See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.

net/publication/318307135

Biotecnología asociada a la generación de pigmentos microbianos

Article · October 2014

CITATIONS READS
0 6,827

1 author:

Ignacio Atenas Rodríguez

Universidad Iberoamericana de Ciencias y Tecnología UNICIT
3 PUBLICATIONS   0 CITATIONS   

SEE PROFILE

All content following this page was uploaded by Ignacio Atenas Rodríguez on 09 July 2017.

The user has requested enhancement of the downloaded file.

BIOTECNOLOGIA ASOCIADA A LA GENERACION DE
PIGMENTOS MICROBIANOS PARA LOS ALIMENTOS

Autor: Ignacio J. Atenas Rodríguez.

Asignatura: Bioprocesos en empresas

alimentarias.

Docente: Alejandra Arancibia Díaz.

Fecha: 29-10-2014.
Índice de contenidos

N° Págs.

Resumen. 1-2

Abstract. 3-4

Introducción. 5

Desarrollo y Marco teórico. 6-10

Hallazgos 11

Resultados. 12-18

Género Monascus.

A. Condiciones fermentativas en Monascus. 12-14

B. Condiciones funcionales de los biopigmentos. 14
C. Estabilidad de los pigmentos. 14-15

Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma).

A. Condiciones fermentativas en X. dendrorhous (Phaffia rhodozyma). 16-17

B. Condiciones funcionales de los biopigmentos. 17
C. Estabilidad de los pigmentos. 17-18

Discusiones y conclusiones 19-20

Recomendaciones 21-22

Referencias 23-24
Índice de tablas

Tab. 1. Crecimiento, producción de biopigmentos y síntesis de citrinina por

diferentes cepas de Monascus, después de 7 días de incubación (en arroz) y 11
días (en bagazo de yuca, CB) Pág. 14

Tab. 2. Relación de carotenoides encontrados en X. dendrorhous y la cantidad

media en la que están presentes. Pág. 18

Tab. 3. Comparación del crecimiento de distintas cepas de X. dendrorhous, en

distintos sustratos indicando la producción de astaxantina. Con un asterisco (*) se
indican las cepas mutantes.YE:extracto de levadura; ME:extracto de malta. Pág.18

Índice de figuras

Fig. 1. Fórmulas químicas de algunos pigmentos microbianos de calidad

alimentaria. Pág. 2

Fig. 2. Variación de color (medida como absorbancia relativa) con tiempo (en
horas) para soluciones de pigmentos acuosos a diferentes temperaturas de
incubación, con pH 6. Pág. 15

Fig. 3. Variación de color (medida como absorbancia relativa) con tiempo (en
horas) a diferentes valores de pH 6, a 100°C Pág. 15

Fig. 4. Propiedades críticas de varios solventes. Pág. 20

 Página |1

Resumen

El color de los alimentos entrega una primera impresión a cerca de ellos e influye
en la decisión final de cuál de ellos consumir. El uso de colorantes sintéticos
nocivos en los alimentos abrió la búsqueda de pigmentos de origen natural. En
esta perspectiva, la extracción de pigmentos microbianos se ha enfocado en la
obtención de carotenos, de alta demanda comercial, tales como astaxantina,
licopeno, β-caroteno, y zeaxantina; estos carotenoides por ejemplo, han sido
utilizados como complemento en las dietas de salmónidos para mejorar e
intensificar la coloración de su carne. Los carotenoides extraídos de Monascus,
han sido usados en China para la producción de arroz rojo chino (Ang-Khak),
queso de soya, vino Shao-Shing, y vino rojo de arroz. Las levaduras Monascus
producen pigmentos con tonalidades que van del rojo al amarillo de carácter
hidrosolubles, y que difunden por todo el medio de cultivo; dada esta condición
han podido ser extraídos fácilmente mediante solventes apropiados o bien por la
tecnología de fluidos supercríticos. Por otro lado, diferentes carotenoides
producidos por la levadura Phaffia rhodozyma y la cantidad del carotenoide
principal, astaxantina, han podido modificarse por cambios en la composición del
medio de cultivo y por otros factores ambientales. Alternativamente, otros ensayos
de laboratorio han logrado modificar genéticamente el hongo Fusarium
sporotrichioides para la elaboración del colorante y antioxidante licopeno (de color
rojo) a partir del material de fibra de maíz, un residuo de la industria energética del
etanol. Siguiendo esta línea, el β-caroteno del hongo Blakeslea trispora, se ha
posicionado en la cúspide de la industria alimentaria; así, al introducir iononas,
amidas, imidas, lactamas, hidrazidas, o piridinas sustituidas y, en particular
succinimida y isonicotinoylhidrazina, han producido un incremento de dos o tres
veces en la cantidad de β-caroteno presente en los medios de cultivo; así mismo,
cepas apareadas de Blakeslea trispora han sintetizado 850 mg/g de peso seco de
carotenos.

Otros pigmentos han sido aplicados exitosamente al uso de la industria de

alimentos, tal es el caso del colorante arpink-red de Penicillium oxalicum, los
pigmentos derivados de Monascus purpureus (ankaflavina/monascina, de color
amarillo, la rubropunctatina/monascorubrina de color anaranjado, la
rubropunctamina/monascorubramina, de tonalidad púrpura; el pigmento
cantaxantina en la cianobacteria Anabaena variabilis, y la riboflavina de Ashbya
gossypi, un superproductor de este pigmento en cantidades superiores a 1 g/L.

El éxito de cualquier pigmento derivado de la fermentación microbiana, depende

de su aceptación en el mercado, de la aprobación regulatoria, y el tamaño de la
inversión de capital necesaria para llevar dicho producto al mercado. En términos
de laboratorio, el trabajo se ha orientado en mejorar los parámetros de cultivo y las
condiciones físico-químicas respectivas (temperatura, pH, aireación, relación C:N);
variables como la solubilización, estabilidad y la extracción de pigmentos en
solución, han sido parámetros para medir la alta calidad fermentativa del
 Página |2

colorante. Últimamente se ha usado la ingeniería genética, mediante la cual se

han logrado producir mutantes con cambios en la capacidad de producir
pigmentos, tal es el caso de Escherichia coli, trasformada y condicionada para la
síntesis de carotenoides.

Palabras clave: Astaxantina, β-caroteno, licopeno, Monascus purpureus, Phaffia

rhodozyma, Blakeslea trispora, calidad fermentativa.
 Página |3

Abstract

The foods color gives a first impression about of them and this have influence in
the final decision of which of them consume. The use of harmful synthetic dyes in
the foods opened the search of pigments from naturally origin. In this perspective,
the extraction of microbial pigments has focused in the obtaining of carotenes of
high market demand, such as astaxanthin, lycopene, β-carotene, and zeaxanthin;
these carotenoids for example, have been used as supplement in the salmonid
diets to enhance and intensify the coloration of its flesh. The carotenoids extracted
from Monascus have been used in China to the production of chinese red rice
(Ang-Khak), soya cheese, Shao-Shing wine, and red wine of rice. The yeasts
Monascus produce pigments with tonalities that ranging from red at yellow of
soluble character and that disseminate for all the culture medium; happened this
condition has been able easily extract it by means of suitable solvents or well for
the supercritical fluid technology. For other side, different carotenoids produced by
the yeast Phaffia rhodozyma and the amount of the principal carotenoid,
astaxanthin, they have been modified by changes in the composition of the growth
medium and by means of other environmental factors. Alternatively, other
laboratory tests have succeeded genetically modifying the fungus Fusarium
sporotrichioides, to prepare the dye and antioxidant lycopene (of color red) from to
material of corn fiber, a residue of energy industry of ethanol. Following this line,
the β-carotene of the fungus Blakeslea trispora, have been positioned at the peak
of the food industry; thus at introduce ionones, amides, imides, lactams,
hydrazides, or substituted pyridines and in particular succinimide and
isonicotinoylhidrazine have produced an increase of two or three times in the
amount of β-carotene present in the culture medium; of this mode the
microorganism strain consortium of Blakeslea trispora have synthesized 850 mg/g
of dry weight of the carotenes.

Other pigments have been applied with sucess to the use of the food industry, as
in the case of the arpink-red colorant of Penicillium oxalicum, the pigments derived
of the Monascus purpureus (ankaflavin/monascine, of yellow color,
rubropunctatin/monascorubrine, of orange color, the rubropunctamine
monascorubramine, of a purple tonality; the pigment canthaxanthin in the
cyanobacterium Anabaena variabilis, and the riboflavin of Ashbya gossypi, a
overproducer of this pigment, in amounts superior to 1 g/L.

The success of any pigment derived of the microbial fermentation depends of his
market acceptance, of the approval from regulating, and the size of the capital
investment necessary, to bring this product to market. In terms of laboratory, the
work has been focused on improving the parameters of culture, and the respective
physico-chemical conditions (temperature, pH, aeration, C:N relation); variables as
the solubilization, stability and the extraction of pigments in solution, have been
parameters to measure the high fermentative quality of the colorant. Recently,
genetic engineering has been used through which it reached, produce mutants with
 Página |4

changes in the ability to produce pigments, as in the case of Escherichia coli,

transformed and conditioned to the synthesis of carotenoids.

Keywords: Astaxanthin, β-carotene, lycopene, Monascus purpureus, Phaffia

rhodozyma, Blakeslea trispora, fermentative quality.
 Página |5

Introducción

Los pigmentos son compuestos químicos que entregan color a otros materiales
debido al efecto óptico de la refracción de la luz solar. El color es una cualidad
organoléptica de los alimentos que se aprecia mediante del sentido físico de la
vista; es considerado como un factor psicológico y un criterio para elegir un
determinado alimento; e incluso en los productos de origen vegetal, el color se
relaciona con la posibilidad de distinguir su grado de maduración y su idoneidad
(Bello-Gutiérrez, 2000). Debido a esta característica, los pigmentos son
importantes en la industria alimentaria, ya sea como aditivos, o intensificadores de
color. Un aditivo es una sustancia que se añade de manera intencional a los
alimentos, por lo general en pequeña cantidad, para mejorar su apariencia, sabor,
color, y preservación, de acuerdo al Codex Alimentarius de 1988. Otra definición
es que los aditivos son sustancias que se añaden a los alimentos y bebidas con la
intensión de proporcionar o intensificar el aroma, color o sabor, prevenir cambios
indeseables o alterar en general su aspecto físico.

Desde hace tiempo se ha investigado la elaboración de pigmentos de origen

natural, recogiendo, caracterizando y purificando muchos compuestos de este tipo
(Durán, y col., 2002); los cuales se han obtenido a partir de plantas y
microorganismos principalmente; aunque en la actualidad los procesos
biotecnológicos, parecen ser una mejor alternativa para la obtención de estos
compuestos. El empleo de microorganismos, especialmente los hongos
filamentosos y varios géneros bacterianos, ha traído consigo la generación de
nuevas tecnologías, y nuevos pigmentos; así mismo, la obtención de estos
productos, puede reemplazar en gran medida el uso de colorantes químicos o
sintéticos. En referencia a esta perspectiva, la búsqueda de nuevos pigmentos
naturales apunta a retirar los colorantes sintéticos, debido a su considerable
toxicidad, y sustituirlos por colorantes naturales (Gibaja, 1998). Las lista de
colorantes sintéticos autorizados es cada vez más corta, y su fabricación objeto de
un control muy estricto por parte de los organismos gubernamentales, debido a
esto, la tecnología de colorantes naturales se desarrolla a ritmo acelerado (Muller
y Riel, 1990). Aquí juega un rol importante revisar y reunir los últimos avances en
esta temática, destacando y estudiando los microbios (bacterias y hongos) con un
alto potencial biotecnológico en la industria de generación de pigmentos; junto a
ello, referir la problemática, orientada a la optimización de los bioprocesos y las
variables que afectan el crecimiento y la proliferación de la biomasa implicada.

En los microrganismos, algunos pigmentos se encuentran difusos, mientras otros

están localizados en cromóforos; unos son hidrosolubles y pasan al medio,
coloreándolo (exopigmentos); otros en cambio, son insolubles en agua y
permanecen como inclusiones en el cuerpo microbiano (endopigmentos), siendo
preciso extraerlos mediante disolventes específicos (éter, cloroformo, benceno,
ácidos o bases) o bien por lisis celular (Abbayes y col. 1989; Caneva, Nugari y
Salvadori, 2000).
 Página |6

Desarrollo y Marco teórico

Las publicaciones científicas relativas a la generación de pigmentos como

metabolitos secundarios se han enfocado esencialmente al estudio de los hongos
filamentosos. Estos, han sido estudiados por su actividad metabólica, midiendo su
cantidad y capacidad de producción extracelular de pigmentos, de tal forma de
facilitar los procesos fermentativos, pero su mayor énfasis recae en los altos
rendimientos de síntesis obtenidos (Carvalho y col., 2003). Los hongos
pertenecientes al género Monascus sp. han sido estudiados por largo tiempo y
diversos autores refieren a estos hongos, como potenciales productores de
pigmentos naturales (Blanc y col., 1994; Carvalho y col., 2003). Algunas especies
de Monascus sp. producen pigmentos hidrosolubles y que difunden por todo el
medio de cultivo (exopigmentos) con tonalidades rojas a amarillas; los cuales han
sido aplicados exitosamente como ingredientes alimenticios (Blanc y col., 2001). El
pigmento rojo se ha aplicado en el koji, salsa de soya, tofu, cuajada de frijol, vinos
rojos, carnes (salchichas, y jamones), productos marinos (como el surimi y la
pasta de pescado), salsa de tomate, helados, dulces y mermeladas (Socaciu,
2008).

Monascus sp. no es el único microorganismo con potencial de producir colorantes,

otros microorganismos como los pertenecientes al género Paecilomyces sp.
también producen pigmentos en tonalidades rojas, amarillas y violetas; en
cantidades de hasta 4.73 g/L-1 (Cho y col., 2002). Siguiendo esta lógica, los
hongos pertenecientes a los géneros Penicillium sp. y Aspergillus sp. también han
sido estudiados como potenciales productores de pigmentos naturales (Engstrom
y col., 1982; Larsen y Breinholt, 1999; Suhr y col., 2002). Conjuntamente se han
reportado el uso de microorganismos tales como bacterias, levaduras y
actinomicetos, en la producción de pigmentos; tal cual ha sido el caso de Phaffia
rhodozyma (Fontana y col., 1996; Lim y col., 2002). Esta levadura se ha utilizado
para la producción de un pigmento rojo con mucho uso en la industria alimentaria,
la astaxantina, con nombre comercial “AstaXin”, comercializada por Igene
Biotechnology Inc., Columbia, Maryland; astaxanthin of Mera Pharmaceuticals Inc.
(Wani y col., 2004). Otros microorganismos han logrado ser modificados
genéticamente para poder producir pigmentos, tal es el caso de Escherichia coli,
trasformada y condicionada para la síntesis de carotenoides. (Yokohama y col.,
1998).

Otros estudios han caracterizado los pigmentos típicos de algunas especies:

piocianina en Pseudomonas aeruginosa; la violaceína en Chromobacterium
violaceum, rubixantina, colorante propio de Staphylococcus aureus; prodigionina
de Serratia marcescens; el leproteno en Mycobacterium phlei; la rodoviolaceína y
la flavocodina en los Rhodovibrio; la espiriloxantina de los Thyocystis; la
sarcinaxantina en las Sarcinas; y las bacteriorruberinas α y β en Bacterium
halobium (Abbayes et a. 1989). Otros pigmentos microbianos se han descrito;
como las benzoquinonas que son metabolitos sintetizados por los hongos como la
 Página |7

espinulosina (de color púrpura-negro y presente en Penicillium spinolosum Thom

y Aspergillus fumigatus, el ácido polipórico (de color pardo violáceo y aislado con
un 20 % de rendimiento del hongo Polyporus rutilans, la fumagantina (de color
pardo-castaño producido por Penicillium spinolosum en presencia de fenolasas y
Aspergillus fumigatus (Gibaja, 1998).

En términos de mercado, se han explotado con énfasis los pigmentos de

Monascus, la astaxantina de Xanthophyllomyces dendrorhous, el pigmento rojo-
rosa de Penicillium oxalicum, la riboflavina de Ashbya gossypii, y el β-caroteno de
Blakeslea trispora (Dufossé, 2006).

A la actualidad sólo la astaxantina extraída del alga verde Haematococcus

pluvialis y del hongo levaduriforme Xanthophyllomyces dendrorhous puede
competir con la astaxantina sintética, ya que producen 30 y 4 mg de astaxantina
por gramo de peso seco, respectivamente, siendo las de mayor rendimiento
encontradas.

Monascus, se usa con frecuencia en la comida oriental, esencialmente al sur de

China, Japón, y al sureste del continente Asiático. En la actualidad un número
superior a las 50 patentes han sido emitidas en Japón, Estados Unidos, Francia y
Alemania, referentes al uso de pigmentos de Monascus en la comida. El consumo
anual de estos pigmentos de Monascus en Japón, movilizó más de 100 toneladas
en 1981 a 600 toneladas a finales de los años noventa, cantidad que fue valorada
en $1.5 millones. Así mismo, se ha descrito la aplicación del pigmento en cuanto a
la coloración de las carnes procesadas (salchichas y jamón), productos marinos
como pasta de pescado, surimi y salsa de tomate.

Otros pigmentos de interés son la ankaflavina y la monascina (de color amarillo),

la rubropunctatina y la monascorubrina (de coloración naranja), y la
rubropunctamina y monascorubramina, que son de tonalidades púrpuras; todo
ellos presentes en Monascus purpureus. Si bien estos pigmentos presentan un
potencial biotecnológico, exhiben ciertas problemáticas: poseen una baja
solubilidad en agua, son sensibles al calor, inestables a pH entre 2-10, y se
desvanecen por acción de la luz. Un número de métodos han sido patentados con
el fin de hacer que los pigmentos sean solubles en agua. En monascorubrina o
rubropunctatina, se sustituye el oxígeno por el nitrógeno del grupo amino de
diversos compuestos tales como aminoácidos, péptidos y proteínas, cambiando el
color de naranja a púrpura. La estabilidad de los pigmentos se ve afectada por la
acidez, la temperatura, la luz, el oxígeno, la actividad y el tiempo de agua. Se
demostró que estos pigmentos añadidos a las salchichas o paté enlatado se
mantuvieron estables tras un almacenamiento de 3 meses a 4°C, mientras que su
estabilidad varió desde 92 hasta 98%. Por lo tanto, los principales patentes se han
centrado en la solubilización, la estabilidad y la extracción de pigmentos en
solución. Los pigmentos pueden reaccionar fácilmente con grupos compuestos de
amino en el medio, tales como proteínas, aminoácidos, o ácidos nucleicos para
formar pigmentos solubles en agua.
 Página |8

El rojo-rosa (Arpink red) de Penicillium oxalicum, otro pigmento de importancia

comercial, ha tenido continuas patentes por parte de Ascolor Biotech s.r.o. en la
República Checa, en las cuales se reseña a una nueva cepa de dicho hongo con
propiedades de síntesis de un pigmento rojo que se puede aplicar en la industria
alimentaria. La cepa de Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM 8242, como fue
llamada, se aisló de la tierra, y genera un cromóforo del tipo antraquinona. Su
cultivo en caldo líquido requiere de la aplicación de carbohidratos (como sacarosa,
y melaza), nitrógeno (mediante el uso de extracto de maíz, autolisado o extracto
de levadura), además de sulfato de zinc y sulfato de magnesio. Las condiciones
óptimas para la ejecución de la producción microbiológica fueron determinadas, y
corresponden a un valor de pH 5.6-6.2, y una temperatura de 27 a 29°C. Al
segundo día de incubación un colorante rojo se libera al caldo, el que aumenta en
concentración de hasta 1.5 a 2.0 g/L de caldo después de 3-4 días. Luego de
completarse la biosíntesis del pigmento rojo, el caldo se filtra o centrifuga para la
separación de la biomasa. El volumen obtenido se acidifica a pH 3.0-2.5 para
precipitar el colorante. Posteriormente, este precipitado se disuelve en alcohol
etílico y se filtra. Luego de la eliminación del alcohol, se obtiene el colorante en la
forma cristalina, es decir, como un polvo de color rojo oscuro. El colorante da un
color rojo frambuesa en solución acuosa, y estable a pH superior a 3.5. Las
soluciones neutras son estables incluso después de 30 minutos de ebullición y la
tonalidad del color no cambia en relación con el pH.

Otro pigmento de aplicación industrial, la riboflavina (vitamina B2) de Ashbya

gossypii tiene variedad de aplicaciones alimentarias como colorante amarillo. Las
aplicaciones incluyen bebidas, postres instantáneos, helados, y otros productos.
La riboflavina tiene una afinidad específica como base para la fabricación de
productos cereales, pero su uso en estas aplicaciones está limitado debido a su
ligero olor y sabor amargo. Existen numerosos microorganismos que producen la
riboflavina por fermentación. Esta podría clasificarse en tres categorías de
microrganismos: superproductores débiles (100 mg/L o menos, como Clostridium
acetobutylicum), superproductores moderados (hasta 600 mg/L, en levaduras tales
como Candida guilliermundii o Debaryomyces subglobosus), y superproductores
fuertes (más de 1 g/L, como los hongos Eremothecium ashbyii y Ashbya gossypi).

Otro pigmento de interés, el β-caroteno de Mucor circinelloides tipo salvaje es de

color amarillo. Las características básicas de la vía de carotenoides, incluyendo la
fotocarotenogénesis, son similares en Phycomyces y Mucor. Mucor Circinelloides
responde a la luz azul, activando la biosíntesis de este pigmento. Cepas de tipo
salvaje cultivadas en la oscuridad contienen cantidades mínimas de β-caroteno,
debido a los bajos niveles de transcripción de los genes estructurales para
carotenogénesis. Cuando se expone a un pulso de luz, el nivel de transcripción de
estos genes aumenta fuertemente, lo que conduce a la formación de altas
concentraciones de pigmento. Nuevas investigaciones se centran ahora en
mutantes semejantes a las levaduras (M. circinelloides es un hongo dimórfico que
 Página |9

crece en forma de levadura o en forma de micelio) y que podrían ser útiles en una
producción biotecnológica.

El β-caroteno también puede ser extraído de Phycomyces blakesleeanus. El

contenido de caroteno de cepas salvajes cultivadas bajo condiciones estándar es
reducido, de aproximadamente 0.05 mg/g de masa seca, sin embargo, ciertos
mutantes acumulan hasta 10 mg. En cuanto a Blakeslea trispora, la estimulación
sexual de la biosíntesis de carotenos sigue siendo esencial para aumentar los
rendimientos hasta 35 mg/g. Las mejores cepas de Phycomyces hasta ahora
probadas, presentan su potencial carotenogénico completo sobre sustratos sólidos
o en medio líquido. Cerdá-Olmedo hace hincapié en que su pariente, Blakeslea
trispora, es más apropiado para la producción en fermentadores habituales.

Jones y col. modificaron genéticamente el hongo Fusarium sporotrichioides para la

fabricación del colorante y antioxidante licopeno (de color rojo) a partir del material
de fibra de maíz, correspondientes a los restos de la producción de etanol. La fibra
de maíz es abundante (la industria del etanol en EE.UU. produce cuatro millones
de toneladas anuales) y cuesta unos cinco centavos de dólar por libra. Se han
propuestos también el uso de granos secos de destilería con solubles (DDGS)
como sustrato. Fuertes secuencias promotoras y de término se han añadido a los
genes de biosíntesis de carotenoides de la bacteria Erwinia uredovora, y los genes
quiméricos o recombinantes se han ensamblado e introducido en el hongo
expresándose a niveles comparables a los observados para los genes
biosintéticos endógenos. Cultivos en frascos de laboratorio produjeron 0.5 mg
(licopeno)/g de masa seca dentro de 6 días y tal producción según un estudio se
incrementará en los próximos años.

La astaxantina de Xanthophyllomyces dendrorhous, antes conocida como Phaffia

rhodozyma, se pretende agregar a la dieta de salmónidos para impartirle la
coloración rojo-anaranjado distintivo que lo hace atractivo para los consumidores
en el mercado. Entre los pocos microorganismos productores de astaxantina,
Xanthophyllomyces dendrorhous es uno de los mejores candidatos para la
producción comercial. Para el crecimiento del cultivo se deben suministrar fuentes
complejas de nutrientes, tales como extractos de peptona, malta y levadura; así
también como subproductos de la agricultura (melaza), hidrolizados enzimáticos
de madera, maíz, bagazo de caña de azúcar, y jugo de uva. La principal
desventaja de su uso radica en que estos sustratos son variables en composición.
Palagyi y col. ensayaron once cepas por su capacidad para utilizar 99 compuestos
como única fuente de carbono. En un segundo estudio, la biosíntesis de
carotenoides se incrementó a bajos niveles de amonio o fosfato y se estimuló por
citrato. Las condiciones óptimas de estimulación más altas de astaxantina fueron:
temperatura de 19.7 °C, una concentración de carbono de 11.25 g/L, pH 6.0, 5%
de inóculo, y concentración de nitrógeno de 0.5 g/L. En estas condiciones la
astaxantina contenida fue de 8.1 mg/L.
 P á g i n a | 10

Por otro lado, las levaduras del género Rhodotorula sintetizan pigmentos
carotenoides. La mayor parte de la investigación se centra en la especie
Rhodotorula glutinis, sin embargo, algunos artículos tratan con otras especies
como R. gracilis, R. rubra, y R. graminis. Los principales compuestos producidos
por estas levaduras rojas son tolueno y torularhodin, con una mínima cantidad de
β-caroteno; empero se han hecho esfuerzos para aumentarla a través de la mejora
de cepas, la mutación, la optimización del medio y la manipulación de las
condiciones de cultivo (temperatura, pH, aireación, relación C:N ) .

Otro pigmento, la zeaxantina de color amarillo se puede emplear, como alimento

para aves de corral con objeto de fortalecer la coloración amarilla de la piel de
animales de este tipo o para acentuar el color de la yema de los huevos. Cultivos
de Flavobacterium sp. en un medio que contiene glucosa o sacarosa, aminoácidos
tales como metionina, cistina o cisteína, iones metálicos piridoxina y bivalentes
seleccionados de entre el grupo constituido por Fe +2, Co+2, Mo+2 o Mn+2 fueron
capaces de producir hasta 190 mg de zeaxantina/L, con una concentración celular
específica de 16 mg/g de masa seca celular.

El pigmento carotenoide cantaxantina se ha utilizado por muchos años con el fin

de impartir el color de la carne deseada en los salmónidos de cría. Bradyrhizobium
sp., ha sido descrito como productor de cantaxantina y su grupo de genes de
carotenoides fue completamente secuenciado. Este ceto-carotenoide también se
encontró en otro microorganismo, una bacteria halófita extrema del género
Halobacterium belongingo.

En comparación con la gran cantidad de investigación de Xanthophyllomyces

dendrorhous, la producción de astaxantina utilizando Agrobacterium aurantiacum
ha sido investigado en menor cantidad. La primera descripción de la biosíntesis de
astaxantina en esta bacteria fue publicada por Yokoyama y col. en 1994. Los
autores describieron la ruta biosintética, la influencia de las condiciones de
crecimiento en la producción de carotenoides y la ocurrencia de glucósido
astaxantina en dos artículos siguientes. Como los carotenoides representan un
grupo de pigmentos que han obtenido un creciente interés comercial en los últimos
años, numerosas proyecciones se han realizado con el objeto de caracterizar
nuevas fuentes biológicas de astaxantina, y así se han aislados positivamente de
Paracoccus carotinifaciens y Halobacterium salinarium. Tres interesantes
resultados se informaron en el último documento: (i) concentraciones extremas de
NaCl (aproximadamente 20%) se utilizaron en el medio de cultivo para evitar la
contaminación con otros organismos (por lo que no es necesaria la esterilización);
(ii) las concentraciones de NaCl de menos de 15% inducen la lisis bacteriana, por
lo que no se necesita ninguna técnica especial de rotura celular; y (iii) los
pigmentos pueden ser extraídos directamente con aceite de girasol en lugar de
disolventes orgánicos, eliminando así posibles reacciones tóxicas debido al
arrastre de concentraciones de acetona o hexano y facilitando por lo tanto la
asimilación del pigmento por los animales.
 P á g i n a | 11

Hallazgos

Los pigmentos carotenoides, de alta valor comercial, están presentes en algas,

hongos y bacterias (Goodwin, 1980). En los hongos destaca el licopeno en
Blakeslea trispora, y la astaxantina en la levadura Phaffia rhodozyma; en las algas
verdes se han identificado la luteína en Spongiococcum excentricum y Chlorella
pyrenoidosa y la astaxantina en Haematococcus pluvialis. En bacterias no
fotosintéticas destacan el licopeno en Streptomyces chrestomyceticus subesp.
rubescens, la zeaxantina en Flavobacterium sp., la cantaxantina en Brevibacteríum
KY-4313 y la astaxantina en Brevíbacteríum sp. Entre las bacterias fotosintéticas se
ha evidenciado la presencia de astaxantina en Rhodococcus maris, mientras que
entre las cianobacterias se ha encontrado cantaxantina en Anabaena variabilis. El
género Monascus, encierra tres especies principales (M. pilosus, M. purpureus y M.
ruber) perteneciente a la familia Monascaceae y a la clase Ascomyceta (Pitt, 1997),
cuya característica más notoria es la capacidad de producir metabolitos secundarios
de estructura policetídica, (Juszlová, 1996), algunos de ellos con una intensa
pigmentación de color amarillo, naranja o roja. Las dos primeras especies son más
importantes para la producción de pigmentos, mientras que M. ruber se ha asociado
a la descomposición de varios alimentos. Entre los pigmentos producidos
por Monascus, los rojos son considerados los de mayor importancia industrial, ya
que estos pueden ser utilizados como sustitutos de los nitritos en los productos
cárnicos y de los colores sintéticos tales como eritrosina (FD y C, rojo n°3) (Johns y
Stuart, 1991; Fabre, 1993). Países orientales como Japón han hecho un amplio uso
de estos pigmentos desde hace décadas – en una primera instancia, como
colorantes amarillos solubles en agua aplicados a caramelos (Watanabe, 1997), o
bien como se mencionó anteriormente como pigmento rojo para el vino rojo de arroz.
Como es el caso de otros hongos, las diferentes cepas de Monascus producen
también micotoxinas. En este caso, la micotoxina producida es citrinina, una
sustancia nefrotóxica que también presenta propiedades antibióticas, por lo tanto en
términos industriales se ha seleccionado las cepas que producen grandes
cantidades de biopigmentos pero baja o nula cantidad de citrinina. Igualmente se ha
intentado sobreexpresar metabolitos propios del género como son monacolinas K y
L, un conjunto de anti-hiperlipidémicos (Ma, 2000). La aplicación de xantofilas se ha
empleado exitosamente en la dieta de aves productivas (avicultura), ya que estas
son absorbidas a niveles apreciables y transportadas a la yema de huevo y masa
muscular (Mateas, 1991). En términos prácticos, su dieta se ha suplementado con
distintos pigmentos para favorecer la coloración amarillo-naranja de la yema de
huevo y en la piel de pollos y gallinas (Marusich y Bauernfeind, 1981). Un color
óptimo de la yema se consigue por adición de un pigmento base amarillo (como
luteína, etil éster del ácido β-apo-w-carotenoico) y uno naranja-rojo, preferentemente
un cetocarotenoide (tales como astaxantina, cantaxantina, y/o zeaxantina). A su vez,
en salmónidos, la absorción de los carotenoides ocurre a nivel del píloro (Torrisen,
1986), de donde pasa a la piel y al músculo, y como ocurre en el caso anterior se ha
asegurado la ingesta continua de los pigmentos para asegurar la llegada al período
de fertilidad reproductiva.
 P á g i n a | 12

Resultados.

Género Monascus

A. Condiciones fermentativas en Monascus

Medios de cultivo comunes son el agar papa dextrosa (PDA) y agar extracto de
malta (MEA) (ATCC, 2004). El crecimiento se hace posible entre 15-18°C (mínimo)
y a 45°C (máximo) (Pitt, 1997), pero la síntesis de pigmentos varía mucho entre
especies y depende además de las condiciones de cultivo. El rango de T° óptimo
para el crecimiento de Monascus es de 28-32°C, aunque esta temperatura varía
dependiendo de la cepa entre 25 y 37°C (Lin, 1991). El crecimiento se ha
observado de 2.5 a 8.0, con un rango ideal de 4.0-7.0 (Yongsmith, 1993). Durante
el cultivo de Monascus, se produce CO2, etanol y acetato.

Cuando se usó SSF de arroz, Rosenblitt y col. (2000) evidenciaron que a las 240
horas finales de fermentación, el balance de carbono fue el siguiente: 23% del
carbono se convierte en biomasa, 35% en CO2, 15% en etanol, 1% en ácido
acético y un 17% permaneció sin usar. En condiciones ideales en fermentación de
columna se obtuvo una velocidad máxima de crecimiento específico de 0.039 h -1 y
una velocidad de producción específica de pigmento de 27.5 UA/g de biomasa por
hora, a 140 horas con 500 UA/g fermentado seco después de 12 días. La
velocidad específica de formación de producto en el biorreactor fue de 4.7 UA/gh,
a un tiempo de 240 horas de fermentación, y la producción total de pigmento fue
de 108.7 UA/g fermentado seco después de 15 días (de Carvalho, y col., 2006).
Mismos autores, en 2007 concluyeron que el arroz es el mejor sustrato para el
cultivo en SSF. Empero, algunos de los otros sustratos utilizados también
presentaron una buena producción de pigmentos, especialmente el maíz, el trigo y
la yuca. El bagazo de Yuca dio un bajo rendimiento de pigmento, pero es un
residuo agroindustrial cuyo bajo precio podría compensar su bajo rendimiento. Sin
embargo, la producción eficiente de pigmento con este sustrato requiere que se
agreguen otros nutrientes al medio de cultivo. En este estudio, el tiempo de
fermentación óptima para SSF con bagazo de yuca fue de 10-11 días. La
producción de pigmentos de color amarillo fue superior a la de los pigmentos rojos,
pero la relación rojo/amarillo (500Abs/400Abs) creció durante el curso del
proceso. La comparación de varios disolventes para la extracción exhibió que el
metanol era el mejor disolvente, seguido cercanamente por el DMSO y el
etanol. Los resultados también indicaron que una mezcla de etanol-agua con
Etanol al 60% (p/p) era más eficaz que otras concentraciones de etanol.

Por otro lado, algunos pigmentos producidos por Monascus sp. son intracelulares
e insolubles en agua, pero de acuerdo a las condiciones de crecimiento tales
como la fuente de nitrógeno, el pH y la aireación pueden resultar en la formación
de pigmentos extracelulares y solubles en agua (Hayyay et al., 1998).
 P á g i n a | 13

La glucosa es el sustrato principal, pero además pueden usarse etanol (Hamdi y

col., 1997), glicerina cruda, y residuos agrícolas. Pigmentos rojos se han obtenido
del crecimiento del hongo en medio sólido con yuca (Babitha; Soccol; y Pandey,
2006), jarabe de maíz (Hamano; y Kilikian, 2006), harina de trigo (Domínguez-
Espinosa y Webb, 2003), harina de camarón y con exoesqueleto de cangrejo
(Wang y col., 2002), jugo de pera (Hamdi; Blanc; y Goma, 1996), y los residuos de
la uva (Silveira; Daroit; y Brandelli, 2008). Por otro lado, la mayor síntesis de
colorantes rojos obtenidos usando glicerina y glucosa como sustratos fue de 8.28
UA (510nm) con una productividad de 0.13 UA (510nm) /h-1 y 2.15 g/L de
biomasa. La producción de pigmentos se asocia al crecimiento; la fuente de
nitrógeno y el pH tienen grandes efectos que favorecen la producción de
pigmentos rojos y el crecimiento de Monascus sp. En estudios anteriores
(Meinicke y col., 2012), se obtuvo un máxima de 7.38 UA de pigmentos rojos en
matraces usando glicerol. Pastrana y col. (1995) estudiaron la producción de
pigmentos en un biorreactor de 20 litros usando glucosa como sustrato, y
obtuvieron 9.7 UA de pigmento rojo. Las condiciones óptimas de cultivo en un
biorreactor de 3 litros obtenido por Lee y col. (2001) fueron: 5,9 g/L-1 de biomasa y
13.37 UA de pigmentos rojos, en 80 horas de cultivo. Orozco y Kilikian (2008)
estudiaron los parámetros cinéticos en un biorreactor de 4 litros; obtuvieron 5.2-
10.4 g/L-1 de biomasa y 11.3 UA de pigmentos rojos al usar M. purpureus y
glucosa como sustrato; la mayor producción se obtuvo a pH 6.5-8.5. Otros autores
refieren que a pH 5.45-6.23 se favorece la liberación y producción de pigmentos
rojos (Chen, y Johns, 1993; Blanc y col., 1995). De Carbalho, y col. (2006),
lograron una disminución del pH en la etapa inicial del cultivo, seguido de un ligero
aumento constante en la siguiente etapa. Mismo comportamiento detectaron Teng
y Feldheim (2001) en cultivos con M. purpureus, y Domínguez y Webb (2003)
también observaron una disminución en el pH al comienzo del cultivo. Cuando los
pigmentos se excretaron al medio, el pH se mantuvo igual o ligeramente mayor
que su nivel original (6-7).

La tasa de crecimiento específico obtenido por Hamdi, Blanc y Goma (1996) fue
de 0.1 y 0.05 h-1, y la tasa de producción específica de pigmentos rojos fue de
0.08 y 0.2 UA/g-1. La tasa de producción específica de pigmentos aumentó
continuamente con la formación de pigmento rojo y llegó a 7.85 al final del cultivo.
En un biorreactor de 20 litros, Pastrana y col. (1995) observaron un crecimiento
máximo específico de 0.04 h-1 y 0.08 UA/g h-1 de tasa máxima de producción
específica de pigmentos rojos en un cultivo que duró 180 horas
utilizando Monascus ruber y glucosa como sustrato. Las cuatro cepas de
Monascus utilizadas en dicho trabajo se compararon con respecto a la velocidad
de crecimiento en PDA, medido a través del crecimiento radial y en relación a la
síntesis de pigmento rojo usando como fuente de SSF, arroz y bagazo de yuca,
después de 7 y 11 días de fermentación, respectivamente. El análisis mostró que
las cepas 1991, 2897 y LPB 31 se desarrollaron de una manera comparable, pero
 P á g i n a | 14

las colonias más grandes fueron las de LPB 31, mientras que la cepa 3802
presentaba colonias un 30% más pequeñas. La velocidad de crecimiento, mostró
que la cepa aislada, LPB 31, presentaba una velocidad de crecimiento similar a las
cepas NRRL 2897 y NRRL 1991, y superior a la cepa CCT 3802 (Tabla 1).

Se utilizó el bagazo de yuca porque es un sustrato tradicional para SSF en LPB,

mientras que el arroz es el sustrato tradicional para la producción de pigmentos en
Monascus. Al comparar las características de las cepas probadas con otros
evaluados por Miyashira (2003), también en el uso de arroz como SSF, es
evidente que la cepa aislada, LPB 31, es superior a otras cepas ensayadas, y que
su producción de citrinina, fue la más baja de todas las cepas.

B. Condiciones funcionales de los biopigmentos

Varios estudios refieren una baja o nula toxicidad de los pigmentos de Monascus
(Lin, 1991a). Sin embargo, se ha demostrado la existencia de la toxina fúngica
citrinina (Blanc et al., 1995a), pero no en todas las cepas. La fuente de nitrógeno
utilizada interfiere en la producción de citrinina; para la misma cepa de M. ruber en
un medio sintético con etanol, la producción de citrinina varió de 0 mg/L usando la
metionina como fuente de nitrógeno, a 100 mg/L usando nitrato de amonio como
fuente de nitrógeno (Blanc, 1995).

Por otro lado, estudios sobre la toxicidad de los extractos mostraron que hubo de
hecho una actividad antibiótica para Monascus, especialmente los pigmentos
naranjas y, en menor grado, los rojos (Martínková, 1995).

C. Estabilidad de los pigmentos.

Según Lin y Demain (1992), estos pigmentos son estables a una amplia gama de
pH. Fabre (1993), demostró que salsas y patés con pigmento rojo
de Monascus muestran un color residual de 92-98% luego de tres meses a 4°C, y
con buena aceptación sensorial. Sin embargo, estos pigmentos son inestables a la
luz (sólo se mantiene un 20% del color residual después de 50 días) y frente al
calor (45% del color residual después de 2 horas a 100°C). Estos pigmentos son
más estables a pH básico o neutro (Fabre 1993, Lee 2000). Carvalho, y col. (2005)
 P á g i n a | 15

midieron la absorbancia residual relativa de pigmentos a distinto pH y T°; la

absorbancia disminuyó en el tiempo, y dicho patrón se reforzó a temperaturas
crecientes (degradación térmica), lo que supone un problema en alimentos que
pasan por un tratamiento calorífico (Fig. 2). A pH bajo el color disminuyó más
rápido (Fig. 3), lo que supone un problema para su aplicación en alimentos ácidos,
(ej.: leches fermentadas); esto último debido a la ruptura de un enlace éster en
rubropunctamina o monascorubramina. En resumen, los resultados indican que
existe una disminución importante del color a todos los pH, a temperaturas
superiores a 60°C, y que en pHs más altos (cerca de la neutralidad), el pigmento
es más estable. Estos resultados están de acuerdo con lo señalado por Fabre
(1993) y Lee (2000).
 P á g i n a | 16

Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma)

A. Condiciones fermentativas en X. dendrorhous (Phaffia rhodozyma)

Medios de cultivo de bajo costo utilizan: residuos de alfalfa (Okagbue y Lewis,

1984), melazas de caña de azúcar (Haard, 1988; Fontana y col., 1996),
hidrolizados de turba (Martin y col., 1993; Vazquez y Martin, 1998), zumo de uva
(Meyer y du Preez, 1994a), subproductos de la maceración húmeda del maíz
(Hayman y col., 1995), jugo de caña de azúcar (Florencio y col.,1998), hidrolizados
hemicelulósicos de eucalipto (Parajo y col., 1998b), hidrolizados de Yucca fillifera
(Ramírez y col., 2000), leche de coco (Domínguez-Bocanegra y Torres-Muñoz,
2004) o residuos de mostaza (Tinoi y col., 2006) (Tab.3).

La astaxantina (Fig. 5) se produce en la fase exponencial de crecimiento celular y

la mayor parte se acumula en la fase estacionaria. Para un crecimiento óptimo, el
pH y la temperatura deben mantenerse entre 5.0 y 22°C, respectivamente. P.
rhodozyma, genera 30-800 ppm de astaxantina libre/kg levadura seca (Markovits,
1991), dependiendo del medio de cultivo.

Aumentan la síntetis de carotenoides: la valina (Meyer y col., 1993), el extracto de

levadura (Fang y Cheng, 1993), el ácido acético (Meyer y duPreez, 1993), el ácido
mevalónico (Calo y col., 1995) y el etanol (Gu y col., 1997). Precursores de la
síntesis de astaxantina, como el licopeno, añadidos al medio de cultivo estimulan
la producción de astaxantina. El uso de algunos de estos compuestos, como el
mevalonato (precursor de los isoprenoides), aumenta considerablemente la
producción de astaxantina (hasta cuatro veces), pero es demasiado caro para
usarlo en fermentaciones a gran escala (Calo y col., 1995). Sin embargo,
compuestos como el etanol, constituyen una forma simple y económica de
incrementar la producción de astaxantina en procesos industriales (Gu y col.,
1997). Un incremento en la producción de carotenoides se observó con un
descenso en la concentración de nitrógeno en el medio (Meyer y du Preez, 1994b;
Yamane y col., 1997; Flores-Cotera y col, 2001). La disminución en la
concentración de nitrógeno genera una reducción en la síntesis proteica, lo que
hace que aumenten los niveles de carbono, ATP y NADPH en la célula; para
adecuar estos niveles al estado normal, se produce un aumento en la síntesis de
ácidos grasos y carotenoides (Flores-Cotera y col., 2001).

En el uso de caldo nutritivo de extracto de malta y levadura, se reportan 487 ppm

(Martin y Sivagurunathan, 1999); pero con cultivos mutantes, se obtienen valores
de 3000 ppm o superiores. An y col. reportaron el aislamiento de dos mutantes
que producían 800-900 y 900-1300 μg. de astaxantina/g de células. Meyer y col.,
luego de un tratamiento con nitrosoguanidina (NTG), obtuvieron una mutante de
Phaffia que sintetizaba 1688 μg/g de biomasa, contra los 330 que producía la cepa
silvestre, si bien disminuyó el crecimiento celular y la máxima velocidad específica
de crecimiento, aumentó la producción de pigmento. El uso de manitol y succinato
 P á g i n a | 17

como fuentes de carbono, aumentó igualmente la tasa de generación de 1926 a

1973 μg/g de biomasa respectivamente. Fang y Cheng, estudiaron distintas cepas
con NTG, usando el medio agar YM con β-ionona. Una cepa mutante (NCHFU-FS
301), tuvo una producción de 1515.63 μg/g de células, mientras que la cepa
silvestre CBS-6398 sólo obtuvo una producción de 565.08 μg/g de células.
Determinaron además que con glucosa como fuente de carbono se tuvo una
producción de 7809.3 μg/L de astaxantina, y que el extracto de levadura fue la
mejor fuente de nitrógeno al producir un valor de pigmento de 8637.6 μg/L.

Inhiben y/o reducen la producción del carotenoide: la luz, la saponina, las

condiciones semianaeróbicas y las concentraciones de glucosa superiores a 1.5 %
(p/v); esto, debido a que la síntesis de carotenoides ocurre una vez que la glucosa
del medio se ha agotado, por lo que concentraciones elevadas de este
carbohidrato, si bien proporcionan altas tasas de crecimiento, provocan un
descenso en la síntesis de carotenoides.

Inconvenientes en la obtención son: i) la levadura tarda 7 días en alcanzar la fase

estacionaria de crecimiento; ii) la astaxantina es producida intracelularmente,
asociada fuertemente a membranas celulares, de modo que los animales
alimentados con células intactas del hongo son incapaces de asimilar el pigmento
debido a que no pueden digerir la pared de la levadura (Johnson y col., 1978).
Para que la astaxantina sea asimilada por el animal es necesario añadir la
levadura lisada o bien obtener pigmento como extracto. Para lo primero, se han
usado enzimas líticas de Bacillus circulans WL-12 (Johnson y col., 1978), o bien
provenientes de cultivo mixto (Johnson y col., 1978); problemáticas de esta cepa
es el estrecho rango de pH al que crece, lo cual implica la necesidad de reajustar
el pH del medio. El uso de hongos hiperparásitos (ej: Trichoderma harzianum)
evita el uso de dichas enzimas líticas; iii) La concentración de pigmento presente
en extractos de P. rhodozyma oscila entre 50-300 flg. de astaxantina por gramo de
levadura seca según la cepa. Por tanto, hay que añadir gran cantidad de levadura
a la dieta para proporcionar 50-200 mg de astaxantina por kg de alimento para
lograr una pigmentación adecuada de salmónidos (An y Johnson, 1989). Este
aporte alto de levaduras supone un suplemento excesivo de nutrientes que podría
ser perjudicial debido a que según se ha evidenciado, esto produce un engorde
excesivo del animal. Por ello, es preferible la administración tanto del pigmento
aislado como de cepas de levadura hiperproductoras en las que la relación
pigmento/biomasa de levadura sea más beneficiosa para la nutrición integral del
animal.

B. Condiciones funcionales de los biopigmentos

El grupo cromóforo en astaxantina constituye un agente fotoprotector y

antioxidante en P. rhodozyma (Nelis y De Leenheer, 1989). Contrarresta el efecto
del peróxido de hidrógeno (H2O2), radicales superóxido (O2-), hidroxilo (OH-), el
 P á g i n a | 18

oxígeno monoatómico (1O2), y de los radicales libres (Krinsky, 1979). Así, los
carotenoides, localizados en glóbulos lipídicos en el citoplasma y en las membranas de la
levadura, compensan la falta de enzimas antioxidantes (Schroeder y Johnson, 1993;
1995a; 1995b). Los carotenoides, que están asociados con los lípidos y con la membrana
celular, pueden servir como un excelente mecanismo de defensa contra la peroxidación
lipídica en la célula (Schroeder y Johnson, 1995a). Además, los radicales peróxido
reducen el contenido de astaxantina en X. dendrorhous por degradación oxidativa,
desencadenando un aumento en la concentración de β-caroteno, lo que sugiere la
existencia de un mecanismo de retrorregulación de la carotenogénesis por el producto
final (Schroeder y Johnson, 1995b).

C. Estabilidad de los pigmentos.

La inestabilidad de estos pigmentos se produce frente a agentes físicos (luz, oxígeno,

calor) y químicos (ácidos, y a veces bases). La exposición a la luz solar, y UV induce una
fotoisomerización cis-trans llevando a la destrucción de los carotenoides. Estos pigmentos
son termolábiles, por lo que es necesaria seleccionar aquellos solventes que presentan
menor punto de ebullición; así, las fracciones ligeras de petróleo, con un punto de
ebullición de 30-60 oc son preferibles a las fracciones pesadas. Los carotenoides pueden
ser oxidados por oxígeno o por peróxidos, siendo particularmente sensibles a la oxidación
en cromatografía de capa fina, por lo que es necesario trabajar en atmósfera inerte
(Davies, 1976). Los cristales de los carotenoides son además sensibles a la oxidación
cuando están expuestos al aire y deben ser mantenidos en atmósfera inerte o a vacío
(Britton, 1992). Se caracterizan por su insolubilidad en agua y su alta solubilidad en
disolventes orgánicos e incluso en aceites vegetales.
 P á g i n a | 19

Discusiones y conclusiones

Un punto crítico en la obtención de los pigmentos, sean estos de bacterias o bien

de hongos, es el proceso de extracción.

Para endopigmentos, se debe romper la pared celular según los siguientes

métodos: 1) ruptura mecánica por tratamiento con homogeneizador Braun, o bien
el paso por una prensa de French; empero, estos métodos son laboriosos, y
requieren un gran aporte energético, por lo que su aplicación a escala industrial es
difícil; 2) ruptura celular química por hidrólisis ácida o alcalina; sin embargo,
algunos pigmentos (como el caso de carotenoides) son susceptibles al uso de
ácidos o bases; 3) ruptura enzimática, mediante la cual se destruye la pared
celular por medio de enzimas líticas de origen microbiano (un ejemplo es el uso de
las enzimas del microorganismo Bacillus circulans cepa WL-12, que en diferentes
estudios presentaron una elevada actividad lítica (Johnson y col., 1978; Tangeraas
y col. 1989), o bien el caso de la enzima lítica de la levadura Rhizoctonia solanni.
Con posterioridad al tratamiento, el pigmento se debe extraer por aplicación de
disolventes específicos tales como éter, cloroformo, benceno, ácidos o bases.

Estos solventes orgánicos, no obstante resultan poco efectivos por ser tóxicos,
inflamables, poco selectivos y muy laboriosos. Como solución a la problemática
anterior, se debe aplicar la tecnología de fluidos supercríticos (FSC), la cual se ha
aplicado exitosamente a la extracción de pigmentos como el caroteno, la bixina, y
el licopeno desde vegetales y frutas, ya que los extractos obtenidos mediante la
tecnología de FSC se caracterizan por no contener residuos ni contaminantes.

Existen dos solventes que se utilizan en esta tecnología (Fig. 4.): el dióxido de
carbono y el agua supercrítica; ambos, bajo condiciones cuasicríticas exhiben
propiedades solventes atractivas, no son tóxicos ni inflamables y presentan un
bajo costo. En referencia al tiempo de producción mediante esta tecnología, es
relevante destacar que requiere un tiempo de trabajo inferior si se compara con
otras técnicas de extracción, como son la destilación o la aplicación de los
solventes orgánicos mencionados, ya que demanda un menor número de
operaciones, al no generar residuos en el proceso, evitando así una posterior
operación de separación y/o purificación.

La tecnología de FSC se basa en el denominado punto crítico, que es específico

para cada solvente, y se define como la presión y temperatura a las cuales el gas
y el líquido son indistinguibles; por encima de éste punto los fluidos presentan
características de ambas fases, propiedades similares a las de los gases, como su
gran difusividad (capacidad de difundir a través de un medio), y otras que los
asimilan más a los líquidos, tal cual es su alta densidad (Domínguez y Parzanese,
2011).
 P á g i n a | 20

La desventaja de FSC es que los costos de operación son elevados, por lo que se
necesita de una inversión inicial alta, hay una baja disponibilidad de equipos y hay
un reducido desarrollo de diseños, además de tener un costo de mantenimiento
elevado. El valor de un equipo cuya capacidad de operación es de 4 ó 5 litros, en
algunas de las firmas americanas o europeas que se dedican a fabricarlas, ronda
los US$ 150.000.

En resumen la principal limitación desde el punto de vista económico es el costo

energético requerido para mantener las altas presiones a establecer. Debido a ello
hasta el momento esta tecnología se ha aplicado a productos que, por su alto
valor agregado, consienten absorber dichos costos: aromas, pigmentos, aditivos
alimentarios, compuestos bioactivos, productos farmacéuticos. En este sentido, las
líneas de investigación deben orientarse a la búsqueda de nuevos solventes, con
propiedades específicas deseadas (como etano, propano, agua, mezclas de
solventes; y hacia la optimización de los procesos, para minimizar el costo
energético requerido (Domínguez y Parzanese, 2011).
 P á g i n a | 21

Recomendaciones

En vista a lo estudiado, es necesario hacer notar que las investigaciones se deben

orientar hacia la identificación de nuevas especies microbianas, con potenciales
biopigmentos nuevos, o bien, que sinteticen los ya conocidos, pero que presenten
elevadas tasas de generación de pigmentos y altas velocidades específicas de
crecimiento; todo lo anterior de acuerdo a las condiciones de cultivo óptimas, tanto
nutricionales como a las condiciones físico-químicas propias de cada especie.

Por otro lado se deben hacer mayores estudios en relación a la genética molecular
de cada una de las cepas ya identificadas, logrando un mapeo completo de sus
genes, tanto en cepas silvestres como mutantes. Además se debe determinar
específicamente la función biológica de metabolitos primarios y secundarios de
estos microorganismos, con énfasis en la funcionalidad de los pigmentos con
potencial uso en la industria de los alimentos.

Otra línea de investigación debe centrarse en la bioseguridad de los pigmentos

obtenidos, identificando todos aquellos biocolorantes potencialmente tóxicos para
los consumidores, y con ello, aplicar métodos bioquímicos y biotecnológicos que
logren modificar las propiedades propias de cada uno de ellos, eliminando la parte
perjudicial y expresando en ellos otros constituyentes que entreguen un valor
agregado a cada pigmento, tales como concentraciones de determinadas
vitaminas, aminoácidos, y otros constituyentes con beneficio a los consumidores.

La ingeniería genética debe potenciar los estudios sobre la generación de cepas

superproductoras de biopigmentos, sobreinduciendo la expresión de los genes
transcripciones, y enfocándose en la expresión de pigmentos exógenos en
aquellas cepas que no los expresan naturalmente, tal es el caso mencionado de
Escherichia coli, trasformada y condicionada para la síntesis de carotenoides,
organismo de fácil manejo tanto a nivel de laboratorio como industrial. Mismo
ejemplo, es el practicado por Meyer y col., que obtuvieron una mutante de Phaffia
rhodozima que sintetizaba 1688 μg/g de biomasa, contra los 330 que producía la
cepa silvestre, o bien el caso de la cepa mutante (NCHFU-FS 301), que tuvo una
producción de 1515.63 μg/g de células, mientras que la cepa silvestre CBS-6398
sólo una producción de 565.08 μg/g de células.

Siguiendo la lógica anterior, el estudio debe enfocarse en producir y mejorar las

bacterias y hongos superproductores fuertes de pigmentos; es decir, aquellos que
sintetizan más de 1 g/L de estos colorantes, como es el caso de los hongos
Eremothecium ashbyii y Ashbya gossypi, que producen dichas concentraciones de
riboflavina. Metabolitos como este, pueden ayudar a suplir la ingesta recomendada
de dicha vitamina, y orientarse a sectores específicos del mercado, tal como
 P á g i n a | 22

mujeres embarazadas y en condiciones de lactancia, que necesitan 1.4 y 1.6 mg

de riboflavina por día, respectivamente (Biesalski y Grimm, 2007).

En otra perspectiva, se deben buscar métodos físicos, químicos y biológicos, que

mantengan estable en el tiempo las propiedades de los pigmentos extraídos, ya
que muchos de ellos son sensibles al calor, inestables a determinados intervalos
de pH, y/o se desvanecen por acción de la luz. Encontrar los ajustes óptimos para
cada pigmento, logrará mantener estables la vida de anaquel de los alimentos en
los que este se aplicó, y por consiguiente las propiedades organolépticas de ellos.

En conjunto a lo anterior, se deben buscar nuevos métodos de extracción, tanto de

endopigmentos como exopigmentos; asegurar de la misma forma un 100% de
pureza de los extractos, ya que con los métodos de extracción tradicionales
algunas veces se extraen sustancias innecesarias y hasta metabolitos tóxicos.
Debido a lo anterior, también se deben optimizar los procesos de post-extracción.

Finalmente, el éxito de cualquier pigmento producido por la fermentación de

microorganismos depende de su aceptación en el mercado, la aprobación
regulatoria, y el tamaño de la inversión de capital necesaria para llevar el producto
al mercado. De cualquier forma, el uso de biopigmentos es una alternativa mucho
más segura que el uso de su contraparte sintética, además últimamente se ha
enfatizado el movimiento y cultura de “lo natural” por parte de los consumidores,
por lo que el interés de los empresarios de la alimentación sobre la obtención de
biopigmentos de origen microbiano, se ve como un buena fuente de ganancias.
 P á g i n a | 23

Referencias

Libros

- FIGUEROA, Eugenio. Biodiversidad marina: valoración, usos y

perspectivas: ¿hacia dónde va Chile?. Santiago, Chile. Editorial
Universitaria, 2005. Págs. 360-361.
- BELLO Gutiérrez, José. Ciencia bromatológica: principios generales de los
alimentos. Madrid, España. Ediciones Díaz de Santos, 2000. Págs. 179-
181.
- ABBAYES, H., CHADEFAUD M., FELDMANN J., DE FERRÉ Y., GAUSSEN
H., GRASSÉ P., PRÉVOT A. Botánica: vegetales inferiores. Barcelona,
España. Editorial Reverté, 1989. Págs. 9-11.
- CANEVA G., NUGARI, María Pía, SALVADORI O. La biología en la
restauración. Volumen 5 de Arte y restauración. Andalucía, España.
Editorial NEREA, 2000. Págs. 54-55.

Tesis

- GARCÍA Guerra, Ana. Estudio de la producción de astaxantina por

Xanthophyllomyces dendrorhous. Tesis (Doctorado en Biotecnología).
León, España. Universidad de León, Departamento de Biología Molecular,
2012 (176 h).

Revistas

- MÉNDEZ Zavala A., CONTRERAS Esquivel J.C., LARA Victoriano F.,

RODRÍGUEZ Herrera R., AGUILAR C. N. Producción fúngica de un
pigmento rojo empleando la cepa xerofilíca Penicillium purpurogenum GH-
2. Universidad Autónoma Metropolitana de México. Iztapalapa, México.
Revista Mexicana de Ingeniería Química, vol. 6, núm. 3, 2007, págs. 267-
273.
- PÉREZ Galván, C., MONTAÑEZ Sáenz, J. C., MÉNDEZ Zavala, A.,
RAMOS Ponce, L. M., LARA Cisneros, G. Producción fúngica de un
pigmento amarillo a partir de una cepa de Aspergillus ustus. Coahuila,
México. Editorial Universidad Autónoma de Coahuila, 2010.
- VILLA, Pilar., CALO, Pilar. SÍEIRO, Blanco, y SÍEIRO, Carmen. Phaffia
rhodozyma: primer microorganismo explotado para la producción de
astaxantina. Departamento de Microbiología. Facultad de Farmacia.
Universidad de Santiago de Compostela, España.

Artículos de Revistas

- DE CARVALHO, Júlio Cesar, PANDEYB, Ashok, OLIVA, Bruno, BRANDA,

Débora, RODRÍGUEZ-LÉONA, José Ángel, SOCCOLA, Carlos Ricardo.
Relación entre el crecimiento, análisis respirométrico y producción de
biopigmentos desde Monascus por fermentación en estado sólido. Revista
 P á g i n a | 24

de Ingeniería Bioquímica (Biochemical Engineering Journal). Editorial

Elsevier. Volumen 29. Págs. 262-269. 15-Abril-2006.
- NINET L., RENAUT J. y TISSIER R. Activación de la biosíntesis de
carotenoides por Blakeslea trispora. Revista de Biotecnología y
Bioingeniería (Biotechnology and Bioengineering). Editorial John Wiley &
Sons, Inc. Volumen 11, pags. 1195-1210, Noviembre de 1969.
- THOMAS D.M., GOODWIN T.W. Estudios de carotenogénesis en Blakeslea
trispora—I.: Observaciones generales de la síntesis en cepas con y sin
acoplamiento. Revista de Fitoquímica (Phytochemistry). Volumen 6. Marzo
de 1967. Págs. 355–360.
- FANG, Tony J., CHENG, Yi-Shin. Mejora de la producción de astaxatina
por Phaffia rhodozyma a través de la mutación y optimización de las
condiciones de cultivo. Revista de Fermentación y Bioingeniería (Journal of
Fermentation and Bioengineering). Volumen 75, Marzo de 1993. Págs.
466–469.
- HAILEI, W, ZHIFANG, R, PING, L, YANCHANG, G, GUOSHENG,
L, JIANMING, Y. Mejora de la producción de un pigmento rojo en
Penicillium sp. HSD07B sintetizado durante co-cultivo con Cándida
tropicalis. Revista Bioresour Techno. Editorial Elsevier. 9 de Marzo de 2011.
- VÁSQUEZ Rodríguez, Jesús Alberto, GARCÍA Díaz, Graciela, NÚÑEZ
González, María Adriana, HERNÁNDEZ Luna, Carlos, PALACIOS Cortés,
Lucía. Efecto de hidrolizados enzimáticos de grano e inflorescencia de
Amaranto (Amaranthus cruentus) sobre la producción de pigmentos
carotenoides en cultivo mixto de Saccharomyces exiguus y Phaffia
rhodozyma. Revista de la Facultad de Ciencias Biológicas, UANL.
Monterrey, México. 2007.
- LIM, Seong Han, CHOI Jong Soo, PARK Enoch Y. Producción microbiana
de riboflavina usando los superproductores de riboflavin: Ashbya gossypii,
Bacillus subtilis, y Cándida famate. Revista de Biotecnología e Ingeniería en
Bioprocesos (Biotechnology and Bioprocess Engineering). Volumen 6, Abril
de 2001. Págs. 75-88.
- DUFOSSÉ, Laurent. Producción microbiana de pigmentos de calidad
alimentaria. Chicago, EEUU. Revista Food Technol, 2006. Volumen 44.
Págs. 313–321.

Referencias electrónicas

- MEINICKE Bühler, Rose Marie, DUTRA, Anderson Cesar,

VENDRUSCOLO, Francielo; ESTEVES, Moritz Denise, NINOW, Jorge Luiz.
Producción de pigmentos de Monascus en biorreactor utilizando un co-
producto de biodiesel como sustrato [en línea]. Ciencia y tecnología de
alimentos (Food Science and Technology), Febrero de 2013.
<<http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0101-
20612013000500002&script=sci_arttext>> [consulta: 18 de Octubre de
2014].

View publication stats