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SBQ 27
SBQ 27
TEMA
AMBATO – ECUADOR
2012
i
APROBACIÓN DEL TUTOR DE TESIS
TUTOR
ii
AUTORÍA DE LA INVESTIGACIÓN
AUTORA
iii
APROBACIÓN DEL TRIBUNAL DE GRADO
iv
DEDICATORIA
v
AGRADECIMIENTO
vi
ÍNDICE GENERAL
Contenido Pág.
PÁGINAS PRELIMINARES
Portada i
Dedicatoria v
Agradecimiento vi
Índice de tablas xi
INTRODUCCIÓN 1
vii
CAPITULO I
EL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
CAPITULO II
MARCO TEÓRICO
viii
CAPITULO III
METODOLOGÍA
3.1 Enfoque 35
3.2 Modalidad básica de la investigación 36
3.3 Nivel o tipo de investigación 36
3.4 Población y muestra 37
3.4.1 Población 37
3.4.2 Muestra 37
3.5 Operacionalización de variables 38
3.6 Recolección de información 38
3.6.1 Obtención del jugo de piña 38
3.6.2 Extracción de bromelina 39
3.6.3 Concentración de la bromelina 39
3.6.4 Determinación de la actividad enzimática del concentrado 40
proteínico de bromelina
3.6.4.1 Determinación de la constante K del viscosímetro de 41
Cannon – Fenske
3.6.4.2 Determinación de la densidad de los sustratos proteínicos 42
de hidrólisis
3.6.4.3 Medición de la viscosidad de la leche y jugo de carne 43
al adicionar el concentrado proteínico de bromelina
3.6.4.3.1 Preparación de las muestras 43
3.6.4.3.2 Medición de la viscosidad 43
3.6.5 Diseño experimental 44
2
3.6.5.1 Diseño factorial 2 44
3.6.5.2 Diseño de bloques completos 46
3.7 Procesamiento y análisis 47
ix
CAPITULO IV
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1 Conclusiones 61
5.2 Recomendaciones 63
CAPITULO VI
PROPUESTA
x
6.4 Objetivos 68
6.4.1 General 68
6.4.2 Específicos 68
6.5 Análisis de factibilidad 69
6.6 Fundamentación 70
6.7 Metodología 72
6.8 Administración 74
6.9 Previsión de la evaluación 75
MATERIALES DE REFERENCIA
Bibliografía 77
ÍNDICE DE TABLAS
xi
ÍNDICE DE FIGURAS
ÍNDICE DE ECUACIONES
Ecuación 5. Viscosidad 44
ÍNDICE DE ANEXOS
xii
Tabla A2. Constante K de los viscosímetros Cannon - Fenske para la
medida de viscosidad.
Tabla A7. Viscosidad del jugo de carne con concentrado proteínico que
contiene bromelina en etanol.
Tabla A8. Viscosidad del jugo de carne con concentrado proteínico que
contiene bromelina en NaCl.
ANEXO B. GRÁFICAS
xiii
Gráfica B2. Determinación de la actividad enzimática mediante pruebas de
cambios de viscosidad de la leche en función del tiempo por efecto de
bromelina extraída con etanol, con la correspondiente ecuación lineal.
xiv
Gráfica B10. Determinación de la actividad enzimática mediante pruebas de
cambios de viscosidad del jugo de carne en función del tiempo por efecto de
bromelina extraída con NaCl, con la correspondiente ecuación lineal.
Tabla C3. Prueba de comparación múltiple Tukey al 95% para los diferentes
tratamientos.
xv
ANEXO D. FOTOGRAFÍAS
xvi
Fotografía D18. Medición de la viscosidad de la leche
xvii
RESUMEN EJECUTIVO
xviii
al adicionar 0,1g de concentrado de bromelina disuelto en 100ml de vinagre
natural. Se realizó entonces una adaptación del método de coagulación de
la leche al jugo de carne, en donde también se observó que su viscosidad
va aumentando conforme aumenta el tiempo de acción del concentrado de
bromelina, demostrando que se da la hidrólisis de enlaces peptídicos de sus
proteínas como son caseína y actina respectivamente.
xix
INTRODUCCIÓN
La piña contiene diversas enzimas entre las que se destacan las proteasas,
sobresaliendo la bromelina que es una glicoproteína básica del grupo de las
cisteín proteasas. Es una proteína constituida por aminoácidos que se
encuentran enrollados en dos partes separadas por un puente que tiene un
lugar activo con un grupo tiol (SH) libre, la misma que ha reportado varios
usos.
1
CAPÍTULO I
EL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
2
1.2.1 Contextualización
1.2.1.1 Macro
(RAJESHA et al., 2006), citado por (FÉLIX, 2008), menciona que la mayor
parte de la producción mundial de enzimas está destinada a la obtención de
proteasas, las cuales son enzimas proteolíticas que cumplen una
importante función en el desarrollo de las reacciones inherentes al
metabolismo de la planta y existen varios estudios desarrollados que
demuestran que las proteasas, desempeñan un rol muy importante en la
patofisiología de muchas enfermedades. Se ha despertado el interés en su
estudio, tanto en lo concerniente a su actividad enzimática, su efecto sobre
sustratos y en lo relacionado a sus inhibidores.
3
Novo en Brasil (IZQUIERDO Y DE LA RIVA, 2000) citado por (ELIÉCER,
2003).
1.2.1.2 Meso
4
En el país no existen empresas especializadas en la producción de
enzimas, sin embargo, al momento se están realizando investigaciones de
enzimas proteasas de ciertas frutas, como son del babaco, hierba mora e
higuerón, en la Escuela Politécnica Nacional, y de toronche y papaya en la
Escuela Superior Politécnica del Litoral. En ambas instituciones se
observan buenos resultados en los métodos aplicados, y pretenden
continuar con el trabajo para llegar a la industrialización de las enzimas.
1.2.1.3 Micro
5
1.2.2 Análisis crítico
Pocas universidades Falta de interés en el Poca importancia en Preferencia por la Poco conocimiento de
con estudios afines a estudio de enzimas el estudio de cinética importación de las aplicaciones de
enzimas proteasas enzimática enzimas las enzimas en la
industria
6
1.2.3 Prognosis
7
1.2.6 Delimitación del objeto de investigación
Área: Bioquímica
Subárea: Enzimología
1.3 Justificación
8
extracción, que incluye la utilización de una solución salina (NaCl) y un
alcohol (etanol). También es de interés el estudio de cinética enzimática,
parámetros que son necesarios para conocer el estado de las reacciones
químicas, y para implementar posteriores procesos de purificación de
enzimas.
1.4 Objetivos
1.4.1 General
9
1.4.2 Específicos
10
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
11
GAUTAM y otros (2010), mencionan que la bromelina es una proteinasa
principal, aislada de la piña (Ananas comosus). El objetivo del estudio fue
comparar la cantidad y actividad de la bromelina presente en el tallo y la
fruta de la planta. La bromelina fue aislada de los tallos y los frutos de las
plantas de piña madura por extracción con solución de buffer acuosa
amortiguada. La purificación de la enzima se llevó a cabo por centrifugación,
técnica de precipitación de sales, diálisis, cromatografía de intercambio
iónico y la estimación por el método de Lowryûs. La bromelina fue ensayada
por su actividad mediante la hidrólisis de la gelatina, representado mediante
el uso de unidad de digestión de gelatina. La homogeneidad de la bromelina
fue confirmada por el análisis SDS-PAGE (sodio dodecilsulfato-
poliacrilamida por electroforesis en gel). Se encontró que la mejor actividad
es de la bromelina de fruta. Por otra parte, la cromatografía de intercambio
iónico con dietilaminoetil celulosa (DEAE), mantiene la integridad estructural
de la bromelina purificada y por lo tanto el producto exhibe una mejor
actividad proteolítica.
12
farmacológicas y alimenticias. Se diseñó y patentó un procedimiento de
extracción de bromelina en el que se utilizaron protectores del centro activo
de la enzima a un pH cercano al fisiológico de la planta y alejado del óptimo.
El perfeccionamiento de la tecnología demostró que se alcanzan
rendimientos de 20,8 g de producto/kg de tallos y 3,9 g de proteínas/kg de
tallos, con una actividad específica de 1,36 U/mg. El procedimiento de
extracción se puede escalar y tanto en planta piloto como a escala industrial
se logran rendimientos en términos de actividad superiores al 72% de los
obtenidos en el laboratorio. La purificación mediante la combinación de
métodos cromatográficos hizo factible el aislamiento, a partir del preparado
crudo de tallo.
13
GALLARDO y otros (s.f), en su investigación denominada extracción de
bromelina a partir de residuos de piña, concluyen que las mejores
condiciones para la extracción de la bromelina fueron con el solvente etanol,
temperatura de -10 ºC y durante un tiempo de reposo de 7 días. La mayor
cantidad de proteínas se encuentran en la cáscara, sin embargo esta tiene
la menor actividad enzimática y específica. La bromelina extraída de
cáscara de piña tiene un menor costo con respecto a la de las demás partes
del fruto ya que es un residuo agroindustrial. Los resultados obtenidos son
prometedores para que con un mayor grado de purificación sea factible
aplicar esta enzima en tratamientos biomédicos.
14
órganos de plantas de la familia Bromeliaceae. Se colectaron y clasificaron
cinco grupos. Las plantas que se colectaron pertenecen a 3 géneros de la
mencionada familia: 3 grupos son del género Tillandsia, 1 es del género
Guzmania y otro del género Hohenbergia. Los mayores índices de actividad
específica (3,3 U/mg de proteínas) se obtuvieron en los preparados
obtenidos a partir de diferentes órganos de Hohenbergia penduliflora Mez,
de cuyos extractos obtenidos se evaluó la influencia del pH de extracción y
la actividad específica fue superior al realizarla a pH 3 a partir de sus tallos.
En los últimos años existen muchas investigaciones encaminadas a explicar
los mecanismos de activación de las cisteíno proteasas in vivo. Se ha
demostrado claramente que la activación de estas enzimas depende del pH.
Los autores sugieren un predominio de moléculas de enzima activa a pH
ácido y está claro que las variaciones de pH neutro a pH ácido en las
vacuolas provocan cambios en la conformación nativa de la enzima inactiva,
lo que permite el procesamiento y plegamiento de la enzima activa. Las
proteasas presentes en los extractos enzimáticos de H. penduliflora Mez,
pudieran tener usos similares a las obtenidas a partir de A. comosus L.
La investigación positivista asume que está regido por leyes, las cuales
permiten explicar, predecir y controlar los fenómenos. En consecuencia, la
finalidad de las ciencias está dirigida a descubrir esas leyes, a arribar
generalizaciones teóricas que contribuyan al enriquecimiento de un
conocimiento de carácter universal.
16
validez universal, aplicables a cualquier contexto y situación (GONZÁLEZ,
2003).
17
hechos y por inducción se obtendrían afirmaciones aún más generales que
reciben el nombre de teorías.
TÍTULO II
DERECHOS
Capítulo segundo
Sección primera
Agua y alimentación
18
TÍTULO VII
Capítulo primero
Inclusión y equidad
Sección octava
19
3. Asegurar la difusión y el acceso a los conocimientos científicos y
tecnológicos, el usufructo de sus descubrimientos y hallazgos en el marco
de lo establecido en la Constitución y la Ley.
20
c) Aumentar la calidad de conservación o la estabilidad de un alimento o
mejorar sus propiedades organolépticas, a condición de que ello no
altere la naturaleza, sustancia o calidad del alimento de forma que
engañe al consumidor.
Bromelina (1101(iii))
Clases funcionales
21
2.4 Categorías fundamentales
Piña Enzimología
Enzimas Cinética
vegetales enzimática
Reacciones
Proteasas
enzimáticas
Concentrado Actividad
proteínico de enzimática
bromelina
22
con un centro activo, formado por relativamente pocos aminoácidos que son
los responsables directos de la unión con el sustrato y que catalizan la
reacción característica de cada tipo particular de enzima. La estructura
secundaria de una enzima viene determinada por aquellas secciones de la
cadena polipetídica que adoptan estructuras bien definidas, por ejemplo en
hélice α; la terciaria se refiere al enrollamiento de la estructura del polipétido
producido por fuerzas secundarias, como enlaces iónicos, hidrofóbicos y
puentes de hidrógeno, y la estructura cuaternaria corresponde a la forma
de asociación de ciertas enzimas complejas, usualmente intracelulares, que
unen sus cadenas polipeptídicas mediante fuerzas secundarias hasta formar
enzimas con multisubunidades (WISEMAN, 1985).
23
En una reacción catalizada por enzimas (E), los reactivos se denomina
sustratos (S), es decir la sustancia sobre la que actúa la enzima. El sustrato
es modificado químicamente y se convierte en uno o más productos (P).
Como esta reacción es reversible se expresa de la siguiente manera:
24
Fig 2. Evolución energética de una reacción química (ITESCAM, s.f).
Especificidad
25
enunció: "el sustrato se adapta al centro activo o catalítico de una
enzima como una llave a una cerradura". (HIPERTEXTOS DEL ÁREA DE
LA BIOLOGÍA, 2003).
26
Liasas: Catalizan las reacciones de adición o formación de dobles enlaces
tales como
Las proteasas son enzimas que rompen los enlaces peptídicos de las
proteínas. Usan una molécula de agua para hacerlo y por lo tanto se
clasifican como hidrolasas (WISEMAN, 1985).
ELIÉCER (2003), establece que las proteasas son enzimas que hidrolizan
las cadenas polipeptídicas de las proteínas sustrato, se caracterizan por
tener gran variedad de especificidades. De acuerdo con el aminoácido o
metal que posean en su sitio activo se clasifican en cuatro familias: serín
proteasas, asparticoproteasas, cisteín proteasas y metaloproteasas.
Existen diversos ejemplos de enzimas útiles que han sido obtenidas a partir
de plantas por métodos sencillos mediante procesos biotecnológicos, por
ejemplo la proteasa bromelina (piña) (GASESA y HUBBLE, 1941).
27
La piña tiene actividad proteolítica debida a la bromelina que se activa por la
cisteína, tiosulfato y glutatión. Es inhibida o inactivada por iones metálicos
oxidantes y por agentes que reaccionan con los tioles (ácido ascórbico).
28
Tabla 1. Propiedades físicas de la bromelina
29
2.4.2 Marco teórico de la variable dependiente
30
Actividad enzimática
31
modificada su carga eléctrica al aceptar o donar protones, lo que modificará
la estructura de los aminoácidos y por tanto la actividad enzimática.
32
Fig 5. Viscosímetro de Cannon – Fenske (CORREA, 2006).
Donde:
h = Altura
R = Radio
L = Longitud
µ = Viscosidad
33
Esta ecuación es la base para la operación de los viscosímetros de tubo y
capilares. Para un viscosímetro dado, h, R2 y 8L son constantes; en
consecuencia, la expresión de la viscosidad puede ser escrita en la forma
siguiente:
Donde:
2.5 Hipótesis
34
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA
3.1 Enfoque
35
3.2 Modalidad básica de la investigación
Investigación aplicada
Investigación experimental
36
laboratorio. El experimento realizado permitió introducir las variables de
estudio, y manipularlas para controlar su aumento, disminución y así
establecer los mejores parámetros, obteniendo los mejores resultados.
Investigación descriptiva
3.4.1 Población
3.4.2 Muestra
37
Se trabajó con 8 piñas de esta variedad, repartiéndolas para las 2 replicas y
para cada solución extractora.
Lavado: Se lava la fruta con agua potable para eliminar las impurezas
presentes.
38
Obtención: Separar la pulpa de piña de la cáscara.
39
Sacar las muestras de la estufa y enfriarlas en un desecador durante 10
minutos.
(Ec.1)
Donde:
M = Peso de la muestra
(Ec.2)
40
3.6.4.1 Determinación de la constante K del viscosímetro de Cannon –
Fenske
(Ec.3)
Donde:
41
ρ = Densidad del agua a 20°C
(Ec.4)
Donde:
= Densidad relativa
42
= Densidad de referencia (agua a 20°C).
43
Cálculo: Con los datos del tiempo de escurrido de las muestras, se calcula
la viscosidad, utilizando la siguiente fórmula:
(Ec.5)
Donde:
ρ = Densidad de la muestra
t = Tiempo de escurrido
Factores en estudio
44
Nivel bajo (-1) = Leche
Tratamientos = 4
Actividad enzimática
45
Análisis de varianza: Tabla ANOVA
Tratamientos = 6
T1 = Etanol - Leche
T2 = NaCl - Leche
Actividad enzimática
Observaciones Tratamientos
R1 R2
1 T1
2 T2
3 T3
4 T4
5 T5
6 T6
46
Análisis de varianza: Tabla ANOVA
47
CAPÍTULO IV
48
La tabla A2 nos muestra las constantes K de cada viscosímetro de Cannon
Fenske existentes en el laboratorio, las cuales fueron establecidas mediante
la aplicación de la Ec.3, para lo cual se trabajó con datos de viscosidad
(9,9341x10-1 mPa.s) y densidad (998,2 kg/m3) del agua a una temperatura
de 20ºC.
mPa.s
Los valores de actividad enzimática en ( ) de los sustratos leche y jugo
s
de carne, con concentrados proteínicos de bromelina en etanol y NaCl se
presentan en la tabla A10. Estos datos fueron obtenidos al aplicar un
método gráfico de regresión lineal a las viscosidades de los tiempos de toma
muestra de 360s a 720s.
49
El Anexo B corresponde a las gráficas realizadas en función a los
resultados obtenidos.
50
concentrado proteínico que contiene bromelina en NaCl sobre la muestra de
jugo de carne. Gráfica B12 – Actividad enzimática de bromelina comercial
sobre la muestra de jugo de carne.
51
Se determinó que el concentrado de bromelina en etanol presenta un mayor
porcentaje de humedad que el concentrado con NaCl. Los valores obtenidos
son 8,1% y 5,6% respectivamente, lo que indica que en el concentrado con
etanol se ha evaporado una mayor cantidad de agua que en la de NaCl,
motivo por el cual esta última muestra presenta un mayor porcentaje de
materia seca que corresponde a 94,4 en contraparte con la de etanol que
corresponde a 91,9%; estos valores corresponden al residuo que queda una
vez evaporada el agua libre del sistema.
52
kg kg
(1038 3
) es mayor que el de la leche, que corresponde a 1030 3 ,
m m
datos que fueron calculados utilizando la Ec.4. Los valores de viscosidad en
este caso son directamente proporcionales a los de la densidad ya que la
viscosidad del jugo de carne (2,52 mPa.s ) también es mayor que el de la
leche (2,30 mPa.s ). Se puede mencionar entonces que la muestra de jugo de
carne utilizada es más densa y más viscosa que la muestra de leche. Es
importante mencionar que tanto la densidad como la viscosidad son
propiedades físicas que caracterizan a cada sustancia, y que la una es
independiente de la otra.
53
En estas tablas se también se observa que la mayor viscosidad que alcanza
la leche con concentrado proteínico que contiene bromelina en etanol (7,00
mPa.s) es mayor que la que contiene NaCl (5,67 mPa.s), lo que da a
entender que el concentrado con etanol actúa de mejor forma que el NaCl
sobre el sustrato leche. Y esto se comprueba también ya que la viscosidad
inicial con etanol es mayor que la de NaCl, indicando que el concentrado
proteínico con el alcohol se acopla más rápidamente con el sustrato. Se
determina además que los valores de viscosidad son directamente
proporcionales al tiempo de toma de muestra; es decir que la viscosidad
aumenta conforme pasa el tiempo de reacción.
54
casos anteriores, y se observa que el mejor sustrato en el que actúa es el
jugo de carne con una viscosidad máxima de 9,13 mPa.s. Lo que si se
observa en los testigos, es que estos alcanzan valores más altos de
viscosidad, indicando que las enzimas están catalizando de mejor manera
las reacciones.
55
que los dos solventes actúan sobre los sustratos, pero el concentrado
proteínico con etanol presenta mayor actividad enzimática.
4.2.6 Gráficas
56
Se puede demostrar entonces, que con el etanol se da una mayor hidrólisis
de proteínas tanto de la leche como del jugo de carne, esto debido a que su
concentrado presenta buena afinidad con los sustratos. Con la solución
salina también se da la hidrólisis de enlaces peptídicos, pero requiere de
mayor tiempo para concluir con su función catalítica.
Se puede observar las ecuaciones, las mismas que son diferentes para cada
solución extractora, y sustrato sobre el cual actúan, debido a que en cada
minuto, cada concentrado de bromelina ya sea en etanol o NaCl actúan de
diferente manera. Lo que se puede notar es que los valores de la ecuación
polinómica son más altos en relación al mejor tratamiento, y viceversa.
57
donde la pendiente (a) corresponde al valor de actividad enzimática) y el
valor R cuadrado.
58
actúa de mejor manera que en la leche. Cabe mencionar que entre las
soluciones extractoras hay mayor diferencia significativa que entre los
sustratos proteínicos.
59
De los concentrados proteínicos elaborados, se observa que el mejor
tratamiento es el #3, que corresponde a la actividad enzimática del jugo de
carne al actuar el concentrado proteínico de bromelina en etanol. Le sigue el
tratamiento 1, posteriormente el tratamiento 4, y por último el tratamiento 2,
como se observa en la tabla C3.
Se realizó una tabla ANOVA con los datos del diseño experimental 2 2 y
diseño de bloques completos para así poder establecer si se acepta o se
rechaza la hipótesis planteada. Debido a que los valores de Ft son menores
a los de Rv, se rechaza la Ho y se acepta la Ha, indicando que las
soluciones extractoras, los sustratos proteínicos, el testigo 1 y el testigo 2, si
presentan diferencia significativa en la actividad enzimática.
Los valores de Rv son mayores que los de Ft, ubicándose estos en la curva
de Fisher en la zona de rechazo, motivo por el cual se rechaza la Hipótesis
nula que indica que las soluciones extractoras no conducen a la obtención
de un concentrado de bromelina a partir de pulpa piña, medida por la
actividad enzimática, y se acepta la hipótesis alternativa que indica que las
soluciones extractoras si conducen a la obtención de un concentrado de
bromelina a partir de pulpa piña, medida por la actividad enzimática.
60
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1 Conclusiones
61
hidrolizaron los enlaces peptídicos de sus proteínas, principalmente la
caseína. Este método fue adaptado al jugo de carne, y se obtuvieron
buenos resultados ya que también se dio la hidrólisis de sus proteínas
(actina), y esto se noto por la variación de su viscosidad.
62
actividad enzimática del concentrado de bromelina en etanol sobre la
muestra de jugo de carne y la de leche, mientras que valores de
actividad enzimática inferiores presenta el concentrado proteínico de
bromelina en NaCl. Se puede observar entonces que el valor más alto de
actividad enzimática 0,0061mPa.s/s corresponde al concentrado con
etanol en el jugo de carne, y este valor se encuentra muy próximo a los
obtenidos con bromelina comercial, lo que indica que se obtuvieron
resultados satisfactorios.
5.2 Recomendaciones
63
mejor los concentrados de bromelina, siempre tomando en cuenta la
estandarización de los sustratos, para obtener datos más confiables.
64
CAPÍTULO VI
PROPUESTA
65
6.2 Antecedentes de la propuesta
6.3 Justificación
La piña es una de las frutas con alto valor nutricional a más de contener a la
bromelina, que es una enzima proteasa con alta funcionalidad ya que
hidroliza las cadenas polipeptídicas de las proteínas sustrato.
67
organismo, en la lisis de células tumorales, para eliminar tejidos necrosados;
asumiendo además una creciente significación en estudios relacionados con
la regulación biológica (CHÁVEZ y otros, 1995).
6.4 Objetivos
6.4.1 General
6.4.2 Específicos
68
- Purificar el concentrado proteínico de bromelina extraído con etanol,
mediante cromatografía de intercambio iónico.
69
Tabla 5. Costos de la propuesta de investigación
6.6 Fundamentación
70
parte superior de la columna y va poco a poco entrando en la columna con
la fase móvil. Cada proteína migrará a distinta velocidad según su grado de
afinidad por la fase estacionaria.
En ella, la columna está rellena con un soporte al que van unidos grupos
cargados positivamente (intercambio aniónico) o negativamente (intercambio
catiónico). Estos grupos cargados normalmente están neutralizados por
iones del tampón. Estos iones son reversiblemente reemplazados por las
proteínas con más tendencia a unirse al soporte. Las proteínas cargadas
pueden por lo tanto unirse a intercambiadores catiónicos o aniónicos
dependiendo de su carga neta. Las proteínas más cargadas se unirán más
fuertemente al intercambiador y por lo tanto serán más difíciles de eluir. La
afinidad con la que una proteína se une a un intercambiador iónico depende
de la fuerza iónica del medio, debido a la competencia entre los grupos
cargados de la proteína y los iones de la fase móvil.
71
concentración de sal, NaCl), de esta forma se eluyen primero las proteínas
mas débilmente retenidas y cuando la fuerza iónica sea mayor saldrán las
proteínas más cargadas y por lo tanto más retenidas.
6.7 Metodología
72
Tabla 6. Modelo operativo (Plan de acción)
Purificar el
concentrado proteínico
Humanos
de bromelina y
1. Formulación de
determinar su Revisión bibliográfica Investigador Técnico 450 2 meses
la propuesta
actividad enzimática
Económicos
en sustratos
proteínicos.
Determinar la Humanos
3. Implementación Ejecución de la viscosidad de los
Investigador Técnico 2500 3 meses
de la propuesta propuesta sustratos al aplicar la
enzima Económicos
Humanos
Comprobación de la
4. Evaluación de Determinación de la
metodología Investigador Técnico 135 2 meses
la propuesta actividad enzimática
implementada Económicos
73
6.8 Administración
74
6.9 Previsión de la evaluación
75
MATERIALES DE REFERENCIA
BIBLIOGRAFÍA
76
CASILARI, I., HIDALGO, R. 2007. Proyecto de exportación de mermelada
de mango con trocitos de piña al mercado europeo. Disponible en:
http://www.dspace.espol.edu.ec/bitstream/123456789/3720/1/6247.pdf
Fecha: 2011-11-10.
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alimentarios. CODEX stan 192-1995. 297pp. Disponible en:
http://www.codexalimentarius.net/gsfaonline/docs/CXS_192s.pdf Fecha:
2011-11-22
77
CUADRADO, J., IZURIETA, K., PALACIOS, R. (2009). Fomento del sector
agroindustrial de la piña en pequeñas y medianas inversiones. 9pp.
Disponible en:
http://www.dspace.espol.edu.ec/bitstream/123456789/450/1/823.pdf Fecha:
2012-03-28.
GAUTAM, S., MISHRA, S., DASH, V., GOYAL, A., RATH, G. 2010.
Comparative study of extraction, purification and estimation of bromelian
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78
http://www.pharm.chula.ac.th/tjps/ContentVol34No2/V34-2Art3%20pp67-
76.pdf Fecha: 2011-11-18
79
PEI, M., BAHARIL, S., AISHAH, N., YU, L., MAJID, A., ADIBAH, F. 2005.
Pilot scale extraction of proteolytic enzyme bromelain from pineapple
(Ananas comosus). Disponible en: http://eprints.utm.my/5270/ Fecha:
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TRUJILLO, R., LORENZO, J., NATALUCCI, C., HERNÁNDEZ, M. 2006.
Actividad proteolítica de extractos enzimáticos obtenidos de plantas de la
familia Bromeliaceae. Disponible en:
http://bvs.sld.cu/revistas/pla/vol11_2_06/pla03206.htm Fecha: 2011-11-18
81
ANEXOS
ANEXO A
TABLAS DE
RESULTADOS
Tabla A1. Valores de humedad y materia seca de los concentrados
proteínicos de bromelina extraídos con etanol y NaCl.
* Tiempo de
Viscosidad Densidad Constante K
escurrido del
Viscosímetro 𝜇(𝑚𝑃𝑎. 𝑠) 𝑚3
agua 𝑘𝑔 𝐾(𝑚𝑃𝑎. )
t (s) 𝜌( ) 𝑘𝑔
𝑚3
1 634,5 9,9341E-01 998,2 1,5685E-06
2 6,0 9,9341E-01 998,2 1,6587E-04
3 294,0 9,9341E-01 998,2 3,3851E-06
4 35,5 9,9341E-01 998,2 2,8034E-05
5 72,5 9,9341E-01 998,2 1,3727E-05
6 33,0 9,9341E-01 998,2 3,0158E-05
7 75,5 9,9341E-01 998,2 1,3182E-05
8 78,8 9,9341E-01 998,2 1,2638E-05
9 35,0 9,9341E-01 998,2 2,8434E-05
Densidad Viscosidad
Sustrato kg
( 3 ) (mPa.s)
m
Leche 1030 2,30
Jugo de carne 1038 2,52
mPa.s
Actividad enzimática ( )
Sustrato s
Réplica 1 Réplica 2 Promedio
Leche – Bromelina en etanol 0,0052 0,0053 0,00525
Leche – Bromelina en NaCl 0,0034 0,0033 0,00335
Leche – Bromelina comercial 0,0065 0,0065 0,00650
Jugo de carne – Bromelina en etanol 0,0061 0,0060 0,00605
Jugo de carne – Bromelina en NaCl 0,0042 0,0042 0,00420
Jugo de carne – Bromelina comercial 0,0068 0,0068 0,00680
GRÁFICAS
8,00
7,00
Viscosidad (mPa.s)
6,00
5,00
y = -5E-09x3 + 8E-06x2 + 0,0001x + 3,3674
R² = 0,9979
4,00
3,00
0 120 240 360 480 600 720 840 960 1080 1200 1320
Tiempo (s)
7,00
6,00
Viscosidad (mPa.s)
5,00
y = 0,0052x + 2,2923
R² = 0,9963
4,00
3,00
240 360 480 600 720
Tiempo (s)
Viscosidad (mPa.s)
5,00
4,00
y = -3E-09x3 + 4E-06x2 + 0,0015x + 3,07
R² = 0,9974
3,00
0 120 240 360 480 600 720 840 960 1080 1200 1320
Tiempo (s)
6,00
Viscosidad (mPa.s)
5,00
y = 0,0034x + 2,7067
R² = 0,993
4,00
3,00
240 360 480 600 720
Tiempo (s)
8,00
Viscosidad (mPa.s)
7,00
6,00
y = -7E-09x3 + 1E-05x2 + 0,0006x + 4,1417
R² = 0,9973
5,00
4,00
0 120 240 360 480 600 720 840 960 1080 1200 1320
Tiempo (s)
8,00
7,50
Viscosidad (mPa.s)
7,00
6,50
y = 0,0065x + 2,9745
R² = 0,9986
6,00
5,50
5,00
240 360 480 600 720
Tiempo (s)
8,00
Viscosidad (mPa.s)
7,00
6,00
5,00
y = -6E-09x3 + 1E-05x2 + 0,0001x + 3,7264
R² = 0,9972
4,00
3,00
0 120 240 360 480 600 720 840 960 1080 1200 1320
Tiempo (s)
8,00
7,00
Viscosidad (mPa.s)
6,00
y = 0,006x + 2,4898
R² = 0,9918
5,00
4,00
240 360 480 600 720
Tiempo (s)
6,00
Viscosidad (mPa.s)
5,00
y = -4E-09x3 + 5E-06x2 + 0,001x + 3,2497
R² = 0,995
4,00
3,00
0 120 240 360 480 600 720 840 960 1080 1200 1320
Tiempo (s)
6,00
5,50
Viscosidad (mPa.s)
5,00
y = 0,0042x + 2,5807
R² = 0,9988
4,50
4,00
240 360 480 600 720
Tiempo (s)
9,00
Viscosidad (mPa.s)
8,00
7,00
6,00
y = -7E-09x3 + 1E-05x2 + 0,0005x + 4,8708
R² = 0,996
5,00
4,00
0 120 240 360 480 600 720 840 960 1080 1200 1320
Tiempo (s)
9,00
8,50
Viscosidad (mPa.s)
8,00
7,50
7,00
y = 0,0068x + 3,5273
R² = 0,9967
6,50
6,00
5,50
240 360 480 600 720
Tiempo (s)
.
ANÁLISIS
ESTADÍSTICO
Tabla C1. Optimización del diseño factorial 22
Tabla C3. Prueba de comparación múltiple Tukey al 95% para los diferentes
tratamientos
GRUPOS
TRATAMIENTOS AE
HOMOGENEOS
Jugo de carne – bromelina comercial 6 0,0068 A
Leche – bromelina comercial 5 0,0065 B
Jugo de carne – etanol 3 0,0061 C
Leche – etanol 1 0,0053 D
Jugo de carne – NaCl 4 0,0042 E
Leche – NaCl 2 0,0034 F
Gráfica C3. Prueba de Tukey al 95% para los tratamientos
FOTOGRAFÍAS
OBTENCIÓN DEL JUGO DE PIÑA