AISLAMIENTO DE ACIDOS

NUCLEICOS (2da parte)

Asignatura: Biotecnología-Año 2020

Dra. Mariela Monti

Departamento Química Biológica Ranwel Caputto
CIQUIBIC-CONICET
Facultad de Ciencias Químicas, UNC
AMPLIFICACION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

PCR acoplada a transcripción reversa

Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR)

Tipos de ARN (11 especies diferentes)

Electroforesis en geles de agarosa de material obtenido por

extracción de ARN total (especies mayoritarias: ARNr)
 AMPLIFICACION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

PCR acoplada a transcripción reversa

Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR)

ADN polimerasa
dependiente de ARN

Genera la primera
cadena del ADNc
ADN polimerasa
dependiente de ADN

Genera la segunda
cadena del ADNc (primer
ciclo del PCR)
AMPLIFICACION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

PCR acoplada a transcripción reversa

Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR)
Transcriptasas Reversas (RT)
participan en el ciclo de vida de los retrovirus
la mayoría derivan del virus del mieloblastosis aviar (AMV) o del virus de la leucemia murina (M-MLV)
Mientras mayor T de reacción, menos estructuras secundarias
en el ARN pero se puede degradar el ARN aislado
Se pueden adicionar sustancias que disminuyen la formación
de estructuras secundarias como espermidina

RT con actividad ARNasa reducida (naturalmente o por

mutación)

Enzimas que no sufren de la inhibición por estructuras

secundarias y tienen una baja actividad ARNasa sirven para
sintetizar ADNc mas largos
 AMPLIFICACION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

PCR acoplada a transcripción reversa

Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR)
Tipos de cebadores utilizados en la reacción de
transcripción reversa

1 Oligo dT

Anchor ensures that the oligo(dT) primer binds at the 5′

end of the poly(A) tail of mRNA and not to other poly(A)
sites

Full length cDNA from poly(A)-tailed mRNA

Good to use if little starting material is available, difficult

secondary structure may lead to incomplete cDNA
generation

Pregunta 6: si utilizo este tipo de cebadores, es posible obtener un ADNc de un ARN ribosomal?
Y es posible obtener un ADNc de un ARN mensajero purificado de bacterias?
Qué largo poseen los ADNc gnerados por este método?
 AMPLIFICACION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

PCR acoplada a transcripción reversa

Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR)
Tipos de cebadores utilizados en la reacción de
transcripción reversa

2 Cebadores con secuencia al azar

Six to nine bases long, they anneal at multiple points

along RNAs

Truncated cDNA from all RNA (tRNA, rRNA, and mRNA),

can dilute mRNA signal ARN
5’ 3’
Good to use for transcripts with significant secondary
structures, or if little starting material is available

Pregunta 7: porqué este método es mas efectivo para obtener ADNc de muestras que contienen
poco material (ARN) de partida?
 AMPLIFICACION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

PCR acoplada a transcripción reversa

Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR)
Tipos de cebadores utilizados en la reacción de
transcripción reversa

3 Cebador específico

Target a specific RNA sequence

Synthesis is limited to one gene of interest

Increased sensitivity

Pregunta 8: si se quiere amplificar 10 ARNm diferentes de una muestra de ARN total de humanos,
cuántos oligonucleótidos debe adquirir si utiliza para obtener su ADNc este método? Y si utiliza el
método del oligodT?
AMPLIFICACION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

PCR acoplada a transcripción reversa

Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR)

Specific primers Oligos(dT) or random primers Specific primers

AMPLIFICACION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
PCR acoplada a transcripción reversa
Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR)
• Contamination prevention—the closed-tube system
prevents introduction of contaminants between the
reverse transcription and PCR stages
• Convenience—the number of pipetting steps is
reduced and hands-on time is minimized
• High-throughput sample screening—for the
reasons mentioned above
• cDNA is not available for other PCR
reactions—one-step reactions use all the cDNA from
the reverse transcription step, so if the reaction fails, the
sample is lost
• Sensitivity—one-step reactions may be more
sensitive than two-step reactions because all the
first-strand cDNA created is available for real-time
PCR amplification
• Increased risk of primer-dimer formation—forward
and reverse gene-specific primers, present from the
start in one-step reactions, have a greater tendency
to dimerize under the 42–50°C reverse transcription
conditions.
• Contamination risk—increased risk of contamination
due to the use of separate tubes for each step
• Less convenience—two-step reactions
require more handling and are less amenable to
high-throughput applications
• cDNA may be archived and used for additional
real-time PCR reactions—two-step qRT-PCR
produces enough cDNA for multiple PCR
reactions, making it optimal for rare or limited samples
• Sensitivity—two-step reactions may be more
sensitive than one-step reactions because the
reverse transcription and real-time PCR reactions are
performed in their individually optimized buffers
• Multiple targets—depending on the reverse
transcription primers used, multiple targets can be
interrogated from a single RNA sample
• Reverse transcriptases and buffers can inhibit
real-time PCR— typically, only 10% of the cDNA
synthesis reaction is used in PCR, because the reverse
transcriptase and associated buffer components may inhibit
the DNA polymerase if not diluted properly.
AMPLIFICACION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

PCR acoplada a transcripción reversa

Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR)

Diagnóstico y seguimiento de leucemia mieloide crónica y leucemia linfoblástica

aguda BCR-ABL positiva
bcr (breakpoint cluster
region) o gen BCR

El gen ABL codifica una proteína con actividad

tirosinquinasa, que juega un rol crítico en el
control y proliferación celular

Las proteínas generadas del gen de fusión BCR-ABL tienen actividad tirosinaquinasa
aumentada, lo que favorece la proliferación neoplásica de las células hematopoyéticas
AMPLIFICACION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

PCR acoplada a transcripción reversa

Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR)

Diagnóstico y seguimiento de leucemia mieloide crónica y leucemia linfoblástica

aguda BCR-ABL positiva

Detecta los transcriptos fusión BCR-ABL

AMPLIFICACION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

PCR acoplada a transcripción reversa

Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR)

Diagnóstico y seguimiento de leucemia mieloide crónica y leucemia linfoblástica

aguda BCR-ABL positiva

Prueba de diagnóstico basada en RT-

qPCR multiplex para la cuantificación
de los tránscritos BCR-ABL y ABL en
ARN total de sangre de pacientes con
Leucemia Mieloide Crónica positivos
diagnosticada t(9;22) expresando
tránscritos de fusión de e13a2 o e14a2
AMPLIFICACION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

PCR acoplada a transcripción reversa

Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR)

Diagnóstico y seguimiento de leucemia mieloide crónica y leucemia linfoblástica

aguda BCR-ABL positiva

Amplificación cuantitativa y multiplex (sondas Taqman con diferentes colores) a partir de

ADNc obtenido por transcripción reversa de ARN total
Cebadores para los transcriptos fusión BCR-ABL

Cebadores para el transcripto ABL normal y fusión BCR-ABL

(control interno)

Cebadores para un transcripto sintético control

AMPLIFICACION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

PCR acoplada a transcripción reversa

Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR)

Diagnóstico y seguimiento de leucemia mieloide crónica y leucemia linfoblástica

aguda BCR-ABL positiva (Medicina)

Amplificación cuantitativa y multiplex (sondas Taqman con diferentes colores) a partir de

ADNc obtenido por transcripción reversa de ARN total

Pregunta 9: cuantas curvas de calibración sugiere que

deberían relizarse en este ensayo?
Porqué no se utiliza el monitoreo con SYBR green para
realizar este PCR multiplex?
AMPLIFICACION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

PCR digital
Digital-PCR (dPCR)

dPCR enables the absolute quantification of target nucleic acids present in a sample

The PCR mix is first

partitioned into many
independent PCR sub-
reactions such that each
partition contains either
a few or no target
sequences. After PCR,
the fraction of
amplification-positive
partitions is used to
quantify the
concentration of the
target sequence with a
statistically defined
accuracy using Poisson’s
statistics.
AMPLIFICACION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

One PCR
reaction
(20 µl)

Diseño de cebadores y sistema de detección (sondas TaqMan o SYBR) se realiza como en qPCR
AMPLIFICACION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

PCR digital
Digital-PCR (dPCR)

umbral

muestra

Calcular fracción de gotas positivas (p)

No de total de gotas con una fluorescencia
Curva teórica de fracción de gotas
por encima del umbral/No total de gotas
positivas (p) vs No de copias del ácido
nucleico por gota (Distribución de
Poisson)
CUESTIONARIO ORIENTATIVO:

1. Qué significa amplificar un ácido nucleico?

2. Indique cómo se realiza la reacción de PCR y sus etapas. En que proceso natural se basa el PCR? Porqué
permite una amplificación exponencial? Cómo se especifica que fragmento de ADN o ARN se amplifica?

3. Cómo se visualizan los productos de PCR? Porque esta técnica se llama de punto final? Cómo determina la
identidad del amplicon o producto de amplificación?

4. Indique los componentes que lleva la mezcla de reacción de PCR. Cuáles son las diferencias entre las ADN
polimerasas utilizadas para catalizar la reacción de PCR? Qué características deben tener los oligonucléotidos
utilizados como cebadores de la reacción?

5. Cuál es la base de la qPCR? Qué característica de esta reacción permite cuantificar la cantidad de moléculas
templado inicial? Cuáles son las principales diferencias entre la qPCR y la PCR convencional?

6. Indique los tipos de cuantificación que se puede realizar con la técnica de qPCR y cómo se llevan a cabo.

7. Qué tipos de sistemas de monitoreo se usan en la qPCR? Cuáles son sus diferencias?

8. Cuál es la base de la RT-PCR? Qué tipo de ácido nucleicos permite amplificar? Puede realizarse de punto final
(RT-PCR) y también cuantitativa (RT-qPCR)? Cómo se visualizan los productos de RT-PCR y RT-qPCR?

9. Nombre las enzimas utilizadas en la reacción de transcripción reversa y cuáles son las principales
características de las enzimas comerciales.

10. Indique los tipos de cebadores utilizados en la reacción de transcripción reversa y sus diferencias.
PROBLEMA:

Indique que material de partida , técnica de PCR y detección del amplicón utilizaría para :

1-Determinar la presencia de un gen en el ADN mitocondrial de una planta

2-Determinar el número de copia de un transcripto en una bacteria

3-Determinar el número de copia de un fragmento de una región intergénica en un cromosoma de

levadura

4-Determinar la presencia de un ARN ribosomal en un hongo

5-Determinar la presencia de un gen de resistencia a antibióticos en una bacteria patógena

a. ADN genómico a. PCR convecional a. Electroforesis en geles de

b. ADN plasmídico b. qPCR agarosa o poliacrilamida
c. ARN total c. RT-PCR b. Medición de fluorescencia
d. ADN mitocondrial d. RT-qPCR