Genética

Tecnología del ADN recombinante II

Manipulación y aislamiento de Genes

Dr. Javier Valdez Taubas

Bibliografía: “An Introduction to Genetic Analysis” Griffiths,

Wessler, Carrol , et al ;11th edition Chapter 10.
 Manipulación y aislamiento de Genes

-Cómo se aísla un Gen de secuencia conocida?

Homología de secuencia
Si se conoce la proteína….
 Aislamiento de genes por complementación functional

Mutantes resistentes a CANAVANINA

Levadura de cerveza ( haploide!)
(análogo tóxico de arginina)

UV

ADN genómico de una cepa wt

Recuperar sensibles a
CANAVANINA

Extracción de ADN plasmídico

Genoteca
 Genética Directa
Se parte de un mutante que afecta una propiedad de interés , pej el color

-Lo primero es conocer si esta característica depende de un solo gen, Como hago?

Aspergillus nidulans,
mutantes de color

- Cómo aíslo el gen?

Mapeo Secuenciamiento Complementación con una genoteca

 Mapeo de mutantes

Donde está el gen?

 Genes en una misma vía

Mutagénesis

Medio sin lisina

Selección de mutantes
Per O. Ljungdahl, and Bertrand Daignan-Fornier Genetics
2012;190:885-929
 Y ahora?
Las mutantes que obtuvimos , son todas la misma o son diferentes genes que
producen el mismo fenotipo?

mat a, x Mat , z grupos de complementación

Mating mat a mat 

Cruza

x X, z Z
Diploide

En haploides es mas fácil!!

salvaje
YA tenemos los grupos de complementación , y ahora como identificamos el gen?

Extracción de ADN plasmídico

 Ejemplos de “rastreos” de mutantes para estudiar procesos biológicos

a) Mutantes del desarrollo en Drosophila

b) Mutantes de secreción y tráfico de proteínas en levadura

c) Mutantes de comportamiento en C.elegans
 Genética reversa
La genética reversa comienza por una molécula , generalmente una secuencia de ADN, e
intenta eliminar su función para luego inferir su rol en la biología de un organismo

Mutagénesis dirigida
Creación de fenocopias,
. Mutagénesis al azar
RNA de interferencia
 Mejor un marcador que
No esté presente en el genoma!

Todos los ORFs de levadura han sido delecionados!

80% son no escenciales
 Estudio de las mutantes de deleción

-Condiciones de cultivo (pej uso de fuentes de carbono, N, alta Sal,

Stress etc)
-Resistencia a drogas o análogos tóxicos
Colección de mutantes de levadura en medio selectivo

High-throughput analysis
En células de mamífero y plantas …
CRISPR/CAS9