TOXICOLOGÍA AMBIENTAL Y SALUD PÚBLICA

(CIENCIAS AMBIENTALES)

CUADERNO DE PRÁCTICAS
CURSO 2020-21

ÚNICA FECHA DE ENTREGA: HASTA EL 15 DE ENERO

DE 2021
(NO SE ADMITE LA ENTREGA POSTERIOR A ESTA
FECHA, TAMPOCO EN SEPTIEMBRE)
El cuaderno debe enviarse a través del curso virtual
utilizando la herramienta “Entrega de trabajos”. Se
debe entregar en formato PDF (puede emplear el
programa gratuito PrimoPDF para la conversión de
Word a PDF).
Es obligatorio contestar todas las preguntas y
hacerlo en castellano.

Nombre y Inés Núria Draaijer Rodríguez

Apellidos:

Correo Inesdr1704@gmail.com
electrónico:

1
2
 Prácticas de Toxicología Ambiental y Salud Pública – 2019-20

PRÁCTICA 1
ETIQUETAS Y FICHAS DE DATOS DE SEGURIDAD
Una de las normas de seguridad más importantes a la hora de trabajar en el laboratorio
es conocer la información relativa a los productos químicos que se manipulan. Los
proveedores de estos productos deben incluir de forma obligatoria una ficha de datos de
seguridad (FDS) que complementa la información que se aporta en la etiqueta con los
riesgos que supone el compuesto para la salud y la seguridad de las personas que los
manipulen, así como para el medio ambiente.
1.1 En el Anexo II del Reglamento (CE) Nº 1907/2006 (REACH) (L396/267) corresponde a la
“Guía para la elaboración de fichas de datos de seguridad”. Utilizando esta guía,
conteste a las siguientes cuestiones.
Respuestas:
Pregunta Respuesta
1 C
2 A
3 A
4 A
5 C
6 D
7 A
8 D
9 D
10 C

1.2 El CLP o Reglamento CLP es el Reglamento (CE) Nº 1272/2008 (modificado en el

Reglamento (CE) Nº 790/2009) sobre clasificación, etiquetado y envasado de
sustancias y mezclas, y por el que se modifican y derogan las Directivas 67/548/CEE y
1999/45/CE y se modifica el Reglamento (CE) Nº 1907/2006 (REACH). Entró en vigor el
20 de enero de 2009 y es de aplicación en toda la Unión Europea. En su Título III se
establecen las normas generales para la comunicación del peligro de una sustancia o
una mezcla mediante el etiquetado de su envase. Utilizando las Partes 3 y 4 del Anexo I
de este Reglamento (página 116 del 1272/2008), relativas a los peligros para la salud y
para el medio ambiente, indique a qué tipo de peligro se refiere cada uno de los
siguientes textos que se indican a continuación:

1 D
2 D
3 B

3
4. ¿Por qué se plantean criterios diferentes para la exposición a la sustancia y la exposición a
mezclas?
Porque la toxicidad de una sustancia puede incrementar o disminuir como consecuencia de la
exposición simultánea o consecutiva con otra, y los efectos combinados de dos o más compuestos
pueden ser muy diferentes de los que ejercerían aisladamente. Aunque el estudio de los efectos
tóxicos se basa en el análisis individualizado de cada uno de ellos es importante tener en cuenta que
la exposición simultánea a más de un tóxico puede tener importantes consecuencias en sus efectos.
Los tóxicos pueden interaccionar de forma que el resultado sea más complejo de lo esperado,
produciéndose una potenciación y/o la aparición de efectos sinergísticos, aditivos o incluso
antagonistas.

1.3 La lista de indicaciones de peligro, información suplementaria sobre los peligros y

elementos suplementarios que deben figurar en las etiquetas y la lista de consejos de
prudencia aparecen en los anexos III y IV (página 198 del 1272/2008). En la tabla se
muestran las indicaciones de peligros y los consejos de prudencia referentes a un
producto, complétela explicando lo que significa cada número.

Hazard statements
H202 Explosivo; grave peligro de proyección
H226 Líquidos y vapores inflamables.
H260 En contacto con el agua desprende gases inflamables que pueden inflamarse
espontáneamente.
H312 Nocivo en contacto con la piel.
H317 Puede provocar una reacción alérgica en la piel.
H332 Nocivo en caso de inhalación.
H340 Puede provocar defectos genéticos <Indíquese la vía de exposición si se ha
demostrado concluyentemente que el peligro no se produce por ninguna otra
vía >.
H412 Nocivo para los organismos acuáticos, con efectos nocivos duraderos.
EUH 019 Puede formar peróxidos explosivos.
EUH 204 Contiene isocianatos. Puede provocar una reacción alérgica.
Precautionary statements
P251 Recipiente a presión: no perforar ni quemar, incluso después del uso.
P270 No comer, beber ni fumar durante su utilización.
P231 + P232 Manipular en gas inerte. Proteger de la humedad.
P235 + P410 Conservar en un lugar fresco. Proteger de la luz del sol.
P314 Consultar a un médico en caso de malestar.
P331 NO provocar el vómito.
P336 Descongelar las partes heladas con agua tibia. No frotar la zona afectada.
P350 Lavar suavemente con agua y jabón abundantes.
Luchar contra el incendio desde una distancia razonable, tomando las
P374
precauciones habituales.

4
1.4 A la hora de avisar de los peligros de un compuesto químico existen una serie de
pictogramas que se emplean para que el usuario conozca el tipo de peligro. Utilizando el
documento “Globally harmonized system of classification and labelling of chemicals
(GHS)” de las Naciones Unidas y el anexo V del Reglamento CLP (página 415 del
1272/2008) indique el significado de cada uno de los pictogramas que se indican a
continuación (nota: los de color naranja son los usados antes y han sido sustituidos por
los que tienen el recuadro rojo):

1 2 3

GHS04 Gas bajo presión (GZ). Gases a presión en un recipiente. Algunos

pueden explotar con el calor: se trata de gases comprimidos, licuados o
A1
disueltos. Los licuados refrigerados pueden producir quemaduras o heridas
relacionadas con el frío, son las llamadas quemaduras o heridas criogénicas.
Sustancias tóxicas (T). Producen efectos adversos para la salud, incluso en
A2 pequeñas dosis. Pueden provocar náuseas, vómitos, dolores de cabeza,
pérdida de conocimiento e, incluso, la muerte.
Sustancias nocivas (Xn). Pueden suponer algún tipo de riesgo para la salud
de forma leve (temporalmente o por reacciones alérgicas) debido al contacto,
A3
inhalación o ingestión. Como precaución debe evitarse el contacto con este
producto mediante la utilización de guantes homologados.
GHS03 Sustancias carburentes (CB). Pueden provocar o agravar un incendio
B1
o una explosión en presencia de productos combustibles.
GHS05 Sustancias corrossivas (CR). Estos productos químicos son corrosivos
y pueden atacar o destruir metales. Pueden causar daños irreversibles a la
B2
piel u ojos, en caso de contacto o proyección. Pueden causar daños
irreversibles a la piel u ojos, en caso de contacto o proyección.
Peligroso para el medio ambiente (N). El problema de estas sustancias es que
afectan de forma directa al medio ambiente sin que pueda evitarse el daño al
B3 ecosistema y la capa de ozono. Su manipulación exige una serie de permisos
por el grave daño que puede provocar al planeta y por eso nunca debe ser
expuesto al aire libre. Ejemplos: cianuro de potasio y benceno.

5
PRÁCTICA 2
MÉTODOS DE ENSAYO
La clasificación de las sustancias se hace sobre la base de ensayos bien realizados y
suficientemente validados, considerándose de preferencia los descritos en el Reglamento
(CE) Nº 440/2008 (y las modificaciones al mismo incluidas en el Reglamento (UE) Nº
260/2014).
2.1 En la Parte C de este Reglamento (página 787) se explican distintos métodos de
evaluación de la toxicidad. Respecto al ensayo de toxicidad para quironómidos en
sistemas sedimento-agua con sedimento enriquecido, señale la opción correcta:
Respuestas:

Pregunta Respuesta
1 C
2 B
3 D
4 C
5 C
6 D
7 A
8 D
9 A
10 C

2.2 Realice un esquema de la información que debe incluirse en el informe del ensayo de
inmovilización aguda de Daphnia sp.

El informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:

 Método utilizado
 Especificación precisa de la sustancia (identidad e impurezas) y, en su caso, fase de
purificación previa
 Estimación de la precisión

Deberán indicarse los valores medidos de los puntos de ebullición así como su media (el
punto de ebullición registrado será la media entre dos mediciones, como mínimo, situadas
en la zona de precisión estimada), y la presión o presiones a que se hayan efectuado las
mediciones deberán registrarse en kPa. La presión debe, preferentemente, ser próxima a la
presión atmosférica normal.

Deben suministrarse todas las informaciones y observaciones que se consideren útiles para
la interpretación de los resultados, en particular lo referente a las impurezas y al estado
físico de la sustancia.
6
PRÁCTICA 3
BASES DE DATOS
Como fuente de información toxicológica además de las etiquetas y las FDS (MSDS,
Material Safety Data Sheet en inglés) existen bases de datos disponibles en Internet. La
información que incluyen es abundante siendo necesario organizarla para poder hacer un
buen uso de ella. Cada base de datos presenta una gran variedad de datos, incluyendo
información relativa a estudios realizados, concentraciones analizadas, efectos que se
producen u organismos que se han empleado en los ensayos de toxicidad. Uno de los
objetivos de los créditos prácticos de la asignatura es conseguir que el alumno se familiarice
con las bases de datos y conozca dónde conseguir la información que puede requerir en un
futuro.

3.2 Utilizando la base de datos HSDB responda a las siguientes preguntas sobre el
Glyphosate (CAS 1071-83-6) en el espacio asignado.

1. ¿Se considera corrosivo?

Sí
2. ¿Cuáles son los síntomas de exposición a este compuesto?

Los síntomas de exposición a este compuesto incluyen irritación de la piel, el tracto

gastrointestinal y el tracto respiratorio, convulsiones y coma. También puede causar
respiración mejorada. PELIGROS AGUDOS / CRÓNICOS: Este compuesto irrita la piel,
el tracto respiratorio y el tracto gastrointestinal. Cuando se calienta hasta su
descomposición emite humos muy tóxicos de óxidos de nitrógeno y óxidos de fósforo.
3. ¿Cuál es la LC50 aguda que se ha observado en conejo por vía oral?

3800 mg/kg
4. ¿Qué presión de vapor presenta este compuesto a 25 °C?

9,8*10-8 mm Hg
5. ¿Cuál es la cantidad máxima tolerada en plátano?

0,2 ppm
6. ¿Cuál es la concentración en suero por encima de la que se considera
envenenamiento severo?

1000 mg/L, aunque se debate la relevancia de esto ya que no se cree que el glifosato
induzca toxicidad clínica por sí mismo. Sin embargo, podría ser un biomarcador
razonable de exposición al producto, pero se requiere más investigación para explorar
esta relación.

7
 7. ¿Qué coeficiente de partición octanol-agua tiene?

log Kow = -3,40

8. ¿Cuáles son las rutas posibles de exposición en humanos?

La exposición ocupacional al glifosato puede ocurrir por inhalación y contacto dérmico

con este compuesto en lugares de trabajo donde se produce o se usa glifosato. Los
trabajadores ocupacionales y los jardineros domésticos pueden estar expuestos al
glifosato por inhalación y contacto dérmico durante la pulverización, mezcla y limpieza.
También pueden quedar expuestos al tocar el suelo y las plantas a las que se les aplicó
glifosato. La exposición dérmica también puede ocurrir durante la fabricación, transporte,
almacenamiento y eliminación del glifosato. En una encuesta de California de 1987 sobre
exposiciones ocupacionales relacionadas con pesticidas, las exposiciones al glifosato
fueron (actividad laboral, número de personas expuestas): aplicador en el suelo, en el
suelo, 13; aplicador de mano, 8; aplicador, otro, 1; exposición coincidente, 4; mezclador /
cargador, aplicación terrestre, 4 (1). Los datos de seguimiento indican que la población en
general puede estar expuesta al glifosato a través de la ingestión de agua potable y el
contacto dérmico con productos de consumo que contienen glifosato (SRC).
9. ¿Cuál es la concentración máxima que se ha encontrado en el medio ambiente?

232 ug/L
10. ¿Qué punto de fusión?

189,5 ºC
11. ¿Es soluble en agua?
Sí
12. ¿Qué sinónimos se utilizan para referirse a este compuesto?
glyphosate
1071-83-6
N-(Phosphonomethyl)glycine
Roundup
Glyphosphate
(…)

3.3 La EU – Pesticides database recoge información de interés sobre estos compuestos.

Se va a utilizar para buscar información sobre los pesticidas y su situación actual en
relación a la normativa europea.
Iniciando la búsqueda por sustancias activas (“Search active substances”), conteste a
las preguntas siguientes relativas al Oryzalin (CAS 19044-88-3).

8
 1. ¿Cuál es su estatus actual y en qué fecha expira el mismo?

Está aprobado. Esta aprobación caduca el 31/05/2021.

2. ¿Cuál es el Acceptable operator exposure levels (AOEL) para este compuesto?

0,05 mg/kg bw/día

3. ¿En qué países está autorizado?

España, Francia, Italia y Portugal.

3.4 Existen otras bases de datos que se pueden emplear. Una de ellas es la PPDB:
Pesticide Properties DataBase, de la Universidad de Hertfordshire. Empleando esta
base de datos responda a las siguientes preguntas relativas al compuesto Oryzalin.
1. ¿Para qué tipo de plagas se utiliza?

Malezas herbáceas anuales, incluida la Echinochloa; Setaria incrassata; Digitaria;

Megathyrsus maximus; Malezas de hoja ancha, incluidas la ortiga muerta purpúrea;
quinhuilla; amaranto; hierba mora.
2. ¿Qué modo de acción tiene?
Proceso de crecimiento fisiológico que afecta selectivamente. Inhibición del ensamblaje
de microtúbulos.
3. ¿Qué factor de bioconcentración presenta?

66,1 l/kg
4. ¿Qué solubilidad tiene en solventes orgánicos?
A 20ºC, en mg/l:
250000 - A5 Acetone
91900 - A5 Methanol
0.709 - A5 n-Heptane
1570 - A5 Xylene

5. ¿Qué presión de vapor tiene?

A 20ºC, 1,1*10-7 mPa

9
PRÁCTICA 4
En los últimos años se ha desarrollado una actividad importante en tratar de conjugar la
información disponible para obtener conclusiones integrales. Una herramienta que se ha
puesto en marcha es la Adverse Outcome Pathway wiki, por la acción de un consorcio
formado por diversas organizaciones. Es mantenida por una sociedad enfocada al avance
en las rutas que dan lugar a respuestas adversas [Society for the Advancement of Adverse
Outcome Pathways (SAAOP)]. Esta wiki tiene como objetivo ser un componente de una
base de datos más amplia propuesta por la OECD, la AOP Knowledgebase (AOP-KB), que
tiene como objetivo integrar la información molecular con los resultados procedentes de test
de toxicidad.
Entre en los AOPs pinchando en el enlace correspondiente (en la parte superior) y realice
la búsqueda del término “mitosis”. Conteste a las siguientes preguntas:

1. ¿Quién es el autor de la entrada “Protein Alkylation leading to Liver Fibrosis”?

Brigitte Landesmann
2. Busque el resultado “Constitutive androstane receptor activation leading to
hepatocellular adenomas and carcinomas in the mouse and the rat”. ¿Cuáles son
los sucesos claves [Key Events (KE)] y la respuesta adversa [Adverse Outcome
(AO)]?
KE 1214: Altered gene expression specific to CAR activation, Hepatocytes
KE 716: Increase, cell proliferation (hepatocytes)
KE 774: Increase, Preneoplastic foci (hepatocytes)
AO 719: Increase, hepatocellular adenomas and carcinomas

3. Busque el resultado “Protein Alkylation leading to Liver Fibrosis”. ¿Cuál es su

aplicación a nivel taxonómico (Taxonomic Applicability)?
Humano (Homo sapiens) – Evidencia alta
Rata (Rattus norvegicus) – Evidencia alta
4. Busque el resultado “Protein Alkylation leading to Liver Fibrosis”. Según la
información incluida en el ámbito de aplicabilidad de este AOP (Domain of
Applicability), ¿es dependiente de sexo o se encuentra asociado a una etapa
determinada de la vida? En relación a otras especies, ¿estaría conservado este
AOP en otros organismo?
El AOP descrito es válido para ambos sexos y cualquier etapa de la vida. Sí, los
resultados sugieren que se conservan algunos caminos de unas especies a otras, que
inician y promueven la fibrosis del hígado.
5. ¿Cuál es el AOP cuyo punto de contacto es Kristin Lichti-Kaiser?, ¿en qué
situación se encuentra?, ¿está en algún proyecto de la OECD?
“Constitutive androstane receptor activation leading to hepatocellular adenomas and
carcinomas in the mouse and the rat”. Está bajo revisión y se puede encontrar en el
proyecto 1.17 de la OECD.

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 Prácticas de Toxicología Ambiental y Salud Pública – 2019-20

PRÁCTICA 5
ENSAYO TOXICOLÓGICO
Al valorar la ecotoxicidad de un compuesto el primer paso es realizar un ensayo de
supervivencia exponiendo grupos de animales prueba o de referencia a concentraciones
crecientes del compuesto potencialmente tóxico durante un tiempo definido. El análisis de la curva
dosis-respuesta, en relación a la mortalidad o la supervivencia del organismo estudiado, permite
cuantificar y expresar de forma precisa la toxicidad. En este tipo de estudios se pueden obtener
distintos parámetros de interés como la LC10 o la LC50. Con los datos que se indican:

5.1 Obtenga la LC50 para cada uno de los compuestos mostrados por medio de interpolación
gráfica. Para la representación gráfica puede utilizar el programa Graph.

Antes que nada, hemos realizado la media de los tres experimentos para cada compuesto,
sumando los resultados de cada concentración y dividiéndolo entre el número de experimentos.
Luego, hemos calculado el logaritmo de cada concentración, el porcentaje de mortalidad y el
Probit que corresponde a este.

Compuesto A
Concentración (μg/L)
0 0,001 0,01 0,1 1 10 100
log(Concentr) -3 -2 -1 0 1 2
Experimento 1 30 30 28 23 20 16 12
Experimento 2 30 28 25 23 21 17 11
Experimento 3 30 30 27 23 22 16 10
Media 30 29,3333333 26,6666667 23 21 16,3333333 11
Porcentaje mortalidad 0 2,22222222 11,1111111 23,3333333 30 45,5555556 63,3333333
Probit 2,95 3,77 4,26 4,48 4,9 5,33
Compuesto B
Concentración (μg/L)
0 0,001 0,01 0,1 1 10 100
log(Concentr) -3 -2 -1 0 1 2
Experimento 1 30 25 18 13 7 5 3
Experimento 2 30 26 22 19 15 8 3
Experimento 3 30 22 17 11 8 6 4
Media 30 24,3333333 19 14,3333333 10 6,33333333 3,33333333
Porcentaje mortalidad 0 18,8888889 36,6666667 52,2222222 66,6666667 78,8888889 88,8888889
Probit 4,12 4,67 5,05 5,44 5,81 6,23
Compuesto C
Concentración (μg/L)
0 0,001 0,01 0,1 1 10 100
log(Concentr) -3 -2 -1 0 1 2
Experimento 1 30 28 21 18 15 11 7
Experimento 2 30 29 29 21 17 12 8
Experimento 3 30 28 22 18 16 12 6
Media 30 28,3333333 24 19 16 11,6666667 7
Porcentaje mortalidad 0 5,55555556 20 36,6666667 46,6666667 61,1111111 76,6666667
Probit 3,45 4,16 4,67 4,92 5,28 5,74

11
 Prácticas de Toxicología Ambiental y Salud Pública – 2017-18

Este es el gráfico que se obtiene al representar, para cada compuesto, el porcentaje de individuos
que sobreviven para una determinada concentración (en forma logarítmica.)

Para y=50, obtenemos los siguientes resultados:

Compuesto A: LC50= 17,2934 µg/L

Compuesto B: LC50= 0,0683 µg/L

Compuesto C: LC50= 1,335 µg/L

12
 Prácticas de Toxicología Ambiental y Salud Pública – 2017-18

5.2 Calcule la LC50 para cada uno de los productos mostrados utilizando el análisis Probit.

Si representamos la mortalidad en unidades Probit frente al logaritmo de concentración,

obtenemos estas gráficas con sus correspondientes líneas de tendencia y ecuaciones.

Luego, sustituyendo y=5 y aislando x (deshaciendo posteriormente el logaritmo), obtenemos el

valor de la LC50 para cada compuesto.
Manual:

Compuesto LC50

A 13,219 µg/L

B 0,092 µg/L

C 1,547 µg/L

Programa:

LC/EC 50 (en 95% Confidence Limits

Compuesto
ppm) Lower Upper
A 13.278 1.869 94.318
B 0,094 0013 0.665
C 1.587 0.245 10.271

13
 Prácticas de Toxicología Ambiental y Salud Pública – 2017-18

¿Qué puede decir de la toxicidad relativa de cada compuesto respecto a los otros dos si los
pesos moleculares de estos compuestos son 350.2 g/mol (A), 211.3 g/mol (B) y 127.8 g/mol
(C)?

Para poder comparar las toxicidades de los compuestos, deberemos calcular sus respectivas
concentraciones ponderadas según su peso molecular, y para una concentración determinada
(por ejemplo, 1 g/L).

Molaridad del compuesto A : 1/350,2 = 2,86 10-3 mol/L

Molaridad del compuesto B : 1/211,3 = 4,73 10-3 mol/L
Molaridad del compuesto C : 1/127,8 =7,82 10-3 mol/L

Observamos que el compuesto más tóxico en relación a los otros dos es el C.

5.3. Obtenga la representación normal para cada producto. Esta representación se realiza
calculando la mortalidad relativa específica para cada concentración. Para ello basta con
restar a cada valor de la mortalidad la inmediatamente anterior y representar el diagrama
correspondiente.

Compuesto A
Concentración (μg/L)
0 0,001 0,01 0,1 1 10 100
log(Concentr) -3 -2 -1 0 1 2
Experimento 1 30 30 28 23 20 16 12
Experimento 2 30 28 25 23 21 17 11
Experimento 3 30 30 27 23 22 16 10
Media 30 29,3333333 26,6666667 23 21 16,3333333 11
Porcentaje mortalidad 0 2,22222222 11,1111111 23,3333333 30 45,5555556 63,3333333
Mortalidad acum. 0 2 10 21 27 41 57
Mortalidad 0 2 8 11 6 14 16
Compuesto B
Concentración (μg/L)
0 0,001 0,01 0,1 1 10 100
log(Concentr) -3 -2 -1 0 1 2
Experimento 1 30 25 18 13 7 5 3
Experimento 2 30 26 22 19 15 8 3
Experimento 3 30 22 17 11 8 6 4
Media 30 24,3333333 19 14,3333333 10 6,33333333 3,33333333
Porcentaje mortalidad 0 18,8888889 36,6666667 52,2222222 66,6666667 78,8888889 88,8888889
Mortalidad acum. 0 17 33 47 60 71 80
Mortalidad 0 17 16 14 13 11 9
Compuesto C
Concentración (μg/L)
0 0,001 0,01 0,1 1 10 100
log(Concentr) -3 -2 -1 0 1 2
Experimento 1 30 28 21 18 15 11 7
Experimento 2 30 29 29 21 17 12 8
Experimento 3 30 28 22 18 16 12 6
Media 30 28,3333333 24 19 16 11,6666667 7
Porcentaje mortalidad 0 5,55555556 20 36,6666667 46,6666667 61,1111111 76,6666667
Mortalidad acum. 0 5 18 33 42 55 69
Mortalidad 0 5 13 15 9 13 14

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Prácticas de Toxicología Ambiental y Salud Pública – 2017-18

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 Prácticas de Toxicología Ambiental y Salud Pública – 2017-18

5.4 A la hora de evaluar la toxicidad se emplean parámetros muy variados, entre los cuales
se encuentran los de tipo molecular como pueden ser la expresión de un gen o la
cantidad de una proteína. A continuación se proporcionan los datos obtenidos en un
estudio de expresión génica con lo s productos A, B y C. Haga la representación gráfica
de los datos y comente los resultados obtenidos razonando sus respuestas. En esta
práctica el estudiante debe emplear los conocimientos adquiridos a lo largo del grado,
especialmente lo aprendido en materias como Biología, Matemáticas, Estadística o
Técnicas Instrumentales. Datos obtenidos (“Rep.” indica réplica):

1ª Parte: En primer lugar, agrupamos todos los datos que tenemos haciendo la media de las 3
repeticiones que se hacen de cada experimento para cada una de las muestras. Luego
representamos esos valores medios (uno para cada experimento) en un diagrama de
columnas.

Gen 1
EXP 1 EXP 2 EXP 3
Control 17,85 18,00 17,24
Comp A 0.1 mg/L 24,02 24,11 25,41
Comp A 1 mg/L 25,66 27,11 24,32
Comp A 10 mg/L 26,68 23,85 25,51
Comp B 0.1 mg/L 26,08 23,34 25,74
Comp B 1 mg/L 33,38 35,17 34,36
Comp B 10 mg/L 52,55 55,44 54,99
Comp C 0.1 mg/L 22,68 22,67 22,08
Comp C 1 mg/L 10,26 10,49 10,54
Comp C 10 mg/L 5,43 5,20 4,88

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 Prácticas de Toxicología Ambiental y Salud Pública – 2017-18

Gen 2
EXP 1 EXP 2 EXP 3
Control 74,05 73,40 72,51
Comp A 0.1 mg/L 72,93 77,41 72,22
Comp A 1 mg/L 72,65 73,68 72,31
Comp A 10 mg/L 22,93 25,91 24,69
Comp B 0.1 mg/L 76,78 76,35 72,78
Comp B 1 mg/L 67,98 67,18 66,41
Comp B 10 mg/L 42,56 41,81 41,26
Comp C 0.1 mg/L 72,42 72,19 70,82
Comp C 1 mg/L 96,58 97,75 97,70
Comp C 10 mg/L 107,41 109,39 111,07

Gen 3
EXP 1 EXP 2 EXP 3
Control 168,23 164,22 164,72
Comp A 0.1 mg/L 168,37 167,58 165,77
Comp A 1 mg/L 225,71 222,35 226,00
Comp A 10 mg/L 402,98 408,55 403,49
Comp B 0.1 mg/L 75,33 74,10 75,38
Comp B 1 mg/L 214,80 218,45 212,63
Comp B 10 mg/L 385,53 387,95 381,20
Comp C 0.1 mg/L 165,16 162,06 161,04
Comp C 1 mg/L 167,31 165,41 162,93
Comp C 10 mg/L 167,66 166,33 164,47

17
 Prácticas de Toxicología Ambiental y Salud Pública – 2017-18

2ª Parte:

Se ha estudiado también el efecto que tiene la mezcla de los productos D y E. La gráfica de

los resultados obtenidos se muestra a continuación. Comente los resultados de las
gráficas en relación a la interacción que puede darse y el efecto que tiene la mezcla en la
expresión del gen.

50 En el eje de ordenadas se muestra el valor en

unidades arbitrarias de la medida de expresión
40 del gen. En el eje de abscisas se muestran las
concentraciones empleadas siendo la mezcla
Arbitrary units

30 preparada con las mismas cantidades de cada

producto, es decir, 0.1 mg/L significa que hay
20 0.1 mg/L de producto D y 0.1 mg/L de producto
E.
10
Se representan los datos por medio de Whisker
0 Boxes y el círculo indica la media.
C 0.1 1 10 0.1 1 10 0.1 1 10 [mg/L]

Producto D Producto E Producto D+E

18
 Prácticas de Toxicología Ambiental y Salud Pública – 2017-18

Producto D: Aunque al añadir el producto la expresión del gen disminuye respecto a la muestra de
control, a medida que se incrementa la concentración del producto, esta vuelve a subir. Vemos
también que a menos concentración del producto, menor es la dispersión de los datos. Es
decir, que hay menos diferencia entre el mínimo y el máximo. A la concentración máxima, el
dato superior (no atípico) es mucho mayor y está más lejos de la media que a concentraciones
más bajas.

Producto E: Igual que con el producto D, la expresión del gen aumenta a medida que lo hace la
concentración del producto. Llama la atención el hecho de que para la concentración de 1 mg/L
el 50% central de los datos (el alcance de la “caja”) está muy compacto.

Mezcla de productos D+E: Cuando se mezclan los dos productos, la expresión del gen disminuye
cuando aumenta la concentración. Esto nos sugiere que existe un antagonismo químico entre
ambos productos. Es decir, que se inhiben mútuamente pasando a ser menos activos.
Además, se muestra una gran dispersión de los datos para la concentración de 1 mg/L.

Parece extraño que el producto sea más potente a dosis pequeñas que a dosis elevadas, sin
embargo existe un ejemplo contemporáneo de un efecto similar en la vacuna del COVID-19 de
Astra Zeneca, que utiliza un vector viral: un adenovirus. A pequeñas concentraciones es efectiva
pero, si se administra una dosis demasiado elevada, el sistema inmune reacciona con tanta fuerza
que el adenovirus no invade las células y no genera las proteínas Spike del SARS-Cov-2. Sin
tener más datos sobre el contexto, se me ocurre que podría estar sucediendo algo similar. A
pequeñas dosis del producto, la respuesta inmune no sería tan fuerte y este podría actuar con
más potencia, mientras que a grandes dosis activaría la primera y tanto el producto (D o E) como
la mezcla serían inhibidos y la expresión del gen regresaría a los valores normales del control.

19
 Prácticas de Toxicología Ambiental y Salud Pública – 2017-18

5.5 A continuación se muestran distintas gráficas obtenidas con un producto X.

Gráfica 1
Gráfica 2
18
175
16
Actividad (K/gr proteína)

14 150
12
125
10
8
100
6

(µg/L)
4 75

2
50
0
CAT SOD GPx TXN
25
0h 6h 12h 24h 48h

0
CAT: catalasa 0h 12h 24h 36h 48h 60h 72h 84h 96h
SOD: superóxido dismutasa -25
Tiempo
GPx: glutation peroxidasa
TXN: tiorredoxina

Gráfica 3 Gráfica 4
C 0.01 mg/L 0.1 mg/L 1 mg/L % Puestas viables
60 100%

50
Unidades arbitrarias

75%
40
50%
30
25%
20

10 0%

0
Proteína I Proteína II Proteína III

1. ¿Qué análisis se está realizando de acuerdo con la gráfica 1? Razone su respuesta.

Se analiza la evolución en el tiempo de la actividad de 4 enzimas diferentes, al ser expuestas a un

determinado compuesto:
- CAT: Catalasa (enzima perteneciente a la categoría de las oxidorreductasas que cataliza la
descomposición del peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua). Esta aumenta tras las primeras
48h de exposición al compuesto
- SOD: Superóxido oxidasa. Aumenta de forma constante, aunque a partir de las 12h se mantiene
relativamente estable.
- GPX: Glutatión peroxidasa. Aumenta de forma constante tras las primeras 6h.
- TXN: Tiorredoxina. Aumenta levemente a partir de las 24h desde la exposición-

20
 Prácticas de Toxicología Ambiental y Salud Pública – 2017-18

2. Se quiere utilizar este producto en un ensayo de toxicidad acuática pero no existe

posibilidad de realizar un ensayo de flujo. Un estudio previo proporcionó los datos que se
muestran en la gráfica 2 en relación a la degradación del producto. Indique cómo realizaría
un ensayo de toxicidad de una semana de duración para evaluar el daño sobre el desarrollo
en una especie con larvas acuáticas. Razone su respuesta.

En la gráfica 2 se observa que el producto se degrada en su totalidad transcurridas 96h. Por lo

que, para evaluar el daño sobre el desarrollo de una especie con larvas acuáticas, habría que
realizar diferentes exposiciones al producto a lo largo de los días, intentando mantener el nivel
constante añadiendo el producto necesario para compensar la degradación.

3. Al analizar los niveles de tres proteínas en adultos de una especie de molusco de agua
dulce se obtuvieron los datos de la gráfica 3. Los niveles del producto estudiado en el
ambiente de este organismo oscila entre 1 nM y 1 µM (MW = 228.29). ¿Cuál de las tres
proteínas seleccionaría como biomarcador para valorar los efectos? Razone su respuesta.

La proteína 1, puesto que es la que responde con mayor intensidad al producto.

4. En la gráfica 4 se muestra un ensayo realizado sobre una especie de insectos y con el
producto X. En el ensayo se tratan el mismo número de larvas durante el mismo tiempo con
las concentraciones indicadas, ¿qué conclusión obtiene de los datos? Razone su
respuesta.

Para dosis mayores a 0,1 nM, el número de puestas viables empieza a descender
considerablemente, no alcanzando ni el 25% para 100 nM. Se deduce que el producto es tóxico
para esta especie de insectos y que por lo tanto, su número de puestas, podría ser un
bioindicador de la presencia del producto.

5.6 Empleando como referencia lo aprendido en los ejercicios previos y las bases de datos
utilizadas, elabore el informe final de un ensayo de toxicidad para evaluar el daño crónico en
un test semi-estático. El compuesto a evaluar es fenaminstrobin ((2E)-2-(2-{€-((2E)-3-(2,6-
dichlorophenyl)-1-methylprop-2-enylidene)aminooxymethyl}phenyl)-2-(methoxyimino)-N-
methylacetamide) y el ensayo se realiza con una de las especies siguientes: Artemia
franciscana o Lymnaea stagnalis (el estudiante debe seleccionar una de ellas). En el mismo
debe incluir los materiales y métodos que emplea en el ensayo (información sobre la especie
y su ciclo vital, número de individuos usados por concentración, fase del ciclo empleada,
composición del medio a emplear, propiedades físico-químicas del producto estudiado), las
condiciones del ensayo (concentraciones a emplear y forma de selección de las mismas,
parámetros a evaluar en el ensayo, periodos de toma de datos, criterio de evaluación,
metodología de análisis de datos, análisis estadísticos empleados, cómo mostrar los datos) y la
información de los resultados que debe mostrarse al lector (realizar en un máximo de dos
caras de A4). Para un mejor desarrollo del ejercicio pueden crearse datos ficticios.

21
 Prácticas de Toxicología Ambiental y Salud Pública – 2017-18

Materiales y métodos

ESPECIE UTILIZADA

La especie escogida para el estudio es la Lymnaea stagnalis. Lymnaea stagnalis, comúnmente

denominado gran caracol de estanque, es una especies de gran caracol de agua dulce, un
molusco gasterópodo acuático pulmonado en la familia Lymnaeidae. Es una especie hermafrodita
simultánea y puede aparearse en el rol masculino y femenino, pero dentro de una cópula solo se
realiza un rol sexual a la vez.

Su mantenimiento se llevará a cabo en una cámara con temperatura controlada de 19±1 ºC,
aireación constante y un fotoperiodo de 16:8 horas de luz:oscuridad.

El ciclo de vida de este invertebrado dura de 3 a 4 meses en condiciones de laboratorio, si bien su

longevidad en laboratorio puede alcanzar el año. El cultivo se inicia con la recuperación de las
masas de huevos y su subsiguiente cultivo en vasos de precipitado con aireación. Tras la
eclosión, los juveniles se alimentan ad libitum con comida en polvo, la cual se va sustituyendo
progresivamente por comida para adultos, hasta alcanzar los 1,2 mg/caracol. Una vez que estos
han alcanzado el tamaño de adultos, son trasladados a vasos de vidrio (por ser químicamente
inerte) de 2 litros de capacidad que contienen medio de cultivo, permitiendo la puesta de huevos.
La composición del medio de cultivo será la siguiente:

CaCl2 2 mM,
MgSO4 0.5 mM,
NaHCO3 0.77 mM,
KCl 0.08 mM

COMPUESTO A ANALIZAR

Fenaminstrobin (2E)-2-(2-{(E)-((2E)-3-(2,6-dichlorophenyl)-1-methylprop-2-
enylidene)aminooxymethyl}phenyl)-2-(methoxyimino)-N-methylacetamide. Se trata de un fungicida
que mata o inhibe el crecimiento de los hongos en aplicaciones de la agricultura, sobre madera,
plástico u otros materiales. Su peso molecular es de 434,3 g/mol.

CONDICIONES DEL ENSAYO

Análisis de la supervivencia

Los efectos letales del compuesto se estudiaron tras exposiciones de 96 horas a un gradiente de
concentraciones (20, 200, 500 y 5000 µg/L), haciendo recuentos del número de individuos vivos
cada 24 horas. Se realizaron tres experimentos independientes, empleando 50 individuos por
cada concentración estudiada.

Análisis de los niveles de expresión génica

Los efectos del compuesto sobre la actividad transcripcional se evaluaron exponiendo tres adultos
por réplica a 20 y 200 µg/L durante 24 horas, tras lo cual se almacenaron a -80 ºC hasta el
momento de proceder a la extracción de su ARN.

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 Prácticas de Toxicología Ambiental y Salud Pública – 2017-18

Análisis de la genotoxicidad (ensayo cometa)

Se estudiaron los efectos genotóxicos mediante el ensayo cometa, a partir de suspensiones

celulares de 13 individuos expuestos durante 24 horas a 20 y 200 µg/L.

RESULTADOS

Efectos en la supervivencia

Los resultados muestran que para las concentraciones más bajas (<=200 µg/L) no se observa la
muerte de los individuos transcurridas 96h. Sin embargo, a partir de esta concentración, la
supervivencia disminuye hasta alcanzar una tasa de letalidad del 75% para la concentración más
elevada (5000 µg/L) en un periodo de 24h y del 100% en 48h.

Efectos en los niveles de expresión génica

Observamos una disminución estadísticamente significativa de la actividad transcripcional de

Hsp20.4 (una proteína perteneciente al grupo de las llamadas small heat shock proteins) a 20
µg/L. Aunque la Hsp16.6 y Hsp17 también disminuyeron, las diferencias no fueron
estadísticamente significativas.

Efectos en la genotoxicidad

El parámetro elegido del ensayo cometa fue el porcentaje de ADN en cola. Se observó que el
porcentaje de ADN en la cola muestra una inducción estadísticamente significativa cuando los
adultos se expusieron a una dosis no inferior a 200 µg/L .

23
 Prácticas de Toxicología Ambiental y Salud Pública – 2017-18

PRÁCTICA 6
BIBLIOGRAFÍA
A la hora de realizar un estudio toxicológico es importante tanto la aproximación práctica como
la teórica. En esta práctica se leerá un documento relacionado con aspectos toxicológicos de
interés. En el curso virtual se han incluido dos documentos de literatura científica de los cuales
debe seleccionarse uno para contestar las preguntas correspondientes que se encuentran a
continuación. Las respuestas deben ser razonadas y no ser la traducción del texto.

Mixture toxicity revisited from a toxicogenomic perspective. Altenburger R, Scholz

S, Schmitt-Jansen M, Busch W, Escher BI. Environ Sci Technol. 2012 46(5):2508-22.
doi: 10.1021/es2038036.

1.- Haga un resumen del artículo.

La publicación proporciona una descripción general sobre estudios de la última década que
abordan el diagnóstico y/o las cuestiones sobre los efectos combinados de mezclas químicas
mediante técnicas toxicogenómicas. Postula que la mayoría de los estudios de mezclas se
diseñan comparando el resultado del efecto de la mezcla con el resultado de los componentes
individuales, y que este enfoque se queda anticuado en frente a nuestra comprensión actual de la
actividad biológica conjunta en los niveles de interacciones químicas y efectos combinados. Su
objetivo es dar lugar a un marco conceptual que ayude a superar la limitación actual de
proporcionar principalmente evidencia anecdótica sobre los efectos de la mezcla. Para lograrlo,
sugieren:
1. Diseñar estudios que establezcan relaciones cuantitativas entre dosis y dependencia del
tiempo de las respuestas.
2. Empezar a adoptar modelos de toxicidad mixta.

Además, defienden que la utilización de nuevos métodos bioinformáticos y los conceptos de

respuesta al estrés podrían ser productivos para traducir múltiples respuestas a hipótesis sobre
las relaciones entre el estrés general y las reacciones específicas de toxicidad de los organismos.
El objetivo del estudio es proporcionar una amplia revisión de los primeros pasos realizados para
abordar los problemas de las mezclas toxicológicos utilizando enfoques toxicogenómicos

2.- Explique la figura 1 del artículo.

24
 Prácticas de Toxicología Ambiental y Salud Pública – 2017-18

La figura mencionada pretende mostrar la estructura de los estudios toxicogenómicos de las

mezclas. Se separan los procesos toxicogenómicos y toxicodinámicos, que determinan la relación
dosis-respuesta. Para la hipótesis nula de compuestos que no interactúan, los modelos de mezcla
sugerirían que las respuestas toxicogenómicas combinadas pueden explicarse por adición de
concentración o modelos de acción independientes.

3.- ¿Qué recomendaciones hacen los autores para la utilización de las aproximaciones
toxicogenómicas en la evaluación de mezclas?

Los autores afirman que es esencial organizar los datos para su visualización y análisis en forma
agregada preparándolos para interpretación. Para cumplir este objetivo, disciernen tres grande
smétodos.

Primero, técnicas gráficas como diagramas de Venn, mapas de calor o pliegues gráficos de
expresión.

Segundo, métodos estadísticos como el agrupamiento jerárquico, la regresión lineal de la

intensidad de la señal frente a la concentración o el tiempo, técnicas de variación, correlación o
multivariante como el análisis de componentes principales (PCA).

Finalmente, las publicaciones más recientes utilizan herramientas bioinformáticas como el

agrupamiento en términos de ontología genética, el análisis de enriquecimiento de conjuntos de
genes o las conexiones de red, que se utilizaron para consultar observaciones para información
resumida biológicamente significativa.

Test

RESPUESTAS

OPCION 1
1 C
2 A
3 C
4 B
5 D
6 D
7 A
8 D
9 D
10 A

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 Prácticas de Toxicología Ambiental y Salud Pública – 2017-18

Exposure-driven risk assessment: applying exposure-based waiving of toxicity

tests under REACH. Rowbotham AL, Gibson RM. Food Chem Toxicol. 2011,
49(8):1661-73. doi: 10.1016/j.fct.2011.03.050.

1.- Haga un resumen del artículo

El Reglamento REACH 1907/2006/EC tiene como objetivo mejorar el conocimiento de los riesgos
potenciales para los seres humanos y el medio ambiente de los productos químicos producidos y
utilizados en la UE. Pero es probable que los requisitos de estos ensayos desencadenen en
millones de experimentos con animales, a pesar del objetivo declarado de REACH de reducir las
pruebas con vertebrados. Por ello se sugiere sustituir los ensayos con animales por otros
métodos, reservando las pruebas con animales para las sustancias de mayor preocupación. Un
enfoque consistiría en renunciar a ciertas pruebas basadas en los niveles de exposición a la
sustancia. El artículo explora la aplicación de la "exención basada en la exposición" (EBW) de los
estudios de toxicidad. La incorporación de la EBW en las pruebas necesarias para el registro de
sustancias podría promover los objetivos de REACH y las 3R (reducción, reemplazo y
refinamiento de animales en investigación) al reducir el uso de animales en ensayos de toxicidad,
manteniendo al mismo tiempo una protección adecuada de la salud humana y el medio ambiente.
Sin embargo, se requiere una mayor evaluación, aceptación y orientación regulatoria para que
EBW logre todo su impacto.

2.- Explique la figura 3 del artículo.

26
 Prácticas de Toxicología Ambiental y Salud Pública – 2017-18

La figura muestra un diagrama de flechas de aplicación del protocolo TTC (Threshold of

Toxological Concern) aplicada al reglamento REACH. Se trata de una herramienta basada en la
ciencia para priorizar aquellas sustancias que podrían presentar efectos tóxicos para los humanos
y que requieren más estudios para confirmarlo sobre aquellas que parecen no presentar efectos
importantes sobre la salud humana. En la figura se comparan la exposición estimada (EE) y la
TTC, llegando a diversas conclusiones según si la una es mayor que la otra.

3.- Resuma las conclusiones a las que llegan los autores.

Uno de los principales beneficios de utilizar EBW y un enfoque TTC en la evaluación del riesgo
para la salud humana es que las pruebas de toxicidad innecesarias y las evaluaciones de
seguridad podrían evitarse si la ingesta humana estuviera por debajo de los umbrales pertinentes.

Cuando está respaldada por argumentos sólidos, la EBW (“adaptación basada en la exposición”)
podría ser una herramienta muy valiosa aplicada al reglamento REACH. A día de hoy ya sería
posible implantarla para productos químicos con propiedades particulares o que sean
utilizados de forma que se limite claramente la exposición humana (por ejemplo, en sistemas
cerrados o artículos particulares). En el futuro, si los reguladores pueden desarrollar, validar y
aceptar enfoques, la EBW podría constituir un componente importante de una estrategia de
prueba más inteligente y que haría el mejor uso de toda la información disponible sobre una
sustancia, incluido el conocimiento existente de los peligros y usos de la sustancia química,
información de pruebas in vitro, extrapolación, relaciones estructura-actividad...

Esto permitiría cumplir el compromiso de REACH y las 3R (reducción, reemplazo y refinamiento

de animales en la investigación) al reducir significativamente el uso de animales de laboratorio en
pruebas de toxicidad, manteniendo al mismo tiempo una protección adecuada de la salud humana
y el medio ambiente.

Se concluye que el reglamento REACH necesitaría un enfoque más pragmático si realmente

quiere cumplir sus objetivos y reducir las pruebas en animales.

Test

RESPUESTAS

OPCIÓN 2
1 B
2 A
3 B
4 A
5 C
6 C
7 D
8 B
9 D
10 B

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