INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONA L

CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA

Cultivo de células de Uncaria tomentosa; Efecto de la

concentración de sacarosa inicial en la producción
de biomasa y de alcaloides en un biorreactor con un
impulsor de paletas inclinadas

TESIS QUE PARA OBTENER EL

GRADO DE MAESTRO EN
CIENCIAS EN DESARROLLO DE
PRODUCTOS BIÓTICOS

P R E S E N T A

Jorge Isaac Martínez Corona

Director: Dr. Mario Rodríguez Monroy

YAUTEPEC, MORELOS MAYO, 2007

Este trabajo fue desarrollado en el Laboratorio de
Biotecnología del Centro de Desarrollo de Productos
Bióticos del Instituto Politécnico Nacional, bajo la
dirección del Dr. Mario Rodríguez Monroy. Para la
realización de los estudios se tuvo el apoyo
económico de una beca CONACyT (No de registro:
190953) y del Programa Institucional de Formación de
Investigadores (PIFI). La investigación fue realizada
con el financiamiento económico de los proyectos SIP
(20050035 y 20060039) y CONACyT P43861-Z.
 AGRADECIMIENTO

Se agradece a la M. en C. Gabriela Luna Palencia y a la Dra. Ana C.

Ramos Valdivia del Departamento de Biotecnología del CINVESTAV-México su
apoyo y colaboración para la determinación de los alcaloides e iridoides en las
muestras.
 ÍNDICE DE CONTENIDO

Páginas
ABREVIATURAS i
ÍNDICE DE CUADROS ii
ÍNDICE DE FIGURAS ii
RESUMEN iv
vi
ABSTRACT
1
I ANTECEDENTES
1.1 Uncaria tomentosa; una planta de interés 1
farmacológico por sus principios activos
1.2 Antecedentes del cultivos de células vegetales de 5
Uncaria tomentosa
1.3 Manipulación de la concentración de sacarosa: una 9
estrategia para incrementar la producción de biomasa
o de metabolitos secundarios en cultivo de células
vegetales
1.4 El uso de impulsores de paletas inclinadas para 14
biorreactores
II COROLARIO 17
III OBJETIVOS 18
3.1 General 18
3.2 Particulares 18
IV MATERIALES Y METODOS 18
4.1 Planteamiento experimental 18
4.2 Línea celular 18
4.3 Inóculo para los experimentos 19
4.4 Efecto de la concentración de sacarosa inicial en 20
cultivo en matraces
4.5 Condiciones de cultivo en el biorreactor tipo tanque 21
 agitado con el impulsor de paletas inclinadas
4.6 Determinación de biomasa 23
4.7 Determinación de sacarosa 23
4.8 Extracción y cuantificación de alcaloides 24
4.9 Determinación de peróxido de hidrógeno 24
4.10 Análisis estadístico. 25
V RESULTADOS 26
5.1 Efecto de la concentración de sacarosa en el cultivo 26
de las células de Uncaria tomentosa en matraces
agitados
5.2 Cinéticas de crecimiento de las células de Uncaria 31
tomentosa en biorreactor tipo tanque agitado con un
impulsor de paletas inclinadas
5.2.1 Con una concentración de sacarosa inicial de 20 31
g/l.
5.2.2 Con una concentración de sacarosa inicial de 50 34
g/l.
VI DISCUSIÓN 38
VII CONCLUSIÓN 46
VII BIBLIOGRAFÍA CITADA 47
 ABREVIATURAS

AOM Alcaloides oxindólicos monoterpénicos

EROS Especies reactivas de oxígeno
g Gramos
l Litros
μ Velocidad específica de crecimiento (días -1)
PF Biomasa fresca (g)
PS Biomasa seca (g)
qs Velocidad de consumo de sustrato (días -1)
rpm Revoluciones por minuto
sac Sacarosa
URL Unidades relativas de luminiscencia.
Yx/s Rendimiento: gramos de biomasa producida/gramos de sacarosa
consumida.

i
 ÍNDICE DE CUADROS

No. Título Pág.

1 Alcaloides de Uncaria tomentosa 2

2 Estudios reportados para cultivos de células en suspensiones 7
de Uncaria tomentosa
3 Cultivo de células de Uncaria tomentosa para la producción de 43
AOM

ÍNDICE DE FIGURAS

No. Título Pág.

1 Alcaloides oxindólicos pentacíclicos y tetracíclicos de U. tomentosa 3
2 Vías metabólicas involucradas en la biosíntesis de los alcaloides 4
oxindólicos
3 Diagrama metodológico 19
4 Tamizado y escurrido de las células de Uncaria tomentosa para la 20
preparación de inóculo
5 Dimensiones generales del biorreactor y esquema del impulsor de 21
paletas inclinadas
6 Inoculación del biorreactor 22
7 Efecto de diferentes concentraciones de sacarosa sobre el cultivo de 28
células de Uncaria tomentosa desarrolladas en matraces
8 Fotografías de células y agregados del cultivo en matraces de 29
Uncaria tomentosa a diferentes concentraciones de sacarosa inicial
9 Efecto de diferentes concentraciones de sacarosa sobre la 30
producción de AOM e iridoides
10 Cinética de crecimiento y consumo de sacarosa del cultivo de 32
células de Uncaria tomentosa con 20 g sacarosa/l en biorreactor con
un impulsor de paletas inclinadas
ii
11 Cinética de producción de alcaloides e iridoides con células 33
suspendidas de Uncaria tomentosa en un biorreactor tipo tanque
agitado con un impulsor de paletas inclinadas con 20 g/l de sacarosa
inicial
12 Cinética de producción de EROS con células suspendidas de 34
Uncaria tomentosa en un biorreactor tipo tanque agitado con un
impulsor de paletas inclinadas con 20 g/l de sacarosa inicial
13 Cinética de crecimiento y consumo de sacarosa del cultivo de 35
células de Uncaria tomentosa con 50 g sacarosa/l en biorreactor con
un impulsor de paletas inclinadas
14 Cinética de producción de alcaloides e iridoides con células 37
suspendidas de Uncaria tomentosa en un biorreactor tipo tanque
agitado con un impulsor de paletas inclinadas con 50 g/l de sacarosa
inicial.

iii
 RESUMEN

Uncaria tomentosa es una planta qua habita en Centro y Sudamérica,

donde es utilizada ampliamente en la medicina tradicional. Estudios fitoquímicos y

farmacológicos indican que los alcaloides oxindólicos monoterpénicos (AOM) son

los principios activos responsables de sus propiedades inmunoestimulantes y

antitumorales. En este trabajo se estudió la alternativa para generar cultivos de

alta densidad celular de la línea green Uth-3 de U. tomentosa capaces de producir

AOM en un biorreactor agitado con un impulsor de paletas inclinadas.

Mediante la manipulación de la concentración de sacarosa en los cultivos

en matraces Erlenmeyer, se observó que al aumentar la concentración de

sacarosa inicial de 20 a 50 g/l, se puede incrementar la producción de biomasa

desde 12 a 24 g PS/l. Pero la máxima acumulación de AOM (25 µg AOM/g PS) se

presentó con 40 g de sacarosa/l; para 50 g de sacarosa/l, la biosíntesis de los

AOM se ve limitada y se da la acumulación de iridoides. Las células sometidas a

dichas condiciones sufren una disminución en su tamaño celular.

Los resultados con la línea green Uth-3 de U. tomentosa crecidas en el

biorreactor con el impulsor de paletas inclinadas, indican que el mezclado

generado por dicho impulsor fue capaz de mantener un cultivo de alta densidad

(35 g PS/l), ello se logró con el aumento de la concentración de sacarosa inicial de

20 a 50 g/l. aunque en dicho cultivo no se logró la máxima producción de los AOM

(14 µg AOM/g PS). Comparando los mejores resultados de producción de

iv
alcaloides en matraces (25 µg AOM/g PS), con los del biorreactor agitado con el

impulsor de paletas inclinadas (31 µg de AOM/g PS), podemos sugerir que el

impulsor de paletas inclinadas resulta una buena alternativa para la producción de

AOM en los cultivos de la línea green Uth-3 de U. tomentosa.

v
 ABSTRACT

Uncaria tomentosa is a plant that habit in Central and South America where

is widely used in traditional medicine. Pharmacological and phytochemical studies

have shown monoterpenoid oxindole alkaloids (AOM) as the immune stimulant and

anti tumor activity responsible compounds.

This work shows a bioreactor equipped with a pitched blade impeller as an

alternative to produce a high density cell culture and its AOM production with the

green Uth-3 Uncaria tomentosa cell line.

By increasing initial sucrose concentration (20-50 g/l) in the Erlenmeyer

flask culture, it seems that it is possible to increase biomass concentration (12-24 g

DW/l). Although the highest AOM accumulation (25 mg AOM/g DW) was achieved

with 40 g sucrose/l. At 50 g sucrose/l AOM production looks limited and a iridoids

accumulation was detected. The cells at these conditions show cell size diminution.

The results obtained with the Uncaria tomentosa green Uth-3 cell line

growth in bioreactor with the pitched blade impeller, corroborate that this impeller

mixing was capable to maintain a high density cell culture (35 g DW/l), this was

possible by increasing sucrose concentration from 20 to 50 g/l, but this culture

doesn’t achieve the highest AOM production (14 µg AOM/g DW). By comparing the

best result about AOM production in flask cultures (25 µg AOM/g DW) with the

pitched blade impeller equipped bioreactor cultures (31 µg de AOM/g DW), it

vi
suggest that the pitched blade impeller is a good alternative for AOM production in

Uncaria tomentosa green Uth-3 cell line.

vii
I. Antecedentes

1.1. Uncaria tomentosa; una planta de interés farmacológico por sus

principios activos.

Las plantas son fuente para la obtención de varios compuestos químicos

importantes para el hombre, de ellas se extraen los principios activos que se

utilizan para la elaboración de insecticidas, colorantes y fármacos, entre otros.

Muchos de estos compuestos, son difíciles de obtener por síntesis química y

varios de ellos son clasificados como metabolitos secundarios (Croteau et al.,

2000).

Verpoorte (2000) indica que en el Diccionario de Productos Naturales se

tienen documentados a los terpenoides como el grupo de metabolitos secundarios

más abundante (27,463 compuestos), mientras que los alcaloides ocupan el

segundo lugar en abundancia (15,765 compuestos). Los alcaloides son sustancias

que contienen nitrógeno y presentan un carácter básico (Carey, 1999). Estos

compuestos son de interés particular para uso farmacéutico por presentar

actividad citotóxica e inmunoestimulante (Keplinger et al., 1999).

Uncaria tomentosa es una planta de tallo leñoso que se encuentra

distribuida de Centro a Sudamérica y se le conoce comúnmente como “uña de

gato” (debido a la forma de sus espinas). Esta planta es pilar importante de la

medicina tradicional de la tribu Ashaninka de los bosques pluviales de Perú

(Heitzman et al., 2005). Las plantas de Uncaria tomentosa son de interés particular
1
en la medicina herbolaria tradicional y se tiene documentado que a finales del siglo

pasado, las plantas de U. tomentosa tenía una alta demanda para ser utilizada

como medicamento en forma de infusiones, tabletas o cápsulas en cerca de 30

países (De Jong et al., 1999). Rengifo y Zanabria (2001) comentan que en 1997

más de 50 fabricantes de suplementos dietéticos en Estados Unidos ofrecían

productos de U. tomentosa. Esta planta produce entre otros metabolitos

secundarios de interés farmacológico, alcaloides del tipo indólico y oxindólico

monoterpénico (AOM) (Cuadro 1). Estos compuestos se dividen en pentacíclicos y

tetracíclicos en función del número de anillos presentes en la molécula (Figura 1).

Los AOM tienen particular importancia, pues se tiene documentada

científicamente su actividad farmacológica, en relación a sus efectos

inmunoestimulante y antitumoral (Keplinger et al., 1999).

Cuadro 1. Alcaloides de Uncaria tomentosa.

Pentacíclicos Tetracíclicos
a
Oxindólicos Pteropodina (1) Rincofilina (7) b
Isopteropodina (2) Isorincofilina (8)
Especiofilina (3) Corinoxeína (9)
Uncarina F (4) Isocorinoxeína (10)
Mitrafilina (5)
Isomitrafilina (6)
Indólicos Akuammigina Hirsutina
Tetrahidroalstonina Hirsuteína
Isoajmalicina Dihidrocorinanteína
Corinanteína
Tomado de Trejo-Tapia, 2005, versión Adaptada de Keplinger et al. (1999).
a
figura 1A; b figura 1B.

2
 CH3 A
H H
19 B
N 20 O
R
N 20 OCH3
7 3 15
7 3 15

H H
N O O OCH3 H H
H N OCH3
O O
H

1 3S, 7R, 15S, 19S, 20S 6 3S, 7S, 15S, 19S, 20R
2 3S, 7S, 15S, 19S, 20S 7 3S, 7R, 15S, 20R R= etil
3 3R, 7S, 15S, 19S, 20S 8 3S, 7S, 15S, 20R R= etil
4 3R, 7R, 15S, 19S, 20S 9 3S, 7R, 15S, 20R R= vinil
5 3S, 7R, 15S, 19S, 20R 10 3S, 7S, 15S, 20R R= vinil

Figura 1. Alcaloides oxindólicos pentacíclicos (A) y tetracíclicos (B) de

U.tomentosa. (Tomado de Trejo-Tapia, 2005).

Una de las desventajas que enfrenta la explotación comercial de los

alcaloides de las especies de U. tomentosa es que la planta crece de forma

silvestre, como una enredadera leñosa sobre árboles de las selvas tropicales de

Centro y Sudamérica y los alcaloides oxindólicos monoterpénicos se acumulan

mayoritariamente en hojas jóvenes (Keplinger et al., 1999). Lo anterior, implica

que para la explotación de este recurso, se recurra a la corta de los árboles y

vegetación aledaña, conllevado a un manejo insostenible de este recurso (De

Jong et al., 1999).

Por otro lado, la síntesis química de estos alcaloides es compleja y poco se

conoce sobre la ruta bioquímica de su síntesis y sobre los mecanismos de

regulación. En la figura 2, se resume la posible ruta de su biosíntesis, se propone

que los alcaloides oxindólicos podrían provenir de la oxidación de los alcaloides

indólicos (Laus, 2004), mismos que (como otros alcaloides) parten de la

3
estrictosidina (Croteau et al., 2000). La estrictosidina es el producto de la unión de

dos vías metabólicas: la vía del shikimato; por medio de la triptamina, y la vía no-

mevalonato (compartamentalizada en los plastidios) por medio de la secologanina

(Burlat et al., 2004).

Figura 2. Vías metabólicas involucradas en la biosíntesis de los alcaloides

oxindólicos. Adaptado de Burlat et al., 2004.

4
 La demanda creciente de AOM por la industria farmacéutica conlleva a la

necesidad de buscar métodos alternativos para su obtención. En este sentido, la

biotecnología vegetal es considerada como una de las tecnologías de vanguardia

y de la cual se espera el desarrollo de procesos para la obtención de metabolitos

secundarios producidos por plantas silvestres con interés farmacéutico (Kieran et

al., 1997). Particularmente, el establecimiento de cultivos de células vegetales y su

crecimiento en biorreactores, resulta una forma alternativa de obtener metabolitos

secundarios de difícil obtención por síntesis química o de plantas que crecen en

regiones geográficas limitadas (Kieran et al., 1997), como puede ser el caso de los

AOM de U. tomentosa. Las técnicas de cultivo de células vegetales se basan en el

principio de totipotencialidad, que establece que una célula vegetal tiene la

información genética para regenerar una planta completa; las células pueden

activar la maquinaria bioquímica necesaria para la producción de los AOM. Las

etapas por las cuales se tiene que pasar antes de llegar a los cultivos masivos en

biorreactores incluyen el cultivo de callos y el cultivo de células en suspensión

(Rodríguez et al., 1999).

1. 2. Antecedentes del Cultivo de Células Vegetales de Uncaria

tomentosa

El cuadro 2 presenta una síntesis de los reportes sobre cultivos de células

en suspensión de Uncaria tomentosa. Se reporta el uso de dos líneas celulares

con fenotipos diferentes; una línea celular albina (Flores-Sánchez et al., 2002,
5
Feria-Romero et al., 2005, Luna-Palencia et al., 2005) y una línea celular verde

(Trejo-Tapia et al., 2005). La diferencia entre ambos fenotipos radica en la

presencia o ausencia de clorofilas en los plastidios. Trejo-Tapia (2005) destaca

que la línea verde podría tener ventajas sobre la línea albina, si se considera que

la propuesta de la ruta de biosíntesis de los AOM (figura 2) se presenta

compartamentaliza en los cloroplastos (Burlat et al., 2004). Aunque debe

señalarse que no todos los estudios centran su atención en la producción de AOM,

sino que también se ha reportado la producción de esteroles y terpenos (Feria-

Romero et al., 2005) y ácido ursólico y oleanólico (Flores-Sánchez et al., 2002).

Aun cuando existen varios reportes sobre el crecimiento del cultivo de

Uncaria tomentosa en matraces Erlenmeyer (Feria-Romero et al., 2005; Flores-

Sánchez et al., 2002; Luna-Palencia et al., 2005), solamente se tiene

documentado el reporte de Trejo-Tapia et al. (2005), para el crecimiento de éste

cultivo a nivel de biorreactor. El crecimiento máximo de las células de Uncaria

tomentosa reportado para matraces oscila entre 12.7 y 32.8 g PS/l, con un

rendimiento de biomasa producida/sacarosa consumida de 0.31 a 0.58. Cabe

resaltar el estudio de Luna-Palencia et al. (2005) quienes trabajando con la línea

albina, observaron que un aumento de sacarosa de 20.8 g/l a 52.2 g/l, ocasionó

un incremento tanto en la producción de biomasa de 14 gPS/l a 32.8 g PS/l, como

en la producción de los AOM de 2 μg/gPS a 4 μg/gPS. Tomando en cuenta el

resultado anterior, sería importante conocer si el efecto positivo del aumento de la

concentración de sacarosa sobre el crecimiento y la producción de AOM

observado en la línea albina, podría presentarse también en la línea verde.

6
 Cuadro 2. Estudios reportados para cultivos de células en suspensiones de Uncaria tomentosa.

Concentración
Fenotipo Concentración Rendimiento Edad de cultivo
de
de la de de biomasa / con mayor Metabolito
Sistema sacarosa Referencia
línea biomasa final sacarosa concentración de de interés
inicial
celular (g/l) consumida biomasa (días)
(g/l)
Flores-
Esteroles y
Albina Matraces 13.8 20 0.46 10 Sánchez et
triterpenos.
al., 2002
Albina Matraces 32.8 52.2 0.57 15 AOM Luna-
Palencia et
Albina Matraces 14.7 20.8 0.56 15 AOM
al., 2005
Ácido Feria-
Albina Matraces 15.3 20 0.58 10 ursólico y Romero et
oleanólico al., 2005
Verde Matraces 12.7 20 0.31 7 AOM Trejo-Tapia
Verde Biorreactor 11.9 20 0.3 12 AOM et al., 2005
 Trejo-Tapia et al. (2005) reportan para el cultivo de Uncaria tomentosa

en el biorrector, que la línea celular verde presenta un crecimiento máximo de

11.9 g/l, utilizando una concentración de sacarosa inicial de 20 g/l (rendimiento

de biomasa producida/sacarosa consumida de 0.3). Estos valores son

comparables con los reportados para la línea celular verde en matraces (Trejo-

Tapia et al., 2005) y están dentro de los valores reportados para la línea celular

albina (Feria-Romero et al., 2005; Flores-Sánchez et al., 2002; Luna-Palencia

et al., 2005).

El trabajo de Trejo-Tapia et al. (2005) cobra particular relevancia para el

proceso de escalamiento de los cultivos de U. tomentosa, ya que hace un

estudio comparativo entre los resultados de matraces con los de un biorreactor,

que permiten inferir algunas de las implicaciones durante el cambio de escala

del cultivo. Considerando que una de las respuestas bioquímicas de las células

vegetales ante factores de estrés es el aumento de las especies reactivas de

oxígeno (EROS), los resultados del trabajo mencionado muestran que las

células en el biorreactor producen más peróxido de hidrógeno (H2O2) en 3

órdenes de magnitud que las células en matraces. El peróxido de hidrógeno

que producen las células de Uncaria tomentosa es una de las señales

bioquímicas que inducen la biosíntesis de los AOM y además se observó que

la acumulación de los AOM fue proporcional a la producción de EROS (Trejo-

Tapia, 2005). Otra de las diferencias observados fue el cambio del tamaño de

los agregados, los cuales en el biorreactor (0.012 mm2) fueron cerca de tres

veces más grandes a las que se generan en matraces (0.005 mm2).

8
 Aún cuando los resultados de Trejo-Tapia et al. (2005) muestran la

factibilidad técnica de usar un biorreactor tipo tanque agitado para el

crecimiento del cultivo de Uncaria tomentosa. Para fines de escalamiento, la

condición de agitación utilizada (400 rpm con un impulsor de disco de 4

paletas), no sería la más apropiada en un reactor industrial para mantener al

cultivo suspendido, y por tanto se podrían presentar problemas de

sedimentación que afectarían la transferencia de masa en el cultivo (Doran,

1999).

1. 3. Manipulación de la concentración de sacarosa: una estrategia

para incrementar la producción de biomasa o de metabolitos

secundarios en cultivo de células vegetales

En cultivos de células vegetales, el factor más importante para lograr

altas producciones de metabolitos es el incrementar la productividad

volumétrica y para ello, el incremento de la densidad celular (g PS/l) es la

estrategia más lógica (Su y Humphfrey, 1990), pues un cultivo de alta densidad

ofrece la ventaja de una alta producción de metabolitos en tanques de cultivo

compactos con alta producción volumétrica (Zhong et al., 2000). En el plano del

cultivo de células vegetales, se puede considerar que a partir de los 20 g PS/l

se tiene un cultivo de alta densidad (Zhang y Zhong, 2004, Wu et al., 2005),

pero se han alcanzado densidades celulares de hasta 75 g PS/l en cultivos de

Coptis japonica (Misawa, 1994).

9
 El establecimiento de cultivo de células vegetales de alta densidad

puede conllevar al uso de estrategias que generen condiciones de estrés para

las células. En este contexto, debe considerarse que en las plantas, la

acumulación de metabolitos secundarios puede ocurrir como un mecanismo de

respuesta de las células vegetales a diversas condiciones de estrés (Vom-Endt

et al. 2002). Estas condiciones se pueden agrupar como bióticas y abióticas,

dentro de las primeras es posible identificar el ataque de herbívoros u otros

patógenos y dentro de las de tipo abiótico se podría citar la falta de agua

(estrés hídrico), el cambio de pH, presión osmótica y temperatura y/o cambio

en la composición de sustratos (Morris et al., 1991, Sepúlveda-Jiménez et al,

2003, Wu et al., 2005). El cultivo de células vegetales representa un sistema

modelo para estudiar en laboratorio, bajo condiciones controladas, el efecto de

diferentes condiciones de estrés sobre el crecimiento celular y en la

acumulación de metabolitos. Además permite indagar sobre los eventos

bioquímicos involucrados en la respuesta de las células (Verpoorte et al.,

1994).

La elicitación (el uso de sustancias que estimulan el metabolismo

secundario) y la modificación de la composición del medio de cultivo son dos

de las estrategias utilizadas en cultivos de células en suspensión para producir

una mayor cantidad de biomasa y de metabolitos secundarios (Wu y Lin, 2002).

Particularmente, la modificación de la fuente de carbono en los cultivos de

células in vitro es una alternativa sencilla que ha sido utilizada en diferentes

trabajos.

10
 Las células de las plantas en los tejidos fotosintéticos son autotróficas,

sin embargo, en los cultivos in vitro las células son heterotróficas y requieren

de la adición de una fuente de carbono para lograr su crecimiento (Morris et al.,

1991). Varios son los compuestos que se pueden usar como fuente de carbono

en cultivos de células vegetales, como por ejemplo: polisacáridos (almidón);

disacáridos (lactosa, sacarosa) y monosacáridos (glucosa, maltosa, galactosa,

manosa, fructosa y sorbitol) (Chattopadyay et al., 2003, Vanisree et al., 2004,

Wu et al., 2005, Misawa, 1994). No obstante, la sacarosa es la fuente de

carbono usada en la mayoría de los medios de cultivo de células vegetales

debido a su bajo costo, disponibilidad comercial y rápida asimilación atribuible a

su eficiente transporte a través de la membrana plasmática (Shimon-Kerner et

al., 2000). Además se ha reportado que a diferencia de algunas sales

catiónicas monovalentes, el efecto osmótico provocado por la presencia (o

aumento) de sacarosa en el medio de cultivo de células de tabaco no produce

un estrés significativo (Kawano et al., 2001).

La sacarosa es un dímero formado por una molécula de glucosa y una

de fructosa, unidas mediante enlaces alfa 1,4. Es sabido que las células son

capaces de utilizar a la sacarosa por medio de invertasas extracelulares, que la

hidrolizan liberando la glucosa y la fructosa que son asimiladas por difusión o

mediante transportadores al interior de la células. También, la sacarosa puede

ser introducida a la célula vía cotransporte con protones en una reacción

dependiente de ATP (Hopkins, 1999).

11
 La glucosa y la fructosa intracelular forman parte del acervo de hexosas

en el citoplasma de la célula y sirven para el metabolismo celular. Está

reportado que las células vegetales cultivadas in vitro utilizan los carbohidratos

consumidos para la biosíntesis de macromoléculas y también para obtener la

energía necesaria para su mantenimiento celular. Además, la tasa de consumo

de oxígeno en el cultivo es proporcional a la cantidad de sacarosa presente en

el medio (Roby et al., 2002). En este contexto se reportan rendimientos de

biomasa producida (g) por sacarosa consumida (g) (Yx/s) en el intervalo de 0.23

a 0.58 (Chattopadyay et al., 2003, Taticek et al., 1990, Feria-Romero et al.,

2005).

A continuación se presentan algunos de los reportes que muestran la

manipulación de la fuente de carbono como estrategia para mejorar el

crecimiento y producción de metabolitos secundarios en cultivos de células in

vitro. Dong y Zhong (2002) aumentan la producción de biomasa casi en un 70%

al llevar la concentración de sacarosa del medio de 30 g/l a 40 g/l, en la mitad

de la fase exponencial de un cultivo de Taxus chinensis, cabe destacar que

esta maniobra no incrementó la producción del metabolito secundario de

interés (taxuyunanina). Chattopadhyay et al. (2003) reportan para células

suspendidas de Podophyllum hexandrum que tanto la biomasa como la

producción de podofylotoxina aumenta de manera proporcional a la

concentración de sacarosa inicial en un rango de 20 a 40 g/l; pero un

incremento en la concentración de sacarosa de 40 a 80 g/l provoca que tanto la

producción de biomasa como la de podofylotoxina decrezcan de manera

significativa.

12
 Miñano et al. (2004) modificaron la concentración de sacarosa (0, 20, 47

y 63 g/l) en cultivos celulares de Vitis vinifera logrando incrementar la

producción de antocianinas (1.16, 1.75, 1.96, 1.97 μM, respectivamente). Wu et

al. (2005) trabajando con cultivos de células de Panax ginseng, demostraron

que un aumento en la concentración de sorbitol (de 18.2 g/l a 54.6 g/l), induce

un incremento en la producción de saponinas de hasta un 50%. Luna-Palencia

et al. (2005) reportan que al incrementar la concentración de sacarosa (de 20.8

a 52.2 g/l), se logró incrementar la producción de alcaloides terpenoides (de 6 a

23 μg/g PS). Shohael et al. (2006) por medio de un aumento de sacarosa inicial

(de 0 a 9%) produjeron una mayor cantidad de eleuterósidos en cultivos

embriogénicos de Eleutherococcus sessiliflorus.

La sacarosa adicionada al medio de cultivo en altas concentraciones

(>50g/l) puede provocar un aumento en la presión osmótica, que entre otras

consecuencias, puede inducir la acumulación del metabolito en la célula,

además de disminuir el tamaño celular (Miñano et al., 2004). Kawano et al.

(2001) reportan un estudio efectuado con suspensiones celulares de tabaco,

donde a diferencia de algunas sales catiónicas monovalentes, el efecto

osmótico provocado por la presencia (o aumento) de sacarosa en el medio no

produce un estrés significativo traducido en especies reactivas de oxígeno

(EROS).

13
 1. 4. El uso de impulsores de paletas inclinadas para biorreactores

La obtención de metabolitos secundarios en forma comercial y basada

en el cultivo de células vegetales, demanda del uso de biorreactores. Dentro

de los tipos de biorreactores probados para tales fines se encuentran: el tanque

agitado, el tambor rotatorio, la columna de burbujeo y el air-lift (Rodríguez et al.,

1999). Pero el tipo con que se han alcanzado los mayores volúmenes de

producción es con el tanque agitado, donde se reportan reactores de 1 a 75 m3

(Kieran et al., 1997).

En los biorreactores tipo tanque agitado, la turbina Rushton es el

impulsor más utilizado para el desarrollo de varios sistemas biológicos

(Amanullah et al., 2004). Este tipo de impulsor presenta un patrón de descarga

radial, es decir paralelo al eje del tanque del biorreactor, el cual además de

provocar el movimiento del fluido para el mezclado, crea una condición de

corte que propicia el rompimiento de las burbujas de aire y aumenta la

capacidad de transferencia de oxígeno. Para las células vegetales en

suspensión, se ha considerado que dichas condiciones de estrés hidrodinámico

pueden generar diversos daños, especialmente por su gran tamaño celular, por

su presencia de vacuolas de almacenamiento y por su tendencia a formar

agregados (Rodríguez-Monroy y Galindo, 2003).

El estrés hidrodinámico generado por la agitación de los impulsores en

los biorreactores puede ocasionar diferentes grados de daño celular en los

cultivos de células vegetales, que incluyen cambios en el patrón de agregados,

14
liberación de sustancias intracelulares, cambios metabólicos y la pérdida de

viabilidad celular (Rodríguez-Monroy y Galindo, 2003).

Alternativamente a los impulsores con descarga radial, como la turbina

Rushton, existen impulsores de descarga axial que dirigen el movimiento del

fluido de forma paralela al eje del impulsor provocando un movimiento

ascendente o descendente, dependiendo de la orientación de las paletas. En el

trabajo de Doran (1999) se presentó un análisis teórico de las características

de mezclado y de transferencia de oxígeno que se presentan con la turbina y

con un impulsor de paletas inclinadas para caldos de células vegetales en un

bioreactor de 10 m3. En dicho estudio se observo que el impulsor radial

presentó un rango de velocidades de agitación restringido, a las que puede

operar, sin que las células presenten daños letales, pero en ese intervalo de

agitación se presentarían problemas de sedimentación de las células y de

transferencia de oxígeno. En contraste, el uso de un impulsor de paletas

inclinadas permite manejar velocidades de agitación en las cuales el mezclado

y transferencia de oxígeno sean mejores; se asegura la suspensión de las

células, se satisface su demanda de oxígeno y no se generan daños letales a

las células.

Tomando en consideración el análisis teórico de Doran (1999), en el

trabajo de Ortíz (2004) se evaluó el desempeño de una turbina Rushton y de un

impulsor de paletas inclinadas en un tanque de 7 litros con un cultivo de

Solanum chrysotrichum. Para tratar de simular condiciones similares a las del

reactor de 10 m3, se propuso mantener la velocidad en la punta del impulsor

15
constante (2. 3 m /s). Sus resultados corroboraron la propuesta de Doran

(1999), ya que con la turbina Rushton las células perdieron su viabilidad dentro

de los primeros 3 días, por el contrario, el cultivo agitado con el impulsor de

paletas inclinadas mantuvo su viabilidad alrededor de 80 % y logró un

crecimiento celular de 12 g PS/L. Recientemente Flores (2007), determinó que

el consumo de potencia de la turbina Rushton a aquella velocidad de agitación

fue 3 veces superior a la del impulsor de paletas inclinadas, por lo que se

comprobó que el estrés hidrodinámico de la turbina Rushton es más dañino

para las células vegetales.

Los datos anteriores muestran la factibilidad técnica para usar el

impulsor de paletas inclinadas, como una alternativa a la turbina Rushton. Sin

embargo, no se obtuvo información documentada del desempeño de este tipo

de impulsor para cultivos con concentraciones celulares superiores a los 20 g

PS/L. La generación de cultivos de densidades superiores a los 30 g PS/L es

de especial interés, ya que representan una posibilidad para mejorar la

productividad de los sistemas de cultivo de células y para la producción de

metabolitos secundarios (Humphrey, 1994; Doran, 1999).

16
II . COROLARIO

El cultivo de células vegetales es una tecnología de vanguardia que

permite producir sustancias de interés farmacológico. Uncaria tomentosa es

una especie que produce alcaloides oxindólicos monoterpénicos (AOM) usados

por su actividad citotóxica e inmunoestimulante. Los estudios documentados en

la revisión, muestran que el cultivo in vitro de células de esta especie es una

alternativa para la producción de estos metabolitos secundarios.

Sin embargo, para mejorar la productividad de los AOM obtenidos con

los cultivos de Uncaria tomentosa in vitro es necesario evaluar estrategias para

mejorar el rendimiento celular y definir condiciones para el crecimiento de estos

cultivos en biorreactores. Tomando en cuenta los antecedentes, se desprende

que una alternativa viable para mejorar el rendimiento en los cultivos de

Uncaria tomentosa línea green Uth-3 productores de AOM, podría ser el

incremento en la sacarosa inicial del medio (Luna-Palencia et al, 2005).

Además, para lograr el desarrollo de un cultivo de alta densidad en el

biorreactor, se propone la evaluación de un impulsor de paletas inclinadas que

permita aumentar la velocidad de agitación en caso de que fuera necesario.

17
III. OBJETIVOS

3. 1. General

Evaluar el efecto de la concentración de sacarosa inicial en la

producción de biomasa y de AOM en cultivos de U. tomentosa (green Uth-3) en

un biorreactor con un impulsor de paletas inclinadas.

3. 2. Particulares

• Analizar los efectos del aumento de la concentración de sacarosa inicial

sobre el crecimiento y la producción de alcaloides oxindólicos

monoterpénicos en el cultivo de Uncaria tomentosa.

• Evaluar el uso del impulsor de paletas inclinadas (IPI) para el mezclado

del cultivo de U. tomentosa en el biorreactor tipo tanque agitado.

• Determinar las condiciones de agitación, para desarrollar un cultivo de

alta densidad celular en el biorreactor con el IPI, favorables para la

producción de AOM.

IV. Materiales y Métodos

4. 1. Planteamiento experimental. Como lo muestra la figura 3, la estrategia

experimental de este trabajo se planteó en dos etapas: 1ª) evaluar los efectos

de diferente concentración de sacarosa en el medio buscando obtener un

cultivo de alta densidad y con producción de AOM y 2ª) el uso de un biorreactor

equipado con un impulsor de paletas inclinadas para el desarrollo del cultivo de

alta densidad y con producción de AOM.

18
 Uncaria tomentosa
Línea celular green Uth-3

Matraces. Efecto de la Biorreactor: IPI

concentración de sacarosa Concentración de sacarosa
inicial. 20, 30, 40 y 50 g sac/l inicial: 20, 50 g sac/l

Medición de biomasa, sacarosa residual y AOM

Figura 3. Diagrama metodológico

4. 2. Línea celular. La línea celular green Uth-3 de Uncaria tomentosa utilizada

fue proporcionada por la Dra. Ana C. Ramos Valdivia del Departamento de

Biotecnología y Bioingeniería del CINVESTAV-IPN. Esta línea celular se

mantuvo resembrándola cada 15 días en matraces Erlenmeyer de 250 ml con

50 ml del medio Murashige-Skoog (MS) (Murashige and Skoog, 1962)

adicionado con sacarosa (20 g/l), 2,4-D (10 μM) y cinetina (10 μM) y con pH de

6.2 antes de esterilizar. Los matraces se mantuvieron agitados orbitalmente a

110 revoluciones por minuto (rpm), iluminación constante (150 μmolm-2s-1) y a

25+2 °C.

4. 3. Inóculo para los experimentos. Se preparó en matraces Erlenmeyer de

1 l con 200 ml de medio de cultivo. Estos matraces se inocularon con 20 g de

biomasa escurrida en un tamiz (número de malla 100) proveniente de un

cultivos de 7 días de edad (ver figura 4).

19
 Figura 4. Tamizado y escurrido de las células de Uncaria tomentosa

para la preparación de inóculo.

4. 4. Efecto de la concentración de sacarosa inicial en cultivo en

matraces. Se probaron diferentes concentraciones de sacarosa inicial: 20, 30,

40 y 50 g/l (3 matraces para cada concentración). Para ello, se utilizaron

matraces Erlenmeyer de 125 ml con 25 ml de medio de cultivo y se inocularon

con 2.5 g de células frescas cada uno. Las células provenientes de un cultivo

de 7 días de edad, fueron escurridas en un tamiz e inmediatamente trasladadas

a los matraces con la ayuda de una espátula (figura 4). A los 10 días de edad

de los cultivos, se evaluó el contenido de biomasa fresca (PF), biomasa seca

(PS) y se determinó el contenido de sacarosa residual en el medio de cultivo,

así como la presencia de AOM. Se realizaron dos réplicas de este experimento.

20
4. 5. Condiciones de cultivo en el biorreactor tipo tanque agitado con el

impulsor de paletas inclinadas. Se utilizó un biorreactor de 3 litros de

volumen nominal (Vn), y un volumen de trabajo (Vt) de 1.4 l (figura 5 a), asistido

por un biocontrolador (marca Applikon, Holanda). El biocontrolador registra en

línea los valores de pH y oxígeno disuelto, además de dirigir la adición de una

solución de NaOH 0.1 N para mantener el pH en 5 ± 0.3, todo ello siguiendo la

metodología utilizada por Trejo-Tapia et al. (2005).

El impulsor utilizado fue de 6 paletas inclinadas a 45° (figura 5 b) y

estuvo situado a 2.6 cm del fondo del biorreactor. La relación diámetro del

impulsor/diámetro del tanque (Di/Dt) es de 0.3, la velocidad de agitación fue

constante de 400 revoluciones por minuto (rpm).

Figura 5. a) Dimensiones generales del biorreactor, b) Esquema del

impulsor de 6 paletas inclinadas a 45°.

21
 El biorreactor se inoculó con 140 g de células frescas utilizando un

matraz Erlenmeyer de 1000 ml con 200 ml de medio. El matraz usado para la

inoculación cuenta con una manguera adaptada a una salida en el fondo de 8

mm de diámetro como se muestra en la figura 6. Las condiciones de cultivo

fueron con iluminación artificial por medio de 3 lámparas de luz fría (150

μmolm-2s-1), y a 23.5 + 1.5ºC. Se probaron dos concentraciones de sacarosa

inicial: 20 y 50 g/l.

Figura 6. Inoculación del biorreactor.

Se realizaron las cinéticas tomando muestras cada tercer día y

evaluando: contenido de biomasa fresca (PF), biomasa seca (PS), el contenido

de sacarosa residual en el medio de cultivo y la presencia de AOM. Se

realizaron dos réplicas de cada experimento.

22
4. 6. Determinación de biomasa. Se determinó la biomasa presente por el

método gravimétrico. Para peso fresco: se filtraron al vacío 3 ml de caldo de

cultivo en papel filtro Whatman No. 1 (de peso conocido). La torta del filtrado se

pesó junto con el papel. Para peso seco: El papel con la torta se secó durante

12 horas en estufa al vacío (-0.5 atm manométricas) a 70°C. Para medir la

velocidad máxima de crecimiento (μ[=]días-1) se utilizaron los valores de

biomasa seca que pertenecen al crecimiento exponencial del cultivo; con estos

datos se evaluó una regresión exponencial para la fórmula: Xt=X0eμt; donde

Xt=gramos de biomasa seca (gPS) al término de la fase exponencial,

X0=gramos de biomasa seca al inicio de la fase exponencial y e=función

exponencial (2.71828). Para medir la velocidad de consumo de sustrato (qs) se

utilizo la relación: qs=μ/(Yx/s); donde μ=velocidad máxima de crecimiento y

Yx/s=gramos de biomasa seca producida/gramos de sacarosa consumida.

4. 7. Determinación de sacarosa. Se siguió la metodología propuesta por

Dubois et al. (1956). Las muestras de medio de cultivo se diluyeron con agua

hasta alcanzar concentraciones menores a 200 mg de sacarosa por litro.

Posteriormente, a 1 ml de la solución del medio se adicionó 1 ml de fenol al

80%, y 5 ml de ácido sulfúrico concentrado. Después se leyó la absorbancia de

las muestras a 490 nm y se interpolaron los datos para obtener la

concentración de sacarosa. Para construir la curva tipo se utilizó sacarosa en

un intervalo de 0 a 200 mg/l. Para la obtención de la velocidad de consumo de

sustrato (qs) se uilizaron los datos de la fase exponencial del cultivo.

23
4. 8. Extracción y cuantificación de alcaloides. Sólo se realizó para el medio

de cultivo libre de células. Se utilizó la metodología reportada por Luna-

Palencia et al. (2005). Los alcaloides se extrajeron alcalinizando el medio libre

de biomasa con hidróxido de amonio al 29% a pH entre 8 y 9. Después se

extrajeron con cloroformo (grado HPLC) (2 veces el volumen de la muestra)

agitando vigorosamente en un embudo de separación. La fase orgánica se

recuperó y se evaporó el solvente en un rotavapor a 65°C. Las muestras,

después de la evaporación, se disolvieron y se inyectaron 50 μl (bomba Varian

Pro Star 320 de inyección manual) en una columna C-18 Waters Spherishob de

una longitud de 25 cm en un cromatógrafo de líquidos de alta resolución

(Varian Pro Star) acoplado a un detector de arreglos de diodos (Varian Walnut

Creek). Los alcaloides se identificaron con base en sus tiempos de retención y

por comparación de los espectros de absorción UV de triptamina, loganina

(para detección de iridoides), pteropodina (para detección de AOM) y ajmalicina

(para detección de alcaloides indólicos). El estándar de pteropodina fue

obtenido de la corteza de la planta por Luna-Palencia et al. (2005).

4. 9. Determinación de peróxido de hidrógeno. Para la evaluación de la

producción extracelular de H2O2, se recurrió al método utilizado por Trejo-Tapia

et al. (2005). Se centrifugó el caldo a 720 x g durante 10 minutos a 4°C. Se

añadieron a 325 μl del sobrenadante: 1 ml de fosfato de sodio (0.1 M, pH=7),

150 μl de luminol (solución a 2.5 mM en búffer de fosfato de sodio 0.1 M, pH=7)

y 25 μl de peroxidasa (6mU/μl, SIGMA P-6140, lote 051K7490) preparada en

amortiguador de fosfatos de sodio (fosfato de sodio monobásico monohidratado

y fosfato de sodio dibásico anhidro 1.0 M, pH=7) en ese orden. La

24
luminiscencia se midió de inmediato durante 3 minutos cada 30 segundos en

un luminómetro (Betascout 2007-0010, Perkin Erlmer Life Sciences, Turku,

Finlandia) considerando el valor más alto de cada medición. La luminiscencia

se expresó como unidades relativas de luminiscencia por gramo de peso seco

de biomasa (URL/gPS).

4. 10. Análisis estadístico. Todos los datos, cuya inferencia estadística se

muestra, se sometieron a pruebas indicadas a continuación utilizando el

paquete estadístico Sigma Stat para Windows 3.0.1. Para las comparaciones

de biomasa producida (g PF/l y g PS/l) se realizaron pruebas de Kruskal-Wallis,

y para comparación entre dos grupos se utilizó la prueba de Mann-Whitney.

Para la comparación de AOM en matraces se realizó un ANOVA o Kruskal-

Wallis dependiendo de la normalidad de los datos.

25
V. Resultados

5. 1. Efecto de la concentración de sacarosa en el cultivo de las

células de Uncaria tomentosa en matraces agitados

En la figura 7A se presentan los resultados de crecimiento de las células

de Uncaria tomentosa a diferentes concentraciones de sacarosa inicial. En los

tratamientos se obtuvo una cantidad de biomasa entre 368 y 427 g PF/l, y no

se observaron diferencias entre los diferentes tratamientos (KW, H=0.05,

gl=3,P=0.90). En los resultados de peso seco no se obtuvo diferencia

significativa (KW, H=7.18, gl=3, P=0.06). Sin embargo se aprecia una

tendencia de incremento en proporción directa al aumento en la concentración

de sacarosa que va desde 12 g PS/l hasta 24 g PS/l, para 20 y 50 g sacarosa/l,

respectivamente. No obstante, al comparar los resultados de 20 y 50 gramos

de sacarosa, se encontró una diferencia significativa (MW, T=26.5, P=0.04).

En la figura 7B, se observa que la relación PF/PS fue de 28 para una

concentración de sacarosa de 20 g/l y este valor decrece a medida que

aumenta la concentración de sacarosa, alcanzando un valor mínimo de 12 para

50 g sacarosa/l. Siendo estos dos puntos diferentes entre sí (F=3.2, gl=3,20,

P=0.45) .En forma consistente con la disminución de la relación PF/PS, se

observa que las células se hacen más pequeñas a medida que se aumenta la

concentración de sacarosa (figura 8 ). Lo anterior, indica que el aumento de la

sacarosa genera un incremento en la osmolaridad del medio y ocasiona una

disminución en el tamaño celular, lo que a su vez favorece a un mejor

26
rendimiento celular en base seca. Por otra parte, el rendimiento de gramos

biomasa producida con base en los gramos de sacarosa consumida (Yx/s),

aumenta desde un valor de 0.16 para 20 g sacarosa/l a un valor de 0.37 para

50 g sacarosa/l, no obstante el análisis estadístico indica que no existe efecto

de la concentración de sacarosa sobre el rendimiento en los cultivos en

matraces de la línea celular green Uth-3 de Uncaria tomentosa (F=163,

gl=3,20, P=0.21) (Figura 7 B).

En la figura 9 se presentan los resultados de producción de alcaloides e

iridoides en función de la concentración de sacarosa inicial. En el panel A se

observa que la producción de AOM con 20 g sacarosa /l fue de 6 μg/g PS y que

el aumento de la sacarosa provocó una respuesta directamente proporcional en

la producción de AOM, alcanzando una acumulación máxima de 25 μg de

AOM/g PS con 40 g sacarosa/l. No obstante para 50 g sacarosa/l se observa

que la acumulación de los AOM baja a un valor de 11 μg de AOM/g PS

(F=1.52, gl=3,8, P=0.28). Por otro lado, se observa que con 20 y 30 g de

sacarosa/l no se produjeron iridoides (loganina), pero con 40 y 50 g sacarosa/l

se presentan trazas de iridoides en valores de 0.02 y 0.04 μg/g PS,

respectivamente.

27
Figura 7. Efecto de diferentes concentraciones de sacarosa sobre el cultivo

de células de Uncaria tomentosa desarrolladas en matraces. A)

Crecimiento celular, B) Relación PF/PS y rendimiento celular con

base en sacarosa consumida. Los puntos presentan los valores

promedio y las barras de error presentan la desviación estándar.

Puntos en la misma línea seguidos de la misma letra no son

diferentes entre sí (P=0.05).

28
 10 µm

Figura 8. Fotografías de células y agregados del cultivo en matraces de

Uncaria tomentosa a diferentes concentraciones de sacarosa

inicial.

Este efecto del aumento de la concentración de sacarosa inicial se repite

para la producción volumétrica (figura 9 B). No obstante, el análisis estadístico

de los resultados indica que no hubo un efecto significativo (KW, H=5.3, gl=3,

P=0.14). Estos resultados indican que la producción más alta de AOM se

puede obtener con 40 g de sacarosa/l.

29
Figura 9. Efecto de diferentes concentraciones de sacarosa sobre la

producción de AOM e iridoides. A) Rendimiento específico, B)

Rendimiento volumétrico. Los puntos presentan los valores

promedio y las barras de error presentan la desviación estándar.

30
5. 2. Cinéticas de crecimiento de las células de Uncaria tomentosa en

biorreactor tipo tanque agitado con un impulsor de paletas inclinadas

5. 2.1. Con una concentración de sacarosa inicial de 20 g/l.

Con el objeto de conocer el desempeño del impulsor de paletas

inclinadas para el crecimiento y producción de AOM en los cultivos de Uncaria

tomentosa, inicialmente se llevaron acabo los cultivos con una concentración

de sacarosa de 20 g/l, que corresponde a la concentración usada por Trejo-

Tapia et al. (2005) para el cultivo en el biorreactor, pero con un impulsor de

disco con 4 paletas planas.

En la figura 10 se presenta la cinética obtenida, en donde se observa

que el cultivo presentó una fase de adaptación (lag) de 1 día. Posteriormente el

cultivo se desarrolló con una velocidad de crecimiento máxima de 0.14 d-1,

alcanzando una cantidad de biomasa máxima de 14 g PS/l (en el día 6); al día

10 la cantidad de biomasa fue de sólo 10 g PS/l, sugiriendo la existencia de

una fase de muerte celular.

Las células consumieron toda la sacarosa suministrada con una

velocidad de consumo (qs) de 0.36 d-1, al día 6 se observó que el agotamiento

de la sacarosa coincidió con el crecimiento máximo del cultivo. En esta

condición se obtuvo un rendimiento celular con base en la sacarosa consumida

de 0.37.

31
Figura 10. Cinética de crecimiento y consumo de sacarosa del cultivo de

células de Uncaria tomentosa con 20 g sacarosa/l en biorreactor

con un impulsor de paletas inclinadas. Biomasa en base

seca (♦), sacarosa residual (■). Los puntos presentan los valores

promedio y las barras de error presentan la desviación estándar.

En la figura 11 se presentan los resultados correspondientes a la

producción de AOM e iridoides. Para los AOM, el perfil de la curva sugiere dos

máximos de acumulación que corresponden a 31 y 28 μg AOM/g PS a los días

2 y 6 respectivamente, Mientras que para los iridoides se presenta un valor

máximo de 0.58 μg/g PS al día 1, el cual desaparece al día 4 y nuevamente

presenta una tendencia de aumento alcanzando un valor de 0.2 μg/g PS al día

10. Para la producción volumétrica de los AOM y de los iridoides se observa un

comportamiento similar (figura 11 B).

32
Figura 11. Cinética de producción de alcaloides (■) e iridoides (▲) con células

de Uncaria tomentosa suspendidas en un biorreactor tipo tanque

agitado con un impulsor de paletas inclinadas usando 20 g/l de

sacarosa inicial. A) Rendimiento específico, B) Rendimiento

volumétrico. Los puntos presentan los valores promedio.

33
 Considerando la producción de EROS por parte del cultivo de Uncaria

tomentosa como un indicativo de la respuesta de las células al estrés impuesto

por la agitación con el impulsor de paletas inclinadas, el gráfico de la figura 12

indica que durante los primeros 32 minutos se da un aumento en el contenido

de EROS que alcanzó un valor de 104 URL/g PS, pero que desaparece

después de 170 minutos y no vuelve a haber producción de EROS a lo largo de

la cinética.

Figura 12. Cinética de producción de EROS con células suspendidas de

Uncaria tomentosa en un biorreactor tipo tanque agitado con un

impulsor de paletas inclinadas con 20 g/l de sacarosa inicial.

5. 2.2. Con una concentración de sacarosa inicial de 50 g/l.

Tomando en cuenta los resultados previos obtenidos en matraces, en

donde se observó que la línea green Uth-3 de Uncaria tomentosa presentaba el

mejor crecimiento con 50 g sacarosa/l se decidió probar el crecimiento de las

células en el biorreactor bajo aquella condición. En la figura 13 se presentan la

34
 cinética de crecimiento y de consumo de sacarosa de el cultivo, en ésta gráfica

no se observa una fase lag. El cultivo presentó dos fases distintas y

subsecuentes de crecimiento: del inicio al día 6 (μ=0.0963 d-1) y del día 6 al día

10 (μ=0.1688 d-1). Al día 10 se observó la producción máxima de células que

corresponde a un valor de 35 g PS/l. El consumo de sacarosa se presentó de

una forma acelerada durante los primeros dos días (qs=1.64 d-1) y después de

este momento el consumo fue gradual (qs=0.92 d-1). El rendimiento (Yx/s) fue de

0.51. La fase de muerte comenzó antes de que se terminara la sacarosa

presente en el caldo.

Figura 13. Cinética de crecimiento y consumo de sacarosa del cultivo de células

de Uncaria tomentosa con 50 g sacarosa/l en biorreactor con un impulsor

de paletas inclinadas. Biomasa en base seca (♦), sacarosa residual (■).Los

puntos presentan los valores promedio y las barras de error presentan la

desviación estándar.

35
 En la figura 14 se presentan los resultados de producción de AOM e

iridoides obtenidos con el cultivo de células de Uncaria tomentosa en un

biorreactor con un impulsor de paletas inclinadas y 50 g de sacarosa/l. En el

panel A se observa que en el día 1desaparecen en el medio de cultivo los

AOM, pero al día 2 se presenta un aumento que alcanzó los 14 μg/g PS y a

medida de que transcurren los días la producción tiende a disminuir quedando

en valores de 5 μg/g PS. El panel B de la misma figura muestra la producción

volumétrica de AOM, en este caso se observa que durante los primeros 6 días,

el perfil de acumulación de AOM es similar al generado por la producción

másica, sin embargo, al día 10 se presenta un aumento considerable que

alcanza un valor de 200 μg de AOM/l, valor obtenido al día 2 del cultivo. Por

otro lado, para los iridoides se observan valores trazas con un máximo de (1

μg/g PS y 11μg/l) que se presenta al inicio del cultivo (día cero) y que tiende a

disminuir a lo largo de la cinética.

36
Figura 14. Cinética de producción de alcaloides (■) e iridoides (▲) con células

suspendidas de Uncaria tomentosa en un biorreactor tipo tanque

agitado con un impulsor de paletas inclinadas con 50 g/l de

sacarosa inicial. Los puntos presentan los valores promedio y las

barras de error presentan la desviación estándar.

37
VI. Discusión

Los resultados del crecimiento de las células de U. tomentosa en

matraces, indica que hasta 50 g sac/l no hubo inhibición por la concentración

de sacarosa (figura 7 A). Podría pensarse entonces que para incrementar la

biomasa en el cultivo, bastaría con seguir añadiendo sacarosa. Sin embargo, el

aumento de sólidos disueltos en el caldo puede traer distintas consecuencias al

cultivo, entre ellas:

Elevar la presión osmótica: el aumento de la presión osmótica puede

provocar que las células pierdan agua y reducir su tamaño, al mismo tiempo

que reducen el volumen de su vacuola, ello puede ser provechoso desde la

perspectiva de la viabilidad celular, ya que al tener una vacuola menor, las

células podrían ser resistentes al estrés hidrodinámico (Rodríguez-Monroy y

Galindo, 2003). El efecto anterior de disminución del tamaño de las células, se

puede observar en el panel B de la figura 7 donde el cociente PF/PS decrece a

medida que la concentración de sacarosa inicial aumenta. Por otro lado, la

presión osmótica interna puede provocar el que se retengan los metabolitos de

interés, como sucede con antocianinas producidas por suspensiones celulares

de Vitis vinifera (Miñano et al., 2004). Es posible que la presión osmótica

también proporcione estrés mecánico a las células, y el estrés es una condición

que suele favorecer la producción de metabolitos secundarios. Sin embargo,

estudios con células de tabaco muestran que la presión osmótica producida por

sacarosa en el medio no provee de un estrés traducible en la producción de

EROS (Kawano et al., 2001); mismo que, en el caso de suspensiones celulares

38
de Uncaria tomentosa, repercute linealmente en la producción de AOM (Trejo-

Tapia et al., 2007).

Deficiencia en el mezclado: un incremento en la cantidad de sacarosa

aumenta la densidad del caldo y ello conlleva a que disminuya el coeficiente de

transferencia volumétrica de oxígeno (kLa) del cultivo (Parente et al., 2004), así

como la solubilidad de otras sustancias, con ello se necesita un mejor

mezclado traducido en un aumento en la velocidad de agitación. Sin embargo,

el rendimiento de biomasa producida sobre sacarosa consumida no presentó

variaciones significativas (ver figura 7 B) que conlleven a suponer que la

sacarosa se encuentra disuelta en proporción menor al aumentar la

concentración de la misma, lo que lleva a pensar que con 110 rpm, es una

velocidad de mezclado eficaz para el cultivo en matraces dentro del intervalo

de concentraciones de sacarosa probado.

Con respecto a la producción de AOM secretados por las células en los

cultivos en matraces, en la figura 9 se observa que éstos aumentan a medida

que se incrementó la concentración de sacarosa inicial en el intervalo de 20 a

40 g sacarosa/l. Con 50 g sacarosa/l, la producción de AOM decrece, es

importante observar que a partir de los 40 g sacarosa/l se presentan iridoides

en cantidades traza en el caldo y aumentan con el incremento de la

concentración de sacarosa a 50 g/l. La estrictosidina es el precursor universal

de los AOM y se produce al unir la secologanina y la triptamina (figura 2) por

medio de la enzima estrictosidina sintasa (Whitmer et al., 1998). El análisis de

los datos obtenidos conduce a pensar que pudiera haber una deficiencia en

39
uno de los precursores de los alcaloides, apuntando a los sustratos de la

estrictosidina sintasa y particularmente de la triptamina cuya presencia no se

detectó en el caldo de cultivo de ninguno de los experimentos de este trabajo.

En el caso de los cultivos en matraces es muy probable que la triptamina haya

sido rápidamente metabolizada para la producción de estrictosidina y al

comenzar a decaer su presencia en las concentraciones de 40 y 50 g/l de

sacarosa inicial, no se pudo producir la estrictosidina y por tanto la loganina

haya quedado fuera de la reacción catalizada por la estrictosidina sintasa. Una

explicación podría fundamentarse en que la triptamina proviene de la

descarboxilación del triptofano por parte de la enzima triptofano descarboxilasa

y la actividad de esta enzima puede verse mermada con altas tasas de

acumulación de AOM (Whitmer et al., 1998).

En el cultivo de células de Uncaria tomentosa en el biorreactor con 20 g/l

de sacarosa inicial se puede observar que el término de la fase exponencial de

su crecimiento (figura 10) coincide con la desaparición de la fuente de la

sacarosa (día 6), es probable que a ello se deba el fin de su crecimiento, así

como el comienzo de su fase de muerte, pues se ha observado que al disminuir

la concentración de sacarosa en el medio, disminuye la respiración celular y

comienzan la autofagia (Contento et al., 2004).

Los datos de producción de EROS en el biorreactor con el impulsor de

paletas inclinadas, señalan que este sistema provee de un menor estrés

hidrodinámico (104 URL/gPS) comparado con el impulsor de 4 paletas

verticales utilizado por Trejo-Tapia (2005), que presentó una producción de

40
EROS de 107 URL/gPS. Recordando que la producción de EROS puede servir

como una medida del estrés generado por un sistema sobre las células,

entonces se puede explicar el porqué con el sólo cambio del impulsor el cultivo

puede incrementar su densidad celular (de 12 g PS/l a 14 g PS/l) y velocidad

de crecimiento (de 0.102 d-1 a 0.1472 d-1). Es interesante mencionar que el

nivel de producción de EROS que sufrieron las células bajo la agitación

proporcionada por el impulsor de paletas inclinadas, es del mismo orden al

generado en los matraces en el estudio de Trejo-Tapia (2005). De esta forma,

podemos establecer que el uso del impulsor de paletas inclinadas es un

sistema de mezclado más apropiado para el crecimiento de las células de

Uncaria tomentosa que ofrece un menor daños (EROS bajas) y es capaz de

soportar un cultivo que crece y produce mejor.

En el experimento posterior donde se realizó el cultivo aumentando la

concentración de sacarosa inicial a 50 g/l (figura 13), se aprecia como en los

primeros 2 días, la sacarosa presente disminuye drásticamente (qs=1.64 d-1).

Sin embargo este consumo acelerado no coincide con un crecimiento

acelerado (μ=0.09 d-1), esto sugiere que en esta etapa las células acumulan la

fuente de carbono en su interior. Posteriormente se presenta una fase de

crecimiento acelerado (μ=0.16 d-1), pero que presenta una velocidad de

asimilación de sacarosa menor (qs=0.92 d-1); lo cual indica que en esta fase las

células utilizan la sacarosa acumulada y la que consumen del medio. Es

importante señalar que el rendimiento de biomasa/sacarosa consumida

obtenido bajo esta condición fue de 0.51 (Cuadro 3). Este valor fue superior al

obtenido con 20 g sacarosa/l (0.37, Cuadro 3), la razón podría explicarse por

41
las diferencias del perfil de crecimiento entre ambas condiciones de cultivo. Es

importante señalar que a pesar de que la sacarosa es un nutriente esencial

para el crecimiento por ser la fuente de carbono, el medio de cultivo se agota

en otros nutrientes (por ejemplo nitrógeno, fósforo, azufre, otros), lo cual podría

ser otra razón para que el cultivo no siga creciendo.

El cuadro 3 presenta los datos de crecimiento de los cultivos de Uncaria

tomentosa y la respectiva producción de metabolitos secundarios, incluyendo

los resultados obtenidos en este trabajo. Se observa que la producción de

biomasa de este trabajo en el biorreactor con un impulsor de paletas inclinadas

con 20 g sacarosa/l supera la producción de biomasa y el rendimiento de AOM

obtenido por Trejo-Tapia et al. (2005) con un impulsor de 4 paletas verticales.

Lo anterior muestra que el hecho de cambiar el impulsor de paletas verticales

(flujo radial) por el de 6 paletas inclinadas (flujo axial) permite incrementar la

densidad celular de un cultivo; esto se puede atribuir a que el patrón de flujo

axial de este impulsor mantiene a las células suspendidas, favoreciendo la

transferencia de masa en el cultivo, además de que genera una condición de

menor estrés hidrodinámico (Doran, 1999, Ortiz, 2004, Flores, 2007).

42
 Cuadro 3. Cultivo de células de Uncaria tomentosa para la producción de AOM

Máxima Edad con mayor

Fenotipo de la Sacarosa AOM (μg/
Sistema densidad Yx/s densidad celular Referencia
línea celular inicial (g/l) gPS)
celular (gPS/l) (días)
32.8 52.2 0.57 15 0 Luna-Palencia et
Albina Matraces
14.7 20.8 0.56 15 10.2 al., 2005
Matraces 12.7 20 0.31 7 0 Trejo-Tapia et al.,
Verde
Biorreactor 11.9 20 0.3 12 16.5 2005
12 20 0.16 10 6
Matraces
24 50 0.36 10 11
Verde Este trabajo
14 20 0.37 6 31
Biorreactor
35 50 0.51 10 14
 El cultivo de Uncaria tomentosa crecido en el biorreactor con la

concentración de 50 g sacarosa/l, comenzó su fase de muerte antes de que se

termine la sacarosa en el medio. Este fenómeno, no se observó con el cultivo

crecido con 20 g de sacarosa/l, lo cual indica que el cultivo no cesó su

crecimiento debido a la falta de sacarosa, si no por algún otro nutriente

limitante.

Está reportado que los cultivos de células vegetales con concentraciones

superiores a los 20 g PS/l presentan problemas de mezclado al aumentar la

viscosidad de los caldos (Scragg, 1995; Flores, 2007). Los resultados de este

trabajo, indican que el mezclado generado con el impulsor de paletas

inclinadas a 400 rpm permite mantener un cultivo de alta densidad (35 g PS/l,

figura 13). Este resultado de desempeño del impulsor de paletas inclinadas

para el mezclado de caldos de células vegetales es consistente con los

reportados previamente para los cultivos de Solanum chrysotrichum (Ortiz,

2004; Flores, 2007). Sin embargo, debe considerarse que los cultivos vegetales

de máxima densidad celular reportados para Coptis japonica alcanzan valores

de 75 g PS/l (Misawa, 1994), en este sentido faltará evaluar el desempeño de

dicho impulsor con caldos más concentrados y por ende con mayor viscosidad.

Al incrementar la sacarosa inicial (20 a 50 g/l) en el biorreactor se logró

incrementar la cantidad de biomasa (de 14 a 35 gPS/l) esperando del mismo

modo incrementar la producción de AOM como sucedió con el trabajo de Luna-

Palencia et al. (2005), sin embargo los resultados muestran lo contrario ya que

se produjo un máximo de 31 μg/gPS con 20 g sac/l y 14 con 50 gsac/l. Lo

44
anterior se puede deber a la presión osmótica debida al aumento de la

concentración de sacarosa (Miñano et al., 2004). Debido a que el pH se

mantuvo constante se descarta la posibilidad de que la solubilidad de

metabolitos oscilara debido a algún cambio en la acidez del medio.

Los resultados de este trabajo referentes a la producción de biomasa

son muy alentadores pues muestran que tanto el aumento de la concentración

inicial de sacarosa, como el uso de un impulsor de paletas inclinadas son una

alternativa para lograr un cultivo de alta densidad con células suspendidas de

Uncaria tomentosa.

La máxima producción de AOM en este trabajo se logró con el

biorreactor con 20 g de sacarosa inicial, logrando 31 μg AOM/gPS al día 2 del

cultivo, lo que casi duplica la producción de Trejo-Tapia (2005) de 16.5 μg

AOM/gPS en el día 18 de el cultivo (Cuadro 3). Lo anterior muestra que tanto

para la producción de biomasa como para la producción de AOM, el impulsor

de paletas inclinadas es una mejor opción que el impulsor de 4 paletas utilizado

por Trejo-Tapia (2005).

45
VII. Conclusión

Los resultados obtenidos demuestran que con el cultivo de células de la

línea green Uth-3 de Uncaria tomentosa a nivel de matraces, el aumento en la

concentración de sacarosa inicial de 20 hasta 50 g/l, permitió generar cultivos

con una concentración celular hasta de 24 g PS/l. Pero la máxima acumulación

de AOM (25 µg/g PS) se presentó con 40 g de sacarosa/l, para 50 g de

sacarosa/l, la biosíntesis de los AOM se ve limitada y aparecen algunos

precursores iridoides.

Mientras que para los cultivos de Uncaria tomentosa en el biorreactor, el

uso de un impulsor de paletas inclinadas resultó adecuado para el mezclado

del cultivo, logrando establecer un cultivo de alta densidad celular (35 g PS/l)

con la concentración de sacarosa inicial de 50 g/l; aunque en dicho cultivo no

se logró, la máxima producción de los AOM (si no solo 14 µg AOM/g PS). Por

el contrario, la mejor producción de AOM (31 µg AOM/ g PS), se logró con la

concentración de sacarosa inicial de 20 g/l.

46
VIII. BIBLIOGRAFÍA CITADA

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