PpdD Tipo IV Pilin de Escherichia coli K-12 Puede ser ensamblado en Pili en

Pseudomonas aeruginosa

La Escherichia coli K-12 posee al menos 16 genes cromosómicos relacionados con genes
implicados en la formación del pili tipo IV en otras bacterias gramnegativas.

Sin embargo, E. coli K-12 no produce pili tipo IV cuando se cultiva en condiciones normales de
laboratorio. Los resultados de la transcripción inversa-PCR, análisis de fusión de operón e
inmunotransferencia demostraron que varios de los genes de la supuesta piliación de E. coli se
expresan a niveles muy bajos. El aumento del nivel de expresión del gen principal de la pilina
(ppdD) y de los genes de ensamblaje hofB y hofC (homólogos de los genes de ensamblaje de
Pseudomonas aeruginosa tipo IV pilB y pilC) no condujo a la producción de pilus. Sin embargo, la
expresión del gen ppdD en P. aeruginosa llevó al ensamblaje de PpdD en pili que fueron
reconocidos por anticuerpos dirigidos contra la proteína PpdD. El ensamblaje de PpdD en pili en P.
aeruginosa dependía de la expresión de los genes pilB y pilC e independiente de la expresión del
gen estructural pilA de P. aeruginosa pilin. El tipo IV pili (34), apéndices largos y delgados
presentes en las superficies de muchas bacterias gramnegativas, están involucrados en la
adherencia bacteriana a varias superficies (9, 10, 31), patogenicidad (5, 10, 21), y fenómenos
relacionados (38). La biogénesis del tipo IV pilus consiste en una maquinaria compuesta de hasta
16 proteínas que se encuentran en los diferentes compartimentos bacterianos (19). El papel
exacto de cada proteína de piliación y la forma en que se regulan sus genes no están claros. Sin
embargo, se sabe que el tipo IV pili contiene una subunidad principal de pilin que es procesada
proteolíticamente y N metilada por una prepilin-péptidasa (13, 18, 33, 35). Esta enzima, junto con
las subunidades mayor y menor de la pilina (2), una proteína de la membrana externa (secretina)
(6, 11, 22) con su proteína similar a la chaperona (12), y una proteína de unión ATP (37) son los
componentes mejor caracterizados de la maquinaria de piliación tipo IV. No se sabe si Escherichia
coli K-12 posee el tipo IV pili, pero sorprendentemente, 16 genes en siete loci diferentes (Tabla 1)
que podrían codificar componentes de una máquina de piliación han sido identificados en su
cromosoma (7). Recientemente, Francetic et al. demostraron que uno de estos genes, el gen pppA
que codifica una prepilina peptidasa, está mal expresado y que los niveles de proteína PppA y de
actividad son cuatro veces más altos cuando se cultiva E. coli K-12 a 37°C que a 30°C (16). En este
informe, examinamos la expresión de otros genes de piliación putativa en E. coli K-12 cultivados
bajo condiciones de laboratorio y examinamos si la subunidad de pilina mayor putativa, PpdD,
puede ser ensamblada en pili.

Primero, examinamos la transcripción de genes hipotéticos de piliación tipo IV en E. coli K-12. Se

utilizó un ensayo de transcripción inversa-PCR (RT-PCR) con cebadores de oligonucleótidos
específicos de genes y ARN bacteriano total para analizar la expresión de ppdD (región A) (Tabla
1), hofQ (región C; supuesta secreción de membrana externa), y yggR (región D; supuesta proteína
de unión ATP). Como control positivo, la expresión del gen no inducido cromosómico masculino
(8) también fue probada por la RTPCR. El ARN total fue aislado de bacterias de la cepa MG1655 o
MC4100 de E. coli que crecieron hasta la fase exponencial o estacionaria en el caldo Luria-Bertani
(LB) usando un kit de ARN total RNeasy (Qiagen). El ADN contaminante se eliminó por digestión
con DNasa I (Boehringer Mannheim). El ARN (5 mg) fue transcripto y amplificado usando Ready To
Go RT-PCR (Pharmacia) y 200 pmol de oligonucleótidos específicos. Para cada par de reacciones
RT, se precalentó un tubo durante 10 minutos a 95°C para inactivar la transcriptasa inversa y
comprobar la contaminación por ADN. Los tubos se incubaron en un termociclador según las
especificaciones de Pharmacia. Los productos RT-PCR fueron analizados en un gel de agarosa al
1%. ppdD, hofQ e yggR no fueron transcritos ni amplificados en forma inversa, mientras que un
producto RT-PCR fue obtenido con cromosomas masculinos y con ppdD clonados en un plásmido
bajo control de promotor de laca (ver abajo; también datos no mostrados). Para validar los
resultados del análisis RT-PCR y comparar la expresión de los genes probados con la del gen pppA
previamente estudiado (16), se analizó la expresión de los genes de piliación putativa tipo IV
mediante la construcción de dos fusiones transcripcionales con lacZ. La hipotética región
promotora de la hofMNOPQ operón aguas arriba de la hofM no contiene una secuencia
promotora de consenso. Por lo tanto, usamos PCR para amplificar un fragmento de 314-bp cuyo
extremo 59 es 275 bp aguas arriba del inicio de la traducción de hofM dentro del gen aguas arriba,
mrcA. Este fragmento de PCR fue clonado en pRS551 (15 a 30 copias/célula) entre una secuencia
terminadora de transcripción y lacZYA sin promotor para dar pCHAP3103[F(hofM9- lacZ)] (ver
Tablas 2 y 3 para descripciones detalladas de los plásmidos y cepas utilizados en este estudio). Esta
fusión de operón también se introdujo por recombinación homóloga en el cromosoma de la cepa
MC4100 para dar PAP3003. La región aguas arriba de ppdA en el ppdABC operón también carece
de una secuencia promotora de consenso, por lo que amplificamos un fragmento de 578-bp cuyo
extremo 59 es 150 bp aguas arriba del codón de parada de thyA, el gen aguas arriba de ppdA. Este
producto de PCR fue clonado en pRS551 para dar pCHAP3122[F(ppdA9-lacZ)]. b-Galactosidasa fue
ensayada en derivados de E. coli K-12 cultivados en LB a 37°C. Las unidades F(ppdA9-lacZ) y
F(hofM9-lacZ) transmitidas por plasma se expresaron mal[117 a 330 y 165 a 320 unidades Miller
(29), respectivamente, en comparación con 15 a 40 unidades Miller para el vector vacío],
independientemente de si las bacterias se recolectaron en fase exponencial o estacionaria. La
actividad de la b-galactosidasa en E. coli portadora del cromosoma F (hofM9- lacZ) fue de 17
unidades de Miller, comparable a la expresión de bajo nivel de pppA observada anteriormente
(16). Por lo tanto, tanto la RT-PCR como la b-galactosidasa muestran que la hofMNOPQ operón
está mal transcrita. Concluimos que los genes de piliación putativa tipo IV en las regiones A, B, C y
D (Tabla 1) están mal expresados.

Para caracterizar el producto del gen supuestamente principal de la pilina, ppdD, hemos
aumentado los anticuerpos de conejo contra una proteína híbrida periplásmica MalEPpdD. Para
proporcionar una fuente de proteína PpdD, se clonó un fragmento de PCR compuesto por ppdD
con su secuencia Shine-Dalgarno bajo el control del promotor de la laca en diferentes vectores. La
inmunotransferencia de los extractos de estas cepas reveló la presencia de una banda de PpdD (19
kDa) inducible por isopropil-b-D-tiogalactosida (IPTG) que estaba ausente de las cepas de control
que transportan el vector vacío. Luego se probó si la PpdD, como todas las otras pilinas de tipo IV
(34), tiene un enlace de disulfuro intramolecular y es procesada por las péptidasasas de prepilina.
Para ello, se introdujeron plásmidos portadores del fragmento de PCR de ppdD clonado en cepas
de E. coli K-12 con o sin PulO (la prepilina peptidasa de Pul secreton[14, 29]) o en un PAK mutante
de Pseudomonas aeruginosa con el gen principal de la pilina pilA eliminado pero con un gen de la
prepilina peptidasa pilD funcional (PAK A2) (26). Cuando las proteínas celulares fueron examinadas
por electroforesis en gel de dodecilo sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) e
inmunotransferencia, se encontró que la PpdD migraba más lentamente cuando se reducía con
ditiothreitol ($20 kDa; no se mostró). Por lo tanto, la PpdD, que tiene cuatro cisteínas, tiene al
menos un enlace de disulfuro intramolecular. En ausencia de prepilina peptidasa exógena, el PpdD
fue mal cortado a 30°C y procesado al 50% a 37°C en E. coli K-12 (Fig. 1, carriles 1 y 2), pero fue
casi totalmente procesado por las péptidasasas de prepilina PulO y PilD en E. coli y P. aeruginosa,
respectivamente (Fig. 1, carriles 3 y 4). Por lo tanto, el PpdD tiene las características típicas de un
pilín tipo IV. El precursor predicho del PpdD tiene un péptido líder N-terminal corto, similar al de
los pilinos de Neisseria y Pseudomonas (tipo IVa) y diferente al de los pilinos tipo IVb tipificados
por Vibrio cholerae TcpA, que tienen péptidos líderes más largos (.20 aminoácidos) (34). Los
anticuerpos de MalE-PpdD no detectaron PpdD en E. coli K-12 ni en otras 18 cepas de E. coli que
demostraron ser portadoras del gen ppdD (16) (no se muestra). Además, las cepas de E. coli K-12
que carecen del factor huésped de integración de las proteínas reguladoras globales, Lrp, StpA, Fis
y H-NS, eran indistinguibles de las cepas parentales isogénicas con respecto a la expresión ppdD y
hofM (datos no mostrados). Por lo tanto, la incapacidad de E. coli para expresar genes endógenos
de piliación tipo IV no se limita a la cepa K-12. Los resultados de los estudios presentados hasta
ahora sugieren que la E. coli K-12 no produce pili tipo IV porque la ppdD y posiblemente uno o más
de los genes de piliación están mal expresados. Se utilizaron la microscopía electrónica y el
etiquetado de inmunogold con los anticuerpos MalE-PpdD para determinar si el aumento del nivel
de expresión de ppdD o de ppdD junto con los genes de piliación adyacentes hofB y hofC (Tabla 1)
podría promover la piliación en E. coli K-12. Se examinaron las células de colonias de E. coli
PAP5023 (que portan una supresión de la proteína MalE para evitar la detección de la proteína
MalE por los anticuerpos de MalE-PpdD), PAP5023 (pCHAP3098) (plásmido que portan sólo ppdD)
y PAP5023 (pCHAP3101) (plásmido que portan ppdD, hofB y hofC) cultivadas en placas de LB
(véanse los Cuadros 2 y 3 para las descripciones de los plásmidos y las cepas). Ninguna de estas
tres cepas produjo pili detectable que reaccionara con anti MalE-PpdD (Fig. 2). Sin embargo, la
superficie de las bacterias productoras de PpdD estaba cubierta por partículas de oro, lo que
indica que el PpdD podría estar expuesto en la superficie de la célula (Fig. 2B y C). No tenemos una
explicación plausible para esta observación. Dado que la expresión de los genes implicados en la
patogenicidad bacteriana, y en particular los implicados en la biogénesis del pilus, suele estar
regulada y puede ser inducida por condiciones específicas de crecimiento (28), anticipamos que
los genes de piliación de E. coli K-12 podrían estar sujetos a un control medioambiental similar. Sin
embargo, la expresión de ppdD, determinada por inmunotransferencia, y hofM, determinada por
el análisis de la actividad de la b-galactosidasa de E. coli MC4100 F(hofM9-lacZ), no se vio afectada
por la temperatura (20, 30, 37, y 42°C) en LB o en un medio mínimo que contenga glicerol (0.5%)
(25), por inductores conocidos de algunos genes de patogenicidad (LB más rojo del Congo[27],
medio esencial mínimo y medio modificado de Dulbecco[28]; ambos de Gibco-BRL) o condiciones
anaeróbicas en LB o medio modificado de Dulbecco Eagle (no se muestra).

En vista de nuestro fracaso en encontrar condiciones que incrementaran la expresión de hofM o

ppdD, buscamos directamente genes que pudieran controlar su transcripción. En primer lugar, se
intentó inactivar un represor putativo en E. coli MC4100 F(hofM9-lacZ) mediante la transposición
de la mutagénesis con l::Tn1098 (41) con selección para la resistencia a la tetraciclina (Tcr; 16
mg/ml) y fenotipos de Lac1 en el medio mínimo de M63 que contiene lactosa (0,2%) (25). Ninguno
de los aproximadamente 15.000 mutantes de inserción de Tn1098 potenciales (Tcr) eran Lac1.
También realizamos la mutagénesis Tn1098 de MC4100 portando un plásmido de bajo número de
copias en el que la ppdD bajo su propio promotor se fusionó con un gen promotor que codifica la
resistencia a la kanamicina[F(ppdDD-aphA3)] (pCHAP3121) (Tabla 2), con selección de resistencia
al cloranfenicol (34 mg/ml), la tetraciclina (16 mg/ml) y la kanamicina (Kmr; 30 mg/ml) en agar
Luria-Bertani (agar L). También intentamos sobreexpresar un gen activador putativo presente en E.
coli K-12 electroporando cinco bancos cromosómicos independientes (HindIII, XbaI, Sau3A1, y en
dos experimentos separados, BamHI-leaved MG1655 ADN cromosómico clonado en pUC18) en
MC4100 (pCHAP3121) y seleccionando para las colonias de E. coli K-12 en Cmr Apr Kmr. De
alrededor de 20.000 colonias de abril que portaban un plásmido con un fragmento del cromosoma
K-12 de E. coli, 40 exhibieron un aumento de Kmr pero ninguna de ellas produjo niveles
detectables de PpdD (no se muestra). Debido a nuestra incapacidad para encontrar condiciones
que permitan la formación de pilus tipo IV en E. coli K-12, no pudimos determinar si la PpdD
puede, de hecho, formar filamentos que se asemejen al pili. Dado que P. aeru ginosa puede
formar pili tipo IV a partir de subunidades de pilin codificadas por genes clonados de otras
especies de bacterias (4, 15, 20, 23, 40), se probó si PpdD podía formar pili en P. aeruginosa PAK
A2 carente de pilin tipo IV endógeno. Las cepas testigo PAK y PAK A2A1 (Fig. 3A y C) se observaron
con microscopía electrónica, mientras que con PAK A2 (Fig. 3B) no se observó ninguna. El PAK A2
PpdDD1 produjo pili, pero parecía ser más corto que los formados por el PAK (Fig. 2D). Para
comprobar si los pili producidos por el PAK A2 PpdD1 contenían PpdD y si su biogénesis dependía
del PilB, un componente esencial de la maquinaria de biogénesis del pilus tipo IV (26),
examinamos el PAK y el PAK que llevaban una supresión del pilB (PAK B2) mediante el etiquetado
inmunológico y la microscopía electrónica con anticuerpos PilA, y el PAK A2 PpdDD1 y el PAK B2
PpdDD1 con anticuerpos de PpdD (Fig. 4). Como era de esperar, los pili recubiertos de oro se
observaron con PAK (Fig. 4A) pero no con PAK B2 (Fig. 4B). Asimismo, se observaron estructuras
pilosas recubiertas de oro con PAK A2 PpdDD1 y no con PAK B2 PpdDD1 (Fig. 4C y D). Así,
concluimos que los pili observados por microscopía electrónica (Fig. 3D) están compuestos de
PpdD y que su biogénesis es dependiente de PilB. Como un enfoque alternativo para detectar
subunidades de pilin ancladas en la superficie que pudieran derivarse de pili ensamblados, se
extrajeron proteínas de la superficie celular de P. aeruginosa PAK, PAK B2, PAK con pilC eliminado
(otro gen esencial para la biogénesis de pilus tipo IV en P. aeruginosa[26]; PAK C2), PAK A2 PpdD1,
PAK B2 PpdD1, y PAK C2 PpdD1 por cizallamiento. Las proteínas que fueron liberadas fueron
examinadas por SDS-PAGE e inmunotransferencia (Fig. 5). El PilA se extrajo sólo de la cepa PAK, y
el PpdD se extrajo sólo de las células PAK A2 PpdDD1 (Fig. 5A y B). Como control adicional, se
extrajeron proteínas de superficie de PAK que expresan tanto pilA como ppdD. En este caso,
ambas proteínas fueron extraídas en cantidades equivalentes a las obtenidas con bacterias que
expresan sólo uno de los genes del pilin (Fig. 5C). Por lo tanto, la producción de pilA no interfiere
con el montaje de PpdD en estructuras de superficie en P. aeruginosa PAK. Estas dos técnicas
diferentes muestran que la PpdD puede reemplazar a la PilA para formar pili tipo IV en
Pseudomonas. Por lo tanto, el PpdD puede actuar como una subunidad principal de pilin. Es
notable que E. coli K-12 contenga dos conjuntos de genes crípticos relacionados, uno (el grupo de
genes gsp) que se supone codifica un secreto que es parte de la vía secreta general (17) y otro (los
genes ppd y hof) que se presume que están involucrados en la piliación tipo IV (este estudio).
Juntos, estos genes representan casi el 1% del genoma de E. coli K-12 (7). ¿Por qué la E. coli no
produce pili tipo IV? Demostramos aquí que la falta de producción de PpdD pilin no es la única
explicación. Otra causa podría ser el bajo nivel de expresión de otros supuestos factores de
ensamblaje del pilus. No identificamos ninguna condición que aumentara la expresión de estos
genes, aunque los experimentos de mutagénesis y clonación podrían no estar saturándose y
muchas condiciones ambientales no fueron probadas. Sin embargo, nos gustaría plantear la
posibilidad de que al menos algunos genes de piliación se expresen constitutivamente a niveles
muy bajos, que los factores reguladores que normalmente controlarían su expresión estén
ausentes de E. coli K-12, que más de un elemento regulador esté implicado, o que los genes

Agradecemos a Stephen Lory, John Mattick y Cynthia Whitchurch por su guía útil y por suministrar
plásmidos, anticuerpos y mutantes de P. aeruginosa. También estamos muy agradecidos a Olivera
Francetic, que identificó muchos de los genes de piliación putativa tipo IV en la secuencia
genómica de E. coli K-12, y a los miembros del laboratorio de secreción por su constante interés y
apoyo. Este trabajo fue apoyado en parte por la Unión Europea (beca de formación y movilidad en
investigación FMRX-CT96-0004) y por el Ministerio francés de Investigación (Programme
fondamentale en Microbiologie et Maladies infectieuses et parasitaires).