Post Laboratorio #4

Alumno:
Jeisson Estiven Micelly Moreno

Docente:
María Fernanda Garcés Gutiérrez

Genética humana
Grupo: C
Bacteriología y Laboratorio Clínico
Facultad de ciencias de la salud
Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca
Bogotá, 2021
1. Describa el protocolo para obtener cromosomas de un cultivo de un animal o planta

Cultivo Animal
1. Obtener una muestra de sangre humana (3-5 mL) con una jeringa estéril y
heparinizada.
2. Vaciar en un tubo de 15 mL, que sea estéril y este etiquetado las soluciones en el
siguiente orden:
a. 2,5 mL de Medio Mc Coy 5ª
b. 0.16 mL de Fito hemaglutinina
c. 0.016 mL de antibiótico
d. 3 mL de sangre completa
e. Cerrar el tubo y homogenizar suavemente la mezcla.

3. Incubar el tubo a 37°C por 72 – 96 h máximo para realizar el cultivo celular.

4. Entre una y tres horas antes del término del tiempo de incubación se debe añadir 2
mL o 4 gotas de colchicina para así detener las divisiones celulares en metafase
evitando la formación del huso mitótico.
5. Una vez que ha transcurrido la hora, se debe centrifugar el tubo de cultivo a 1500 rpm
durante 10 min y una vez terminado se debe eliminar el sobrenadante.
6. Se debe añadir próximamente la solución hipotónica de KCl al 0.4 % o 0.075 M hasta
llegar a 10 mL y se incuba durante 30 minutos.
7. Transcurrido este tiempo se debe centrifugar nuevamente a 1500 rpm por 10 minutos
y eliminar el sobrenadante.
8. Posterior a esto, se añade una alícuota de solución fijadora ( metanol : ácido acético
3:1) hasta llegar a un volumen final de 10 mL y se centrifuga a 1500 rpm por 10
minutos posterior a esto eliminar el sobrenadante.
9. Se repite el paso número 8.
10. Se debe colocar un botón celular sobre una lamina portaobjetos, luego se lleva a un
refrigerador sumergidas en solución fijadora para favorecer el rompimiento de las
células.
11. Distribuir el contenido y esperar que seque.
12. Teñir la muestra con colorante Giemsa al 4% durante 20 min. Observar las
preparaciones al microscopio para monitorear la dispersión de los cromosomas en
metafase y determinar el índice mitótico.
13. Tomar fotografía del conjunto de cromosomas y realizar el cariotipo.
Cultivo Planta
A nivel general y con base en diferentes metodologías para el conteo de cromosomas en
plantas se plantea este protocolo general:
1. La planta estudio debe ser cultivada bajo condiciones de crecimiento optimas.
2. Una vez emergen las raíces se deben tomar los ápices radiculares jóvenes y se sigue
el siguiente orden según la citogenética vegetal:
a. Pretratamiento = Realizado con 8-hidroxiquinolona, paradiclorobenceno,
colchicina y temperatura adecuada para cada tipo de planta en algunas ocasiones
se suele usar agua fría.
b. Fijación = Se realiza con Carnoy o Solución de Farmer (etanol 96% y ácido
acético en proporción 3:1)
c. Hidrolisis = Puede ser enzimática, ácida o una combinación de las dos. Esto se
realiza con el fin de degradar la pare celular.
 d. Coloración = Acetocarmin solución de tinción colorante mitosis cromosomas o
coloración de Feulgen o Orceína acética en un tiempo máximo de 30 minutos en
oscuridad y calentando cuando sea necesario.
e. Montaje (Aplastado o Squash) = Se realiza entre el portaobjetos y cubreobjetos
y así dispersar y hacer visible la muestra.
3. Analizar la muestra en 10X para buscar células contables y luego en 40X para
seleccionar las mejores células y finalmente en objetivo 100X con aceite de
inmersión para realizar el recuento.
4. Fotografiar y realizar el cariotipo.

2. ¿Que son los intercambios de cromátides hermanas y cuál es su importancia clínica?

Los intercambios de cromátides hermanas (ICH) a dichos cambios de forma simétrica de

uno o más segmentos entre cromátides hermanas sin que ocurra ningún cambio
morfológico del cromosoma debido a que implican recombinación y, por lo tanto,
requieren la rotura y la unión del ADN.
Esto ocurre durante la fase S y es inducido de manera eficiente por mutágenos que
forman aductos de ADN o que interfieren con la replicación del ADN. La formación de
SCE se ha correlacionado con la reparación recombinacional y la inducción de
mutaciones puntuales, amplificación de genes y citotoxicidad.

Respecto a la importancia clínica se usa ampliamente como indicador de inestabilidad

cromosómica espontánea.
IMPORTANTE: El análisis de los ICH es de gran importancia ya que permite valorar el
efecto de numerosos agentes citogenéticos, es decir, agentes mutagénicos que dan lugar o
inducen a la interrupción o rotura de cromosomas, lo que se expone como secciones de
cromosomas eliminadas, añadidas o reorganizadas. Esto puede desencadenar que si
dichas células no mueren por este efecto clastogénico se puedan convertir en células
cancerosas.
Por ejemplo, algunos clastógenos conocidos son:
- Benceno
- Amarillo de acridina
- Óxido de etileno
- Arsénico
- Mimosina y Fosfina.
También funciona en el diagnóstico y caracterización de padecimientos hereditarios
como:
- Síndrome de Bloom = Síndrome caracterizado por una fragilidad cromosómica y
predisposición al desarrollo de neoplasias transmitido en un patrón autosómico
recesivo en donde se encuentra una elevada frecuencia de ICH.

La prueba es realizada en linfocitos obtenidos de sangre periférica ya que estos se

encuentran en la etapa G0 deben ser estimulados para que realicen división para ello
recordamos usar la fitohemaglutinina, siempre usar un inhibidor del huso mitótico como
Colcemid bloqueando las células en metafase.

Debemos realizar una coloración que nos permita distinguir ambas cromátidas y para ello
se utiliza BrdU (Bromo-desoxi-Uridina), el cual se añade al medio de cultivo durante los
ciclos celulares completos.
Las cromátides en donde solo hay una hebra de ADN será incorporado el BrdU y se
observarán de color oscuro y las que contengan dos hebras serán de un tono más claro.

En las condiciones del ensayo, durante esta fase el BrdU reemplaza parcialmente a la
timidina, base que forma parte de los componentes del cromosoma normal.

Si se produjo algún intercambio lo podemos evidenciar como fragmentos oscuros en el

otro, es decir, se observan segmentos alternantes pálidos y obscuros que les confieren un
aspecto característico y se denominan cromosomas arlequinados.
 3. Complete el siguiente cuadro con las diferencias en los protocolos de cultivo para obtención de cromosomas
CULTIVO SIEMBRA
Añadir 0.2 mL a un tubo estéril con 5 mL cultivo
estándar RPMI 1640 suplementado con 20% se suero
fetal bovino y fitohemaglutinina M.
Cultivar durante 72 h a 38°C
FRAGILIDAD
CROMOSOMICA
CELULAS Tomando como ejemplo el tumor mamario:
TUMORALES Condiciones de cultivo Colagenasa solo o mezclado
con otras enzimas (DNAasa, hialuronidasa y pronasa)
tiempos de exposición entre 1 a 7 días.
Sustratos afines a la superficie celular como geles de
colágeno, agar o matriz extracelular. Más utilizado agar
semisólido.
MEDIO DE CULTIVO más utilizado es una mezcla de
50% DMEM y suplementado con suero bovino fetal en
[10%]
CULTIVO 1rio a partir de líneas celulares.
COSECHA
2 horas antes se adiciona 0.8 mL Colchicina,
someter las células a un choque hipotónico con KCl
(0.075M) x 20 minutos y luego se procede a fijar
con Carnoy (metanol : ácido acético proporción
3:1).
Evaluar el crecimiento de las células tumorales
mediante el análisis en un microscopio de contraste
de fase, el microscopio de contraste de fases
permite observar células sin colorear y resulta
especialmente útil para células vivas.La mayoría de
los organismos vivos no pueden ser teñidos debido
a que los colorantes utilizados pueden dañar su
estructura celular hasta el punto de su muerte.
UTILIDAD
-Identificar interrupciones de la Cromatina
(fracturas, quiebres o huecos).
-Síndrome más común diagnosticado mediante esta
prueba es la Anemia de Fanconi, caracterizada por
insuficiencia medular en edad temprana, aumenta
el riesgo de cáncer y de anormalidades físicas.
-X frágil como síndrome de retardo mental ligado
al X
-Anemia aplásica
Sensibilidad inusual a la quimioterapia o
radioterapia.
-En el campo de la oncología, la investigación con
líneas celulares, colonias celulares derivadas las
células tumorales de pacientes, ha contribuido a
caracterizar algunos de los rasgos típicos del
cáncer, así como a desarrollar algunos de los
fármacos usados en la actualidad.
-Obtención del cariotipo para estudios
citogenéticos
Realizar estudios metabólicos principalmente
encaminados al conocimiento del mecanismo
hormonal de estas células tumorales.
 Se centrifuga la suspensión celular a
1500rpm por 7 minutos y se descarta el sobrenadante.
El precipitado celular se resuspende en 3-4 ml de
medio DMEM+SFB10% y se siembra en cajas de
25cm2. Las cajas se incuban a 37°C en atmósfera
humidificada con 5% de CO2 en aire por 24 horas y se
realiza cambio de medio para eliminar detritos y
células muertas que no se hayan adherido.
Se añade tripsina al 0.5% y se incuba a 37°C por 2
minutos golpeando la caja. Se vuelven a añadir 3 mL
de medio DMEM+SFB10% para inactivar la tripsina.

Cultivo 1rio a partir de BIOPSIAS

-A partir de biopsias de pacientes con diferentes tipos
de cáncer.
-Lavar muestras con medio RPMI 1640 para remover
sangre contaminante y retirar con bisturí el tejido
adiposo o necrótico.
-Recortar la biopsia de 1-2 mm^3, incubar a 37°C por
1-2 horas en medio RPMI con 0.5 mg/mL de
colagenasa II.
-Se añade FBS 10% (suero fetal bovino) para bloquear
la actividad proteolítica de la enzima. Lavar dos veces
con medio RPMI+SFB10%.
-Distribuir las células en cultivo celular T-75 e incubar
en medio RPMI+SFB20%. Cambiar cultivo dos veces
por semana.

MEDULA OSEA Se realiza la extracción de hueso el cual debe ser Se realiza una supervisión de los cultivos por medio El objetivo es comprobar si aparece el cromosoma
limpiado, luego se introduce en un tubo de centrifuga de microscopio invertido, para observar si hay Ph (philadelphia) u otros cromosomas anormales.
de 15 mL con DMEM. proliferación de bacterias, hongos o virus, las cuales Se observa en más del 90 % de los pacientes con
 Dentro de una cabina de flujo laminar se realizo lavado
de medula ósea, cortando así la epífisis con una segueta
quirúrgica y se añadió 10 cc con DMEM. Se
centrifugan por 10 minutos a 2500 rpm.
Se suspendió el pellet en tubo de 5 mL en medio de
cultivo con DMEM+SFB 10% con
Penicilina/Estreptomicina al 1% y luego se transfiere el
contenido a un frasco de cultivo T-25.
Cada frasco se incuba a 37°C y 5% de CO2 con cambio
en medio fresco cada 72 .
El pasaje celular se da desprendiendo las células con
tratamiento enzimático de 0.25% de tripsina por 5
minutos. Se añade 10 % de SFB para neutralizar la
tripsina y centrifugar 10 min a 2500 rpm
Se descarta el sobrenadante y se resuspende las células
y son separados en frascos nuevos.
Hace referencia a los virus los cuales necesitaran de
células vivas para su producción, para ello se utiliza el
REPLICACIÓN cultivo en monocapas en donde pueden ser a base de
líneas celulares primarias, diploides o continuas.
INTERCAMBIO Después de haber tomado una muestra de sangre
DE periférica, se coloca en el medio de cultivo el cual
contiene nutrientes, BrdU y fitohemaglutinina (PHA),
CROMÁTIDES
el
HERMANAS cual es un mitógeno que estimula linfocitos, en especial
células T, a que se dividan.
Este cultivo se realiza durante 72 horas para generar un
alto porcentaje de metafases.
serán importantes para el diagnóstico.
Esperar aproximadamente 2 a 3 semanas para que
se produzca el crecimiento de estas células para
luego agregar el fijador, solución hipotónica KCl
0.075M y
La forma de detectar la replicación es por un efecto
denominado citopático, lo que hace referencia a
alteraciones morfológicas que se pueden observar
debido a la replicación vírica.
Pasado el tiempo de cultivo, se cosechan las células
deseadas mediante un tratamiento de centrifugado y
lavados con solución de KCl y fijador Carnoy
(ácido acético-metanol), para el posterior montaje
en portaobjetos y tinción. En algunos casos, y
dependiendo de las preferencias del investigador, se
separa el plasma con las células blancas por
centrifugación y se siembra únicamente esa fracción
en el medio de cultivo y demás soluciones.
leucemia mieloide crónica (LMC).
Buscar deleciones, adiciones o traslocaciones ya
que estos cambios cromosómicos en las células
DMS ayudan a predecir el curso probable de un
síndrome mielodisplásico.
Útil en el diagnóstico de enfermedades víricas y
congénitas.
-El análisis de los ICH ha resultado útil en la
valoración del efecto que numerosos agentes
clastogénicos tienen sobre la estructura
cromosómica.
-A nivel general se realiza para medir diversos
tipos de daños del DNA
-Si se produjo algún intercambio lo podemos
evidenciar como fragmentos oscuros en el otro, es
decir, se observan segmentos alternantes pálidos y

LIQUIDO Se obtiene una muestra de líquido amniótico y se
AMNIOTICO transporta al laboratorio en la misma jeringa en que se
extrajo protegiéndola de la luz.
Los amniocitos son incubados a 37°C en una atmosfera
de 5% de CO2 hasta formar colonias celulares durante
7 a 9 días.
Posteriormente se procede a obtener metafases
añadiendo Colcemid 10 µg/m. Luego se tiñen con la
técnica de bandas GTG (patrón de bandas G con
Tripsina y Giemsa) la cual utiliza tripsina como enzima
proteolítica, que permite que el colorante Giemsa se
una a secuencias ricas en A-T, esto para evidenciar las
bandas oscuras (ricas en secuencias A-T) y claras (ricas
en G-C) de cada par de cromosomas y compararlas con
el patrón normal.
Hibridación in situ por fluorescencia (FISH):
permite la identificación rápida de anomalías
cromosómicas en las células. Mediante esta técnica,
se marca el ADN con moléculas fluorescentes que
se fijan a una región específica situada en el
cromosoma que se desea estudiar, y, después de
teñirla se visualiza mediante microscopio de
fluorescencia. Con sondas específicas de
cromosoma un especialista puede determinar
rápidamente la presencia de un cromosoma 21
extra; observará tres señales fluorescentes en lugar
de las dos normales (una por cada cromosoma 21),
lo que indica que el feto tiene síndrome de Down
obscuros que les confieren un aspecto característico
y se denominan cromosomas arlequinados.
-Síndrome de Bloom = Síndrome caracterizado por
una fragilidad cromosómica y predisposición al
desarrollo de neoplasias transmitido en un patrón
autosómico recesivo en donde se encuentra una
elevada frecuencia de ICH.
- En el diagnóstico genético prenatal, el uso de los
cultivos celulares para el estudio de los líquidos
amnióticos permite detectar anomalías
cromosómicas presentes en el feto, además de la
posibilidad de ampliar a estudios genéticos
moleculares usando el material genético extraído de
las células cultivadas.
Determinación Prenatal del sexo
Desorden Recesivo Ligado al Sexo
-Hemofilia A y B
-Distrofia muscular de Becker y Duchenne
-Mucopolisicaridosis
-Síndrome de Hunter
-Hiperuricemia de Lec Nyhan
Aberraciones Cromosómicas
- Síndrome de DOWN (Trisomia 21)
-Síndrome de BARTHOLJN – PATAU (Trisomia
13)
-Síndrome de EDWARDS (Trisomia 18)
-Síndrome de Gri-du-chat
-Triple X Feminizante
-Virosis : Rubeola y Herpes Simple Genital
Desórdenes Metabólicos
- Enfermedad de Gaucher
-Enfermedad de Fabry
-Enfermedad de Tay Sachs (gangliosidosis)
-Enfermedad de Niemann-Pick
-Síndrome Adreno genital
-Oligofrenia fenilpirúvica
 4. CONSIDERACIONES FINALES
Identifique diferentes técnicas de cultivo de tejido y órganos, realice un cuadro en el que mencione sus ventajas y desventajas.

Técnica Fundamento Ventajas Desventajas

Se coloca el órgano sobre una rejilla situada en la -Mantiene la estructura característica del tejido in -La proliferación es limitada, necesita de un nuevo
interfase líquido-gas de un medio del que obtiene vivo y permite así la diferenciación de tipos explante para cada experimento
los nutrientes y al que puede liberar los desechos. celulares. -La cuantificación es difícil y la cantidad de material
Este tipo de cultivo permite mantener, al menos que se puede cultivar es reducido.
en parte, la arquitectura característica del tejido
“in vivo”. Se conservan las interacciones
histológicas y, gracias a ello, este tipo de cultivo
permite mantener los tipos celulares
CULTIVO DE diferenciados, por lo que representan una buena
ÓRGANOS réplica del tejido de origen. Sin embargo, no
crecen mucho (la proliferación celular se limita a
las células embrionarias de la periferia) y no se
pueden propagar. Se necesita un nuevo explante
para cada experimento lo que supone mucho más
trabajo y una limitada reproducibilidad de la
muestra. Cuantificar es difícil y la cantidad de
material que se puede cultivar es reducida.
Se coloca un fragmento de tejido o de órgano en -Útil en pequeñas cantidades de tejido, por ejemplo, -
la interfase sólido-líquido de un soporte de vidrio en biopsias de piel.
o de plástico. Las células se adhieren a la
EXPLANTES superficie y las células de la periferia del explante
PRIMARIOS pueden migrar y proliferar por la superficie del
soporte.
CULTIVO Es el tipo de cultivo más utilizado. Se puede - Control de factores fisicoquímicos y fisiológicos del -Estrictas condiciones de asepsia
CELULAR obtener a partir de explantes primarios o de medio en el que se cultivan las células -Altos costos para producir una pequeña cantidad de
PRIMARIO suspensiones de células disgregadas. La -Las células en cultivo asumen una constitución células.
disgregación celular se realiza por métodos homogénea, evitando el problema inherente a la -Pérdida irreversible de las propiedades funcionales de
enzimáticos o mecánicos. En estos cultivos se heterogeneidad de las muestras asociado al uso de las células.
pierden las interacciones célula-célula y las animales de experimentación -Dificultad en relacionar células cultivadas con las
interacciones de la célula con la matriz -Economía en ensayos de reactivos o drogas a células funcionales del tejido original
extracelular. Sin embargo, las células son capaces estudiar. -Problemas de inestabilidad genética cuando se
de proliferar y la población celular crece realizan varios pases
notablemente. Cuando las células ocupan toda la
superficie disponible se dice que han alcanzado la
confluencia. En esta etapa, las células establecen
contactos entre ellas que inhiben su proliferación
y el crecimiento se detiene. Por eso, al cabo de un
tiempo hay que trasplantar las células a un nuevo
soporte. Esta operación se denomina subcultivo o
pase.
Existen dos tipos de cultivo celular primario:
• Cultivos en monocapa: las células crecen
adheridas sobre un soporte sólido (plástico o
vidrio). El anclaje al sustrato es un prerrequisito
para la proliferación celular. Es el método
utilizado para la mayoría de las células excepto
para las
hematopoyéticas.
• Cultivos en suspensión: las células se
encuentran dispersas en el medio de cultivo. Su
crecimiento no depende del anclaje. Este tipo de
cultivo se restringe a las células hematopoyéticas,
células madre, líneas celulares transformadas y
células tumorales. Alcanzan la confluencia
cuando el número de células es grande y los
 nutrientes son insuficientes.
Las células del cultivo primario en monocapa se -Se tiene control absoluto del entorno celular -Con el tiempo se pueden dar mutaciones en el ADN
dispersan por métodos enzimáticos y se pasan a -Son cultivos homogéneos -Se necesita condiciones de asepsia estrictos
un nuevo frasco de cultivo. En el caso de células -Son más económicos que otras técnicas -Perdida de propiedades funcionales
en suspensión, sencillamente se diluyen en medio -Las células son capaces de proliferar -Se pierde la relación de las células funcionales del
fresco. Los sucesivos cultivos así formados se tejido original
denominan una línea celular. La formación de una
SUBCULTIVOS Y línea celular a partir de un cultivo primario
implica que:
LINEAS • Aumenta el número de células obtenidas
CELULARES • Acaban predominando uno o dos tipos celulares:
los que tienen mayor tasa de crecimiento
•La población celular se hace uniforme y
homogénea
•Sus características se conservan durante las
sucesivas generaciones y, si se conservan en
nitrógeno líquido, de forma indefinida
Los cultivos histotípicos son cultivos de un solo -Se llega a obtener un gran número de células (una -La asepsia es crítica y necesaria en el cultivo
tipo celular que consigue alcanzar una elevada alta densidad) -Muchas líneas celulares son inestables.
densidad celular (tal y como ocurre en los -Se crea una estructura. -Al ser una técnica sensible el medio debe tener una
tejidos). Los cultivos organotípicos constan de -Este se parece aún más a los tejidos del cuerpo, ya complejidad alta similar a la del plasma
CULTIVOS varios tipos celulares que interaccionan entre sí que pueden estar en el mismo espacio diferentes tipos -Las condiciones de asepsia son muy exigentes
HISTIOTIPICOS de una forma que intenta parecerse lo más posible de células -Es de elevado costo
Y a la original. El objetivo final de este tipo de
ORGANOTIPICO cultivos es la creación “in vitro” de tejidos u
S órganos completamente funcionales que puedan
ser utilizados en injertos o en trasplantes.
Los cultivos organotípicos constituyen la base de
una nueva disciplina denominada ingeniería de
tejidos.
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