando una columna Symmetry Cl 8.
3 .3.3.3. Determinación cuantitativa .
Las rectas de calibrado obtenidas son las siguientes :
Muestras dulces y ligeramente amargas (amigdalina) :
Y=8.050x10 9 +5 .513x104
Muestras amargas (amigdalína) :
Y=6 .573x109 +5.125x104
Muestras amargas y ligeramente amargas en evolución (prunasina) :
Y = 8 .751 x 109 + 2.593 x 104
A partir de estas rectas de calibrado se calculó el límite de detección

para amigdalina y prunasina :

" Límite de detección de la amigdalina: 0.387 mg /100g de muestra

seca, cuando se trabaja con 0 .4 g de muestra y se utiliza un
volumen de extracción de 5 ml- de metano¡.
" Límite de detección de la prunasina: 0.136 mg /100g muestra
seca, con las mismas condiciones de extracción que para
amigdalina .
En la Tabla 3.5 se presenta la reproducibilidad del método a los dos

niveles de concentración estudiados . Se observa que el coeficiente de
variación toma valores de 2 .3% para la variedad Garrigues, y de 22% para la
Titan .
Tabla 3.5. Reproducibilidad del método cromatográfico a dos niveles de concentración de

amigdalina. Contenido de cianuro mg/100g de muestra seca .
MUESTRAS Garri ues Titan

1 1 .32 0.028
2 1 .28 0 .020
3 1 .36 0.034
4 1 .28 0.029
5 1 .27 0.026
6 1 .34 0.031
7 1 .32 0.033
8 1 .34 0.027
9 1 .30 0.021
10 1 .33 0.016
Media 1 .31 0.027

Desviación estándar 0.03 0.006
Coeficiente de variación (%) 2.3 22.0
El protocolo seguido para el análisis de compuestos cianogenicos, por

HPLC así como los reactivos e instrumentación utilizados para la determinación
cromatográfica se detallan en el Anexo 3 .3.

3.3.4. Determinación de glucósidos cianogénicos por microdifusión.
3.3.4.1 . Hidrólisis y microdifusión .
Los resultados de la optimización del tamaño de partícula de la muestra

y de la conveniencia o no del desengrasado ya se han expuesto Apartado
3.3 .2, concluyendo que se debe trabajar con muestras trituradas (< 1 mm) y sin
desengrasar .
Las concentraciones de cianuro obtenidas para muestras de Garrigues

tras la adición o no de R-glucosidasa (Tabla 3 .6) fueron muy similares, por lo
que en nuestras condiciones de trabajo es innecesario adicionar R-glucosidasa .
Aparentemente, la propia almendra contiene enzima suficiente para lograr la
hidrólisis total .
Tabla 3.6. Análisis por microdifusión de muestra de la variedad Garrigues con y sin adición de
enzima R-glucosidasa externa . Contenido de cianuro mg/100g muestra seca.
_Muestra Con lucosidasa _§19_ -U ucosidasa
1 1 .30 1 .26
2 1 .33 1 .29
3 1 .35 1 .36
4 1 .26 1 .26
5 1 .24 1 .33
6 1 .29 1 .36
7 1 .34 1 .29
8 1 .32 1 .30
9 1 .36 1 .27
10 1 .24 1 .34
Media 1 .30 1 .30

Respecto al efecto del tiempo y la temperatura sobre el rendimiento en la

extracción (porcentaje de recuperación del patrón de KCN de 7 .69 x 10-6 M) se
observa que a 35°C la hidrólisis se produce algo más rápidamente, si bien con
24 horas a cualquiera de las temperaturas estudiadas se produce una
recuperación del patrón del 94% (Tabla 3 .7) .

Tabla 3.7. Porcentaje de recuperación en el tiempo (horas) del patrón de KCN de

7 .69 x 10-6 M, a diferentes temperaturas .
Tiempo Temperatura
301C 35°C 18-25 1 C
12 78 80 74
15 83 85 80
18 88 89 84
21 93 94 88
24 94 94 93
27 94 93 94
30 92 94 94
Respecto al diseño de recipiente utilizado en microdifusión, una vez

ensayados diferentes tamaños se optó por la utilización del que se detalla en la
Figura 3 .7, ya que con esas dimensiones se obtiene la mayor recuperación
(94%) y una reproducibilidad adecuada. Las dimensiones exteriores del
recipiente son 6 .0 cm de alto, 3 .0 cm de diámetro y el colector 3.0 cm de alto y
1 .0 cm de diámetro . Se puede afirmar que se consigue un rendimiento mayor
cuando más pequeño sea el espacio de difusión .
pH=5.5
T = 35°C
HCN Tiempo = 24 horas
Muestra
NaOH 11
0 .2 M Tampón fosfato
®e00
Figura 3.7 . Esquema del equipo utilizado para la determinación de cianuro por
microdifusión .

3.3.4.2. Determinació n colorimétrica.
En cuanto a la estabilidad de los reactivos, se ha comprobado que la

disolución de Cloramina T es estable durante 15 días en frigorífico a 4°C . Así
mismo la estabilidad del patrón de KCN de 1000 ppm es de 10 días conservada
en frasco de polietileno, pero sin embargo el patrón diluido se debe preparar
diariamente .
Una vez optimizadas las condiciones para la determinación por

colorimetría se ha obtenido la siguiente recta de calibrado :
Y = 844.229 X + 15.934
El límite de detección teórico de cianuro calculado para esta técnica es

de 0 .013 mg/100 g muestra seca, cuando se trabaja con 0 .4 gramos de
muestra y se lleva a un volumen de 25 mL .
Los resultados de reproducibilidad del método colorimétrico se presentan

en la Tabla 3.8.
Tabla 3.8. Reproducibilidad del método colorimétrico a dos niveles de concentración .

Contenido de cianuro mg 1100 g de muestra seca.
Muestras Garrig ues Titan

_...V
1 .30 0.026
2 1 .33 0.023
3 1 .35 0.032
4 1 .26 0.025
5 1 .24 0.025
6 1 .29 0.022
7 1 .34 0.025
8 1 .32 0.034
9 1 .36 0.024
10 1 .24 0.020
Media 1 .30 0.026

Coeficiente de variación (%) 3.1 15.4

La reproducibilidad disminuye considerablemente a niveles de

concentración extremadamente bajos, ya que el coeficiente de variación pasa
del 3.1 % para Garrigues al 15.4% para Titan . Esto se debe sobre todo a que
los valores de absorbancia medidos son muy pequeños, lo que implica mayor
error fotométrico cuando las concentraciones son tan bajas .
El límite superior de determinación siguiendo el protocolo que se detalla
en el Anexo 3 .5 es de 3.84 x 10-4 M . Las muestras que contienen una cantidad
superior de cianuro deben determinarse por valoración gravimétrica .
3 .3 .4.3. Determinación de cianuro por valoración gravimétrica.
El procedimiento que se sigue para la determinación de cianuro por

gravimétrica se detalla en el Anexo 3 .6. Los resultados de reproducibilidad del
método con una muestra amarga, en concreto la S3108 (217 .8 mg de
cianuro1100g de muestra seca), se indican en la Tabla 3 .9.
Tabla 3.9. Reproducibilidad del método de valoración gravimétrica en una muestra de

almendra amarga (S3108) . Concentración de cianuro en mg 1100g de muestra seca.
Muestra S3108
1 220 .4
2 222 .2
3 215 .4
4 218 .3
5 215 .2
6 216 .4
7 213 .2
8 216 .8
9 219 .6
10 220 .9
-.
- ..
,_ _ _ ,_ ,
El método de determinación por valoración gravimétrica tiene un

coeficiente de variación de 1 .3%, menor que el obtenido con el método
cromatográfico para la variedad Garrigues (2 .3%) y muy inferior a la que se
obtuvo por el mismo método para la variedad Titan (22 .0%) .

El límite de detección viene determinado por la cantidad de AgN03

gastada durante la valoración . Por debajo de 33.4 mg de cianuro/100g de
muestras seca (con 0 .4 g de muestra llevados a 20 mL), los errores de
valoración son importantes, ya que se gasta muy poco reactivo y el volumen se
mide con mucha imprecisión . Por otra parte, si se diluye más el reactivo, el
viraje del indicador no se aprecia convenientemente, lo que implica errores en
el punto final de la valoración .
3 .3 .5. COMPARACIÓN DE MÉTODOS .
En la Tabla 3.10 se muestran los valores de los descriptivos calculados

para cada uno de los conjuntos de muestras, al aplicar el análisis de regresión
lineal.
Tabla 3.10. Valores medios de contenido de cianuro (mg/100 g de muestra seca) y

desviaciones estándar obtenidos mediante HPLC (calculados como cianuro equivalente a
amigdalina) y obtenidos mediante microdifusión, tanto seguida por colorimetría como por
valoración gravimétrica. Coeficientes de correlación de Pearson y significación de los mismos .
Muestras dulces Muestras amargas

li eramente amar as
Microdifusión Microdifusión
HPLC colorimetría HPLC valoración
gravimétrica
Media 4.72 4.53 265 .8 262 .9
Desviación estándar 6.54 6.27 74 .85 72

Coeficiente de
0.980 0.993
correlación
Significación de < 0.001 < 0.001

correlación
Tal como se muestra en la Tabla 3.10 los valores medios de cianuro

para las muestras con alto y bajo contenidos de cianuro, no difieren
prácticamente entre los dos métodos utilizados, siendo también muy
semejantes los valores de desviación estándar obtenidos .
Por otra parte cabe destacar el hecho de que la correlación obtenida

entre los datos correspondientes a los dos métodos es alta y significativa para
ambos conjuntos de muestras .

En la Tabla 3 .11 se muestran los valores calculados para los ajustes a

los modelos de regresión lineal propuestos (coeficiente de determinación, R2 y
error estándar de la estimación, Sy,,), junto al resultado de los análisis de
varianza realizados para contrastar si los modelos propuestos se ajustan
adecuadamente a los datos experimentales .
Tabla 3 .11 . Parámetros calculados relacionados con el ajuste a los modelos de regresión
propuestos para los dos conjuntos de muestras estudiados .
HPLC 1 Microdifusión HPLC 1 Microdifusión

Colorimetría Valoración gravimétrica
Rz 0.960 0.986
SY x 1 .307 9.086
F 5446 .658 3945.373
Significación de F <0 .001 <0.001
De los valores calculados para los parámetros de ajuste, se deduce que

los datos experimentales se ajustan adecuadamente a los modelos de
regresión propuestos, como se pone en evidencia por el alto valor obtenido
para el estadístico F calculado, así como por la significación del mismo .
En la Tabla 3.12, se muestran los valores de los estimadores calculados

(pendiente o coeficiente de regresión y ordenada en el origen), para cada unos
de los modelos de regresión, junto con sus correspondientes desviaciones
estándar e intervalos de confianza calculados para 95% .
Tal como se muestra en la Tabla 3.12 para ambos conjuntos de

muestras, se observa que los valores de 1 para la pendiente y de 0 para la
ordenada en el origen quedan incluidos en los intervalos de confianza (95%), lo
que indica que los resultados obtenidos por ambos métodos para cada
conjunto de muestras no difieren de forma estadísticamente significativa para
un nivel de confianza del 95% .

Tabla 3.12 . Valores de los estimadores calculados para los modelos de regresión propuestos .
HPLC / Microdifusión HPLC / Microdifusión

Colorimetría Valoración gravimétrica
Pendiente (b) 1 .02 1 .04
Desviación estándar
de la pendiente (Sb) 0.01 0.02
Intervalo de confianza
de la pendiente (95%) 0.99-1 .05 1 .00-2
Ordenada en el origen (a) 0.09 - 7
Desviación estándar de la
ordenada en el origen (Sa) 0.11 5
Intervalo de confianza de
ordenada en el origen (95%) -0.12- 0.30 -16- 2
Por tanto, los métodos aplicados proporcionan resultados comparables

al nivel de confianza estudiado para los intervalos de concentración presentes
en las muestras (almendra dulce, ligeramente amarga y amarga).
En las Figuras 3.8 y 3.9, se muestran los resultados obtenidos

experimentalmente por cada método de determinación utilizado, junto con la
recta de regresión propuesta como modelo en cada caso . El análisis estadístico
muestra que los resultados obtenidos mediante HPLC y microdifusión
(colorimetría o valoración gravimétrica) son equivalentes, para un nivel de
confianza del 95% .
Desde el punto de vista práctico, el método de HPLC utilizado es más

sencillo en cuanto a la preparación previa de la muestra, requiere menor
destreza y tiempo de análisis (sobre todo se dispone de un inyector automático
de muestras) y proporciona resultados comparables a los de microdifusión .
Además, presenta la ventaja adicional de permitir la identificación y
cuantificación de los compuestos cianogénicos (amigdalina o prunasina)
presente en la muestra.

84 / Puesta a punto de métodos analíticos
v 30
f0
'U
0)
E
5 10 15 20 25 30
mg cianuro/100g ( Microdifusión)
Figura 3.8. Valores medios de contenido de cianuro en mg de cianuro/100g de muestra seca

obtenidos a partir de la aplicación de los métodos de HPLC y microdifusión con determinación
colorimétrica, junto con el modelo de regresión lineal propuesto .
,-. 500 -
J
400 -
rn
0
0
300 -
mC
E
100
C
(0
U
0)
E 50 100 150 200 250 300 350 400 450
mg cianuro/100g (Microdifusión)
Figura 3.9. Valores medios de contenido de cianuro en mg de cianuro /100 g de muestra seca
obtenidos a partir de la aplicación de los métodos de HPLC y microdifusión con determinación
con valoración gravimétrica, junto con el modelo de regresión lineal propuesto .

3.4. CONCLUSIONES
1 . El acondicionamiento y preparación de las muestras más adecuado para la

determinación analítica de los compuestos cianogénicos fue utilizar almendras
con tegumento, sin desengrasar, trituradas, congeladas con nitrógeno líquido y
liofilizadas durante 32 horas . En el caso específico del estudio de evolución la
liofilización se realizó con almendras enteras durante 40 horas .
2 . Para el análisis por HPLC, la extracción de los compuestos cianogénicos de

la almendra debe realizarse con metano¡ 100% durante 12 horas, a 30°C y con
agitación. El extracto obtenido con metanol es estable durante 7 días.
3. Las condiciones cromatográficas seleccionadas han sido: Columna

Symmetry C18, eluyente acetonitrilo:agua (80:20), caudal 1 .3 mL/min y detector
fotométrico a 218 nm .
4. El coeficiente de variación obtenido en cromatografía, como medida de la

reproducibilidad del método, fue del 2 .3% a niveles de concentración 100 veces
por encima del límite de detección y del 22% en niveles de concentración
cercanos al límite de detección . El límite de detección para amigdalina es de
0.387 mg/100g y para prunasina de 0 .136 mg cianuro/100g .
5. En el análisis por microdifusión, para llevar a cabo la hidrólisis de los

glucósidos no es necesaria la adición de (3-glucosidasa, manteniendo en todos
los casos las muestras en el recipiente de difusión durante 24 horas a 35°C.
6. La determinación colorimétrica se utilizó en muestras con contenido de

cianuro inferior a 41 .9 mg/1008 muestra, a partir del cianuro generado y
recogido sobre la disolución 0.2 M de NaOH, mediante la formación de un
derivado coloreado que absorbe a 580 nm que se forma al adicionar ácido
fosfórico, cloramina T y barbitúrico en piridina.
7 . El coeficiente de variación del método fue del 3.1 % para concentraciones

de cianuro 100 veces por encima del límite de detección y del 15.4 % para
valores de cianuro cercanos al límite de detección de esta técnica (0 .013
mg/100g de muestra seca) .

8 . La determinación por valoración gravimétrica se realizó en muestras con

contenido de cianuro superior a 41 .9 mg/100g muestra, mediante valoración del
cianuro recogido sobre la disolución 0.2 M de NaOH con AgN03, utilizando
Rodanina como indicador . El límite de detección de esta técnica fue 33.4 mg de
cianuro/100g de muestras seca .
9. Los resultados obtenidos por ambas técnicas (cromatografía y

microdifusión) son comparables en cuanto a precisión y límites de detección .
Sin embargo la técnica cromatográfica resulta más simple en cuanto a la
manipulación de la muestra previa a la determinación cuantitativa y por otra
parte requiere un menor tiempo de análisis . Esta ventaja es todavía más
notoria si se dispone de un inyector automático de muestras acopladas al
equipo de HPLC . Además, la técnica cromatográfica permite identificar y
cuantificar los glucósidos cianogénicos presentes en la muestra, mientras que
la microdifusión solo revela el contenido total de cianuro liberado .

4 . VARIABILIDAD DEL CONTENIDO

DE AMIGDALINA EN VARIEDADES
DE ALMENDRA


Variabilidad del contenido de amigdalina en variedades de almendra / 89
4. VARIABILIDAD DEL CONTENIDO DE AMIGDALINA EN

VARIEDADES DE ALMENDRA.
4.1 . INTRODUCCIÓN .
Como se ha indicado en el Capítulo 1, el sabor amargo o dulce de la

almendra es un carácter monogénico, siendo el sabor dulce dominante
(Heppner 1923, 1926; Dicenta y García 1993). Muchas variedades cultivadas
son heterocigóticas para este carácter, y aunque algunas de ellas son
ligeramente amargas, la mayoría son dulces.
Cuando las variedades heterocigóticas se cruzan entre sí en los

programas de mejora, el 25% de los descendientes son amargos y por lo tanto
eliminados del proceso de selección . Este hecho, que reduce la eficacia del
programa de mejora, es especialmente frecuente en la obtención de variedades
autocompatibles, ya que la mayoría de los genitores autocompatibles son
heterocigóticos para este carácter (Grasselly y Crossa-Raynaud 1980, Dicenta
1991) .
Un caso extremo en este sentido han sido los programas de mejora

americanos que han utilizado el amargo Prunus webbii como genitor
autocompatible, lo que ha generado hasta el 50% de las descendencias
amargas cuando el otro genitor (Carmel, Livingstone ), fue heterocigótico
(Ledbetter, 2000).
El lado positivo, de este tipo de cruzamientos ha sido la posibilidad de

clasificar numerosas variedades como homocigóticas o heterocigóticas
(Grasselly y Crossa-Raynaud 1980, Dicenta 1991, Vargas y col. 1999).
Aunque en general se acepta que las variedades ligeramente amargas

son heterocigóticas para este carácter, actualmente la única manera de saber
si una variedad es homocigótica o heterocigótica es estudiando a sus

90 / Variabilidad del contenido de amigdalina en variedades de almendra
descendientes, tarea que es enormemente laboriosa, costosa y que requiere

varios años de estudio .
Algunos autores han apuntado que el sabor ligeramente amargo

posiblemente sea en cierto modo independiente del carácter dulce o amargo y
en consecuencia estar determinando otros genes, que podrían actuar
modificando cuantitativamente la producción de benzaldehído . Dicenta y García
(1993) estudiando cruzamientos entre variedades heterocigóticas, observaron
que los descendientes ligeramente amargos fueron más numerosos cuando el
genitor heterocigótico fue ligeramente amargo.
Si los homocigóticos dulces y los heterocigóticas tuvieran diferentes

contenidos de amigdalina, podrían reconocerse a través de un análisis químico
simple. Esto permitiría diseñar los cruzamientos evitando la aparición de
descendientes amargos, o bien asumiendo a priori el riesgo de obtener estos
amargos, si el cruzamiento fuera especialmente interesante por otras
circunstancias .
La identificación de los homocigóticos dulces es muy interesante, ya que

su uso en cruzamientos garantiza la totalidad de la descendencia dulce, incluso
cuando se cruce con un amargo, si bien en este caso es probable la aparición
de ligeramente amargos (Dicenta y García 1993) .
El objetivo de este trabajo es estudiar la variabilidad del contenido de

amigdalina en relación con el sabor de las semilla de diferentes variedades y
estimar las posibilidades de utilización de las técnicas analíticas para
establecer el genotipo para el sabor de una variedad dada.
4.2 . MATERIAL Y MÉTODOS .
Se ha determinado el contenido de amigdalina en 23 variedades de

almendra procedentes de la colección del CEBAS, durante dos años . Dado que
en la colección no disponíamos de variedades amargas, además se han
incluido en este estudio 6 descendientes amargos de Garrigues x Tuono.

La mayoría son de genotipo conocido (tras el estudio de sus

descendencias) (Grasselly y Crossa-Raynaud 1980; Dicenta 1991, Vargas y
col. 1999):
- DD (dulces) : Del Cid, Ferragnès, Peraleja, Primorskii, Ramillete y Titan .
- Dd (dulces) : Marcona, Desmayo Largueta, Atocha .
- Dd (ligeramente amargas): Garrigues, Genco, Tuono.
- dd (amargas): S3060, S3062, S3076, S3108, S3112, S3126 .
El resto son dulces pero de genotipo desconocido (DD o Dd): Achaak,

Bonita, Carretas, CEBAS, Colorada, Ferraduel, La Mona, Pajarera, Planeta,
Rumbeta y Tioga .
Entre las variedades dulces, Desmayo Largueta, Atocha y La Mona

tienen un ligerísimo (casi inapreciable) sabor amargo. Las características
principales de estas variedades han sido ya descritas en el Capítulo 2.
Las muestras de almendra fueron recogidas en estado de madurez y

preparadas para su posterior análisis tal y como se describe en el Apartado 3.2 .
Los análisis de amigdalina se llevaron a cabo mediante HPLC, realizando 3
análisis independientes para cada muestra, siguiendo el protocolo descrito en
el Anexo 3.3.
Los datos del contenido de amigdalina (mg/1008 de muestra seca) del

conjunto de variedades durante los dos años de estudio, fueron sometidos a un
análisis de la varianza para determinar las diferencias entre años y variedades,
realizando posteriormente una comparación de medias mediante la prueba de
Tukey. Este mismo análisis se repitió considerando únicamente las variedades
dulces y ligeramente amargas .

4.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .
En la Tabla 4.1 se muestran los resultados del análisis de varianza del

contenido de amigdalina de las almendras de las variedades estudiadas
durante dos años.
Tabla 4.1 . Análisis de la varianza del contenido de amigdalina entre variedades y años (1997,
.. ; . . . . . . .- . ...
.............
Fuente de Suma de Grados de Cuadrado Significación
_Variación cuadrados libertad medio F . ratio F
Efectos
571790283 29 19716906 18779 .41 < 0.001
principales
Año 9362 1 9362 8.92 0.004
Variedad 571786321 28 20420990 19447 .97 < 0 .001
AñoxVariedad 107439 22 4883 4.65 < 0 .001
Explicada 571897721 51 11213681 10680 .00 < 0 .001
Residual 112342 107 1050
Total 572010063 158 3620317
Los resultados obtenidos ponen de manifiesto la existencia de

diferencias estadísticamente significativas respecto al contenido de amigdalina
entre las distintas variedades y entre los dos años . También fue significativa la
interacción entre variedad y el año.
A pesar de las diferencias estadísticas, las almendras recolectadas en

1997 tuvieron un contenido medio de amigdalina (4325 mg/100g) casi igual al
de las recolectadas en 1998 (4344 mg/100g) .
El análisis anual de los resultados indica que algunas variedades

presentaron en 1997 valores ligeramente menores (como Achaak, Colorada,
Carretas, Ferraduel, S3076, S3060, etc.) o ligeramente mayores (como
Desmayo Largueta, Genco, S3126, S3062, etc.). Sin embargo, la mayoría de
las variedades mantuvieron valores de amigdalina parecidos los dos años,
como en el caso de Ramillete, Bonita, Marcona etc. (Figuras 4.1 y 4 .2 y Anexo
4 .1).

Tanto en el análisis anual (Figuras 4 .1 . y 4.2) como en el global (Figura

4.3), se observa que todas las muestras dulces y ligeramente amargas forman
un subconjunto homogéneo, cuyos valores medios de contenido de amigdalina
no se diferencian estadísticamente entre sí . Las muestras amargas se
diferenciaron claramente del resto, aunque entre ellas se pueden distinguir 4
grupos distintos .
(5.95)
Primorskii (n .d.)
Ramillete (n.d .)
Bonita (n .d.)
Tioga (0.43)
Titan (0 .43)
Peraleja (1 .76)
Marcona (1 .87)
Colorada (2.41)
Carretas (2 .49)
Planeta (3.71)
La Mona (4 .63)
Ferragnés (5.16)
Atocha (7.28)
Desmayo Largueta (8 .11
Achaak (10 .22)
Genco (18 .74)
Ferraduel (21 .96)
Garrigues (23 .81)
Tuono (25 .05) (2439)
I
S3126(2439) 1 (3830)
S3108(3790)
I
S3062(3870) (5061)
S3060(4916)
S3112(5206)
(5894)
IS3076 (5894)
Figura 4 .1 . Subconjuntos de varianza homogénea respecto al contenido de amigdalina
(mg/100g) para la totalidad de las variedades estudiadas en 1997 . Entre paréntesis el
contenido medio de cada variedad y en la parte superior de cada casilla el del respectivo
subconjunto . En azul dulce DD, en azul claro dulce Dd, en verde ligeramente amargo Dd y en
rojo las amargas dd. Las variedades de genotipo desconocido (todas dulces) en negro. n.d.= no
detectado . Límite de detección = 0 .387 mg / 100g de muestra seca.
Los resultados ponen de manifiesto una enorme variabilidad del

contenido de amigdalina en las variedades estudiadas . Los contenidos medios
de las variedades amargas fueron mucho mayores (hasta 1000 veces) que los
de las "no amargas" (dulces y ligeramente amargas) .

(7.60)
Ramillete (n.d.)
CEBAS (n.d .)
Bonita (n.d .)
Tioga (0.52)
Titan (0.62)
Marcona (1 .87)
Del Cid (2 .15)
Peraleja (2.56)
Carretas (2.65)
Colorada (2 .72)
Planeta (4 .65)
Rumbeta (5.0)
Ferragnés (5.5)
La Mona (6.1)
Desmayo Largueta (6.86
Atocha (8.02)
Achaak (11 .25)
Genco (17 .34)
Garrigues (22 .93)
Ferraduel (23 .36)
Tuono (25 .81)
Pajarera (27 .26) (2360)
(3797)
S3126(2360)
S3108(3810)
(5190)
I
S3062(3784)
S3060(5369)
S3112(5011) (6028)
S3076(6028)
Figura 4.2. Subconjuntos de varianza homogénea respecto al contenido de amigdalina

(mg/100g) para la totalidad de las variedades estudiadas en 1998 . Entre paréntesis el
contenido medio de cada variedad y en la parte superior de cada casilla el del respectivo
subconjunto . En azul dulce DD, en azul claro dulce Dd, en verde ligeramente amargo Dd y en
rojo las amargas dd . Las variedades de genotipo desconocido (todas dulces) en negro. n.d .= no
detectado . Límite de detección = 0 .387 mg 1 100g de muestra seca .
A pesar de la homogeneidad del grupo de las no amargas, mientras que

en algunas variedades como Primorskii, Ramillete y Bonita la amigdalina no fue
detectada, en otras como Ferraduel, Garrigues, Tuono y Pajarera se
alcanzaron concentraciones superiores a 20 mg/100g . El resto de las
variedades presentaron valores intermedios, que se distribuyen de una manera
continua dentro de este intervalo . Los individuos amargos presentaron valores
entre 2400 mg/100g (para el S3126) y más de 6000 mg/100g (en el S3076) .

(7.60)
Primorskii (n .d .)
Ramillete (n.d .)
CEBAS (n .d.)
Bonita (n.d .)
Tioga (0.48)
Titan (0 .53)
Marcona (1 .88)
Del Cid (2.15)
Peraleja (2 .16)
Colorada (2 .58)
Carretas (2.57)
Planeta (4.18)
Ferragnés (5.37)
La Mona (5.40)
Rumbeta (5.34)
Desmayo Largueta(7.49)
Atocha (7.66)
Achaak (10 .74)
Genco (18 .04)
Ferraduel (23 .38)
Garrigues (22 .66)
Tuono (25 .43)
Pajarera (27 .27) (2400)
S3126(2400) 1 (3814)
S3108(3800)
S3062(3827)
I (5125)
S3060(5142)
S3112(5108) I (5961)
S3076 (5961) 1
Figura 4.3. Subconjuntos de varianza homogénea respecto al contenido de amigdalina

(mg/100g) para la totalidad de las variedades estudiadas en 1997 y 1998, conjuntamente . Entre
paréntesis el contenido medio de cada variedad y en la parte superior de cada casilla el del
respectivo subconjunto . En azul dulce DD, en azul claro dulce Dd, en verde ligeramente
amargo Dd y en rojo las amargas dd. Las variedades de genotipo desconocido (todas dulces)
en negro . n .d.= no detectado . Límite de detección = 0 .387 mg / 100g de muestra seca .
Así pues, la concentración de amigdalina no nos permite discriminar, en

este caso, entre variedades dulces y ligeramente amargas, solamente se
puede diferenciar entre amargas y "no amargas" . Esta última diferenciación no
es de una gran utilidad práctica, ya que esta clasificación también puede
hacerse sencillamente probando las almendras .

9 6 / Variabilidad del contenido de amigdalina en variedades de almendra
El contenido de compuestos cianogénicos ha sido estudiado en

diferentes plantas. Chassagne (1996) estudiando semillas de variedades de
maracuyá (Passiflorae) obtuvo concentraciones de 31 mg / Kg de muestra
seca. Shahidi y Wanasundara (1997) encontraron concentraciones de 7000
mg/100g de peso fresco de linamarina en lima y de 500 mg/1008 de peso
fresco de taxipilina en bambú . Además, en semillas de lino detectaron
linamarina (300 mg/100g muestra seca) y linustatina (6000 mg/100g de
muestra seca). Yeoh y col. (1998) estudiando variedades de yuca encontraron
valores de ácido cianhídrico entre 2 y 390 mg/kg de muestra fresca .
También hay algunos estudios del contenido de amigdalina en semillas

de frutales de hueso . Lucas y Sotelo (1984) determinaron el contenido de ácido
cianhídrico (obtenido a partir de la hidrólisis de la amigdalina) en semillas de
diferentes Prunus, como ciruelo (233 mg/100 g), albaricoquero (136 mg/100g),
cerezo (131 mg/1008) y manzano (42 mg/100g).
En semillas albaricoquero, Femenia y col. (1995), obtuvieron

concentraciones de amigdalina entre 4400 a 6500 mg/1008 de muestra seca, y
Gómez y col (1998) entre 5500 y 7000 mg/100g de muestra seca. Otros
investigadores (Stoewsand y col. 1975, Briggs y Yuen 1978, Mandenius y col.
1983, Stosic 1987, Voldrich y col. 1989) encontraron igualmente altos
contenidos de amigdalina en semillas amargas de albaricoque .
En el caso de la amigdalina de la almendra, Corradi (1982) determinó

concentraciones de 3300 mg de ácido cianhídrico /kg de muestra seca . Usa¡ y
col. (1992) determinaron concentraciones de 9255 mg de amigdalina/Kg
muestra seca para la variedad amarga Sassari 11, y 1056 mg/Kg de materia
seca en la variedad dulce Arrubia. En la variedad dulce Texas no fue detectada
amigdalina . Shahidi y Wanasundara (1997) encontraron concentraciones de
5100 mg de amigdalina /1008 muestra seca, en almendras .

McCarty y col. (1952) estudiando semillas de melocotonero y almendras,

e híbridos de almendro x melocotonero, analizaron el benzaldehído obtenido
por hidrólisis enzimática de la amigdalina, obteniendo porcentajes entre 0 .241
y 0 .619 % en melocotoneros, entre 0 .001% y 0 .007% en almendras y entre
0.004 % y 0 .444% en los híbridos almendro x melocotonero .
Barbera y col. (1987), estudiando la amigdalina de variedades dulces y

ligeramente amargas determinaron que, a excepción de la variedad Peerless,
las variedades italianas de Sicilia y Apulia, tenían contenidos más altos que las
americanas y soviéticas . Los valores encontrados por estos autores fueron
mucho mayores que los obtenidos por nosotros en el caso de las variedades
Genco (390 frente 18 mg/100g) y Tuono (750 frente 25 mg/100g) . Polesello y
Rizzolo (1989) señalaron un contenidos de 2,5 al 3,5% de amigdalina en las
almendras amargas .
En general, las diferentes concentraciones de amigdalina encontradas

en semillas amargas de diferentes Prunus, se encuentran dentro del rango
determinado por nosotros (entre 2400 y 6000 mg/100g) en almendras amargas,
con excepción de los resultados de Usa¡ y col. (1992), que fueron muy bajos
para las almendras amargas y muy altas para las dulces, y los de Barbera y
col. (1987) ya citados.
Dadas las enormes diferencias observadas respecto al contenido de

amigdalina entre las variedades amargas y no amargas, y al objeto de poder
distinguir entre genotipos Dd y DD en función de su contenido en amigdalina,
hemos analizado de nuevo los datos sin considerar las variedades amargas .
La Tabla 4.2 muestra los resultados del análisis de la varianza entre

variedades y años para las variedades "no amargas". Al igual que en el estudio
conjunto de todas las variedades, los resultados aquí obtenidos ponen de
manifiesto la existencia de diferencias estadísticamente significativas respecto
al contenido de amigdalina entre las distintas variedades y entre los dos años .
También fue significativa la interacción entre variedad y el año .

La prueba de Tukey ha puesto de manifiesto la presencia de diferentes

subconjuntos homogéneos para los datos anuales y para el estudio conjunto de
los dos años (Figuras 4 .4, 4.5 y 4.6) .
Tabla 4.2. Análisis de la varianza del contenido de amigdalina entre variedades y años (1997,
1998), para las variedades dulces y ligeramente amargas .
Fuente de tt Suma de ` "v\N Grados de Cuadrado m "` ~F. ratio` `BSignificación

variación Cuadrados libertad medio F
Efectos principales 9196 .734 23 399 .858 4761 .249 < 0.001
Año 1 .930 1 1 .930 22.985 < 0 .001
Variedad 9176 .640 22 417 .120 4966 .793 < 0 .001
AñoxVariedad 16 .713 17 0.983 11 .707 < 0.001
Explicada 9213 .448 40 230 .336 2742 .693 < 0.001
Residual 6 .887 82 0.084

Total 9220.334 122 75.577
Centrándonos en la Figura 4 .6, con los datos de los dos años, podemos
observar que en general las variedades dulces tienen menos amigdalina que
las ligeramente amargas .
Si bien todas las variedades ligeramente amargas tienen niveles
elevados de amigdalina (respecto a los niveles de las almendras no amargas),

no todas las variedades que presentan estos niveles fueron ligeramente
amargas. Este es el caso de Pajarera y Ferraduel . Por lo tanto, mientras que en
las almendras ligeramente amargas la concentración de amigdalina varió de 18
a 25 mg/1008, en las almendras dulces varió desde "no detectable" a 27
mg/100g .
Ello parece indicar que no hay una relación estrecha entre el sabor
ligeramente amargo y el contenido de amigdalina, y que para que una variedad
sea ligeramente amarga tiene que tener algo de amigdalina, pero además se
deben dar otros factores (probablemente bioquímicos), ausentes en el caso de
Ferraduel y Pajarera .

0 .17
Primorskii
(nd)
Ramillete
11<
(nd)
Bonita(nd) .
Tioga v
a
(0 .43)
Titan 0 .43 1 .80 Q
Peraleja Q
(1 .76) C2 ."0 Q
Marcona Marcona (2 .50) CD
1 .87 (1 .87) n
Colorada Colorada O
(2 .41) c~D
Carretas (3.70)
X49) Q
Planeta O
(33
.70) 1 (4 .90)
La Mona (4 .63)
Ferragnes
I (7 .30)
Ñ
(5 .16) .
~Q
Atocha (8.10)
.30) 1 .
Desmayo L. I (10 .20)
X10)
cD
Achaak (10 .20) 1 (18 .7 0)
Genco (18 .70) 1 (22.00)
Ferraduel I (23 .80) Ñ
(22 .00)
Garrigues I (25 .10) Q
v
23 .80)
Tuono Ñ
ti
25 .10
Q
CD
Figura 4 .4. Subconjuntos de varianza homogénea respecto al contenido de amigdalina (mg/100g) para las variedades dulces y ligeramente amargas
estudiadas en 1997. Entre paréntesis el contenido medio de cada variedad y en la parte superior de cada casilla el del respectivo subconjunto . En azul cD
dulce DD, en azul claro dulce Dd, en verde ligeramente amargo Dd Las variedades de genotipo desconocido (todas dulces) en negro.
v
w

v
0
0
w
v
0.22) v.
Ramillete (nd) a
Cebas (nd)
v
Bonita (nd) (1 .30) Q
Q
Tioga (0 .52) Tioga (0 .52) cD
Titan (0 .62) Titan (0 .62) (2 .40)
O
Marcona (1 .87) Marcona (1 .87)
Del Cid (2 .15) Del Cid (2 .15) cD
Peraleja (2 .56) Q
O
Carretas (2 .65) Q
cD
Colorada (2 .72) (5.30)
v
Planeta (4 .65) (5 .90)
Rumbeta (5 .00) Rumbeta (5 .00) a
Ferragnés (5 .55) Ferragnés (5 .55) v
La Mona (6 .10) La Mona (6 .1) (7 .40) v
Desmayo L . (6 .86) Desmayo L . (6 .86) cD
Atocha (8 .02) (11 .30)

IAchaak (11 .30) (17.34)
Genco (17.34) (23.10) Q
Garrigues (22 .93) N

Ferraduel (23.36)1 (26.50)
Q
Tuono (25.81) CD
v
Pajarera (27 .26)
CD
Figura 4.5 . Subconjuntos de varianza homogénea respecto al contenido de amigdalina (mg/100g) para las variedades dulces y ligeramente amargas v
estudiadas en 1998 . Entre paréntesis el contenido medio de cada variedad y en la parte superior de cada casilla el del respectivo subconjunto. En azul dulce
DD, en azul claro dulce Dd, en verde ligeramente amargo Dd . Las variedades de genotipo desconocido (todas dulces) en negro.

(0 .41)
Primorskii (nd)
Ramillete (nd) v
Cebas(nd)
Bonita (nd) (1 .44)
á
Tioga (0 .48) Tioga (0 .48) v
Q
Titan (0 .53) Titan (0 .53) (2 .30)
Q
cD
Marcona (1 .88) Marcona (1 .88) Marcona (1 .88)
Del Cid (2 .15) Del Cid (2 .15) O
Peraleja (2 .16) Peraleja (2 .16) (3 .10) Ñ
Colorada (2 .58) Colorada (2 .58) O
Carretas (2 .57) Carretas (2 .57) (5 .10) Ó
Planeta (4 .18) Planeta (4 .18) cD
Ferragnés (5 .37) v
La Mona (5 .40) .
~Q
Rumbeta (5 .34) (7 .50) Q
y
Desmayo L. (7 .49)1 .
v
Atocha (7 .60) (10 .70)
cD
Achaak (10. 70)1 (18.00)
C
Genco (18 .00)1 (23.00) v
Ferraduel (23.38)1 cD'
Garrigues (22 .66)1 (26.40) v

Tuono (25 .43) cD
Pajarera (27.27)
CD
v
Figura 4.6. Subconjuntos de varianza homogénea respecto al contenido de amigdalina (mg/100g) para las variedades dulces y ligeramente amargas cD
estudiadas en 1997 y 1998, conjuntamente. Entre paréntesis el contenido medio de cada variedad y en la parte superior de cada casilla el del respectivo Q
subconjunto. En azul dulce DD, en azul claro dulce Dd, en verde ligeramente amargo Dd . Las variedades de genotipo desconocido (todas dulces) en negro. v
w
0

Así, la determinación de los individuos ligeramente amargos, ligada a la

capacidad humana de detectar bajas cantidades de amigdalina, podría estar
influenciada por la concentración de otros compuestos en la almendra .
Por otro lado, los resultados obtenidos por Dicenta y García (1993)
ponen de manifiesto que las variedades ligeramente amargas (Garrigues en
este caso) tienden a producir más descendientes ligeramente amargos que
otras variedades heterocigóticas dulces . Estas variedades ligeramente
amargas podrían trasmitir a sus descendencias la capacidad de producir estas
sustancias modificadoras del sabor.
Respecto a la relación entre genotipo (DD o Dd) y contenido de

amigdalina, se observa que en general las variedades DD (dulces) presentaron
contenidos menores de amigdalina que las Dd dulces y mucho menor que las
Dd ligeramente amargas. Marcona es una excepción ya que siendo Dd, su bajo
contenido en amigdalina la agrupó entre las DD (Figura 4.6).
Entre las variedades de genotipo desconocido, atendiendo a sus valores

de contenido de amigdalina, se observa que las variedades Achaak, Ferraduel
y Pajarera quedan integradas en subconjuntos formados por las variedades de
genotipo Dd, mientras que el resto de variedades de genotipo desconocido se
integran dentro de los subconjuntos formados por variedades de genotipo DD
(Figura 4 .6).
La variedad de genotipo conocido DD que presenta el valor medio de

contenido de amigdalina más alto y por lo tanto menos diferenciado de las
variedades de genotipo Dd es la variedad Ferragnès. Muy probablemente,
variedades como Bonita o CEBAS deben ser DD .
Así pues, debemos asumir que los resultados obtenidos no permiten

identificar con certeza el genotipo de una variedad dada en función de su
contenido de amigdalina

4.4. CONCLUSIONES .
1 . Se ha observado una gran variabilidad para el contenido de amigdalina

entre las variedades estudiadas .
2 . Aunque hubo cierta variación anual, el contenido de amigdalina de la

almendra, es característico de cada variedad .
3 . Las almendras amargas pueden distinguirse de las no amargas (dulces y

ligeramente amargas) por su elevado contenido de amigdalina .
4 . Las almendras ligeramente amargas no pueden diferenciarse claramente de

las dulces en función del contenido de amigdalina, aunque parece que todas
las ligeramente amargas tienen cierta cantidad de amigdalina .
5. La capacidad humana para detectar los bajos niveles de amigdalina

relacionados con el sabor ligeramente amargo podría estar influenciada por
otros compuestos desconocidos presentes en la almendra .
6 . La determinación del contenido de amigdalina no parece ser una

herramienta fiable para determinar el genotipo DD o Dd de una variedad dulce
dada.


5 . HERENCIA DEL CONTENIDO DE

AMIGDALINA EN UNA DESCENDENCIA
DE ALMENDRO


Herencia del contenido de amigdalina en una descendencia de almendro / 107
5. HERENCIA DEL CONTENIDO DE AMIGDALINA EN UNA

DESCENDENCIA DE ALMENDRO.
5.1 . INTRODUCCIÓN .
El sabor dulce de la almendra, frente al amargo, ha sido el primer

carácter considerado en la mejora del almendro, desde los primeros procesos
de selección llevados a cabo por los agricultores . Como consecuencia de esta
selección continuada, en la actualidad el número de variedades amargas es
muy reducido .
Sin embargo, algunas variedades dulces cuando se combinan entre ellas
en los programas de mejora pueden producir individuos con semillas amargas .

Estos individuos son generalmente desechados, aunque ocasionalmente han
sido seleccionados por su elevada productividad (Spiegel-Roy y Weinbaum
1985) o por su tolerancia a nematodos (Kochba y Spiegel-Roy 1976) .
Como ya hemos comentado, los ancestros de la especie cultivada

probablemente eran de semilla amarga. Heppner (1923) defiende que el
carácter dulce debió aparecer como consecuencia de una mutación de un
almendro originalmente amargo . Desde el punto de la supervivencia, la semilla
amarga aseguraba la protección del embrión frente a roedores o insectos,
garantizando la supervivencia de la especie .
Ya hemos visto que, al igual que en otros Prunus, como el melocotonero

y el albaricoquero, el sabor amargo de la semilla del almendro se debe al
glucósido amigdalina (McCarty y col. 1952, Chandler 1957, Woodroof 1967).
No existen muchos trabajos sobre el control genético de este carácter, a

pesar de la gran importancia que esto tiene para el mejorador. Los primeros
trabajos sobre la herencia del sabor amargo se deben a Heppner (1923, 1926),
que postuló que se trataba de un carácter monogénico, siendo el amargo
recesivo y el genotipo más frecuente el heterocigótico .

108 / Herencia del contenido de amigdalina en una descendencia de almendro
Richter (1962) encontró que Languedoc y Nikitskij urozajnij-16, daban

gran porcentaje de descendientes con semillas de sabor amargo, de entre un
gran numero de variedades que daban descendencias siempre dulces .
Spiegel-Roy y Kochba (1974) estudiando cruzamientos intervarietales

determinaron que el sabor dulce era dominante, pero rechazaron la hipótesis
de la herencia monofactorial de Heppner y postularon la posibilidad de la
intervención de tres genes. En trabajos posteriores (Spiegel-Roy y Kochba,
1977, Spiegel-Roy 1979, Spiegel-Roy y Kochba 1981) y sin aportar nuevos
datos, aceptaron la teoría de Heppner como válida y clasificaron algunas de
sus variedades como homocigóticas o heterocigóticas .
El Gharbi (1981) observó que, en dos cruzamientos entre variedades

dulces, aparecieron individuos amargos en las progenies en una proporción
próxima a la 3:1 observada por Heppner, por lo que aceptó su teoría y
determinó que las variedades implicadas eran heterocigóticas .
Vargas, estudiando descendencias de diferentes cruzamientos, encontró

en general la relación 3:1 esperada según Heppner y definió algunas
variedades como homocigóticas y otras como heterocigóticas para este
carácter (Vargas y col. 1983, Vargas y Romero 1988, Vargas y col. 1999) .
Grasselly y Crossa Raynaud (1983) aceptaron igualmente la teoría de

Heppner, aunque encontraron unas proporciones dulces:amargos muy
variables. Basándose en ellas, clasificaron sus variedades según sus
genotipos .
Dicenta y García (1993) estudiando 51 familias y 1969 individuos

aceptaron la hipótesis de Heppner y clasificaron las 12 variedades implicadas
como homocigóticas o heterocigóticas .
Son muy escasos los trabajos de herencia en los que se han

determinado los niveles de los componentes químicos responsables del sabor
amargo de la semilla . McCarty y col. (1952), estudiando descendientes de
melocotonero x almendro, midieron los niveles de benzaldehído en la semilla y
determinaron que la herencia era más compleja que la descrita por Heppner,

mostrando las descendencias una variación continua . Los niveles de

benzaldehído fueron más altos en melocotonero, medios en los descendientes
y muy bajos en los almendros .
El objetivo de este estudio es determinar el modo de herencia del sabor

amargo de la almendra desde el punto de vista organoléptico y mediante el
análisis químico del compuesto cianogénico implicado, la amigdalina .
5.2. MATERIAL Y MÉTODOS .
En este estudio se ha utilizado una descendencia de almendro

procedente de un cruzamiento de Garrigues x Tuono, ambas de sabor
ligeramente amargo y heterocigóticas con respecto al sabor amargo de la
almendra. La descendencia, descrita en el Apartado 2.2, consiste en 49
individuos, 27 dulces, 12 ligeramente amargos y 10 amargos . El sabor de las
almendras de estas descendencias fue establecido mediante cata .
El estudio se ha realizado a lo largo de dos cosechas correspondientes a

los años 1997 y 1998, determinando mediante HPLC el contenido de
amigdalina en las semillas de los descendientes y de los genitores, según el
procedimiento descrito en el Anexo 3.3 . De cada individuo se realizaron tres
análisis independientes .
Los datos fueron sometidos a un análisis de la varianza para determinar

las diferencias entre genotipos de un determinado sabor (dulce, amargo y
ligeramente amargo) y entre años. Posteriormente, las medias de los
descendientes dentro de cada grupo de sabor fueron comparadas mediante la
prueba de Tukey .
5.3 . RESULTADOS Y DISCUSION .
La Tabla 5 .1 muestra los resultados del análisis de la varianza del

contenido de amigdalina (mg/100g de muestra seca) del conjunto de
descendientes estudiado en función de su sabor dulce, ligeramente amargo o

110 / Herencia del contenido de amigdalina en una descendencia de almendro
amargo . Se han detectado importantes diferencias significativas entre los

grupos de distinto sabor, pero no entre años . La interacción Año x Sabor no fue
significativa .
Tabla 5.1 . Análisis de la varianza de los contenidos de amigdalina obtenidos para el conjunto
de descendientes de Garrigues x Tuono clasificados según su sabor y año de cosecha (1998 y
1999) .
Fuente de ~~ Suma de ~~ Grados de Cuadrado Significación
variación cuadrados libertad medio F ratio F
Efectos
1003048742 3 334349581 908 .379 < 0.001
principales
Año 10867 1 10867 0.030 0.864
Sabor 1003042325 2 501521162 1362.561 < 0.001
Año x Sabor 29522 2 14760 0.040 0.961
Explicada 1003078263 5 200615653 545 .044 < 0.001
Residual 102692248 279 368073
Total 1105770512 284 3893558
En el Anexo 5 .1 se muestran los valores medios y la desviación estándar

del contenido de amigdalina obtenidos para cada muestra estudiada, cada año
y para los dos años conjuntamente .
La Figura 5.1 muestra los valores medios de amigdalina (mg /100 g) de

los descendientes correspondientes a los dos años de estudio conjuntamente,
en función de su sabor dulce, ligeramente amargo o amargo y los resultados de
la prueba de Tukey.
Dulces (12 .40)

Ligeramente amargos 250 .4
Amargos (4678)
Figura 5.1 . Valores medios de amigdalina (mg 1100 g) de los descendientes correspondientes
a los dos años de estudio conjuntamente, en función de su sabor dulce, ligeramente amargo o
amargo . Los valores dentro de diferentes casillas presentan diferencias significativas al 5%
según la prueba de Tukey.

Herencia del contenido de amigdalina en una descendencia de almendro / 11 1
El análisis muestra que los tres sabores detectados se corresponden

perfectamente con tres niveles de amigdalina bien diferenciados. Los
descendientes amargos tuvieron niveles de amigdalina muy superiores a los
dulces, situándose los ligeramente amargos en una posición intermedia, pero
mucho más cerca de los dulces. Esto pone de manifiesto la estrecha relación
entre el contenido de amigdalina y el sabor de los descendientes estudiados .
Una vez establecidas las grandes diferencias respecto del contenido de

amigdalina de los descendientes dulces, ligeramente amargos y amargos,
hemos analizado la variabilidad dentro de cada grupo mediante la prueba de
Tukey con los datos de los dos años conjuntamente. Las Figuras 5 .2, 5 .3 y 5.4
muestran los resultados obtenidos para las muestras dulces, ligeramente
amargas y amargas respectivamente,
En el caso de las 27 muestras dulces (Figura 5.2), se obtuvieron valores

desde "no detectable" hasta 43 mg amigdalina/100g, que fueron clasificados en
8 grupos homogéneos mediante la prueba de Tukey. La mayoría de los
individuos tuvieron valores muy bajos de amigdalina (incluso en 4 de ellos no
fue detectada) . De los 8 grupos obtenidos, tan solo 3 tuvieron valores
superiores a 9 mg de amigdalina / 100g, conteniendo 10 individuos .
Las 12 muestras ligeramente amargas (Figura 5 .3), con valores que

fueron desde 116 hasta 359 mg de amigdalina/1008, fueron clasificadas en 9
grupos homogéneos . Al contrario que en el caso de las dulces, los
descendientes se distribuyeron más homogéneamente entre el valor mínimo y
el máximo de este grupo .
La Figura 5.4 muestra los resultados obtenidos en el caso de los 10

individuos amargos. Los valores de amigdalina, mucho mayores que en los
casos anteriores, variaron entre 2340 y 7152 mg/100g, y fueron clasificados en
7 grupos según la prueba de Tukey. En este caso varios grupos estuvieron
constituidos por un solo individuo .

w
N
2
CD
(1 .70) iDi
S3089 (n .d.)
S3093 (n .d.) Q
S3104 (n .d.) cD
S3117 (n.d.) (2 .40)

S3116 (0 .56) S3116(0 .56) (3.00) ó
S3124 (0 .85) S3124(0 .85) S3124 (0.85) (3.70) m
0
S3103 (1 .61) S3103(1 .61) S3103 (1 .61) S3103 (1 .61) Q
S3106 (1 .99) S3106(1 .99) S3106 (1 .99) S3106 (1 .99) 0
S3071 (2 .26) S3071 (2.26) S3071 (2.26) S3071 (2 .26) m

S3082 2 .79 S3082(2 .79) S3082 (2.79) S3082 (2 .79) (5.70) v
S3098 (4 .58) S3098 (4.58) S3098 (4.58) S3098 (4.58)
S3057 (4 .84) S3057 (4.84) S3057 (4.84) S3057 (4.84) Q
S3099 (5.22) S3099 (5.22) S3099 (5.22) v
.
S3091 (5.43) S3091 (5.43) o
v
S3077 (5.54) S3077 (5.54) CD
S3081 (5.60) S3081 (5.60)
S3070 8.33 (16 .80) ç
0
S3090 16.80 (25 .10) v
S3066 (23 .82) Q
cD
S3068 (24 .35) c)
S3059 (24 .64) CD
S3084 (24 .82) Q

S3073 (24 .99) cD
S3087 (28 . 01) (41 .10) .

v
S3072 (39 .13) Q
S3097 (41 .65) m
S3083 42 .47) v
(D
Figura 5.2. Valores medios de amigdalina (mg /100 g) de los descendientes dulces correspondientes a los dos años de estudio Q
conjuntamente . Los valores dentro de diferentes casillas presentan diferencias significativas al 5% según la prueba de Tukey. n.d.= no 0
detectado . Límite de detección = 0.387 mg/100g de muestra seca.

(134.0)
S3080 (116.2) (169.0)
S3107 (151 .4) S3107 (151 .4) (205.0) cD
S3109 (186.6) S3109 (186.6)

S3061 (197 .0) (226.0) .
v
S3088 (205 .4) S3088 (205 .4) (246.0) Q
cD
S3118 229 .4 S3118 (229 .4) S3118 (229.4) (264.0)
n
S3075 (243.6) S3075 (243.6) S3075 (243.6) (284.0) 0
S3065 (265.4) S3065 (265.4)

S3063 (282.7)
S3065 (265.4)
S3063 (282.7) (326.0)
m
S3125 (305 .1) (353 .0) Q
S3125 (305.1) 0
S3079 (346.6) S3079 (346 .6)

S3069 (358 .6) w
Figura 5 .3 . Valores medios de amigdalina (mg 1100 g) de los descendientes ligeramente amargos correspondientes a los dos años de Q
estudio conjuntamente. Los valores dentro de diferentes casillas presentan diferencias significativas al 5% según la prueba de Tukey . v
.
v
CD
(2340) 0
0
v
S3126 (2340 (3784)
S3056(3720) am
S3108(3804) n
S3062(3827) (4142) cD
S3064(4142) (5042)
S3060(4976)
m
n.
S3112(5108) (5687) sy
S3115(5687) (5961)
S3076 (5961) (7152)
m
v
S3067(7152)
CD
Ó.
Figura 5.4 . Valores medios de amigdalina (mg 1100 g) de los descendientes amargos correspondientes a los dos años de estudio 0
conjuntamente. Los valores dentro de diferentes casillas presentan diferencias significativas al 5% según la prueba de Tukey. w

11 4 / Herencia del contenido de amigdalina en una descendencia de almendro
Si bien se conoce bien la relación entre sabor amargo y amigdalina

(McCarty y col. 1952, Chandler 1957, Woodroof 1967), los estudios de herencia
del sabor amargo tradicionalmente han sido abordados desde el punto de vista
organoléptico, dada la dificultad y el coste que supone la realización de análisis
químicos .
Tan solo McCarty y col. (1952) estudiaron el contenido de benzaldehído

procedente de la hidrólisis de la amigdalina en una descendencia de almendro
de semilla dulce (variedad Jordanola) x melocotonero de semilla amarga
(variedad Peppermint). Encontraron que los descendientes presentaron niveles
de benzaldehído que variaron de una manera continua entre los de los
genitores, si bien algunos descendientes produjeron incluso menos
benzaldehído que el genitor dulce .
Aunque se trate de un cruzamiento interespecífico, este trabajo ya ponía

en duda la simplicidad del modelo monogénico de herencia establecido para el
sabor amargo de la semilla del almendro . Nuestros resultados apuntan algo en
este sentido.
Si aceptamos que el sabor amargo es debido a la amigdalina, entonces

estamos ante la posibilidad de medir un mismo carácter de dos formas
diferentes : organolépticamente o analíticamente . En este caso, como vimos en
el Capítulo 4, tendremos que tener en cuenta que, cuando los niveles de
amigdalina son bajos, la relación entre sabor ligeramente amargo y
concentración de amigdalina puede estar influida por otros factores .
Si consideramos el carácter desde el punto de vista organoléptico, el

sabor amargo, la segregación encontrada en nuestra progenie es 27 dulces
(55%), 12 ligeramente amargos (25%) y 10 amargos (20%).
Dado que ninguno de los genitores es amargo y que este carácter

aparece en sus descendencias, debemos pensar que el carácter amargo es
recesivo, lo que está de acuerdo con los resultados obtenidos por otros autores
(Heppner 1926, Spiegel-Roy y Kochba 1974, El Gharbi 1981, Grasselly y
Crossa-Raynaud 1983, Dicenta y García 1993, Vargas y col. 1999).

Dado que ambos genitores (Garrigues y Genco) son heterocigotos (Dd)

para este carácter, de los 49 descendientes, 12 (el 25%) deberían ser amargos
(dd) y el resto dulces (DD o Dd) . A continuación se presentan los Genotipos y
fenotipos esperados para el sabor amargo en una descendencia de Garrigues x
Tuono según la hipótesis aceptada de un solo gen, siendo dominante el sabor
dulce .
Garrigues (Dd) X Tuono (Dd)

(Ligeramente amargo) (Ligeramente amargo)
25% DD 50% Dd 25% dd

Dulces Dulces ¿o ligeramente amargos? Amargos
El caso de los ligeramente amargos no puede ser explicado según la

hipótesis de dominancia completa del sabor dulce . Si la herencia fuera
intermedia, y los heterocigóticos los ligeramente amargos, esperaríamos el
50% (unos 25 individuos) ligeramente amargos . Como podemos ver esta
hipótesis tampoco se ajusta perfectamente a nuestros resultados, donde solo
12 (24%) son ligeramente amargos .
Dado que todas las variedades ligeramente amargas que conocemos

son heterocigóticas y que algunas variedades heterocigóticas son
completamente dulces, podemos suponer que nuestros 12 individuos
ligeramente amargos se encuentran entre ese 50% de heterocigóticos .
También podemos suponer que entre nuestros individuos dulces se encuentran
homocigóticos (DD) y heterocigóticos (Dd) .
Por otro lado, si consideramos el carácter en función del contenido de

amigdalina, los resultados son algo confusos. Debemos recordar que el
contenido de amigdalina determinado en el Capítulo 4 (Figura 4 .3) para los
genitores fue de 22 .70 mg/100g para Garrigues y 25.40 mg/1008 para Tuono.
En función del contenido de amigdalina se distinguen en primer lugar

tres grandes grupos (coincidentes con los tres sabores determinados), que

11 6 / Herencia del contenido de amigdalina en una descendencia de almendro
presentan concentraciones de amigdalina muy diferentes entre ellos .

Paradójicamente, los valores de amigdalina obtenidos para los genitores se
enmarcarían entre los dulces, a pesar de que son ligeramente amargos .
Lo primero que nos llama la atención es que dentro de cada grupo

encontramos valores que varían de una forma más o menos continua entre los
mínimos y los máximos de cada grupo.
Si consideráramos que estos tres grupos corresponden con los

homocigóticos dulces, los heterocigóticos y los homocigóticos recesivos, los
resultados de nuevo no se ajustan a la segregación esperada (25% DD, 50%
Dd y 25% dd) .
Esta variabilidad del contenido de amigdalina no parece ser apreciada

organolépticamente . En el caso de los individuos del grupo con contenidos
entre "no detectable" y 43 mg de amigdalina/100g, no fuimos capaces de
detectar el más mínimo sabor ligeramente amargo. Tampoco en el grupo con
valores de amigdalina entre 2340 y 7152, fuimos capaces de detectar si alguno
era más amargo que otro . En este último caso, el desagradable sabor de la
almendra amarga impide el poder recrearse en una clasificación más
exhaustiva .
En el caso del grupo intermedio, los valores variaron desde 116 hasta
359 mg de amigdalina / 100g, y fueron clasificados como ligeramente amargos.
En este caso sí se pueden apreciar diferentes grados de amargor, algo
variables dentro de una muestra dada y además percibidos en diferente grado,
difícilmente estimable por los catadores, por lo que no fue anotado.
En cualquier caso, las grandes diferencias entre los contenidos de

amigdalina de amargas y "no amargas" y la segregación de estos fenotipos son
una prueba más de que este carácter está controlado por un solo gen, si bien
es posible que la dominancia del dulce no sea completa y la ausencia de un
alelo dominante en el heterocigoto permita a la planta la acumulación de esas
pequeñas cantidades de amigdalina. Tampoco debemos descartar una cierta
variabilidad debida a las diferentes condiciones ambientales .

Herencia del contenido de amigdalina en una descendencia de almendro / 11 7
Desde el punto de vista de la posible utilización del contenido de

amigdalina para la determinación del genotipo de los descendientes, tal y como
vimos en el Capítulo 4, los análisis realizado solo nos permiten distinguir entre
amargos (dd) y "no amargos" (DD o Dd). Al contrario que en el Capítulo 4, el
contenido de amigdalina de los descendientes estudiados, sí mostró una
relación clara con el sabor dulce, ligeramente amargo y amargo de las
muestras .
5 .4. CONCLUSIONES .
1 . Desde el punto de vista organoléptico, nuestros resultados se ajustan en

general a la hipótesis monogénica establecida para el sabor amargo, siendo el
dulce el dominante, con la salvedad del caso de los ligeramente amargos .
2 . Desde el punto de vista analítico, el contenido de amigdalina de los

individuos fue muy variable, desde no detectable en algunos individuos
dulces, a los elevados valores obtenidos para los amargos . El año no parece
tener una influencia grande en el contenido de amigdalina .
3 . Se han determinado tres grupos muy distintos en función del contenido de

amigdalina, que coinciden con los dulces, ligeramente amargos y amargos, lo
que pone de manifiesto la correspondencia entre contenido de amigdalina y
sabor.
4 . Dentro de cada grupo hay una variabilidad considerable que no ha sido

detectada mediante la cata de las almendras .
5 . Las diferentes concentraciones de amigdalina entre amargos y "no

amargos" y su segregación en la descendencia han puesto de manifiesto que el
contenido de amigdalina de la almendra se encuentra controlado por un solo
gen, siendo la ausencia de amigdalina dominante . Posiblemente la dominancia
de este carácter no sea completa, lo que podría explicar la presencia de
individuos ligeramente amargos con niveles medios de amigdalina .


6 . EVOLUCIÓN DEL CONTENIDO DE

AMIGDALINA Y PRUNASINA DURANTE EL
DESARROLLO DE LA ALMENDRA


Evolución del contenido de amigdalina y prunasina / 12 1
6. EVOLUCIÓN DEL CONTENIDO DE AMIGDALINA Y

PRUNASINA DURANTE EL DESARROLLO DE LA ALMENDRA.
6 .1 . INTRODUCCIÓN .
Todos los frutos sufren una serie de cambios físicos y químicos desde la
fecundación del óvulo hasta la maduración, cuyo objetivo final es la formación
de una semilla viable que garantice la conservación de la especie .
Durante el desarrollo del fruto cada parte del pistilo va a dar lugar a otra
correspondiente en el fruto . La epidermis del ovario se convierte en el
exocarpio, la parte externa de la pared del ovario da origen al mesocarpio que
constituye la parte carnosa del fruto, y la parte interna forma el endocarpio o
cáscara, que se lignificará posteriormente . Las partes internas del ovario darán
lugar a las diferentes partes de la semilla . Los componentes de la semilla son el
embrión, los tejidos de reserva y las cubiertas seminales (Felipe 2000).
Durante el desarrollo del fruto, en el almendro se observan varias fases

(Hawker y Buttrose 1980):
" Multiplicación celular: es una fase de división celular, tras la cual se

alcanza prácticamente el número total de células del fruto.
" Engrosamiento celular: las células aumentan su tamaño y peso por la

acumulación de agua y sustancias nutritivas, hasta alcanzar su tamaño
definitivo, sobre las 10 ó 12 semanas tras la floración.
" Crecimiento del embrión : comienza sobre las 10 semanas después de

la floración. Sobre las 20 semanas el embrión tiene una estructura bien
diferenciada y los cotiledones se encuentran muy desarrollados. A partir de
aquí los cotiledones empiezan a acumular reservas (lípidos y proteínas
principalmente) y a disminuir su contenido en agua . Hacia las 22 semanas
se inicia el endurecimiento de la cáscara . Durante este periodo se producen
importantes transformaciones bioquímicas en el fruto . La maduracion del
fruto, se produce entre las 25 y las 30 semanas tras la floración .

122 / Evolución del contenido de amigdalina y prunasina
Por supuesto, estos procesos descritos dependen de la variedad y de las

condiciones medioambientales del cultivo .
En la Figura 6.1 se observa la evolución temporal de los diferentes

componentes del fruto durante su desarrollo (Kester 1976) .
a FRUTO
3,0
LILA
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Sfr .s£+~sí .~ê; .L

EYIEtF Iüld
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I
ACÜS RP
T11 -
Figura 6.1 . Curvas de crecimiento de los distintos componentes del fruto según Kester (1976) .
Una vez completado el desarrollo de los componentes del fruto, el

mesocarpo empieza a deshidratarse y a separarse del endocarpo por la capa
de abscisión. Posteriormente se produce una capa de abscisión entre el
pedúnculo y el fruto, que facilitará su caída durante la recolección.
Durante todo el proceso de formación del fruto la semilla va acumulando

materia seca, que tiene su origen en los hidratos de carbono sintetizados en las
hojas y en los elementos minerales tomados del suelo por las raíces . Algunos
hidratos de carbono permanecen en la semilla como tales y otros se
transforman en materias grasas o en proteínas al combinarse con el nitrógeno.

Evolución del contenido de amigdalina y prunasina / 123
Serafimov (1981) estudió el desarrollo del fruto de tres variedades de

almendro, (Avgustovski, Primorski y Reams), observando que el mayor
crecimiento en materia seca se produce entre las ocho y las cuatro semanas
antes de la maduración .
La maduración de los frutos en el almendro es una característica varietal

que resulta ser independiente de la época de floración, de manera que hay
variedades de floración temprana que maduran pronto (como Ramillete), o
tarde (Desmayo Largueta) y de floración tardía que maduran temprano (Guara
y Antoñeta) o tarde (Wawona) . En una misma localización se pueden encontrar
diferencias de maduración entre variedades de hasta dos meses .
Los compuestos cianogénicos, como compuestos del metabolismo del

almendro, es de esperar que sufran cambios durante la formación de la semilla,
si bien no hay mucha información sobre este proceso .
Frehner y col. (1990) estudiaron la evolución de estos compuestos en
judía de lima, en semillas de lino y en almendras amargas. En la judía de lima y

en el almendro los compuestos cianogénicos empezaron a aumentar justo
después de la floración, estabilizándose antes de la maduracion . Por el
contrario, en el lino las flores tuvieron un mayor contenido .
Los compuestos cianogénicos encontrados al inicio de la formación del

fruto fueron los monoglucosidos prunasina (almendro), y linamarina y
lotaustralina (lino), mientras que en la maduracion sólo fueron detectados los
diglucósidos amigdalina (almendro) y linustatina y neolinustatina (lino) (Frehner
y col. 1990) .
El objetivo de este capítulo es estudiar la evolución de la amigdalina y la

prunasina durante el desarrollo de la almendra, con objeto de conocer su
metabolismo y de predecir mediante un modelo matemático el contenido de
estos compuestos cianogénicos en un momento dado del desarrollo del fruto .

6 .2 . MATERIAL Y MÉTODOS.
En este capítulo se han estudiado 12 variedades de almendra, 3 de las

cuales son amargas (S3067, S3062, S3056), 4 ligeramente amargas (S3065,
Garrigues, Genco y Tuono) y 5 dulces (Marcona, Del Cid, Peraleja, Ferragnés y
Atocha). Estas variedades ya fueron descritas en el Capítulo 2.
El estudio se ha llevado a cabo durante dos años consecutivos. Cada

año, una muestra de 50 frutos fue recogida a intervalos de 30 días desde la
floración hasta maduración del fruto . Las muestras fueron preparadas y la
determinación de los compuestos cianogénicos se realizó mediante HPLC, tal y
como se describe en el Anexo 3.3 .
Al objeto de poder comparar los contenidos obtenidos de prunasina y

amigdalina durante el desarrollo de la almendra, los valores de estos
compuestos determinados mediante HPLC fueron transformados a cianuro total
(mg / 100g) según los cálculos indicados en el Anexo 3 .3.
También se calculó el cianuro total durante el desarrollo del fruto

mediante microdifusión, siguiendo el procedimiento descrito en los Anexos 3 .4,
3 .5 y 3.6.
Dado que el contenido relativo de humedad de la almendra disminuye

enormemente durante su desarrollo y al objeto de poder estudiar la evolución
de la concentración de los compuestos cianogénicos, las concentraciones de
prunasina, amigdalina y cianuro total de este Capítulo se han referido a peso
fresco .
En el análisis de los datos se ha determinado un modelo matemático de

una aproximación de segundo orden de una ecuación diferencial, que permite
conocer el contenido de estos compuestos en una variedad dada, en función
de su estado de desarrollo .

6.3 . RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el Anexo 6 .1, se muestran los valores medios de dos años de cianuro

obtenidos a partir de los contenidos de amigdalina y prunasina (obtenidos por
HPLC) y de cianuro total obtenidos mediante microdifusión, expresados en mg
cianuro/100 g de muestra fresca .
En la Figura 6.2 se muestra la variación del contenido de humedad de

almendra a lo largo del periodo de maduración de la misma . Si bien se han
observado pequeñas diferencias en el contenido de humedad entre variedades
en una fecha determinada, la tendencia en la pérdida de agua fue similar en
todas las muestras estudiadas . Al principio el contenido en agua de la semilla
es altísimo, superando incluso el 90%, disminuyendo a lo largo del tiempo
hasta llegar en torno al 6% al final del periodo de maduración .
75 -j
v
A
v
m
25
50 100 150 200 250
Días julianos
Figura 6 .2. Variación del la humedad relativa (%) de la almendra a lo largo de la maduración
determinada a partir de los valores obtenidos de las variedades amargas en 1998.
En la Figura 6 .3 se ha representado la evolución del contenido total de

cianuro (mg/100g de muestra) (calculado a partir de la prunasina y la
amigdalina determinadas por HPLC) para las muestras amargas estudiadas,
referido a peso seco y a peso fresco .

126 /Evolución del contenido de amigdalina y prunasina
500
o)
0
0
ó
cm 300
0
E
100
50 100 150 200 250

Días julianos
-"-- Peso fresco -s Peso seco
Figura 6.3. Evolución del contenido de cianuro (mg cianuro / 100g) calculado a partir de las
concentraciones de amigdalina y prunasina determinadas mediante HPLC, para muestras
amargas por cada 100 g de peso fresco y peso seco a lo largo del periodo de desarrollo de la
almendra .
En la Figura 6.3 se observa la diferencia entre referir las concentraciones

a peso fresco o seco . Lógicamente los contenidos de cianuro referidos a peso
seco fueron más altos en todo momento que los referidos a peso fresco . Las
diferencias fueron mayores durante la formación de la semilla y casi
inexistentes en la maduración, donde el contenido de humedad fue muy bajo
(6%) .
Por lo tanto, dada la variabilidad del contenido de humedad de la

almendra, si queremos comparar el contenido de compuestos cianogénicos en
la semilla durante el desarrollo, tendremos que considerar la concentración
respecto al peso fresco .
Se ha observado un comportamiento similar de la evolución de los

compuestos cianogénicos dentro de cada grupo de variedades (dulces,
amargas y ligeramente amargas) . Por ello en las Figuras 6 .4 a 6 .6 se ha

representado la evolución de estos compuestos durante el desarrollo de la
almendra para cada uno de los grupos citados.

En las almendras dulces (Marcona, Del Cid, Peraleja, Atocha y

Ferragnès) únicamente se ha detectado amigdalina, y en cantidades muy
pequeñas (Figura 6 .4). Las amargas (S3067, S3062, S3056) y ligeramente
amargas (S3065, Genco, Tuono y Garrigues), presentan a lo largo del
desarrollo cantidades variables tanto de amigdalina como de prunasina
(Figuras 6 .5 y 6.6).
0 .3
aa
0
0
z 02
c.~
rn
E
r.- - ~E-- - -- . . .__. _ __ ._,_.
50 100 150 200 250

Días julianos
--*r-HPLC (amigdalina) -X -Microdifusión
Figura 6.4. Variación del contenido de cianuro (mg/100g de muestra fresca) calculado a partir
del contenido de amigdalina (HPLC) y mediante microdifusión en almendras dulces (Marcona,
Del Cid, Peraleja, Ferragnès y Atocha) .
0
0
Z
v 3
CD
E
IF,
50 100 150 200 250
Días julianos
tHPLC (Amigdalina) -m--HPLC (Prunasina)
A HPLC (Amigdalina+Prunasina) 0 Microdifusión
Figura 6.5. Evolución del contenido de cianuro (mg/100g de muestra fresca) calculado a partir
del contenido de amigdalina y prunasina (HPLC) y mediante microdifusión en almendras
ligeramente amargas (S3065, Garrigues, Tuono y Genco) .

128 /Evolución del contenido de amigdalina y prunasina
300
c0 200 -
Z
U
50 100 150 200 250

Días julianos
HPLC (Amigdalina) ~_ HPLC (Prunasina)
HPLC
-~- (Amigdalina+Prunasina)-M-- Microdifusión .
Figura 6.6. Evolución del contenido de cianuro (mg/100g de muestra fresca) calculado a partir
del contenido de amigdalina y prunasina (HPLC) y mediante microdifusión en almendras
amargas (S3056, S3062 y S3067) .
En la Figuras 6 .5 y 6.6 se observa una buena correspondencia entre los

contenidos de cianuro obtenidos por microdifusión y los obtenidos mediante
HPLC (equivalentes de amigdalina + prunasina) en todos los casos, lo que
viene a confirmar que la amigdalina y la prunasina son los únicos glucósidos
cianogénicos presentes en la almendra .
La evolución del cianuro total y de la amigdalina fue similar en los tres

grupos de variedades (dulces, amargas y ligeramente amargas). Hasta el día
120 los niveles de cianuro son prácticamente inexistentes . Luego se
experimenta un incremento aproximadamente entre los días 120 y 180 para
luego estabilizarse, sobre todo a partir del día 210. La gran diferencia entre los
tres grupos es que los niveles de cianuro durante el desarrollo del fruto fueron
menores en las dulces, medios en las ligeramente amargas y mucho mayores
en las amargas (Figuras 6.4, 6 .5 y 6 .6).

El contenido en prunasina se mantuvo muy bajo en general a lo largo del

desarrollo del fruto (ausente en el caso de las dulces), para desaparecer en
todos los casos cuando la almendra estuvo madura .
Dado que la prunasina es el monoglucósido presente en la parte

vegetativa (Frehner y col. 1990) y que este compuesto no se encuentra en la
almendra madura, hemos querido profundizar en el papel de este compuesto
en la acumulación de amigdalina en la almendra .
En las Figuras 6 .7 y 6.8 se muestra el porcentaje del cianuro total debido

a la amigdalina y a la prunasina durante el desarrollo de la almendra, en el
caso de las amargas y las ligeramente amargas respectivamente .
Puede observarse que la contribución de amigdalina al contenido de

cianuro total va incrementándose a lo largo de las sucesivas etapas del
desarrollo del fruto, hasta llegar a ser la única fuente de cianuro cuando la
almendra está madura.
1001
ó
U
50 aw
IW-IFI ,A IFIA
0 50 100 150 200 250
Diasjulianos
S3067(amigdalina) T S3067 (prunasina) A S3052 (amigdalina)

S3052(prunasina) 0 S3056(amigdalina) e-- S3056(prunasina)
Figura 6.7 . Porcentaje del cianuro total debido a la amigdalina y a la prunasina (determinadas
con HPLC) durante el desarrollo de la almendra para muestras amargas .

100 ,
50
3
C
!d
ci
i
0 4--
0 50 100 150 200 250
Días julianos
0 S3065(amigdalina) 0 S3065(prunasina) --Genco(amigdalina)

--Genco (prunasina) -t-Garrigues (amigdalina) -M--Garrigues (prunasina)
ME Tuono (amigdalina) -31~Tuono (prunasina)
Figura 6.8 . Porcentaje del cianuro total debido a la amigdalina y a la prunasina (determinadas
con HPLC) durante el desarrollo de la almendra para muestras ligeramente amargas .
Lógicamente, el caso de la prunasina es completamente opuesto, ya que

en los primeros estados del desarrollo ésta es el contribuyente mayoritario del
contenido total de cianuro presente en la almendra, disminuyendo en las
sucesivas etapas hasta su desaparición en la maduración .
Alrededor del día 120, las contribuciones de los dos glucósidos al

cianuro total presente en la almendra se igualan . Este comportamiento fue
similar en las almendras amargas y ligeramente amargas .
Los resultados parecen indicar que la amigdalina no es transportada

desde la planta sino que se forma en la semilla a partir de la prunasina, que sí
está presente en la parte vegetativa. Sin embargo no parece haber una relación
entre la concentración de prunasina en los tejidos y de amigdalina en la semilla
o lo que es lo mismo y el sabor dulce o amargo (Dicenta, comunicación
personal) .
Parece ser que todos los almendros tienen más o menos prunasina en la
parte vegetativa y que solo algunos son capaces de transformarla en
amigdalina en la semilla, dando lugar a las almendras amargas . Esta

Evolución del contenido de amigdalina y prunasina 1 131
transformación de prunasina en amigdalina parece estar controlada por una

glucosiltransferasa (Frehner y col. 1990), posiblemente controlada por el gen
responsable del sabor dulce o amargo de la almendra (Dicenta, comunicación
personal) .
Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que todas las variedades

siguen una pauta similar respecto a la evolución de cianuro en la semilla, sería
interesante establecer un modelo matemático que permitiera, con
independencia de la variedad considerada, estimar la concentración de este
compuesto en la semilla en función de su estado de desarrollo .
Teniendo en cuenta la importancia de la temperatura ambiente en los

procesos bioquímicos y considerando que ésta aumenta gradualmente durante
el desarrollo del fruto, hemos ensayado un modelo cinético que contempla las
variaciones de temperatura a lo largo de la evolución de la semilla.
Si se parte de la transformación de un reactivo R en un producto P que

sigue una cinética de orden "n", la velocidad de aparición del producto se
expresa mediante la siguiente ecuación diferencial :
d[P] ]n
= K[P
dt
[P] = Concentración de producto .

t = Tiempo.
K = Constante de reacción .
Si se considera el efecto provocado por la variación de la temperatura, la

constante K vendrá dada por:
K=Ko .e-E/RT
Ko = Constante.
E = Energía de activación .
R = Constante de los gases.
T = Temperatura .
Por tanto la expresión diferencial de la velocidad de aparición de un producto P

queda de la siguiente forma :

d[P] = . -E/RT .
Ko e [p]n
dt
Realizando las transformaciones correspondientes, se obtiene la siguiente

expresión :
d[P]
= Ko' . e-E/R[1/T 1/TJ .
[p]n
dt
Ko "= Constante.
To = Temperatura inicial .
T = Temperatura en cada tiempo t .
e-E/RT0
Siendo Ko' = Ko .
Por lo tanto:
-E/R[1/T-1/T 0 ] . [p] n . At
0[P] = Ko . . e
0[P] = Variación de la concentración de producto formado en un

incremento de tiempo At.
Ot = Incremento de tiempo .
Obteniendo el valor de [P] en cada instante aplicando el método de
Euler:
[P(t)] = [P(t-At)] + O[P]
[P(t)] = Concentración de producto en el tiempo t.

[P(t-Ot)] = Concentración de producto en el tiempo (t-Ot) .
0[P] = Incremento en la concentración de producto en el tiempo At.
Aplicando esta ecuación a los datos experimentales obtenidos para cada

muestra, previamente normalizados con objeto realizar una homogeneización
que permita su posterior tratamiento matemático, se obtiene:
Un valor promedio de orden de reacción n = 2.
Un valor promedio de constante de reacción Ko"= 0 .55 .
Un valor medio de E/R = 62330.
utilizando para ello como criterio de optimización del ajuste del modelo
matemático, el que la suma de los cuadrados de las diferencias entre los

Evolución del contenido de amigdalina y prunasina 1 133
valores de [P] calculado por el modelo propuesto y los valores de [P] obtenidos
experimentalmente, sea mínima.
Considerando todas las muestras estudiadas, el criterio de optimización

utilizado como función objetivo tiene un valor medio calculado de 0 .00816 con
una desviación estándar relativa del 3%. Estos valores ponen de manifiesto la
adecuación del modelo matemático utilizado, ya que la situación ideal es que los
puntos calculados por el modelo coincidan exactamente con los puntos
experimentales, en cuyo caso el valor de la función objetivo sería cero .
En todos los casos se ha supuesto una variación de tipo lineal para la

temperatura a lo largo del periodo de maduración, considerando una temperatura
media de 10°C para el día 83 del año hasta una temperatura media de 25°C para
el día 240 del año.
En las Figuras 6.9 a 6 .20 se puede observar, para cada variedad

estudiada, los datos de contenido de cianuro obtenidos experimentalmente a lo
largo del desarrollo del fruto y los calculados mediante el modelo propuesto. Se
han señalado los días naturales del año en los que se produce la floración plena
(F) y la maduración (M) en cada una de las variedades .
Se observa que las concentraciones de cianuro calculadas con el modelo

propuesto se ajustan bien a los datos experimentales obtenidos, por lo que el
modelo es válido para las variedades dulces, ligeramente amargas y amargas
estudiadas .
El modelo permite estimar el contenido de cianuro total a lo largo del

desarrollo de la almendra, si bien la cinética real no es tan sencilla como la
propuesta, ya que se debe producir un aporte de prunasina por parte de la
planta, y ésta se debe ir consumiendo para formar amigdalina . Por tanto, por una
parte se está produciendo un aporte de prunasina y por otra una disminución,
debida a una reacción de transformación de prunasina en amigdalina . El modelo
se ajusta bien a la necesidad de cuantificar en cualquier día juliano la cantidad
de compuesto producido en el fruto durante su maduración, conociendo
únicamente el contenido de amigdalina en almendra madura.

400
ÑN 300
3
O
r 200
ó
3
C
lC
0 I 50 100 150 200 250

M
F Dias julianos
0 Ciauro total(experimental) -f- Cianuro total (calculada)
Figura 6.9. Evolución del contenido de cianuro (mg/100g de muestra fresca) real (calculado a
partir de las concentraciones de amigdalina y prunasina obtenidas por HPLC) y del contenido
estimado por el modelo propuesto, para la variedad amarga S3056.
F = Floración plena, M = Maduración .
400
iaL
yam 300
3
m 200 ,.
O
O
Ó
L
3
C
. lC
V
50 100 150 200 1 250

F Dias julianos
M
--* -Cianuro total (experimentalj-E- Cianuro total (calculado)
Figura 6.10 . Evolución del contenido de cianuro (mg/100g de muestra fresca) real (calculado a

400 -
I
N
N
3
E 300 I
OI
O
O
200
O
L
3
C
d
u 100
a
a
E _
t50 100 150 -200 250
F Días julianos
0 Cianuro total(experimental)-*-- Cianuro total (calculado)
Figura 6 .11 . Evolución del contenido de cianuro (mg/100g de muestra fresca) real (calculado a
14
mL
w 10 -
3 I
E
O
°0 6 :
0
L
C
0
E I 50 100 150 200T 250

F Días julianos
t Cianuro total(experimental)-- "-Cianuro total(calculado)
Figura 6.12 . Evolución del contenido de cianuro (mg/1008 de muestra fresca) real (calculado a
estimado por el modelo propuesto, para la variedad ligeramente amarga S3065.

2
L
Nd
3
O
O
O
1
L
cm
50 100 150 200 1 250

Días julianos M
f-Cianuro total (experimental) -IF- Cianuro total (calculado)
estimado por el modelo propuesto, para la variedad Garrigues .
ÑN
E
O
O
O
óL
.R
u
E
50T 100 150 200 250

F Dias julianos M
-"-Cianuro total(experimental)-"-Cianuro total(calculado)
estimado por el modelo propuesto, para la variedad Genco.

L
U)
d
3
50 1 100 150 200 250

F Días julianos
M
--Cianuro total(experimental)~/-Cianuro total (calculado)
estimado por el modelo propuesto, para la variedad Tuono.
óL
3
C 0 .2
R
V
E
t5-
0- 100 150 200+ 250
Días julianos
+ Cianuro total (experimental) --IR- Cianuro total (calculado)
estimado por el modelo propuesto, para la variedad Marcona .

2 0 .2
Ñ
d
3
O
O
O
c 0 .1
o)
E
50 100 150 200 250

Días julianos
M
F * -Cianuro total(experimental~-Cianuro total(calculado)
estimado por el modelo propuesto, para la variedad Del Cid .
R
Ñd 0 .4
3
E
0 0 .3
0 ir
ó
3G 0 .2
10
.Ci
01
E
50 1 100 150 200 1 250

Días julianos
M
- "-Cianuro total(Experimental)-f- Cianuro total (Calculado)
estimado por el modelo propuesto, para la variedad Ferragnès .

0 .2
L
U)
d
3
01
O 0 .1
O
ai
3
C
R
. C>
E
0 100 150 200 250
F Días julianos
M
-9 -Cianuro total (experimental)-F-Cianuro total(calculado)
estimado por el modelo propuesto, para la variedad Peraleja .
N
G1
£ 0 .3
3
m
0
0
c 0 .2 -~
- - - -
50 -100 150 200 t 250
Días julianos
F M
0 Cianuro total (experimental ~-*- Cianuro total (calculado)
estimado por el modelo propuesto, para la variedad Atocha .

Como todo modelo, el propuesto tiene sus limitaciones . Para el cálculo

de la producción del compuesto cianogénico en la almendra, se han
considerado las variables tiempo y temperatura . El modelo es una
aproximación de segundo orden de una ecuación diferencial y la función
objetivo utilizada es la minimización de la suma de los cuadrados de los
residuos .
6 .4. CONCLUSIONES .
1 . La amigdalina está presente en concentraciones mínimas en las almendras

dulces, pequeñas en las ligeramente amargas y elevadas en las amargas .
2 . La evolución del cianuro total y de la amigdalina fue similar en los tres

grupos de variedades (dulces, amargas y ligeramente amargas), aumentando
principalmente entre los días 120 y 180, si bien las concentraciones finales
fueron claramente superiores en las amargas .
3 . La prunasina solo fue detectada en pequeñas cantidades en las almendras

amargas y ligeramente amargas durante el desarrollo, nunca en las dulces ni
en ninguna almendra madura .
4 . La prunasina es el compuesto cianogenico mayoritario al inicio del

desarrollo del fruto, mientras que la amigdalina lo es al final . En torno al día 120
del año prunasina y amigdalina están igualadas . Aparentemente, la prunasina
presente en la parte vegetativa es transportada hasta la semilla donde es
transformada en amigdalina .
5. Se ha establecido un modelo que permite conocer el contenido de cianuro

total de la almendra durante el desarrollo del fruto, en función del tiempo, la
temperatura y el contenido de amigdalina en la almendra madura.

7 . INFLUENCIA DEL POLINIZADOR

EN EL CONTENIDO DE AMIGDALINA
DE LA ALMENDRA


Influencia del polinizador en el contenido de amigdalina / 143
7 . INFLUENCIA DEL POLINIZADOR EN EL CONTENIDO DE AMIGDALINA

DE LA ALMENDRA .
7 .1 . INTRODUCCIÓN
La polinización es el proceso por el cual el polen es transportado desde

las anteras de una flor hasta el estigma de la misma o de otra flor . La
polinización en almendro es un proceso activo que se lleva a cabo por medio
de las abejas, y es imprescindible para que una flor de lugar a un fruto (Felipe
2000).
Dada la auto¡ncompatibilidad generalizada de esta especie, la falta de

una planificación adecuada de la polinización puede dar lugar a grandes
reducciones de cosecha (Herrero y Ayala 1975, Socias i Company y col. 1994) .
Aunque no es un fenómeno generalizado, el polen puede afectar a

ciertas características del endospermo (xenia) o tejidos adyacentes (metaxenia)
(Swamy y Krishnamurthy 1980) . Esta influencia ha sido observada para
algunos caracteres en peral (Nyeki 1972), manzano (Ruth y Williams 1983),
pistacho (Crane y Iwakiri 1980), castaño (Mckay y Crane 1939) y pecan
(Marquard 1988) .
Existe muy poca información respecto a la influencia del polinizador

sobre las características de la almendra. Kumar y Das (1996) observaron que
el polinizador tuvo una ligera influencia sobre el tamaño del fruto y la
maduración, pero no sobre otros caracteres.
Respecto al sabor amargo, los agricultores ocasionalmente han

observado la presencia de almendras amargas en árboles que generalmente
producen semillas dulces, lo que explican frecuentemente por la polinización
con polen de árboles de semilla amarga, próximos a la plantación .
En este sentido, Crane y Lawrence (1952) observaron que todas las

semillas de la variedad 'Marie Dupuy' resultaron amargas cuando se polinizó

144 / Influencia del polinizador en el contenido de amigdalina
con polen de un almendro amargo. Además, Simms (1996) observó que los
almendros polinizados con polen de melocotonero produjeron semillas
amargas . Otro hecho que nos llama la atención en este sentido es que algunas
variedades heterocigóticas pueden producir almendras ligeramente amargas de
diferente grado de amargor dentro de un mismo árbol y sobre todo
dependiendo del año.
Sin embargo, Kester y Asay (1975) y Kester y Gradziel (1996)

observaron que el sabor dulce o amargo del polinizador no se veía afectado por
el polinizador, aunque no presentaron datos . Dicenta y col. (2000) estudiando
32 cruzamientos entre variedades dulces, amargas y ligeramente amargas
realizados específicamente con este fin, concluyeron que tal efecto no existía .
Que nosotros sepamos en ningún caso ha sido estudiado el efecto del genotipo
del polinizador en el contenido de amigdalina de la semilla que se forma.
El objetivo del presente trabajo es determinar si el polinizador dulce,

amargo o ligeramente amargo tiene alguna influencia sobre el sabor y el
contenido de amigdalina de la semilla que se obtiene .
7 .2 . MATERIAL Y MÉTODOS
En este estudio hemos determinado el sabor y el contenido de

amigdalina de muestras de almendras procedentes de cruzamientos realizados
con el fin de determinar el posible efecto del polinizador sobre este carácter.
Los cruzamientos fueron realizados mediante polinización manual

dirigida en el Departamento de Mejora y Patología Vegetal del CEBAS-CSIC,
en Murcia. Para ello las flores fueron emasculadas y polinizados con polen
obtenido anteriormente, secado a temperatura ambiente y conservado a 4°C .
Como genitores femeninos fueron utilizadas 4 variedades de almendro

de distinto genotipo y sabor: Del Cid (DD dulce), Marcona (Dd Dulce),
Garrigues (Dd ligeramente amarga) y S3067 (dd amarga) .

Cada una de estas variedades fue polinizada con 4 variedades de

distinto genotipo y sabor: Ramillete (DD dulce), Atocha (Dd dulce), Garrigues
(Dd ligeramente amarga) y S3067 (dd amarga).
Dado que Garrigues es autoincompatible, el cruzamiento de Garrigues x

Garrigues fue sustituido por Garrigues x S3065, siendo S3065 una selección
ligeramente amarga (Dd) obtenida en el CEBAS . S3067 es una selección
autocompatible obtenida en el CEBAS . El resto de las variedades ya fueron
descritas en el Capítulo 3.
Los valores de amigdalina (mg/100g) obtenidos en los Capítulos 4 y 5

para estos genitores fueron :
Madres : Del Cid (2 .15), Marcona (1 .88), Garrigues (22.70)
S3067(7152).
Padres: Ramillete (nd), Atocha (7 .66), Garrigues (22 .70),
S3065 (265.4) y S3067 (7152).
Una vez maduros, los frutos procedentes de los cruzamientos fueron

recogidos, desprovistos del mesocarpo y mantenidos en una cámara a 7°C
hasta su análisis .
El sabor dulce, ligeramente amargo o amargo de cada muestras fue

determinado mediante la cata de cinco almendras por dos personas .
En cada una de las muestras fue determinado el contenido de

amigdalina (mg /100g de muestra seca) según el protocolo descrito en el Anexo
3 .3.
Los datos fueron analizados según el siguiente modelo estadístico:
[amigdalina] = p+ Madre; + Padrej + (Madre x Padre);j + Error;jk
En los casos donde se observaron diferencias significativas, fue aplicada

la prueba de Tukey .

7 .3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .
No se ha observado ninguna influencia del polinizador en el sabor de la

semilla, con independencia de si éste fue de semilla dulce o amarga . Así, todas
las muestras de Marcona y de Del Cid fueron dulces, las de Garrigues
ligeramente amargas y las del S3067 amargas .
La Tabla 7.1 muestra los resultados obtenidos del análisis de la varianza

del contenido de amigdalina para las 16 combinaciones . Se observa que los
dos factores estudiados (Padre, Madre) y la interacción fueron muy
significativos, poniendo en evidencia su influencia sobre el contenido de
amigdalina de la almendra obtenida .
Tabla. 7.1 . Análisis de varianza del contenido de amigdalina de las almendras obtenidas
mediante cruzamientos entre variedades dulces, ligeramente amargas y amargas .
Fuente de Suma de Grados de Cuadrado F ratio Significación F

Variación Cuadrados libertad medio
Efectos 331512951 6 55252158 3616 < 0.001
principales
Madré 330602947 3 110222982 7213 < 0.001
Padre 910003 3 303334 20 < 0.001
Madre x Padre 2703443 9 300382 20 < 0.001
Explicado 334216393 15 22281093 1458 < 0.001
Residual 488890 32 15278
Total 334705284 47 7121389
La prueba de Tukey para las madres (Figura 7.1) muestra las diferencias
entre los valores medios de amigdalina, diferenciándose la madre amarga
(S3067) del resto, con un valor mucho más elevado de amigdalina . Las tres
madres restantes no presentaron diferencias significativas entre ellas, en parte
debido a las grandes diferencias con la variedad amarga . La variedad
ligeramente amarga Garrigues presentó un valor medio notablemente superior
a las dos dulces, si bien no hubo diferencias significativas .

(8.80)
Marcona (1 .50)
Del Cid (3 .05)
Garrigues (21 .80) (6070)
S3067 (6070)
Figura 7.1 . Valores medios de amigdalina (mg/100 g) de cada madre polinizada con padres de
diferente sabor y genotipo . Los valores dentro de diferentes casillas presentan diferencias
significativas al 5% según la prueba de Tukey. Entre paréntesis y en negrita, la media de cada
grupo homogéneo .
La prueba de Tukey clasificó a los padres en tres grupos (Figura 7.2) . El

genitor masculino que dio lugar a las semillas con mayor contenido en
amigdalina fue precisamente el amargo S3067, seguido del heterocigótico
ligeramente amargo Garrigues que se agrupó con el heterocigótico dulce
Atocha . Atocha se agrupó a la vez con el homocigótico dulce Ramillete, que dio
lugar a las semillas con menos amigdalina .
(1414)
Ramillete (1377) (1487)
Atocha (1450) Atocha (1450)
Garrigues - S3056 (1523) (1745)
S3067 (1745)
Figura 7.2. Valores medios de amigdalina (mg/100 g) de las semillas de las cuatro madres
conjuntamente, al ser polinizadas con cada uno de los padres indicados en la figura . Los
valores dentro de diferentes casillas presentan diferencias significativas al 5% según la prueba
de Tukey. Entre paréntesis y en negrita, la media de cada grupo homogéneo .
Dada la significativa interacción entre Padres y Madres, hemos realizado

un análisis individual entre los distintos cruzamientos para cada madre. Los
resultados del análisis de la varianza para cada madre (Tablas 7.2 a 7.5)
muestran que las diferencias no fueron significativas en el caso de Marcona,
rozaron la significación en el caso de Del Cid y Garrigues y fueron muy
significativas en el caso del amargo S3067.

Tabla 7.2. Análisis de varianza del contenido de amigdalina de almendras de la variedad Del
Cid polinizada con cuatro variedades de diferente sabor y genotipo .
Fuente de Suma de Grados de Cuadrado
F ratio Significación F
variación cuadrados libertad medio
Entre grupos 0.9525 3 0.3175 3.8570 0.0563
Intra grupos 0.6585 8 0.0823
Total 1 .6110 11
Tabla 7.3. Análisis de varianza del contenido de amigdalina de almendras de la variedad

Marcona polinizada con cuatro variedades de diferente sabor y genotipo.
Entre grupos 0.0928 3 0.0309 1 .3106 0.3364
Intra grupos 0.1887 8 0.0236
Total 0.2815 11

Garrigues polinizada con cuatro variedades de diferente sabor y genotipo.
Entre grupos 53.74 3 17.91 3.81 0.0577
Intra grupos 37.59 8 4.70
Total 91 .33 11

S3067 polinizada con cuatro variedades de diferente sabor y genotipo.
Entre grupos 3613391 3 1204464 19.71 0.0005
Intra grupos 488852 8 61107
Total 4102213 11

Podemos decir que en el caso de Marcona y en cierta medida de Del Cid

y Garrigues, las almendras tuvieron el mismo contenido de amigdalina con
independencia del polinizador (dulce, ligeramente amargo o amargo) utilizado .
Sin embargo en el caso de S3067, sí se detectaron diferencias significativas
entre los contenidos de amigdalina de las muestras de esta variedad
polinizadas con los diferentes polinizadores .
Las Figuras 7 .3 a 7.6 muestran los valores medios de contenido de

amigdalina de cada una de las madres polinizadas con los diferentes genitores
y los resultados de la prueba de Tukey.
Como ya indicó el análisis de la varianza, en el caso de Del Cid,

Marcona y Garrigues vemos que las diferencias fueron pequeñas y no
significativas .
Sin embargo, en el caso de S3067, se observa que la prueba de Tukey

diferenció el cruce con el amargo (con él mismo, autopolinización) por tener un
mayor contenido de amigdalina que cuando se polinizó con el resto de los
genitores .
En general no hay un efecto importante del polinizador sobre el

contenido de amigdalina de la almendra, de manera que las diferentes
muestras de almendra de una variedad dada mantienen su contenido de
amigdalina muy cerca de la media con independencia del polinizador .
Sin embargo, en algunos casos sí se observa un ligero efecto del sabor

amargo del polinizador sobre el contenido de amigdalina, de manera que los
padres con mayor contenido en amigdalina (Garrigues, S3065 y sobre todo
S3067) dan lugar a semillas con más amigdalina que los genitores con menos
amigdalina como Ramillete o Atocha . Esto es evidente principalmente en el
caso de que la madre tiene un elevado contenido de amigdalina (Garrigues y
sobre todo en S3067) y no en el resto . Este efecto es tan pequeño que no pudo
ser detectado mediante la cata de las almendras .

a
a a
Ramillete Atocha Garrigues S3067
Figura 7.3. Contenido de amigdalina (mg /100 g de muestra seca) de las almendras, para cada
cruzamiento realizado con la variedad Del Cid como madre en combinación los cuatro padres
indicados, de diferente sabor y genotipo . Los valores con igual letra no presentan diferencias
significativas al 5% según la prueba de Tukey.
a
a
0
0
c
cruzamiento realizado con la variedad Marcona como madre en combinación con los cuatro
padres indicados, de diferente sabor y genotipo. Los valores con igual letra no presentan
diferencias significativas al 5% según la prueba de Tukey.

30
a
a
a a
Ramillete Atocha S3065 S3067
cruzamiento realizado con la variedad Garrigues como madre en combinación con los cuatro
padres indicados, de diferente sabor y genotipo . Los valores con igual letra no presentan
diferencias significativas al 5% según la prueba de Tukey .
8000
a
000
cruzamiento realizado con la variedad S3067 como madre en combinación con los cuatro
padres indicados, de diferente sabor y genotipo . Los valores con igual letra no presentan
diferencias significativas al 5% según la prueba de Tukey.

Así pues debemos aceptar que el genotipo de la madre es el que

determina principalmente el sabor y contenido de amigdalina de la semilla,
teniendo el genitor masculino una incidencia mínima sobre este carácter .
Las almendras (los cotiledones) analizadas para cada muestra tienen

diferente genotipo dependiendo del polinizador, lo cual parece tener un
ligerísimo efecto sobre en el contenido final de amigdalina . En la Tabla 7 .6 se
muestran los genotipos dd "amargos" esperados .
Tabla 7.6. Porcentaje de genotipos dd "amargos" esperados en los cruzamientos realizados.

Garrigues-
Ramillete Atocha S3067
S3065
Del Cid 0 0 0 0
Marcona 0 25 25 50
Garrigues 0 25 25 50
S3067 -- 0 50 50 100
En el caso de la madre DD (Del Cid), con independencia del genotipo del

polinizador ninguna almendra sería dd (amarga) . En el caso de la madre Dd
(Marcona o Garrigues), el 25% y el 50% de las almendras serán dd, cuando el
polinizador sea Dd y dd respectivamente . En el caso de la madre dd (S3067), el
50% y el 100% de las almendras serán dd, cuando el polinizador sea Dd y dd
respectivamente .
Los resultados aquí obtenidos podrían abrir de nuevo el debate sobre el

efecto del polinizador sobre el sabor de la almendra y más concretamente
sobre su contenido en amigdalina . Al igual que sucedió en nuestro caso, el
efecto del polinizador ha sido negado por varios autores (Kester y Asay 1975,
Kester y Gradziel 1996), e incluso se ha demostrado experimentalmente con un
conjunto de cruzamientos creados con tal fin (Dicenta y col. 2000).

Sin embargo, además de los comentarios de algunos agricultores sobre

la capacidad del polen de árboles amargos para inducir el sabor amargo en
semillas dulces, Crane y Lawrence (1952) observaron que todas las semillas de
la variedad 'Marie Dupuy' resultaron amargas cuando se polinizó con polen de
un almendro amargo . Además, Simms (1996) observó que los almendros
polinizados con polen de melocotonero produjeron semillas amargas .
La ausencia de estudios del efecto del polinizador sobre el contenido de

amigdalina de la almendra no permiten contrastar nuestros resultados, los
cuales parecen indicar la existencia de un ligero efecto en este sentido .
7.4. CONCLUSIONES
1 . El sabor dulce, ligeramente amargo o amargo de una variedad no se ve

afectado por el fenotipo dulce, ligeramente amargo o amargo del polinizador .
2 . El contenido de amigdalina de las almendras de una variedad dada no se ve

alterado de una forma importante por el polinizador, sea cual sea su contenido
en amigdalina o su genotipo para el sabor amargo. Sin embargo, cuando los
genitores masculinos y femeninos son heterocigóticos (Dd) u homocigóticos
amargos (dd), el genotipo del polinizador puede modificar ligeramente el
contenido de amigdalina de una variedad dada .


8 . CONCLUSIONES
GENERALES


Conclusiones / 157
8. CONCLUSIONES GENERALES.
1 . El acondicionamiento y preparación de las muestras más adecuado para la

determinación analítica de los compuestos cianogénicos fueron : almendras con
tegumento, sin desengrasar, trituradas, congeladas con nitrógeno líquido y liofilizadas
durante 32 horas.
2. Para el análisis por HPLC, la extracción de los compuestos cianogénicos de la

almendra debe realizarse con metano¡ al 100% durante 12 horas, a 30°C y con
agitación . Las condiciones cromatográficas seleccionadas fueron : Columna
Symmetry C1 8, eluyente acetonitrilo :agua (80:20), caudal 1 .3mUmin y detector
fotométrico a 218 nm.
3. En el análisis por microdifusión, para la hidrólisis de los glucósidos no es

necesaria la adición de (3-glucosidasa . La determinación colorimétrica es adecuada
para contenidos de cianuro inferiores a 41 .9 mg/100g de muestra, mientras que la

valoración gravimétrica se debe utilizar para muestras con más de 41 .9 mg/1008.
4. Los resultados obtenidos por cromatografía y microdifusión son comparables en

cuanto a la precisión en la detección de los compuestos cianogénicos, si bien la
cromatografía permite identificar y cuantificar los compuestos cianogénicos presentes.
Por separado . Además, la cromatografía es más sencilla de realizar y requiere un
menor tiempo de análisis . Los límites de detección obtenidos para la cromatografía
fueron 0.387 mg/100g para la amigdalina (0 .022 mg cianuro/1008) y 0 .136 mg
cianuro/100 g para la prunasina . (0.012 mg cianuro/ 100g). En el caso de la
microdifusión fueron 0.013 mg cianuro/100g para colorimetría y 33.4 mg cianuro/100g
para valoración gravimétrica .
5. Se ha observado una gran variabilidad para el contenido de amigdalina entre las

variedades estudiadas . Aunque hubo cierta variación anual, el contenido de
amigdalina de la almendra es característico de cada variedad . La almendras amargas
pueden distinguirse de las "no amargas" (dulces y ligeramente amargas) por su
elevado contenido de amigdalina . Las almendras ligeramente amargas no pueden
diferenciarse claramente de las dulces, en función de su contenido de amigdalina,
aunque parece que todas las ligeramente amargas tienen cierta cantidad de

Conclusiones / 158
amigdalina . La determinación del contenido de amigdalina no parece ser una
herramienta fiable para determinar el genotipo DD o Dd de una variedad dulce dada.
6. Desde el punto de vista organoléptico, nuestros resultados se ajustan en general
a la hipótesis establecida de herencia monogénica del sabor amargo, siendo el sabor
dulce dominante . El estudio de las concentraciones de amigdalina de individuos
amargos y "no amargos" y su segregación en la descendencia también se ajustan a
la hipótesis establecida del carácter, aunque la dominancia posiblemente no sea
completa . Esto podría explicar la presencia de individuos ligeramente amargos con
niveles intermedios de amigdalina. Dentro de cada grupo de sabor (dulce,
ligeramente amargo y amargo) hay una variabilidad considerable respecto a la
concentración de amigdalina, que no ha podido ser detectada mediante la cata de las
almendras .
7. La evolución del cianuro total de la almendra durante su desarrollo fue similar en
las variedades dulces, amargas y ligeramente amargas, aumentando principalmente
entre los días 120 y 180 del año, si bien las concentraciones finales fueron claramente
superiores en las amargas . La prunasina solo fue detectada en pequeñas cantidades
en las almendras ligeramente amargas y amargas durante el desarrollo del fruto,
nunca en almendras maduras, ni en las dulces . Cuando está presente, la prunasina
es el compuesto cianogénico mayoritario al inicio del desarrollo del fruto, mientras que
la amigdalina lo es al final. Se ha establecido un modelo que permite conocer el
contenido de cianuro total de la almendra durante el desarrollo del fruto en función del
tiempo, la temperatura y el contenido de amigdalina en la almendra madura .
8. El sabor dulce, ligeramente amargo o amargo de una variedad no se ve afectado
por el sabor dulce, ligeramente amargo o amargo del polinizador. El contenido de
amigdalina de las almendras de una variedad dada no se ve alterado de una forma
importante por el polinizador, sea cual sea su contenido en amigdalina o su genotipo
para el sabor amargo . Sin embargo, cuando los genitores masculinos y femeninos
son heterocigóticos (Dd) u homocigóticos amargos (dd), el genotipo del polinizador
puede modificar ligeramente el contenido de amigdalina de una variedad .

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10 . ANEXOS


Anexos 1179
ANEXO 3 .1 . PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN

DE GRASA DE LAS ALMENDRAS
Material
" Equipo de extracción Soxtec Selecta .
" Algodón .
" Cartuchos de extracción de celulosa de 26 mm de diámetro x 60 mm de
alto. (Whatman)
Reactivos
" Éter de petróleo para HPLC.
Procedimiento
" Pesar exactamente (2 a 3 g de almendra) triturada con tamaño de grano
entre 0 .5 y 1 .0 mm en el cartucho ya montado en su soporte metálico .
Colocar encima un poco de algodón . Acoplar el soporte de la muestra en
el equipo de extracción Soxtec y elevar los cartuchos accionando la
palanca correspondiente .
" Hacer circular agua por el equipo .
" Numerar y tarar los cubiletes de aluminio .
" Colocar los cubiletes de aluminio en el "porta" . Poner en cada cubilete
aproximadamente unos 40 ml de éter de petróleo .
" Acoplar a la vez todos los cubiletes en sus respectivos puntos de
destilación, y manteniéndolos acoplados bajar la palanca fijadora
apretado el embrague y soltar el embrague cuando se llega a la posición
más baja . (Si se procede correctamente, los cubiletes deben quedar
fijos .)
" Bajar los cartuchos, introduciéndolos en los cubiletes y asegurarse que
queda abierta la comunicación del disolvente a través de la tubuladura
lateral .
" Encender el baño, cuya temperatura está ajustada a 1350C. Cuando se
alcanza esa temperatura se mantiene 15 minutos, que es el tiempo
programado de extracción .
" A continuación, se elevan los cartuchos y se sigue la destilación 30
minutos más, durante los cuales se lava la grasa embebida.
" Recuperación del éter : Se prosigue la destilación otros 10 minutos con la
llave lateral cerrada, pasando aire en posición de "evaporación" en el
extractor .
" Se apaga el baño de aceite, volviendo la palanca de evaporación a su
posición de reposo . Se bajan los cubiletes (accionando la palanca de la
izquierda), y se dejan sobre la base aún caliente unos 10 minutos para
eliminar los posibles restos de disolvente .
" Si se quiere determinar el contenido graso, dejar enfriar . Pesar y por
diferencia calcular el contenido graso.

Anexos l180
Anexo 3.1 . (Continuación) . Protocolo de extracción de grasa de las almendras .
" Si se tiene que trabajar con el aceite, guardarlo cuanto antes en un

recipiente de color, tapado y manteniéndolo a 4°C
" Nota : Si no se va a hacer una nueva extracción, recuperar el éter.
" Si se va a hacer una segunda extracción, repetir los pasos indicados
antes, poniendo en los cubiletes unos 10 ml de éter, a los que se
agregarán luego, al abrir la llave, los 30 mi que se suelen recuperar en
cada extracción.
" Es recomendable realizar este proceso en una vitrina .

Anexos 1181
ANEXO 3 .2. PROTOCOLO PARA LA LIOFILIZACIÓN DE ALMENDRAS
Material
" Viales de vidrio.
" Frasco Dewar con nitrógeno líquido.
Instrumentación
" Liofilizador Telstar (Cryodos 2000) .
Procedimiento
" El liofilizador Telstar consta de una cámara de secado y vacío, serpentin
de condensación y una bomba de vacío externa.
Para empezar el proceso de enfriamiento se pulsa el botón C del panel
frontal y se deja funcionando el equipo hasta que alcanza una
temperatura de - 43°C . Encender entonces la bomba de vacío y pulsar
P, para el vacío .
" El equipo debe estar tapado herméticamente, tanto las válvulas de los
viales como la tapa de la cámara de secado.
" El liofilizador está en condiciones operativas cuando alcanza una
temperatura de - 79°C a, - 80°C y una presión de 4.102 mbar, esto se
logra habitualmente en un tiempo de 15 a 20 minutos .
Con el liofilizador a punto :
Tener pesado en los viales del liofilizador exactamente entre 3 y 5
gramos de almendra previamente triturada, en el tamaño de grano
deseado, anotar este peso (P1) .
Cerrar herméticamente los viales.
" Introducir en el nitrógeno liquido a -78°C la muestra dispuesta en el vial
durante 30 segundos con el fin de conseguir la congelación de la misma.
" Para empezar el proceso de liofilizado se introducen con mucho cuidado
cada uno de los viales en su puesto de liofilización, al colocarlo abrir
poco a poco la válvula de control de extracción, con el fin de evitar el
cambio brusco de presión en el interior del vial y así evitar que sea
absorbida, por la fuerza de extracción de la bomba de vacío, parte de la
muestra a liofilizar .

Anexos /182
Anexo 3.2 . (Continuación) . Protocolo para la liofilización de almendras
" Una vez colocados todos los viales comenzar el proceso de liofilización y
mantenerlo durante 32 horas, al cabo de este tiempo empezar a bajar
con mucho cuidado cada uno de los viales, girando en sentido contrario
la válvula de control de extracción de cada vial, para evitar nuevamente
cambios bruscos de presión .
" Pesar cada vial y anotar este peso como (P2) . La cantidad de agua
extraída en el proceso se calcula mediante la expresión :
agua extraída = (Pl - P2 / P1 ) x 100
" Para finalizar se pulsa el icono (- ), del panel frontal se deja reposar el
equipo hasta que se logre la descongelación total del serpentín del
condensador, se seca y se limpia cada pieza del equipo y se tapa.
Nota: En el caso de trabajar con almendra no madura se realiza la liofilización
con almendra entera y manteniendo el proceso durante 40 horas.

Anexos l 183
ANEXO 3.3. PROTOCOLO PARA EL ANÁLISIS

DE COMPUESTOS CIANOGÉNICOS POR HPLC.
Material
" Tubos de centrifuga de Pyrex de 5 cm de largo x 2 cm de diámetro .
" Tapones de silicona para tubos de centrífuga.
" Filtros de Nylon de 0 .45pm (Millipore)
" Jeringa
" Tubos Ependorf
Reactivos
" Acetonitrilo grado HPLC Lab Scan
" Metanol grado HPLC Lab Scan
" Agua ultrapura, obtenida mediante un sistema Milliq (Millipore, Bedford,
MA, USA)
" Patrones de amigdalina y prunasina (Sigma)
Instrumentación
" Centrifuga Alresa
" Baño con agitación Memmert
" Cromatográfo de líquidos de alta resolución Waters multisolvente
provisto de:
" Columna Symmetry C18 Waters
" Precolumma C18 Simmetry
" Válvula Rheodine modelo 7725, bucle de 20 pL
" Detector Diode Array 900
" Software millenium 2010
Condiciones cromatográficas
" Volumen de muestra 20 p.L .
" Flujo del eluyente 1 .3 ml/min
" Composición del eluyente : Acetonitrilo :agua (20:80) isocrática
" Tiempo de elución : 10 minutos

Anexos /984
Anexo 3.3. (Continuación) . Protocolo para el análisis de compuestos

cianogénicos por HPLC .
" Tiempo de retención : Amigdalina : 3.4 minutos y Prunasina : 5 .7 minutos .
Procedimiento
" Se pesa de forma exacta aproximadamente 0 .2 gramos de almendra si
esta es amarga y 0 .4 gramos si la almendra es dulce o ligeramente
amarga .
Se introduce en un tubo de centrifuga junto con 5 mí- de metano¡ de
grado HPLC, se tapa y se deja durante 12 horas en un baño con
agitación a 30°C .
" Se centrifuga durante 5 minutos a 3000 rpm y se deja reposar tratando
de no mezclar nuevamente el sedimento formado .
" El sobrenadante se toma con una jeringa apropiada filtrándolo a través
de un disco Millipore de Nylon de 0 .45p.m Cuando la muestra obtenida
es de almendras dulces o ligeramente amargas se inyecta el extracto
filtrado directamente, pero en el caso de almendras amargas es
necesario dependiendo de la concentración del analito en la muestra
diluir 1 :5, 1 :10 o incluso 1 :20.
La concentración de cianuro a partir de amigdalina o prunasina se obtiene

mediante el siguiente cálculo:
MPm. V
Mgcianuro l 100g muestra = 100
Pi
M = Molaridad de amigdalina o prunasina
P; = Peso de la muestra (g) .
Pm = Masa molecular del cianuro
V = volumen de extractante (mL)

Anexos / 185
ANEXO 3.4. PROTOCOLO DEHIDRÓLISIS Y MICRODIFUSIÓN

DE CIANURO EN ALMENDRAS
Material
" Baño termostático .
Reactor (Vial cilíndrico hermético de 3 cm de diámetro x 6 cm de alto,
con un vial colector de 1 cm de diámetro x 3 cm de alto) Figura 3.7
Capitulo 3
Reactivos
" Disolución de NaOH 0.2M
" Tampón fosfato pH 5 .5
Procedimiento
" Se colocan en el reactor de 0 .2 a 0.4g de almendra liofilizada pesada
exactamente.
" En el vial colector colocado dentro del reactor que se detalla en la Figura
3.7 del Capitulo 3, se dispone 1 mL de disolución de NaOH 0 .2N y por
último se adiciona sobre la muestra 4 mide tampón fosfato pH=5 .5 y se
cierra el reactor inmediatamente.
" Se mantiene en un baño termostatizado a 35°C durante 24 horas, al
cabo de ese tiempo se saca el reactor del baño y se deja enfriar en el
frigorífico, posteriormente se abre el reactor y se recoge el cianuro del
vial colector para su determinación ya sea por colorimetría o valoración
gravimétrica, según su concentración .
" El rendimiento de la extracción se verifica de la siguiente forma :
" Se prepara una muestra con 5 mide patrón de cianuro (1 ppm) con 1
mide NaOH 0 .2N en el vial colector y 0 .7 mL de ácido fosfórico, para
ajustar el pH a 5.5 . Se aplica el procedimiento de microdifusión seguido
de determinación colorimétrica y se determina el rendimiento que resulta
ser del 94% .

Anexos / 186
ANEXO 3 .5 .PROT000LO DE DETERMINACION COLORIMETRICA DE

CIANURO TOTAL
(Para concentraciones de cianuro inferior a 41 .9 mg /100 g muestra)
Material
" Matraz de5 mi-
" Vial colector
Instrumentación
" Espectrofotometro.
Reactivos
" Disolución patrón de KCN (1000 ppm) se conserva refrigerada a 4°C
durante 1 semana .
" Fosfato diácido de potasio : (KH2PO4) (150g /L) .
" Cloramina T al 1 % .
" Ácido barbitúrico en piridina: En un matraz aforado de 50 mí- formar una

papilla homogénea de 3 g ácido barbitúrico y agua ; añadir 15 mí- de
piridina y 3 mide HCI concentrado. Enfriar y.aforar a 25 mi- Guardar la
disolución en frasco de topacio y refrigerada a 4°C .
Procedimiento
" Se pasa cuantitativamente a un matraz de 25 mi, con un cuentagotas, la
disolución alcalina del colector de difusión, lavándose el colector con
4 mide NaOH 0.2M en tres porciones, que se añaden al matraz.
" Se añaden 5 mide la disolución de KH2PO4 y a continuación
inmediatamente 0 .5 mL de la disolución de cloramina T . Dejar reposar
aproximadamente durante 1 minuto. Añadir 1 ml de la disolución de
ácido barbitúrico . en piridina y aforar. Medir la absorbancia a 580 nm,
frente a un blanco preparado con 5 mi- NaOH 0.2M, 5 mide disolución
de KH2PO4, 0.5 mide disolución de cloramina T y 1 mide disolución
de ácido barbitúrico en piridina.
La determinación se hace por comparación con la absorbancia de un
patrón preparado a partir 5 mí- de cianuro de 1 ppm en NaOH 0 .2 M,
5mL de disolución de KH2PO4, 0.5mL de disolución de cloramina T y
1 mL de disolución de ácido barbitúrico en piridina, llevados también a
25 mi- que debe dar una Absorbancia frente al blanco de 0.810 a 0.850 .

Anexos / 18 7
Anexo 3.5. (Continuación) . Protocolo de determinación colorimétrica de

cianuro total (Para concentraciones de cianuro inferior a 41 .9 mg /100 g
muestra)
" Si el patrón no da una absorbancia en el intervalo previsto hay que

comprobar la estabilidad de los reactivos o de la disolución patrón de
cianuro.
" Lavar los matraces utilizados lo antes posible con HN03 (1 :3)
" Si la Absorbancia de una muestra problema es < 0 .020 . Consideramos
que la concentración de cianuro esta por debajo del límite de detección .
El cálculo de la concentración de cianuro en mg/100g de muestra se realiza

comparando la absorbancia de la muestra AM con la absorbancia del patrón
(Ap) de 1 ppm de cianuro del cual se ha tomado 5 mL y se ha llevado a un
volumen de 25 mL, con lo cual la concentración del patrón Cp es de 0.2 ppm
por tanto :
Am . Cp. V.f
(mg cianuro/100g) = 100
ApYi
Siendo :
V= Volumen final en mL.
Pi= Peso de la muestra en gramos .
AM = Absorbancia de la muestra.
Ap= Absorbancia del patrón .
Cp = Concentración del patrón de cianuro en ppm
f = Factor debido a la recuperación del 94% en la microdifusión (1 .06)

Anexos /188
ANEXO 3 .6. PROTOCOLO DE VALORACION GRAVIMETRICA DE

CIANUROS.
(Para concentraciones de cianuro superiores a 41 .9 mg 1100 g)
Material
" Vasos de precipitado de 100 ml .
" Vial colector
" Agitador magnético
Reactivos
" Indicador : 5-Dimetil (4-aminobenciliden) rodanina : 0 .02% en acetona . La
disolución se conserva en la oscuridad unas 4 semanas .
" Patrón primario : AgN03 p.a. conservado en oscuridad (5 x 10-Z M)
" Cuando la muestra lo requiere se preparan diluciones del patrón
primario .
Procedimiento
Se transvasa cuantitativamente a un vaso de precipitados de 100 mi ,
con un cuentagotas, la disolución alcalina de cianuro del colector,
lavándolo y reuniendo los lavados con el primer transvase, con 3
porciones de agua de -- 1-2 mi. Se diluye a ~ 50 mi- con agua y se
añade 1 gota de indicador . Se va añadiendo reactivo valorante AgN03
lentamente (sobre todo en proximidad del viraje) con agitación
magnética, hasta viraje de amarillo a rojizo.
Se calculan los gramos de AgN03 gastados en la valoración por
diferencia de peso del frasco que contiene dicha disolución antes de
comenzar la valoración y después del punto final.
" Hacer una determinación en blanco con 1 mi- NaOH 0.2 M, añadiéndole
agua hasta 50mL y 1 gota de indicador

Anexos 1189
Protocolo de valoración gravimétrica de cianuros .(Para

Anexo 3 .6. (continuación) .
concentraciones de cianuro superiores a 41 .9 mg /100 g)
Los mg de cianuro por 100 gramos de muestra, se calculan de la siguiente

forma :
PnXCdisxf
mg de cianuro/ 100 g de muestra = x 100
Pi
P = Gramos netos de disolución de AgN03 gastados.

(Los gramos netos son los gastados en la valoración menos los gastados en la
valoración del blanco)
Cds = Concentración de la disolución de AgN03 expresada en mg de cianuro
por gramo de disolución de AgN03 .
Pi = Peso de la muestra en gramos.
f = Factor debido a la recuperación del 94% . (1 .06)

Anexos l 190
Anexo 3.7. Valores medios de contenido de cianuro obtenido por HPLC y cianuro obtenido por
microdifusión expresado en mg de cianuro/100 g de muestra seca.
HPLC Microdifusión HPLC Microdifusión
Muestra Media Desviación Media Desviación Muestra Media Desviación Media Desviación
estándar Estándar estándar estándar
1 nd - nd - 49 2 .10 0.11 1 .98 0.12
2 nd - nd - 50 2 .35 0.04 1 .94 0.01
3 nd - nd - 51 2 .35 0.04 2.36 0.03
4 nd - nd - 52 2 .48 0.05 2.42 0.01
5 nd - nd - 53 2 .67 0.12 2.40 0.44
6 nd - nd - 54 6 .60 0.05 6.90 0.75
7 nd - nd - 55 8 .60 0 .10 8.26 0.05
8 nd - nd - 56 9 .60 0.01 10.20 0.10
9 nd - nd - 57 10.73 0 .05 10.13 0.49
10 nd - nd - 58 10 .78 0 .13 9.92 0.62
11 0 .06 0.01 0.08 0.02 59 11 .60 0 .30 9.67 0.06
12 0 .07 0.01 0.12 0.03 60 11 .66 0 .66 12 .17 0.06
13 0 .10 0.02 0.10 0.04 61 12.16 0 .12 12 .33 0.06
14 0 .11 0.01 0.09 0.01 62 12.56 0 .49 10 .27 1 .10
15 0 .11 0.01 0.11 0.02 63 13.35 0 .50 13 .47 0.85
16 0 .11 0.01 0.19 0.06 64 13.90 0 .02 12 .10 0.80
17 0 .12 0.01 0.12 0.01 65 14.33 0 .06 15 .40 0.50
18 0 .15 0.04 0.12 0.03 66 15.03 0 .21 18 .04 0.81
19 0 .16 0.04 0.15 0.03 67 15.12 0 .01 15 .30 0.10
20 0 .16 0.04 0.19 0.04 68 15.30 1 .13 15 .36 1 .74
21 0 .20 0.01 0.21 0.01 69 15.57 1 .27 14 .73 1 .37
22 0 .21 0.01 0.37 0.01 70 16.83 0 .06 12 .94 0.04
23 0 .24 0.04 0.27 0.02 71 19.07 2 .21 19 .73 3.82
24 0 .25 0.05 0.36 0.04 72 19.11 0 .02 15 .45 0.46
25 0 .27 0.01 0.29 0.01 73 19.30 1 .95 20 .18 1 .63
26 0 .29 0.07 0.33 0.04 74 20.32 0 .68 22 .07 0.31
27 0 .30 0.02 0 .30 0.05 75 21 .45 1 .11 14 .32 1 .62
28 0 .30 0.03 0 .24 0.04 76 134 .1 7 .5 134.2 5.0
29 0 .31 0.01 0 .25 0.03 77 138 .6 2 .7 136.4 3.1
30 0 .33 0.04 0.32 0.09 78 208 .7 2 .8 218 .0 8.3
31 0 .35 0.01 0 .30 0.09 79 214 .0 4 .0 216 .2 4.9
32 0 .35 0.05 0 .34 0.04 80 215 .0 3 .8 212 .8 4.6
33 0 .39 0.01 0 .43 0.04 81 215 .8 1 .2 215 .4 4.5
34 0 .70 0.14 0.58 0.03 82 216 .5 1 .4 215 .9 4.1
35 0 .78 0.07 0.97 0.06 83 219 .9 4 .9 224 .2 1 .0
36 1 .13 0.06 1 .80 0.10 84 234 .8 1 .9 231 .5 5.3
37 1 .29 0.11 1 .29 0.03 85 235 .9 3 .8 228 .0 5.9
38 1 .35 0.04 1 .39 0.06 86 279 .3 2 .0 281 .2 0.7
39 1 .35 0.01 1 .29 0.12 87 284 .7 3 .6 286 .7 3.3
40 1 .36 0.01 1 .36 0.06 88 286 .1 3 .3 284 .4 5.9
41 1 .40 0.01 1 .30 0.06 89 295 .8 3.2 284 .1 4.4
42 1 .41 0.04 1 .38 0.04 90 309 .0 6.2 304 .5 5.7
43 1 .42 0.08 1 .52 0 .10 91 334 .9 4.8 338 .3 0.5
44 1 .44 0.01 1 .40 0 .07 92 337 .3 2.2 320.2 2.0
45 1 .47 0.05 1 .43 0 .03 93 342 .5 1 .1 338.5 1 .5
46 1 .49 0.02 1 .56 0 .01 94 401 .0 5.4 405 .0 1 .0
47 1 .74 0.11 1 .61 0 .11 95 411 .8 1 .1 383 .4 1 .9
48 2.07 0.15 2.13 0 .23

Anexos /191
Anexo 4.1 . Valores medios obtenidos de contenido de amigdalina obtenidos para cada
variedad estudiada en cada año de cosecha junto con la desviación estándar .
1997 1998 Total 1997 y 1998

Muestra Sabor Media Desviación Media Desviación Media Desviación
Estándar estándar estándar
Desmayo L. Dulce 8 .11 0 .09 6.86 0.10 7 .49 0.09
Del Cid Dulce - - 2.15 0.04 2 .15 0.04
Atocha Dulce 7.28 0 .04 8.02 0.13 7 .65 0 .10
Ferragnès Dulce 5.16 0 .10 5.5 0.16 5 .33 0 .13
Peraleja Dulce 1 .76 0 .20 2.56 0.37 2 .16 0.30
Primorskii Dulce nd - nd - nd -
Marcona Dulce 1 .87 0 .10 1 .87 0.27 1 .87 0 .20
Ramillete Dulce nd - nd - nd -
Ferraduel Dulce 21 .96 0 .53 23.36 0.53 22 .66 0.53
Achaak Dulce 10 .22 0 .03 11 .25 0 .37 10.74 0.26
Planeta Dulce 3 .71 0 .16 4.65 0.09 4.18 0.13
Bonita Dulce nd - nd - nd -
Colorada Dulce 2 .41 0.22 2.72 0.07 2.57 0.16
Carretas Dulce 2 .49 0.32 2.65 0.19 2.57 0.26
La Mona Dulce 4 .63 0.31 6 .10 0.10 5 .37 0.23
Tioga Dulce 0 .43 0.04 0 .52 0.02 0 .48 0.03
Titan Dulce 0 .43 0.04 0 .62 0.02 0.53 0.03
CEBAS Dulce nd - nd - nd -
Pajarera Dulce - - 27 .26 1 .14 27.26 1 .14
Rumbeta Dulce - - 5 .39 0 .10 5.39 0 .10
Garrigues L. amargo 23.81 0.54 22 .93 0 .44 23.37 0 .49
Genco L. amargo 18 .74 0.09 17.34 0 .10 18.04 0 .10
Tuono L. amargo 25.05 0.44 25 .81 0 .27 25.43 0 .37
S3060 Amargo 4915 35 5036 58 4976 48
S3062 Amargo 3870 86 3784 67 3827 77
S3076 Amargo 5894 84 6028 19 5961 61
S3108 Amargo 3799 22 3810 25 3805 24
S3112 Amargo 5206 55 5011 63 5109 59
S3126 Amargo 2439 47 2360 131 2400 98I

Anexos l 192
Anexo 5.1 . Valores medios de contenidos de amigdalina (mg/100g de muestra seca) junto con
la desviación estándar obtenida para cada muestra estudiada .
1997 1998 Total 1997 y 1998

Desviación Desviación Desviación
Muestra Sabor Media Media Media
Estándar Estándar estándar
S3057 Dulce 6.34 0 .18 3.70 0 .18 5.02 0.18
S3059 Dulce 24.46 0 .18 - - 24.46 0.18
S3066 Dulce 21 .65 1 .98 24.82 1 .41 23.24 1 .72
S3068 Dulce 24.11 0.18 25.34 0 .73 24.73 0.53
S3070 Dulce 14.78 2.38 4.05 0 .73 9.42 1 .76
S3071 Dulce 2.82 0.73 1 .76 0 .18 2.29 0.53
S3072 Dulce 35.02 1 .94 42.06 0 .71 38.54 1 .46
S3073 Dulce 26.05 0.27 24.29 0 .73 25.17 0.55
S3077 Dulce 6.51 0.63 4.93 0 .35 5.72 0.51
S3081 Dulce 3.70 0.83 6.69 0 .18 5.20 0.60
S3082 Dulce 1 .94 0.73 3.52 0 .63 2.73 0.68
S3083 Dulce 40.66 0.70 42.59 0.87 41 .63 0.79
S3084 Dulce 23.94 0.18 26.58 0 .81 25.26 0.59
S3087 Dulce 28.69 1 .94 25.52 0.20 27.11 1 .36
S3089 Dulce nd - nd - nd -
S3090 Dulce 12.50 1 .23 19.36 1 .02 15.93 1 .13
S3091 Dulce 6.16 0.88 4.58 0.10 5.37 0.63
S3097 Dulce 45.76 2.03 33.44 2.69 39.60 2.38
S3098 Dulce 3 .87 0.18 5 .63 0.18 4.75 0.18
S3099 Dulce 5 .81 0.44 5 .28 1 .15 5 .55 0.87
S30103 Dulce 1 .23 0.10 5 .28 0.13 3 .26 0.12
S30106 Dulce 2 .11 0.10 2 .11 0.18 2 .11 0.15
S30116 Dulce nd - 1 .06 0.10 0 .53 0.10
S30124 Dulce nd - 1 .76 0.27 0 .88 0.27
S3061 L. amarga 189.7 0.8 191 .8 11 .6 190.8 8 .2
S3063 L. amarga 296 .0 1 .0 292 .2 19.9 293 .9 14 .1
S3065 L. amarga 266 .0 3.7 266 .1 0 .2 265 .7 2 .6
S3069 L. amarga 358 .0 19 .5 374 .9 14.4 366 .4 17 .1
S3075 L. amarga 245 .0 8.7 251 .7 1 .0 248 .3 6 .2
S3079 L. amarga 371 .4 12 .0 331 .0 18.9 351 .1 15 .8
S3088 L. amarga 117.0 0.8 187.4 2 .2 152.2 1 .7
S30107 L. amara 227 .0 8.6 153.1 1 .8 190.1 6 .2
S30109 L. amara 209 .4 5.2 169.0 0 .1 189.2 3 .7
S30118 L. amara 245 .0 0.3 216 .4 2 .1 230 .7 1 .5
S30125 L. amarga 285 .1 2 .4 335 .9 0.3 310 .6 1 .7
S3060 Amarga 4951 35 3701 49 4327 43
S3062 Amarga 3956 86 5093 58 4525 73
S3064 Amarga 4171 66 3851 67 4011 67
S3067 Amarga 7151 94 4166 33 5658 70
S3076 Amarga 5810 84 7267 19 6538 61
S30108 Amarga 3793 22 6009 19 4901 21
S30112 Amarga 5228 55 3786 25 4507 43
S30115 Amarga 5898 38 5002 63 5450 52
S30126 Amarga 2439 47 2360 131 2400 98

Anexos l 193
Anexo 6.1 . Valores medios de contenido de amigdalina y prunasina, cianuro total obtenido por
HPLC (equivalente de amigdalina y prunasina) y cianuro total por microdifusión, todos
expresados en mg de cianuro/100g muestra húmeda.
HPLC Microdifusión
Cianuro Cianuro Cianuro total Cianuro
uro total
(Prunasina) (amigdalina+prunasina)
Día Desviación Desviación
Muestra Media Media Media Media
Jullano estándar estándar
83 2 .10 17.30 19.40 0.14 8.20 1 .10
118 15.20 32.45 47.65 1 .70 43.48 2 .10
146 97 .98 44.25 142 .2 0.8 138.3 1 .9
S3067
180 322 .7 38.50 361 .2 2.7 352 .5 2.0
210 374 .3 nd 374 .3 2.3 372 .0 4.9
240 381 .8 nd 381 .8 4.0 375 .4 5.3
83 0.84 8.76 9.60 1 .13 10.40 0.42

118 8.00 21 .30 29.30 1 .30 26.90 3 .14
146 52 .40 25.80 78.20 4.60 73.20 3 .14
S3062
180 173.6 15.25 188 .9 2.7 183 .3 2.8
210 194.2 nd 194 .2 1 .1 188 .2 4.0
240 199.5 nd 199 .5 1 .5 192 .5 4.6
I
83 0.77 7.43 8.20 1 0.14 10.40 2.00
118 5.20 14.70 19.90 3.90 22.20 4.20
146 43.90 25.95 69.85 0.45 74.20 1 .80
S3056
180 151 .2 20.1 171 .3 8 .2 170 .6 1 .0
210 186 .4 nd 186.4 5 .5 186 .5 2.8
240 190 .2 nd 190.2 2 .4 189 .4 8.3
Í
83 0.12 0 .47 0 .59 0 .04 0 .64 0.06
118 0.55 1 .04 1 .59 0 .07 1 .64 0 .08
146 3 .31 1 .46 4 .77 0 .07 5 .11 0 .10
S3065
180 10.43 0 .78 11 .21 0 .34 11 .10 0 .70
210 12.00 nd 12 .00 2 .04 12 .90 2 .30
240 12.30 nd 12.30 3 .19 12 .68 2 .40
83 nd 0.05 0.05 <0.01 0.05 <0.01

118 0 .04 0.08 0.12 0.02 0.14 0 .04
146 0 .11 0.12 0.23 0.06 0.28 0 .10
Genco 180 0.75 0.10 0.85 0.02 0 .81 0.07
210 0.89 nd 0 .89 0.10 0.91 0.09
240 0.97 nd 0.97 0.06 0.95 0.03
83 0.01 nd 0.01 <0.01 nd -

118 0.01 nd 0.01 <0.01 0.01 <0.01
146 0.03 nd 0.03 <0 .01 0.03 <0.01
Marcona 180 0.10 nd 0.10 <0 .01 0.10 <0.01
210 0.11 nd 0.11 <0 .01 0.11 <0.01
240 0.11 nd 0 .11 <0 .01 0 .10 <0.01

Anexos /194
Anexo 6.1 . (Continuación) . Valores medios de contenido de amigdalina y prunasina, cianuro

total obtenido por HPLC (equivalente de amigdalina y prunasina) y cianuro total por
microdifusión, todos expresados en mg de cianuro/100g muestra húmeda .
HPLC M icrodifusión
Cianuro Cianuro Cianuro total
Cianuro total
(amigdalina) (Prunasina) (amigdalina+prunasina)
Día Desviación Desviación)
Muestra Media Media Media Media
juliano estándar estándar
83 0.01 nd 0.01 <0.01 nd - _

118 0.02 nd 0.02 <0 .01 0 .02 <0 .01
146 0.05 nd 0 .05 0 .02 0.06 0.02
Del Cid
180 0.12 nd 0 .12 0 .03 0.12 <0 .01
210 0.12 nd 0 .12 0 .01 0.13 <0 .01
240 0.13 nd 0 .13 0 .03 0.14 0.02
83 nd nd nd - nd -
118 0.01 nd 0 .01 <0 .01 0.01 <0 .01
146 0.03 nd 0 .03 <0 .01 0.03 <0 .01
Peraleja
180 0.09 nd 0 .09 0 .01 0.08 0.01
210 0.09 nd 0 .09 0 .01 0.08 0.01
240 0.09 nd 0 .09 0 .01 0,09 0.01
83 0.02 nd 0 .02 <0 .01 0.02 <0 .01

118 0.05 nd 0 .05 j <0.01 0.04 <0 .01
146 0.15 nd 0 .15 0.03 0 .14 0.03
Atocha
180 0.38 nd 0 .38 0.05 0.38 0.05
210 0.39 nd 0 .39 0 .06 0.39 0.03
240 0.38 nd 0 .38 0.01 0.38 0 .10
83 nd 0 .07 0 .07 <0 .01 0.06 <0 .01

118 0 .03 0 .09 0 .12 0.02 0.11 0 .02
146 0 .24 1 0 .10 0 .34 0.02 0.30 0 .02
Garrigues
180 1 .14 0 .14 1 .28 0.02 1 .25 0 .02
210 1 .32 nd 1 .32 0.01 1 .29 0 .01
240 1 .33 nd 1 .33 0.01 1 .30 0.01
83 nd 0.05 0 .05 <0.01 0.04 <0 .01

118 0.03 0.10 0 .13 0 .01 0.12 0.01
146 0.20 0.10 0 .31 0 .01 0.31 0.01 _I
Tuono
180 1 .15 0.12 1 .27 0 .03 1 .21 0.03
210 1 .31 nd 1 .31 <0 .01 1 .31 0.01
240 1 .33 nd 1 .33 <0 .01 1 .33 0.02

Arrazola Paternina Guillermo

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Análisis de glucósidos cianogénicos en variedades de almendro... Guillermo Arrázola Paternina.

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 2002

Centro de Edafología y Biología

Análisis de glucósidos cianogénicos

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 2002

Departamento de Química Analítica

D. GUILLERMO LÓPEZ CUETO, Director del Departamento de Química Analítica

Que D. GUILLERMO ARRAZOLA PATERNINA ha realizado bajo la dirección de

Alicante, Enero 2002

Fdo . D . Guillermo López Cueto.

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 2002

Departamento de Química Analítica

Alicante, Enero de 2002

Federico Dicenta López-Higuera Ñu la Grane Teruel

María Luisa Martín Carratalá

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 2002

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 2002

Estoy persuadido á que esta especie (el almendro amargo)

Diccionario Universal de Agricultura .

Madrid, en la Imprenta Real, Año de 1798 .

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 2002

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 2002

3 . Puesta a punto de métodos analíticos .

4. Variabilidad del contenido de amigdalina en variedades

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 2002

5 . Herencia del contenido de amigdalina en una descendencia de 5

6 . Evolución del contenido de amigdalina y prunasina durante

7. Influencia del polinizador en el contenido de amigdalina de la

8. Conclusiones generales. 155

10. Anexos . 177

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 2002

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 2002

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 2002

3.11 Parámetros calculados relacionados con el ajuste a los modelos de

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 2002

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 2002

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 2002

6.4 Variación del contenido de cianuro calculado a partir del contenido

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 2002

6.16 Evolución del contenido de cianuro real (calculado a partir de las

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 2002

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 2002

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 2002

El almendro, Prunus dulcis Miller, es una especie con una gran

El fruto es una drupa, con su parte exterior formada por el pericarpio y el

1 .1 .1 . Clasificación taxonómica y origen .

Existen diferentes hipótesis sobre el origen de almendro, que se ponen

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 2002

Si se aceptan las clasificaciones de Schneider (1904), Rehder (1947) y

otros, que la engloban en el género Prunus, subgénero Amygdalus, debe

adoptarse la denominación Prunus dulcis Miller . Si se sigue la clasificación de

Spach (1843), que considera Amygdalus como género, resulta adecuado el

nombre Amygdalus communis, aceptado también por los investigadores de la

los mismos Grasselly y Crossa-Raynaud (1980).

Kester y col. (1990) aceptaron la pertenencia del almendro al género

Prunus, la denominación Prunus dulcis para el almendro cultivado y el nombre

Actualmente se admite que Prunus communis es el resultado de

(Prunus bucharica, Prunus ténzliana y Prunus kuramica) que todavía existen en

Raynaud 1980). Todas ellas poseen almendras amargas, si bien se han

encontrado algunos tipos con semillas dulces.

La multiplicación por semilla tras cruzamientos espontáneos, dio lugar a

nuevas formas todavía silvestres que, después de las etapas de cultivo en

zonas más alejadas de su centro de origen, han permitido la expansión