2020

Profesorado de Educación Secundaria en Biología

Profesora:

Alumno:

[Escriba aquí]
 [1]

E.D.I. BIOTECNOLOGIA

FUNDAMENTOS DE LA BIOTECNOLOGÍA

LABORATORIO VIRTUAL

1) Extracción de ADN (DNA extraction):

Indique:

a- Tipo de muestra analizada

Se analiza un frotis de mejilla y extraer ADN de células humanas.
b- Materiales necesarios
 Baño de agua tibia
 Centrífuga
 Micropipetas
 Hisopo bucal
 Tubos de muestra
 Solución de lisis (Lisis celular por tratamiento con detergentes)
 Solución salina concentrada
 Tampón de resuspención
 Etanol
 Alcohol isopropílico
c- Detalle los pasos de la técnica
a. Recolectar muestras del sujeto de prueba, mediante el uso de un hisopo, se toman
muestras del interior de la boca. Arrastrar el hisopo hacia el interior para recolectar
las muestras.
b. A continuación se colocará la cabeza del hisopo, dentro de un tubo de muestra.
c. Mediante el uso de la micropipeta, se agrega un poco de solución de lisis al tubo.
d. Colocar el tubo en el baño de agua tibia.
e. Pasado un tiempo prudencial, se extrae el hispo del tubo y se le agrega al mismo
la solución salina concentrada.
f. Se coloca el tubo en la centrífuga. Para equilibrarla se coloca en la parte del frente
un tubo con agua, se cierra y se hace funcionar la centrífuga. (giran a alta
velocidad).Este paso hace que las proteínas y desechos se hundan hasta el fondo y
las hebras de ADN, permanecen distribuidas a través del líquido.
g. Se retira el líquido mediante el uso de una micropipeta y se lo coloca en un tubo
limpio.
h. Se le agrega a este último, el alcohol isopropílico. Se mezcla el tubo varias veces
con la mano, para lograr mezclar el alcohol isopropílico con la solución de ADN
i. Se coloca el tubo en la centrífuga, se cierra y enciende, después de que este gire,
el ADN se hunde al fondo del tubo.
j. Se retira el líquido del tubo, y se deja secar el ADN, pudiendo el mismo ser
congelado para futuros estudios y ser disuelto en la solución que se elija.
 [2]

d- ¿Qué contiene la solución de lisis? Explique la función de cada componente.

Lisis, proviene del griego y significa separar. La solución de lisis, contiene dos ingredientes:
 Detergente, que interrumpe la membrana celular y envoltura nuclear, para
liberar el ADN.
 Enzima Proteinasa K, separa las histonas para liberar el ADN.

e- ¿Cuál es la función de la solución concentrada de sales?

La concentración salina, hace que las proteínas y otros desechos celulares se agrupen.
f- ¿Cuál es la función del isopropanol?
El ADN no es soluble en el alcohol isopropílico, permitiendo ver el aglutinamiento de ADN.

2) Electroforesis en gel (Gel electrophoresis):

a- Explique el fundamento y describa los pasos dela técnica de electrofories de ADN. ¿Para
qué sirve?

La electroforesis es una técnica utilizada para separar el ADN, el ARN, o moléculas o proteínas
en base a su tamaño y carga eléctrica. Se utiliza una corriente eléctrica para mover las moléculas
y que se separen a través de un gel. Los poros del gel actúan como un colador, permitiendo que
las moléculas más pequeñas se muevan más rápido que las grandes. Las condiciones utilizadas
durante la electroforesis se pueden ajustar para separar moléculas en el rango de tamaño que
se desee.

b- Detalle los materiales necesarios

 Agarosa
 Matraz
 Molde para el gel
 Peine para el molde
 Tampón químico (solución)
 Microondas
 Pipetas
 Puntas de pipetas
 Caja de electroforesis

c- ¿Qué son los primers y que función cumplen?

Primers, es una cadena de ácido nucleico o de una molécula relacionada que sirve como punto
de partida para la replicación del ADN.

Es una secuencia corta que contiene un grupo 3'hidroxilo libre, que forma pares de bases
complementarios a una hebra molde y actúa como punto de inicio para la adición de nucleótidos
con el fin de copiar la hebra molde.

La secuencia y posición de los nucleótidos que conforman el primer se relaciona directamente

con la especificidad del fragmento de DNA que se intenta replicar.

Se necesitan dos primers para la reacción de PCR, uno en el extremo 3' y el otro complementario
para la otra hebra y se componen de aproximadamente 20 nucleótidos
 [3]

d- ¿A qué se llama secuencia target?

La secuenciación del ADN significa determinar el orden de los cuatro componentes básicos
químicos, llamados "bases", que forman la molécula de ADN.

En la doble hélice de ADN, las cuatro bases químicas se unen siempre con la misma pareja para
formar "pares de bases". Adenina (A) siempre forma pareja con timina (T); citosina (C) siempre
forma pareja con guanina (G). Este emparejamiento es la base para el mecanismo mediante el
que las moléculas de ADN se copian cuando las células se dividen, y también es la base para los
métodos usados en la mayoría de los experimentos de secuenciación de ADN.

3) PCR:

a- Indique los ciclos de temperaturas en un termociclador y que ocurre en cada paso.

Desnaturalización. Se conseguiría elevando la temperatura del tubo de reacción hasta 95oC. La

doble hélice de ADN se separa en dos hebras.

Alineamiento. Se desciende la temperatura hasta una temperatura que puede oscilar entre
40 oC y 60 oC (dependiendo de diversos parámetros como la secuencia de los primers, su
especificidad). Los cebadores se unen a las zonas 3´ complementarias que flanquean el
fragmento que queremos amplificar.

Extensión. Se vuelve a aumentar la temperatura hasta los 72 oC y se deja actuar a la Taq

polimerasa. Se produce la síntesis de una cadena sencilla (produciéndose un fragmento de doble
cadena por la complementariedad) en la dirección 5´-> 3´ mediante la enzima DNA polimerasa,
la cual incorpora los deoxinucleótidos fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena molde.

Al cabo del primer ciclo de tres reacciones (desnaturalización, apareamiento, extensión) el

tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad original se encuentra disponible
para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo. El resultado de la aplicación de numerosos
ciclos "en cadena" da lugar a la amplificación geométrica del segmento de ADN delimitado por
los primers

A continuación la secuencia detallada según el simulador

Ciclo 1

Dentro del tubo de PCR, el cuclillo uno ha comenzado. El termociclador se calienta hasta 95°C,
lo que es casi como si estuviera hirviendo. A esta temperatura, la doble hélice de ADN se separa,
creando dos moléculas de ADN de cadena simple

50°

Ahora el termociclador se enfría hasta los 50°C.

A esta temperatura, las moléculas de ADN de una sola hebra intentan emparejarse de forma
natural. Más allá, hay muchas más secuencias primarias que las cadenas de ADN en el tubo. Los
cebadores se amontonan y se fijan en su objetivo antes de que las hebras se vuelvan a juntar...
 [4]

72°

El termociclador cambia ahora la temperatura a 72°C, lo que activa la polimerasa de ADN.

Cuando la polimerasa de ADN localiza un cebador unido a una sola cadena de ADN, comienza a
añadir nucleótidos complementarios a la cadena, y continúa hasta que llega al final de la cadena
y se cae.

El ciclo uno está completo

95°C

Ciclo 2

Los mismos tres pasos ocurren en el ciclo dos la temperatura se eleva de nuevo para separar las
cadenas de ADN

50°C

La temperatura se reduce para que los cebadores se adhieran

72°C

Y la temperatura se eleva de nuevo ligeramente para simular la polimerasa de ADN para copiar
la hebra.

Ciclo 3

72°C

Durante el ciclo 3, los productos deseados empiezan a aparecer. 2 filamentos que empiezan con
el Primer 1 y terminan con el Primer 2. Estas son copias de ADN de sólo el segmento de ADN al
que te has dirigido. Aunque sólo hay dos fragmentos deseados en esta etapa, a medida que
continúen con los ciclos, estos productos se convertirán rápidamente en la mayoría.

Ciclo 4

72°C

Al final del ciclo 4 se obtienen 8 fragmentos que contienen sólo la secuencia del objetivo

95°C

Ciclo 5

72°C

Ahora hay veintidós fragmentos que contienen sólo la secuencia del objetivo y sólo diez copias
de mayor longitud.
 [5]

.....

Ciclo 30

Después de treinta ciclos hay más de mil millones de fragmentos que contienen sólo su
secuencia objetivo y sólo sesenta copias de las moléculas de mayor longitud. Ahora hay una
solución de secuencia objetivo casi pura