NODO: UNION HIDALGO

CARRERA:
ING. ENERGIAS RENOVABLES

TITULO DEL TRABAJO:

Crecimiento y Preparación de Microorganismos (Medida de número de individuos).
 Métodos directos
 Métodos indirectos

3 SEMESTRE GRUPO “A”

INTEGRANTES:
Aurora López Martínez
Jonathan Luciano Castillejos Pedroche
Siremar López Ordaz
Karla Jhoana Orozco López
MATERIA:
Microbiología
ASESOR

Jehu Juárez Reyes

UNIDAD 4

OAXACA, 03 NOVIEMBRE 2019

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 3.4.2.2 MEDIDA DE NUMERO DE INDIVIDUOS
Recuentos microbianos

Recuento de microorganismos totales en cámaras

Fundamento del método: una muestra de cultivo bacteriano diluido se coloca en una
cámara de volumen pequeño y conocido, como por ejemplo la de Petroff Hause que
encierra 2,5x10-7 mL y se cuentan al microscopio las células contenidas en
numerosos cuadrados de la cámara (figura 4) (Prescott et al., 1999).

Se calcula el promedio de células contenidas en dicho volumen y se expresa el No

células/mL de la muestra. La desventaja es que no se pueden distinguir células
viables de no viables y el error experimental es alto. Pero se pueden efectuar
numerosas determinaciones en poco tiempo, con solo lavar la cámara y volverla a
cargar.

4.2.2.1 MÉTODOS DIRECTOS: RECUENTO TOTAL

•Recuento microscópico directo (cámaras de recuento) conteo electrónico (cada
célula origina una corriente eléctrica).

Cámara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial con

una graduación en superficie y unas medidas muy concretas:

 excavación con 0.02 mm de profundidad;

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  área de 1 mm2, dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes;
 cada cuadrado grande está subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados
pequeños.

O sea, la muestra se distribuye en 16X25 = 400 celdillas (cuadros pequeños).

La muestra, una vez dispensada entre la porta y el cubre, se deja reposar sobre la
plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el número de células
en varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes).
Se anota el número n de células observadas en esas 16 celdillas. Entonces, la
concentración celular es fácil de establecer:

n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml.

VENTAJAS DESVENTAJAS
 Es un método muy rápido  Sólo sirve para suspensiones
relativamente concentradas
(>10x106 céls./ml). Por debajo de
este valor el número de células
vistas en el campo del
microscopio es muy pequeño y
poco significativo
estadísticamente.
 En bacterias móviles, hay que
inmovilizarlas previamente, con
una mezcla de alcohol y agua.

Recuento en preparaciones teñidas: Se dispone de una porta con una excavación

circular (de área At) con un volumen conocido (v). Sobre esta excavación se
extiende la muestra con asa de siembra o con micropipeta, y se fija y tiñe por algún
colorante. Se observa con un microscopio dotado de un juego de ocular y objetivo
que delimitan un área de campo (Ac). Si en dicho campo se cuentan n bacterias, la
concentración de bacterias por mililitro será:

n·At/Ac· 1/v

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Recuento proporcional de Wright: Se mezcla la suspensión bacteriana problema
con una cantidad conocida de bolitas de látex o de hematíes. La concentración
bacteriana se deduce de la proporción de bacterias y partículas observadas en el
mismo campo microscópico. Este método se emplea más frecuentemente en
Virología.

Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter): Se hace pasar una

suspensión bacteriana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente
eléctrica. Cada vez que por un orificio (30 mm diámetro) pasa una partícula (p. ej.,
bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro
electrónico, que detecta el número y el tamaño de las partículas que van pasando.
(El tamaño detectado es función de la intensidad del pulso de voltaje al paso de la
partícula). Recientemente se ha introducido la citometría de flujo activada por
fluorescencia (FACS). Es una sofisticada modificación en la que las partículas a
contar se marcan previamente con un anticuerpo monoclonal u otro ligando
específico hacia alguna molécula de superficie, unidos a su vez a un fluorocromo,
una molécula que emite fluorescencia al incidir sobre ella un haz de luz láser.

4.2.2.2 MÉTODOS INDIRECTOS: RECUENTOS DE VIABLES

•Recuentos en placa (cada célula origina una colonia).

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El fundamento del método es permitir el crecimiento de una sola célula en la
superficie de un medio de cultivo sólido apropiado. Se postula que cada colonia
proviene de una sola célula y teniendo en cuenta el volumen de inóculo empleado y
la suspensión-dilución sembrada (figura se calcula el Nº de unidades formadoras de
colonias (ufc)/mL) o por gramo en caso de muestras sólidas (suelo, alimentos, etc.).

VENTAJAS DESVENTAJAS
 Es el único procedimiento  Es más lento, no existe un medio
correcto, ya que cada unidad de cultivo para desarrollar a
formadora de colonia (célula, todos los microorganismos
trozo de micelio, espora) da presentes en una muestra.
origen a una colonia. Resulta muy útil en la evaluación
de grupos fisiológicos:
microorganismos que pueden no
estar relacionados
taxonómicamente, pero que
realizan una función metabólica
común. Por ejemplo: fijadores
aerobios de nitrógeno,
celulolíticos anaerobios,
nitrificantes, etc.
Son métodos que miden el número de bacterias viables (que no equivale al de
totales).
Método del número más probable: Su fundamento estriba en la distribución de
Poisson: una distribución aleatoria de partículas en una serie de muestras iguales,
en función del número medio de partículas presentes en una suspensión.
PX = mX · e-m/x!
donde x = número real de partículas en cada muestra y m = concentración (n o
partículas/volumen)
La técnica consiste en sembrar alícuotas de la suspensión original problema sobre
un medio líquido o sólido adecuado; tras el tiempo de incubación adecuado se anota
la proporción obtenida de muestras donde no se haya dado crecimiento, P 0 (x = 0).
Entonces, según la distribución de Poisson:

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 P0= e--m
y por lo tanto es fácil calcular el valor de m:
m = -lnP0

Determinación de la proporción células viables/células totales: Si se está

interesado en conocer esa proporción se recurre a una técnica de microcultivos en
cubreobjetos: hay que seguir periódicamente la evolución del crecimiento de
células individuales y determinar la proporción de aquellas células no viables
(visibles al microscopio, pero incapaces de crecer).

Recuento sobre filtros de nitrocelulosa: Se usa para suspensiones diluidas de

bacterias. Se hace pasar un gran volumen de suspensión a través de una
membrana de nitrocelulosa estéril, que retiene las bacterias. Posteriormente, el filtro
se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo sólido. Las colonias se forman
sobre el filtro y se cuentan, deduciéndose la concentración original en función del
volumen de suspensión que se hizo pasar por el filtro.

Procedimiento: consiste en contar el número de colonias formadas en medio de

cultivo sólido adecuado, luego de sembrar volúmenes conocidos de varias
suspensiones-diluciones de la muestra (suelo, aguas, alimentos). La siembra con
varias repeticiones permite disminuir el error experimental, el cual es alto en esta
técnica. El método selecciona las cajas de Petri con entre 30 y 300 colonias, ya que
más de 300 colonias por caja implica que muchas pueden originarse por más de
una célula dada su alta densidad y las de menos de 30 colonias también presentan
gran error.

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Recuento en aguas: (Prescott et al., 1999) muestra el procedimiento seguido para
el recuento de viables, por ejemplo, coliformes en aguas, las que deben ser filtradas
(por ejemplo 100 mL de agua) a los efectos de concentrar la carga microbiana, por
filtros bacteriológicos (0,45 micras), los que luego se depositan en la superficie de
medios adecuados. Muchas veces los filtros están cuadriculados, lo que facilita el
recuento de las colonias formadas.

Expresión de los resultados

Nº de ufc/mL= (promedio de colonias en 3 o más repeticiones) X 1/dilución X
1/inóculo
Ejemplo:
Nº de colonias en la suspensión dilución 10-5 = 65, 68, 77; inóculo/caja = 100µL
Nº ufc/mL = 70 X 105 X 10 = 7,0 X 107
En muchos casos se expresa en logaritmo en base 10:
log10 Nº ufc/mL = 7, 84

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BIBLIOGRAFIA

 MICROBIOLOGÍA BÁSICA Y AMBIENTAL Y AGRÍCOLA- LILIAN FRIOMI

2006 (PÁGINA 68, 69)
 Microbiología General, Hans G. Schlegel, Christiane Zaborosch, EDICIONES
OMEGA, S.A. Plató, 26 - 08006 Barcelona.

 NEIDHART, F.C., J.L. INGRAHAM, M. SCHAECHTER (1990): Physiology of

the bacterial cell: a molecular approach. Sinauer Associates, Sunderland,
Massachusetts. Consultar el capítulo 7.
 MEYER, H.-P., O. KÄPPELI, A. FIECHTER (1985): Growth control in
microbial cultures. Ann. Rev. Microbiol. 39: 299-319.

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