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Tema 2:
Técnicas espectroscópicas

ESPECTROSCOPIA RAMAN
Sir C.V. Raman
● ¿Qué es la Espectroscopia Raman? 1928

● Fundamentos
● Instrumentos
● Espectroscopia Raman de Resonancia
● Espectroscopia Raman aumentada por
Superficie (SERS)
● Aplicaciones en biotecnología
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Radiación electromagnética
REPASO
Componente eléctrica

Regiones del espectro electromagnético

1
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REPASO

“Cuando la luz interacciona con una molécula

pueden producirse fenómenos de…

Estado
electrónico
excitado (S1)
Energía

Fluorescencia
Absorbancia

v=3
Estado
v=2
electrónico
v=1 fundamental
IR

v=0 (S0)

REPASO

Movimientos moleculares que alteran la distancia entre átomos

Tensiones o estiramientos y deformaciones de los enlaces

Modos normales de vibración

3n-6

3n-5

2
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modos activos en IR REPASO

Δμ ≠ 0
Regiones características de las frecuencias
para transiciones vibracionales en IR

I0(ν) I(ν)
Muestra

Espectroscopia IR => transición entre estados vibracionales

absorción => información estructural

ESPECTROSCOPIA RAMAN
dispersión inelástica: Raman ν0 ≠ ν
ν0 > ν (Stokes, S) ν0 < ν (anti-Stokes, A)

hν0 dispersión elástica: Rayleigh (R); ν0 = ν

Estado
electrónico
excitado
Energía

Fluorescencia
Absorbancia

Estado virtual

v=3
Estado
v=2
electrónico
v=1 fundamental
IR

v=0
S R A
6

3
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ν0 ESPECTROSCOPIA RAMAN
Muestra
Láser

ν=ν0 ± νm 10-6 a 10-10 del total de fotones

10-3 del total Dispersión Raman
de fotones ν0 = ν
Dispersión Rayleigh

ESPECTROSCOPIA RAMAN

El espectro Raman

CHCl3

Anti-Stokes Stokes

Corrimiento
Raman (cm-1)

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ESPECTROSCOPIA RAMAN

Fundamentos

Polarización de una molécula por acción de un campo eléctrico incidente

Fundamentos ESPECTROSCOPIA RAMAN

Polarización de una molécula diatómica

en presencia de un campo eléctrico

μ= αE

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5
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ESPECTROSCOPIA RAMAN

Magnitud de la dispersión Raman

IRaman: Intensidad
νL: frecuencia del láser
νm: frecuencia de la vibración
I0: intensidad del láser
N: número de moléculas
Modos activos Raman
α: polarizabilidad
Δα ≠ 0
Q: amplitud de la vibración

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ESPECTROSCOPIA RAMAN

Concepto de la sección eficaz

12

6
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ESPECTROSCOPIA RAMAN
2231 cm-1 de N2

633 nm

2B2MP: 2-bromo-2-metilpropano

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ESPECTROSCOPIA RAMAN

Estructura molecular y espectro vibracional

Moléculas con centro de simetría: la regla de exclusión mutua establece

que una vibración no puede ser activa en ambos espectros (IR y Raman)

Vibraciones totalmente simétricas siempre son activas en Raman

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7
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Ejemplos de frecuencias Raman e IR

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ESPECTROSCOPIA RAMAN

Comparación de magnitudes entre

dispersión Raman y absorción IR

Modos activos en IR
Δμ ≠ 0

Modos activos Raman

Δα ≠ 0

16

8
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ESPECTROSCOPIA RAMAN

Muestras

• Se pueden analizar sólidos, líquidos, transparentes y

sólidos translúcidos, polvo, pellets, gases.
• Raman normal necesita concentraciones mM.

Solventes

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Raman vs IR
Dispersión Raman
Absorsión FTIR

! Líneas estrechas Lineas

estrechas
! Compatible con agua Buena huella
digital
! Uso de fibras, muestreo remoto Biblioteca de
espectros
! No invasivo generalmente Vibraciones
fundamentales fundamentales
! Modos a bajas frecuencias
observable
! Posibilidad de incremento
por resonancia y superficie

18 " Baja sensibilidad Muestreo difícil

" Interferencias Agua
absorbe fuertemente

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ESPECTROSCOPIA RAMAN

Relación de despolarización Raman

Útil para determinar estructuras moleculares
Correlacionar líneas Raman con modos vibracionales

Vibraciones no simétricas: p aprox. 3/4

Vibraciones simétricas, p va de 0 a <¾.

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ESPECTROSCOPIA RAMAN

Selección de la longitud de onda de excitación

Para tener en cuenta
- Baja intensidad de la señal Raman
- Interferencia de la fluorescencia

Fuentes de excitación 514,5 nm

monocromáticas e
intensas:
Láseres

785 nm

20

10
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ESPECTROSCOPIA RAMAN

Selección de la longitud de onda de excitación

21

ESPECTROSCOPIA RAMAN

Raman de Resonancia (RR)

Se observan incrementos
en la señal Raman de las
vibraciones asociadas al
cromóforo de aprox. 103 a
105

útil para moléculas

complejas, ej.
biomoléculas

22

11
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ESPECTROSCOPIA RAMAN

Raman de Resonancia (RR)

Selección de la longitud de onda de excitación

23

Raman de Resonancia (RR) ESPECTROSCOPIA RAMAN

24

12
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ESPECTROSCOPIA RAMAN

SERS (Surface enhanced Raman spectroscopy)

Técnica analítica altamente sensible y selectiva para detectar

moléculas adsorbidas sobre (o muy cercanas) a
nanoestructuras metálicas (ej. Ag, Au, Cu, Pt).

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ESPECTROSCOPIA RAMAN

SERS (Surface enhanced Raman spectroscopy)

10 pM
Incremento
señal
108

1 mM

J. Fraire et al, J. Phys. Chem. C. 119 (2015) 8876 - 88

26

13
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ESPECTROSCOPIA RAMAN

Instrumentación Componentes básicos

1- Fuente de excitación: láser
2- Muestra y sistema de colección de luz
3- Selector de longitudes de onda
4- Detector

90º

180º

27

ESPECTROSCOPIA RAMAN

Instrumentación

Dispersivo

28

14
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ESPECTROSCOPIA RAMAN

Instrumentación

Transformada de Fourier

Láser Nd:YAG 1064 nm

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ESPECTROSCOPIA RAMAN

Dispers
ivo
Dispersivos vs FT-Raman

FT-
Raman
Dispersivo/CCD FT-
Raman

Ventajas
Sensibilidad Precisión
en

frecuencias
Alta S/N
λ = 200-800 nm Siempre ≥
1064 nm
Bajas potencia de láser Evita
fluorescencia
30
Desventajas
Fluorescencia Alta potencia de
láser
Resolución variable Resolución constante 15
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ESPECTROSCOPIA RAMAN

Aplicaciones
• Identificación de compuestos orgánicos.
• Determinación de grupos funcionales.
• Identificación de compuestos inorgánicos en soluciones acuosas o
sólidos.
• Determinación de la composición molecular de superficies
• Determinación cuantitativa de compuestos en mezclas.
• Determinación de estructuras en estado fundamental junto con IR
• Información de estructuras en estados excitados.
• Detección de impurezas o aditivos.
• Identificación de polímeros, plásticos y resinas.
• Análisis no-destructivo de sistemas bioquímicos in vivo y in vitro.
• Estudios de superficies empleando SERS.

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ESPECTROSCOPIA RAMAN

Aplicaciones en Biotecnología
• Estudio de la conformación estructural de proteínas, ácidos
nucleicos y membranas.

Estructura peptídica Combinación

Tensión de C=O
de modos*

*
32

16
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ESPECTROSCOPIA RAMAN

Aplicaciones
Espectros de RR en la región del anillo
de aminoácidos Tirosina y Triptófano.

Tirosina

Triptófano

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ESPECTROSCOPIA RAMAN
Aplicaciones

34

17
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ESPECTROSCOPIA RAMAN

Aplicaciones en Biotecnología
• Identificación de microorganismos

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ESPECTROSCOPIA RAMAN

Aplicaciones en Biotecnología
• Monitorear bioprocesos complejos. Ej. Fermentación
de glucosa a etanol por levaduras.

Adrian D. Shaw et al, App. Spectroscopy. 53 (1999) 1419-28.

36

18
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ESPECTROSCOPIA RAMAN

Aplicaciones en Biotecnología
• Cuantificación de modificaciones post-traslacional.
Ej. Acetilación, metilación.

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ESPECTROSCOPIA RAMAN

Aplicaciones en Biotecnología
Estudio de carotenos en plantas

RR a 488 nm

C=C C-C

38

19
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BIBLIOGRAFÍA

• Principios de análisis instrumental, 5ta ed. Skoog, Holler, Nieman, McGraw

Hill, 2001
• Introduction to Raman Spectroscopy, ThermoScientific
-
• Introduction to Raman Spectroscopy, 2da ed. J. R. Ferraro, K. Nakamoto, C. W.
Brown, Elsevier 2003
• Raman Spectroscopy for Chemical Analysis, R. Mc Creery, Wiley, 2000
• Infrared and Raman Spectroscopy 2da ed. P. Larkin, Elsevier, 2018
• Dean´s Analytical Handbook, 2da ed. P. Patnaik, McGraw Hill
• Encyclopedia of spectroscopy & spectrometry, Elsevier, 2000.
• Handbook of Instrumental techniques for analytical chemistry, F. Settle Ed.
Prentice Hall, 1997.
• Principles of Surface-Enhanced Raman Spectroscopy, E. Le Ru, P. Etchegoyn,
Elsevier, 2009
• https://www.europeanpharmaceuticalreview.com/article/1015/raman-
spectroscopic-techniques-for-biotechnology-and-bioprocessing/

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