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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS


QUÍMICA DE ALIMENTOS
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

TEMA: Aislamiento, selección y


preservación de cepas Azotobacter spp.
obtenidas de plantaciones de Stevia
Rebaudiana usando melaza como sustrato
para la producción de un biofertilizante.

Realizado por:

• Andrade Ma. José


• Correa Carina
• Cueva Patricia
• Jácome Rafael
• Simba Saskia
• Tufiño Carolina

2009
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ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………… 3

2. OBJETIVOS………………………………………………………………… 4
2.1 General……………………………………………………………… 4
2.2 Específicos………………………………………………………… 4

3. MARCO TEÓRICO………………………………………………………… 4

3.1 Stevia Rebaudiana…………………………………………………… 4


3.2 Biofertilizante………………………………………………………… 4
3.3 Fermentación discontinua…………………………………………… 5
3.4 Factores de crecimiento……………………………………………… 5

3.4.1 Oxígeno……………………………………………………………… 5
3.4.2 Temperatura……………………………………………………….. 5
3.4.3 pH…………………………………………………………………… 5

3.5 Bacterias fijadoras de nitrógeno……………………………………… 5

4. MARCO METODOLÓGICO…………………………………………………… 6

4.1 Muestreo del Suelo ………………………………………………………… 6


4.1.1 Procesamiento de muestras……………………………………… 6
4.1.2 Medición de pH de las muestras del suelo…………………… 7

4.2 AISLAMIENTO………………………………………………………………… 7

4.2.1 Aislamiento primario……………………………………………… 7


4.2.2 Aislamiento secundario…………………………………………… 7
4.2.3 Pigmentación de los aislamientos………………………………. 7

4.3 IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA……………………………………………… 8

4.4 CONSERVACIÓN DE LOS AISLAMIENTOS MEDIANTE LA


TÉCNICA DE CRIO PRESERVACIÓN EN GLICEROL AL 50% (V/V)……… 8

4.5 SELECCIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO………………………………………… 8

4.5.1 Formulación del medio de cultivo alternativo (ca)……………… 9

4.6 PRODUCCIÓN DE BIOFERTILIZANTE A NIVEL DE LABORATORIO…… 9

4.6.1 Reactivación de las cepas bacterianas…………………………… 9


4.6.2 Obtención del pre inóculo…………………………………………… 9
4.6.3 Fermentación discontinua………………………………………… 10

4.7 EVALUACIÓN DEL CRECIMIENTO BACTERIANO………………………… 10

4.7.1 Determinación de la concentración de biomasa……………… 10


4.7.2 Evaluación del consumo de glucosa…………………………… 11
4.7.3 Evaluación de la variación de pH………………………………… 11
4.7.4 Evaluación de la temperatura del caldo de cultivo…………… 11

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4.8 VIABILIDAD DEL PRODUCTO EN CONDICIONES DE LABORATORIO…… 12

4.9 TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS………………………………………………… 12

4.9.1 Tinción gram…………………………………………………………… 12


4.9.2 Prueba de quiste……………………………………………………… 12
4.9.3 Peso seco celular (pcs g/ml)………………………………………… 12

4.10 ANÁLISIS DE DATOS………………………………………………… 12

5. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………… 13

1. INTRODUCCIÓN

En la Universidad Javeriana se realizó una investigación sobre el aislamiento de bacterias fijadoras


de nitrógeno para emplearlas en un programa de fertilización bajo un esquema de agricultura
orgánica. El aislamiento se realizó a partir del suelo de un cultivo de Stevia Reubaudiana. La
bacteria encontrada fue Azotobacter y su rendimiento se determinó con base en la producción de
biomasa y concentración de glucósidos en la planta presentando mejor estabilidad, pigmentación,
mayor velocidad de crecimiento 0,1405 h-1 fase exponencial de 18 horas y una producción de A/A
promedio de 38,4 mg/ml a las 150 horas. [1]

En la India se realizaron estudios para comparar un fertilizante químico y un biofertilizante en una


plantación de Stevia, mediante mediciones de fósforo soluble con bacterias de Azospirillum, y los
resultados demuestran una eficiencia incrementando la producción de biomasa en un 53,20%. La
química inorgánica del biofertilizante cambio favoreciendo el crecimiento mas no se demostró el
aumento de glucósidos en la planta. [2]

El Azotobacter es el género que ha demostrado tener el rendimiento de absorción más alto


(72.64%) a nivel de la rizosfera comparado con microorganismos como Azospirillum brasilense y
Rhizobium analizados también para la elaboración de biofertilizantes, fijan aproximadamente 20
mg N/g de azúcar en un cultivo de Stevia en medio libre de nitrógeno, siendo una gran fuente para
obtener un biofertilizante natural reduciendo el uso de los fertilizantes químicos nitrogenados,
tienen mayor velocidad de crecimiento que otras cepas aisladas de cultivos diferentes ofreciendo
una mayor productividad.

El azotobacter produce fitohormonas (ácido indolacético y citoquininas) capaces de acelerar y


potenciar el crecimiento de las plantas; promueve la formación de sideróforos, sustancias
antifúngicas y genera enzimas que favorecen a la solubilización de fosfatos y oligoelementos
facilitando la asimilación de estos compuestos.

El uso de fertilizantes químicos constituye un daño biológico a los suelos deteriorando la calidad
de los mismos: inducen el aumento de acidez y salinidad eliminando el humus y suavizando los
tejidos de la planta provocando que ésta sea menos resistente y saludable, eliminan el ecosistema
natural de suelo desarrollando plantas más vulnerables.

La tierra se hace dependiente a los químicos incrementando los daños al suelo y los costos de
fertilización. Actualmente un fertilizante químico nitrogenado se comercializa en $380 por sacos de
19Kg, este costo es alto por la energía que se utiliza para su elaboración. a

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El objetivo de la presente investigación es realizar el aislamiento de una cepa fijadora de nitrógeno,
Azotobacter, que pueda ser empleada para la producción de un biofertilizante en el cultivo de
Stevia rebaudiana, mediante fermentación discontinua.

a. 33.5 MBtu  1 T amoniaco anhidro.


Costo de 1MBtu = 2.20 a 5.00 USD
Costo de 1 T amoniaco anhidro = 200 USD

2. OBJETIVOS

2.1 General

Aislar, seleccionar y preservar cepas Azotobacter spp. obtenidas de


plantaciones de Stevia Rebaudiana usando melaza como sustrato para la
producción de un biofertilizante.

2.2 Específico

• Aislar cepas de Azotobacter spp de muestras de cultivos de Stevia


Rebaudiana proveniente de la agrícola El Edén, en el agar ashby.

• Seleccionar las mejores cepas de Azotobacter spp degradadoras de


melaza utilizando como parámetro de medición el peso seco.

• Preservar cepas de Azotobacter spp en caldo BHI por la técnica del


criovial.

• Evaluar el crecimiento de Azotobacter spp en caldo pikovskaya


modificado y caldo alternativo con melaza y establecer el más
adecuado para una producción a nivel industrial.

• Producir biomasa de la cepa escogida de Azotobacter spp ofreciéndoles


las condiciones óptimas para su crecimiento.

• Controlar el desarrollo del bioproceso mediante los parámetros: pH,


temperatura y concentración de oxígeno.

3. MARCO TEÓRICO

3.1 Stevia Rebaudiana

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Es un género de plantas fanerógamas perteneciente a la familia de las asteráceas.
Son hierbas y arbustos de la familia del girasol (Asteraceae), nativa de regiones subtropicales y
tropicales de América del Sur y América Central. La especie Stevia rebaudiana Bertoni, conocida
comúnmente como dulce hoja, o, simplemente, stevia, es ampliamente cultivada por sus hojas
dulces. Como un sustituto del azúcar.

3.2 Biofertilizante

Los biofertilizantes se caracterizan por la presencia de microorganismos vivos que no causan daño
o enfermedad al hombre, a los animales ni a las plantas. Pueden emplearse bacterias u hongos
microscópicos, llamados micorrízicos, que se asocian en forma natural con las raíces de las
plantas, beneficiando su crecimiento y el rendimiento de los cultivos.
Los microorganismos contribuyen con el crecimiento de las plantas y el rendimiento de los cultivos,
pero para que éstos sean beneficiados es indispensable que las bacterias u hongos se encuentren
vivos. El biofertilizante debe contener varios millones de bacterias por gramo de soporte sólido o
por mililitro, en caso de ser acuoso. Una vez que la semilla germina y las raíces empiezan a
desarrollarse, las bacterias se multiplicarán y colonizarán la superficie de las raíces y promoverán
el crecimiento de las plantas.

3.3 Fermentación discontinua

Una fermentación discontinua (en batch) puede ser considerada como un "sistema cerrado". Al
inicio de la operación se añade la solución esterilizada de nutrientes y se inocula con el
microorganismo, permitiendo que se lleve a cabo la incubación en condiciones óptimas de
fermentación. A lo largo de toda la fermentación no se añade nada, excepto oxígeno (en forma de
aire), un agente antiespumante y ácidos o bases para controlar el pH. La composición del medio de
cultivo, la concentración de la biomasa y la concentración de metabolitos cambia generalmente
como resultado del metabolismo de las células observándose las cuatro fases típicas de
crecimiento: fase de latencia, fase logarítmica, fase estacionaria y fase de muerte.
En los procesos comerciales la fermentación frecuentemente se interrumpe al final de la fase
logarítmica (metabolitos primarios) o antes de que comience la fase de muerte (metabolitos
secundarios).

3.4 Factores de crecimiento:

3.4.1 Oxígeno

El oxígeno es el sustrato gaseoso más importante para el metabolismo microbiano y el anhídrido


carbónico es el producto metabólico más importante. El oxígeno no es un gas muy soluble ya que
una solución saturada de oxígeno contiene aproximadamente 9 mg / L de este gas en agua.
Debido a la influencia de los ingredientes del cultivo, el contenido máximo de oxígeno realmente es
más bajo de lo que debería ser en agua pura. El suministro se logra pulverizando aire en el
fermentador durante el proceso.
Una vez disuelto el O2 éste tiene que transferirse desde la burbuja de gas a cada célula individual.

3.4.2 Temperatura

Los microorganismos que crecen a una temperatura inferior a la óptima tienen retardado su
crecimiento y por lo tanto reducida la producción celular, es decir su productividad. Por otro lado, si
la temperatura es demasiado alta, pero no letal, se puede inducir una respuesta de estrés al
choque térmico con la consiguiente producción de proteasas celulares que ocasionan una
disminución en el rendimiento de los productos proteicos.

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3.4.3 pH

La mayor parte de los microorganismos crecen óptimamente entre pH 5,5 y 8,5. Pero durante el
crecimiento en un fermentador, los metabolitos celulares son liberados al medio, lo que puede
originar un cambio del pH del medio de cultivo. Por lo tanto se debe controlar el pH del medio de
cultivo y añadir un ácido o una base cuando se necesite para mantener constante el pH. Por
supuesto que esta adición del ácido o base debe ser mezclada rápidamente de tal manera que el
pH del medio de cultivo sea el mismo en todo el fermentador.

3.5 Bacterias fijadoras de nitrógeno

Las bacterias fijadoras de nitrógeno son componentes muy importantes del suelo. Para desarrollar
la fertilidad del suelo, debe aumentar el contenido de nitrógeno. En las condiciones
medioambientales adecuadas, las bacterias fijadoras de nitrógeno producen enzimas que toman el
nitrógeno en su forma gaseosa de la atmósfera, y, con los azúcares que obtienen de la planta, fijan
el nitrógeno dentro de la biomasa bacteriana. Si las bacterias satisfacen sus necesidades de
nitrógeno, entonces, el nitrógeno pasa a la planta, y pueden observarse niveles elevados de
proteína en la planta. Este nitrógeno elevado no se libera al suelo hasta que muere parte de la
planta, o se exuda al suelo en la rizósfera.
Se dividen en dos grandes grupos: las simbióticas especificas de las leguminosas como el
Rhizobium y las libres que viven en el suelo y no necesitan la planta para su reproducción como el
Azotobacter y el Azospirillum, entre los más importantes en agricultura.

El Azotobacter y el Azospirillum, en concentraciones adecuadas, pueden sustituir al nitrógeno


químico (urea, amoníaco) sin disminuir la producción y a menor coste.

Otras ventajas comprobadas del uso de estas bacterias como biofertilizante son:

a) Producen fitohormonas, como el ácido indolacètico y las citoquininas, capaces de acelerar y


potenciar el crecimiento de las plantas.
b) Al permanecer vivas durante años y reproducirse en el suelo, no sólo no lo degradan sino que
contribuyen a su enriquecimiento en nitrógeno y a su regeneración de forma ecológica y gradual,
incluso en terrenos de alta concentración salina.
c) Se ha comprobado que fertilizando los cultivos con estas bacterias y con nitrógeno químico en
un porcentaje entre el 20 y 50% del utilizado normalmente, se consigue un aumento de producción
sobre las cosechas obtenidas únicamente con fertilizante químico al 100%. Esto es debido a que,
al liberarse la bacteria de su función fijadora de nitrógeno, produce más factores de crecimiento
vegetal, En cereales de secano, esto puede suponer el ahorro del abonado de cobertera.
d) Crea una barrera protectora contra hongos y bacterias patógenas en la raíz de la planta, por lo
que ésta crece más sana y fortalecida.
e) Producen enzimas que solubilizan los fosfatos y los hacen más accesibles a la planta, así como
factores que facilitan la absorción de oligoelementos.
f) Se ha demostrado que resisten mejor las condiciones de sequía y los climas áridos ya que se
forman alginatos en las raíces de las plantas.
g) Como consecuencia de todo lo anterior, es un mayor desarrollo de las raíces de las plantas, con
el consiguiente beneficio general para ésta, así como el peso de los frutos.
h) También se ha comprobado un mayor índice de germinación de semillas comparada con otros
sistemas de abonado.
i) Las nuevas estirpes de Azotobacter y Azospirillum son capaces de fijar un 72,64% más de
nitrógeno atmosférico, que las estirpes originales.

Hay pues un cúmulo de ventajas para el usuario, económicas, ecológicas, A corto, medio y largo
plazo en la progresiva sustitución de la fertilización química por las bacterias naturales, totalmente
inofensivas para el medio y el ser humano.

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La N2 + 16 ATP + 8e-+ 8H+ nitrogenasa 2NH3 + 8H2 + 16 ADP+ 16 P

4. MARCO METODOLÓGICO

4.1 MUESTREO DEL SUELO

De cada cultivo de Stevia se toman cinco muestras de 500g a una profundidad de 10 a 15 cm, el
muestreo se realiza en forma de zig –zag a lo largo del cultivo.
Las muestras se empacan en bolsas de papel que se colocan dentro de bolsas de plásticos
herméticas y posteriormente se transportan en coolers.

4.1.1 Procesamiento de muestras


Una vez en el laboratorio, las muestras de suelo se tamizan en un tamiz estándar de 4.75 mm, con
el fin de obtener gránulos uniformes, para realizar el aislamiento primario.

4.1.2 Medición de pH de las muestras del suelo

La medición del pH se realizan siguiendo el protocolo descrito por Van Lierop, 1981; se coloca en
un frasco de vidrio limpio suelo tamizado y agua destilada en proporción 1:1 p/v. Posteriormente, la
suspensión se deja precipitar durante 5 min y se toma el valor de pH del sobrenadante con un
potenciómetro. Los valores de pH del sobrenadante a partir de cuatro mediciones en cada cultivo.

4.2 AISLAMIENTO

4.2.1 Aislamiento primario

A partir de cada muestra de suelo obtenida en los diferentes cultivos, se realiza el aislamiento
primario por triplicado, empleando la técnica de gránulos de suelo; que consiste en colocar 20
gránulos en cajas de Agar Ashby – Sacarosa (medio especifico para Azotobacter spp) a una
distancia aproximada de 1 cm. Las cajas se incuban a 28°C por 7 días hasta observar alrededor de
los gránulos colonias translucidas y mucilaginosas. Se realiza el recuento de gránulos con colonias,
con el fin de obtener el porcentaje de recuperación de bacterias diazótrofas aerobias asimbioticas
para cada cultivo (% de recuperación = No. de gránulos con colonias mucilaginosas/total de
gránulos sembrados x100) y se realiza coloración de gram.

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A) Siembra de gránulos en agar Ashby
B) Gránulos mucilaginosos después de la incubación

4.2.2 Aislamiento secundario

El aislamiento secundario se realiza mediante siembra por agotamiento en cajas con Agar Ashby –
Sacarosa a partir de las colonias obtenidas en el aislamiento primario. Las cajas son incubadas por
7 días a 28°C, posteriormente se observa el crecimiento en el medio selectivo Ashby – Sacarosa,
la morfología de la colonia y de las células por medio de la coloración de Gram. Las cepas aisladas
que presenten crecimiento en el segundo aislamiento se codifican de acuerdo al cultivo de donde
fueron aisladas.

4.2.3 Pigmentación de los aislamientos

Con el fin de observar la producción de pigmentos en medio solido, de cada aislamiento se realiza
una siembra en agar diferencial Ashby con 5 g/l de benzoato, remplazando la fuente de carbono
(sacarosa) en cajas petri para observar la pigmentación en las colonias. La siembra se realiza
tomando una colonia de cada aislamiento y realizando una estría en toda la caja, se incuba a 28°C
por 7 días y se observa pigmentación.

Siembra en estria en agar Ashby con benzoato

4.3 IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA

A cada aislamiento se le realiza una caracterización con base en el comportamiento bioquímico


frente a la fermentación de glucosa, maltosa, manitol y ramnosa también se realiza una prueba de
asimilación y crecimiento en benzoato como fuente de carbono, test de catalasa, oxidasa y
desnitrificación en caldo nitrato. La bacteria de azucares se siembra con una colonia de cada cepa,
se lleva a incubar a 28°C por 24 horas. Posteriormente se verifica la acidificación del medio como
indicativo de la fermentación de azúcares y benzoato. Finalmente se realiza la prueba de Nessler
para determinar la desnitrificación, y las pruebas de catalasa y oxidasa a partir de las colonias.
Todas las pruebas bioquímicas se realizaron por triplicado.

Baterias bioquímicas de azúcares sin sembrar.

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A) Baterias bioquímicas servidas en placas de 24 pozos
B) Baterias bioquímicas servidas en tubos de 13 * 100

4.4 CONSERVACIÓN DE LOS AISLAMIENTOS MEDIANTE LA TÉCNICA DE CRIO


PRESERVACIÓN EN GLICEROL AL 50% (V/V)

A partir de las cepas aisladas y evaluadas se realizan cultivos en erlenmeyer de 100 ml con 50 ml
de caldo nutritivo, el cual se incuba a 28°C por 24 Horas con agitación de 150 rpm. El cultivo se
deposita en 10 viales de 1.5 ml de 50 % V/V de glicerol puro estéril. Luego se mantiene en
congelación a -80°C.

4.5 SELECCIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO

En el caso de Azotobacter, existen una variedad de medio de cultivo químicamente definidos,


recomendados por la literatura entre ellos se encuentra además del Agar Ashby el caldo
Pikovskaya modificado; sin embargo, el medio de cultivo que se utilice en la fermentación no solo
debe cumplir con las necesidades nutritivas del microorganismos en cuestión, sino también con las
exigencias del proceso de producción (costo y eficiencia) del mismo.
El caldo Ashby es un medio de cultivo selectivo para Azotobacter debido a que no contiene
nitrógeno. Su ventaja es que al ser un medio selectivo el crecimiento es lento, es observable a
partir de los 3 – 5 días de realizada la siembra lo que implica un mayor gasto de energía para la
producción.
El caldo Pikovskaya modificado es un medio no selectivo pero permite el crecimiento rápido de las
bacterias y requiere un gasto de energía menor
En ambos casos se necesitan reactivos químicos que implican un costo alto adecuado solo para
producciones pequeñas a escala de laboratorio, por este motivo se formula un medio de cultivo
alternativo a base de melaza tomando al caldo Pikovskaya modificado como patrón.

4.5.1 Formulación del medio de cultivo alternativo (ca)

Se partió de un estudio químico de la composición de la melaza y se procedió a sustituir los


componentes del medio químicamente definido (CPM), por el medio natural, que constituye un
medio adecuado para el crecimiento de microorganismos.
Se toma como base la fuente de carbohidratos y proteínas (carbono y nitrógeno), garantizando el
contenido requerido por la bacteria, según el caldo Pikovskaya modificado.
Una vez obtenida la concentración teórica de melaza necesaria para sustituir los componentes del
medio químico se realizan pruebas de crecimiento a nivel laboratorio, para ello se siembran cepas
de Azotobacter spp en CA sólido utilizando concentraciones menores y mayores a la obtenida
teóricamente. Las siembras se realizan por triplicado.

4.6 PRODUCCIÓN DE BIOFERTILIZANTE A NIVEL DE LABORATORIO

4.6.1 Reactivación de las cepas bacterianas

Para reactivar a las bacterias se utiliza el caldo Pikosvskaya modificado liquido, ideal para el
crecimiento de Azotobacter spp. El caldo correctamente preparado se vierte en tubos de ensayo (5
ml/tubo) y se esteriliza. Luego se inocula cada tubo con la cepa madre bajo condiciones de
esterilidad y se incuba a 30°C por 24 horas.

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4.6.2 Obtención del pre inóculo

Para la preparación del pre inoculó se toman en cuenta los siguientes requisitos:

1.- El cultivo debe estar metabólicamente activo y libre de contaminantes. Para ello se trabaja bajo
normas estrictas de esterilidad y se realiza un control permanente de cultivo mediante la
observación directa al microscopio de las características del microorganismo utilizando técnicas
microbiológicas.

2.- El inoculo debe estar en su fase exponencial (grado máximo de desarrollo). Para ello se evalúa
el crecimiento bacteriano durante 30 horas que es el tiempo estimado que tarda en alcanzar la fase
exponencial. Se procura obtener preinóculos con una concentración de biomasa del orden de 108-
109 células/ml.

3.- Se debe disponer de una cantidad de cultivo suficiente para inocular el volumen de medio
liquido a utilizar en la fermentación, el cual debe estar entre el 3 – 10 % del volumen total a
fermentar. En este caso se trabaja con un volumen equivalente al 10% del volumen total a
fermentar.

Procedimiento

Con las cepas reactivadas anteriormente se realiza un pool bacteriano. 10 ml de pool se inoculan
en 90 ml de caldo Pikovskaya modificado (10% de volumen total a fermentar) y otros 10 ml en 90
ml de caldo alternativo, obteniéndose un volumen final de 100 ml de cultivo por cada caldo de
fermentación. Posteriormente se incuban a 30°C por 24 horas y 150 rpm en matraces de 250 ml.

4.6.3 Fermentación discontinua

Una vez obtenidos los preinóculos, estos se inoculan en 900 ml de CPM y 900 de CA. Luego son
incubados a una temperatura promedio de 28°C por 72 horas. El oxigeno se suministra utilizando
un aireador para pecera con un flujo de aire aproximado de 1 m3 /h en matraces de 2000 ml.

El esquema del proceso global de producción de Azotobacter spp a nivel de laboratorio

Inócul

Preinócu
O CO
10ml 100
1000ml de
biofertilizant
e

Cepas 90 ml de caldo de 90 ml de caldo de


reactivad cultivo. Se incuban cultivo. Se incuban
as. con agitación de con aireación aprox.
150 rpm a 30 ºC De 1 m3 / h a 28ºC
por 24 horas en un por 72 Horas
matraz de 250 ml.
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4.7 EVALUACIÓN DEL CRECIMIENTO BACTERIANO

Se ha realizan una serie de corridas cinéticas en las que se evalúa la variación de pH, la
temperatura del caldo de cultivo y la concentración de biomasa. Además se evalúa el consumo de
sustrato en CPM con lo que se puede obtener las variaciones cinéticas de crecimiento. Las
muestras se toman casa tres horas durante las 72 horas que dura la fermentación. Este
procedimiento se realiza tres veces.

4.7.1 Determinación de la concentración de biomasa

Se utiliza la técnica de determinación de biomasa por densidad óptica para el CPM y la


determinación del Peso seco para el CA, debido a que por el color de la melaza es imposible de
medir la absorbancia. Además se realizan conteos de colonias en caja para determinar las
unidades formadores de colonias por litro.
Se mide la absorbancia de cada muestra a 540 nm y luego se obtiene la concentración de biomasa
en gramos por litro utilizando la curva de calibración de absorbancia en función de peso seco para
Azotobacter. Se utiliza medio estéril como blanco.
Para el conteo de bacterias en caja se realizan diluciones de 10-1 a 10-9 y se siembran en CPM
sólido. Cada dilución se realiza por duplicado.

4.7.2 Evaluación del consumo de glucosa

Para determinar el uso de glucosa se utilizo la técnica de DNS que se basa en el uso de 3,5 –
dinitrosalicilico para provocar la oxidación de los azucares y, al mismo tiempo, se propia reducción,
desarrollándose la siguiente reacción:

Según lo anterior, una mole de azúcar reacciona con una mol de acido dinitrosalicilico, dando lugar
a una relación estequiométrica que permite conocer cantidad de azucares reductores presentes en
la muestra. Esta reacción además puede ser leída fácilmente al espectrofotómetro ya que da lugar
a una reacción colometricas el acido 3,5 – dinitrosalicilico de color amarillo cambia al acido 3 –
amino, 5 – nitro salicílico de un color pardo oscuro – marrón, cuya intensidad es proporcional a la
cantidad de azucares reductores

Procedimiento

Se centrifuga cada muestra por 10 min a 5000rpm. Posteriormente se recupera el sobrenadante en


tubos limpios. Se preparan tubos de ensayos forrados con aluminio para proteger de la luz y se
coloca 0.25 ml de sobrenadante con 0.25 ml de reactivo 3,5 DNS en cada uno. Además se prepara
un blanco al que se le coloca únicamente el reactivo. Se llevaron los tubos a ebullición por 5
minutos y posteriormente se frena la reacción con hielo. Finalmente se agregan 2.25ml de agua
destilada en cada tubo y se lee la absorbancia a 546 nm ajustando a cero con el blanco. El blanco
se coloca 2.75 ml de agua para completar el volumen.
Se utiliza la curva de calibración de absorbancia en función de glucosa para obtener concentración
residual de sustrato en gramos por litro.

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4.7.3 Evaluación de la variación de pH

De cada muestra tomada se mide el pH para determinar la variación del mismo durante la
fermentación, para ello se utilizo un potenciómetro previamente calibrado.

4.7.4 Evaluación de la temperatura del caldo de cultivo

La temperatura del caldo de cultivo se mide durante todo el proceso de producción del
biofertilizante utilizando para ello un termómetro acoplado al equipo de fermentación.

4.8 VIABILIDAD DEL PRODUCTO EN CONDICIONES DE LABORATORIO

Para determinar la viabilidad del producto se almaceno el producto terminado en envases plásticos
cerrados y se los coloca en refrigeración (4ºC) bajo condiciones higiénicas para evitar la
contaminación
Cada semana se evalúa el estado del producto mediante observación directa al microscopio. Se
evalúa la población microbiana, la actividad y la contaminación por un periodo establecido de
tiempo. Además se deben realizar conteos de colonias en caja con el medio Ashby como medio de
cultivo selectivo

4.9 TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

4.9.1 Tinción gram

- Se preparan frotis del cultivo. Se secan al aire y se fijan al calor.


- Se cubre el frotis con el reactivo cristal violeta durante un minuto.
- Se lava el frotis con agua durante 5 segundos, y luego se aplica el reactivo yodo de Lugol durante
un minuto.
- Se lava y se aplica el decolorante.
- Se lava y se cubre con el reactivo de Safranina durante 30 segundos.
- Se lava, se seca y se coloca en el microscopio.

4.9.2 Prueba de quiste

- Se coloca un asa del cultivo en un portaobjetos, emulsionado con agua estéril


- Se agrega una o dos gotas de Yodo Lugol y se fija al aire.
- Se coloca al microscopio con aceite de inmersión.

4.9.3 Peso seco celular (pcs g/ml)

- Se toma 5 ml de cada dilución y de elimina en el horno el sobrenadante.


- Se pesa la biomasa seca y se obtiene el PCS en gr/ml.

5. BIBLIOGRAFÍA

12
• [1]http://www.javeriana.edu.co/universitas_scientiarum/articulos/produccion_biofertilizante.p
df
• [2]
http://www.nobelonline.net/UserFiles/File/7kdas.pdf

• [3] http://nostoc.usal.es/sefin/MI/tema12MI.html

• [4]http://www.google.com.ec/search?
hl=es&rlz=1R2ADBF_es&q=bacterias+fijadoras+de+nitrogeno&meta=&aq=0&oq=bacterias
+fijadoras

• [5]
http://jb.asm.org/cgi/reprint/77/1/86.pdf

• ¨Interacción rhizobium/Azosoirllumrhizobium/azotobacter” en línea


http //www.edumicro.usual.es/sefin/rodelas.html
• Espin,gbiología de azotobacter vinelandi Instituto de biotecnología UNAM
en línea http:
//www.microbiología.org.mx/microbiosenlínea/capitulo_09/capitulo09.pdf
• Guiar2001”biofertilzantes” en línea:
http//coli.usual.es/web/educativo/biotec_microb/temas/29RubenIGlesiasG
arcia.pdf
• IAB Centro de investigaciones y aplicaciones
biotecnologías2001”biofertilizantes” Valencia España en línea:
http//www.iabiotec.com/respuestas.htm.

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