LA ESPECTROMETRIA DE MASAS COMO HERRAMIENTA EN LA DETERMINACIÓN DE

ESTRUCTURAS
Alicia M. Seldes# y Gabriela M. Cabrera

Departamento de Química Orgánica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de

Buenos Aires, Ciudad Universitaria, Pabellón II, 1428 Buenos Aires, Argentina. E-
mail:gabyc@qo.fcen.uba.ar

Se presentarán las aplicaciones más relevantes de la espectrometría de masas en la

determinación estructural de moléculas. Se orientará principalmente a:
- Determinación del Peso Molecular
- Determinación de la Fórmula Molecular
- Identificación de compuestos por comparación con bibliotecas de espectros
- Estudio de la presencia de subunidades estructurales
- Determinación de la posición de dobles enlaces
- Determinación de la presencia de componentes específicos en extractos crudos

Determinación del Peso Molecular

Un dato fundamental en toda elucidación estructural es el peso molecular (PM). Esta
información permite conocer la fórmula molecular y es esencial para determinar, junto con los
espectros de RMN, la identidad de un compuesto.
La forma más sencilla de obtener este dato es hacer un espectro de masas por la técnica de
ionización por electrones. Esta técnica es útil para compuestos volatilizables, por lo tanto no
termolábiles y de peso molecular generalmente inferior a 500 u.
En la figura 1 se muestra el espectro de masas obtenido de 1-(3-cloro-4-metoxifenil)-propan-
1,2-diol aislado del medio de cultivo del hongo Bjerkandera adusta1. Como puede verse en el
+•
espectro, el ion molecular m/z 216 (M ) es de baja intensidad. La correcta asignación de este ion
es importante para obtener el dato de PM y para la interpretación del espectro.
Para cualquier ion molecular se debe verificar que:
− Sea el ion de mayor masa que el compuesto pueda producir, teniendo en cuenta los isótopos
naturales más abundantes de los elementos que componen la molécula.
− El valor numérico de su masa sea par cuando en la molécula no haya nitrógeno o haya un
número par de nitrógenos y sea impar cuando la molécula contenga un número impar de nitrógenos.

#
fallecida el 23 de enero de 2003.
1
Levy LM, Cabrera GM, Wright JE, Seldes AM; Molecules 5, 354 (2000).

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CYTED
 − Las diferencias de masa entre el ion molecular y los fragmentos iónicos importantes sean
lógicas desde el punto de vista químico.

OH

OH
H3CO
Cl

Figura 1. Espectro de Masas obtenido por Ionización por electrones a 70 eV.

En el espectro de la figura 1 se observa que el ion m/z 216 está acompañado por el ion m/z
218 de un tercio de intensidad, lo cual es coherente con la presencia de un cloro en la molécula
35 37
( Cl y Cl). Estos iones son pares, lo que concuerda con el hecho de que no tienen nitrógeno. Se
observan los fragmentos m/z 171 y 173 que corresponden a la fragmentación β al anillo aromático
+ + +
(M–OCH2CH3) y los fragmentos m/z 143, (m/z 171 – CO) , y 145, (m/z 173 – CO) . En ambos
pares se observa la relación de intensidad 3:1, característica de la presencia de un átomo de cloro.
Se observan además fragmentos característicos de anillo aromático unido a O, a m/z 108 y los
fragmentos aromáticos característicos m/z 77, 65 y 51.
Cuando el ion molecular es muy pequeño en abundancia y para confirmar su identidad se
puede realizar el espectro a 25 eV en lugar de 70 eV, que es el potencial de ionización aplicado
cuando se quiere obtener mayor grado de fragmentación. El resultado se observa en la figura 2.
Como puede observarse, el ion molecular tiene una intensidad de cerca del 15%, en lugar del 7%
obtenido a 70 eV. Con esta técnica suele verse un incremento en la intensidad del ion molecular y
una disminución de la intensidad de los fragmentos de masas bajas, que no son importantes desde el
punto de vista diagnóstico, ya que representan iones simples, productos de múltiples

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fragmentaciones. No todos los espectrómetros que trabajan a 70 eV permiten la modificación del
potencial de ionización.

OH

OH
H3CO
Cl

Figura 2. Espectro de Masas obtenido por Ionización por Electrones a 25 eV.

Otra técnica que permite obtener un incremento sustancial en la intensidad de los ¨iones
moleculares¨ es la técnica de Ionización Química, en la cual la muestra es bombardeada por iones
de un gas reactivo en lugar de electrones. Por esta técnica se observan los iones cuasimoleculares
+ +
(M+H) o aductos (M+X) donde X= Et, NH4, NO, etc, o mezclas de ambos, dependiendo del gas
+
reactivo utilizado (CH4, NH3, NO respectivamente). Con NO también se observa el (M-H) ya que
la afinidad protónica (AP) del NO es mayor que la de la mayoría de los compuestos orgánicos. En
la tabla 1 se muestra la identidad de los iones cuasimoleculares más comunes que se obtienen según
sea el gas reactivo utilizado.
Tabla 1. Iones cuasimoleculares observados en modo positivo para los gases reactivos más
empleados.

Gas reactivo Especie reactiva Ion cuasimolecular observado Mecanismo

+
CH4 CH5+ [M+H] Transferencia protónica
+
[M-H] (M = alcanos) Transferencia de hidruro
+
[M+C2H5] Formación de aductos
+
HC(CH3)3 (CH3)3C+ [M+H] Transferencia protónica
+
[M-H] (M = alcanos y Transferencia de hidruro
compuestos con AP<gas)
+
NH3 NH4+ [M+H] Transferencia protónica
+
[M+NH4] Formación de aductos
+
NO NO+ [M-H] Transferencia de hidruro
M •
+
Intercambio de carga

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 En la figura 3 se observa el espectro de masas del mismo compuesto que en las figuras
anteriores obtenido por Ionización Química, empleando CH4 como gas reactivo. Como puede
+
observarse, predominan además del (M+H) muy intenso, fragmentos provenientes de pérdidas de
+ +
moléculas neutras, en este caso (M-H2O) , m/z 199/ 201 y (M-C2H6O) , m/z 171/ 173. Las pérdidas
de moléculas neutras suelen dar origen a los únicos fragmentos observables por esta técnica y en
general a todas las técnicas de ionización suave. Se puede ver también en la figura 3 un ion m/z 245
+
de pequeña intensidad que corresponde a (M+Et) , característico del uso de CH4 como gas reactivo.
Este ion suele ser un buen ion diagnóstico para confirmar la identidad del ion cuasimolecular.

OH

OH
H3CO
Cl

Figura 3. Espectro de Masas obtenido por Ionización Química (CH4).

La selección de distintos gases reactivos puede conducir a la obtención de diferentes

fragmentaciones debido a sus distintas afinidades protónicas y propiedades fisicoquímicas en
general. Debido a este hecho, resultan más energéticas las colisiones con metano, más suaves las
obtenidas con isobutano y más aún con amoníaco, y por lo tanto el mayor grado de fragmentación
se dará en el orden inverso.

Cuando los compuestos a analizar son termolábiles, polares y/o de alto peso molecular
pueden emplearse otras técnicas como FAB (fast atom bombardment), MALDI (matrix assisted
laser desorption ionization) o ESI (electrospray ionization) en las cuales las muestras introducidas
en una matriz (FAB, MALDI) o disueltas en el solvente apropiado (ESI) son impactadas por átomos

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o iones rápidos (FAB), por un láser (MALDI) o son ionizadas por asistencia de un campo eléctrico
(ESI).
Los espectros de la figura 4 fueron realizados por la técnica FAB usando una matriz de glicerol en
modo negativo y positivo respectivamente. Como la molécula, aislada de una estrella de mar, es una
-
sal (PM=272), en modo negativo se observa el anión respectivo ROSO3 , m/z 249, mientras que en
+ +
modo positivo se observan los iones (M+Na) a m/z 295 y (M+K) a m/z 3112 . La presencia de
moléculas preionizadas favorece la desorción, por lo cual el agregado de sales en una proporción
adecuada es ventajoso. Una cantidad excesiva de sal suprime la ionización. El agregado de sales es
una práctica común cuando se trabaja con glicósidos.

- +
O SO3 Na

- +
Figura 4. a) Espectro FAB (matriz glicerol), b) Espectro FAB (matriz glicerol+NaI)

2
Roccatagliata AJ, Maier MS, Seldes AM, Zea S, Duque C; J. Nat. Prod. 60, 285 (1997).

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 La elección de la matriz en FAB juega un importante papel. El glicerol o el tioglicerol se usan
en forma genérica para distintos tipos de compuestos, tanto en modo positivo como negativo. En
modo positivo se usan también m-nitrobencilalcohol (NBA) y ditiotreitol/ditioeritritol (magic
bullet), y en modo negativo trietanolamina (TEA) y 3-aminopropan-1,2-diol.
En los espectros obtenidos por las técnicas que emplean matriz hay que tener en cuenta que
pueden observarse, además de los iones característicos, iones correspondientes a (PMmuestra +
PMmatriz)+ y (n x PMmatriz)+ en modo positivo y (n x PMmatriz – 1)- en modo negativo. En la técnica
FAB, dependiendo de la concentración de muestra, pueden observarse también iones del tipo (2 M
+ 1)+. Todos estos iones pueden conducir a establecer un valor erróneo del PM y por lo tanto, deben
tenerse en cuenta los resultados de RMN (número de C, número de H, número aproximado de
heteroátomos) como una guía estimativa del rango de PM esperado.
En la figura 5 se observa el espectro FAB en modo positivo del compuesto aporpinona A de
PM 208, aislado del cultivo del hongo Aporpium caryae3. En dicho espectro puede distinguirse la
presencia del ion m/z 417, correspondiente a (2 M + 1)+, que podría equívocamente inducir a
determinar que la molécula es un dímero.

O O OH

OH

Figura 5. Espectro FAB+ de Aporpinona A (matriz: glicerol)

3
Levy LM, Cabrera GM, Wright JE, Seldes AM; Phytochemistry 62, 239 (2003).

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Determinación de la Fórmula Molecular

Una vez determinado el PM de un compuesto es necesario determinar la fórmula molecular

correspondiente. Para ello se requiere el uso de espectrometría de masas de alta resolución. Las
técnicas de ionización que más se emplean para realizar estas determinaciones son impacto
electrónico y FAB. Existen numerosos centros de investigación en todo el mundo que prestan
servicios de este tipo.
A partir de la determinación de la masa del ion molecular con exactitud, y teniendo en
cuenta los pesos atómicos, se establecen matemáticamente las posibles formulas moleculares. En
este punto es de suma importancia la información previa adquirida por RMN de 1H y 13C, ya que si
pueden limitarse el número de H y C, el número de las posibles fórmulas se reduce
considerablemente.

Tabla 2. Resultados de la determinación con alta resolución por EI de la masa del ion m/z 208 de
aporpinona A. DBE representa el número de insaturaciones. Notar que debe ser un valor entero para
un ion molecular.

En la tabla 2 puede observarse el informe que se elaboró sobre la base de la determinación

con alta resolución por EI de la masa del ion m/z 208 de aporpinona A. Se observa en el mismo el
valor obtenido para dicha masa, m/z 208.07349 y las diferencias observadas para ese valor
experimental con respecto de valores teóricos calculados para distintas fórmulas moleculares. En

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este caso particular se acotaron solamente la cantidad de átomos de N y O a un máximo de 6 y 5
respectivamente, para reducir el listado. Una diferencia de 5 ppm o menor entre valores
experimentales y teóricos se considera adecuada.

Identificación de compuestos por comparación con bibliotecas de espectros

Existen numerosos programas de computación que permiten relacionar datos de un espectro

de masas (m/z e intensidad) con datos de una biblioteca de espectros de masas para determinar la
posible identidad de un compuesto. Las bibliotecas de espectros son bases de datos con una gran
cantidad de espectros obtenidos por ionización por electrones a 70 eV, es decir que hasta el
momento sólo pueden compararse espectros realizados por esta técnica. Además, tanto las
bibliotecas como los programas son privadas y no son de acceso libre. Existe una base de datos
(NIST) de constantes físicas de compuestos, que incluye espectros de masas, que es de acceso
gratuito, aunque previo registro. Pertenece al Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (The
National Institute of Standards and Technology, NIST4), pero la comparación debe hacerse
manualmente.
Los programas comparan un espectro nuevo con los que tiene almacenados a través de
parámetros, y determinan cual es el espectro que más se le asemeja dentro de ellos, estableciendo un
porcentaje de similitud, que es dependiente de los parámetros predeterminados para la comparación.
La comparación se realiza a través de cierto número de iones de la relación m/z de mayor
intensidad, pudiéndose predeterminar el número, eliminar alguno o varios y cambiar la intensidad
mínima requerida de ellos. La computadora realiza inicialmente un filtrado de todos aquellos
espectros que son muy diferentes y finalmente procede a un búsqueda fina, sugiriendo posibles
estructuras para el analito desconocido.
En la figura 6a puede observarse un cromatograma gaseoso de un extracto crudo de un hongo,
de uno de cuyos picos (Rt 11.0 min) se muestra el espectro de masas en la figura 6b. Cuando se
realiza la búsqueda sobre este espectro se obtiene como resultado que la identidad del compuesto
puede ser 3, 4-dimetoxibenzaldehído o 3, 5-dimetoxibenzaldehído. Notar que prácticamente no hay
diferencia entre ellos, lo cual es lógico ya que los isómeros de posición no pueden diferenciarse por
espectrometría de masas.

4
NIST Chemistry WebBook, http://www.chemweb.com/databases/

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 a

Figura 6. Ejemplo de búsqueda en biblioteca de espectros (Masslynx-Micromass). a)

Cromatograma GL; b) Espectro de masas del pico de Rt 11.01 min; c y d) resultados de la
búsqueda.

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 Figura 7. Ejemplo de búsqueda en biblioteca de espectros (Class5K-Shimadzu).

Se observa en la figura 7 otro ejemplo de búsqueda realizado con un programa diferente.

Notar nuevamente que espectros de masas que son muy similares corresponden a compuestos con
estructuras diferentes. Este es un caso muy común cuando se analizan particularmente mono y
sesquiterpenos.
Una conclusión importante de este resultado es que hay que ser muy cuidadoso al interpretar
los resultados de las búsquedas, y que cuando no se dispone de otros datos de la muestra, tienen un
valor importante, pero orientativo.

Estudio de la presencia de subunidades estructurales

En el caso de péptidos, metabolitos que contienen aminoácidos como subunidades, y en

glicósidos es necesario determinar la secuencia en la que se hallan unidos los aminoácidos o
monosacáridos.

10

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 Empleando espectrometría de masas tándem es posible seleccionar como precursor al ion
[M+H]+, hacerlo colisionar con He en una cámara de colisión y observar sus fragmentaciones en un
segundo analizador.
Se muestran en la figura 7 los espectros FAB-EM/EM obtenidos de un glicósido de un
cardenólido de PM 986, aislado de la planta Mandevilla pentlandiana. Por análisis químico se sabía
que el glicósido contenía dos unidades de glucosa y dos de cimarosa (2,6-didesoxi-3-OMe hexosa)5.
Los PM de glucosa y cimarosa son 180 y 162, respectivamente, y la fragmentación
característica de pérdida de monosacárido en glicósidos es la pérdida de monosacárido menos H2O,
por lo cual deben buscarse fragmentos con pérdida de 162 u para glucosa y 144 u para cimarosa
(fig. 6). Como puede observarse en el espectro 7a, en modo positivo, hay numerosos fragmentos y
+
de difícil asignación. El ion m/z 437 se corresponde con [(Glc-Glc-Cym) + H – MeOH] y el m/z
+
519 con (M + H –2Glc-Cym) . En cambio, en modo negativo se observan fragmentos m/z 823 (M -
- - -
H – 162) , 661 (823 – 162) y 517 (661 – 144) . La pérdida consecutiva de dos glucosas y,
finalmente de una cimarosa, indica que la secuencia es glucosa-glucosa-cimarosa-cimarosa-
aglicona4.

CH2OH
O O aglicona

CH2OH OH
AH2+
O O H
OH OH
CH2OH
O O F3H2+
H
OH OH
CH2OH
O O F2H2+
OH H
OH

OH F1H2+
OH H
Figura 8. Fragmentaciones características de glicósidos.

5
Cabrera GM, Deluca ME, Seldes AM, Gros EG, Oberti JC, Crockett J, Gross ML; Phytochemistry 32, 1253
(1993).

11

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 a) O

OH
Glic-O
H

b)

-2 (162) - 144

+ -
Figura 9. a) Espectro FAB -EM/EM del ion m/z 987 (M+H)+ y b) Espectro FAB -EM/EM
del ion m/z 985 (M-H)-.

Hay numerosas técnicas de espectrometría de masas tándem que pueden emplearse para
determinar los iones hijo de un determinado ion precursor y todas pueden usarse para secuenciar6. A
veces es necesario usar en forma complementaria distintas técnicas de ionización para obtener toda
la información requerida.
En la figura 8 se observan los iones fragmento obtenidos por ESI-EM/EM y FAB-EM/EM del
ion precursor m/z 1631, correspondiente al ion (M+H)+ del péptido integramida A, aislado del
extracto del hongo Dendrodochium sp. Como puede advertirse, por ambas técnicas se obtienen
distintos fragmentos, aunque todos corresponden a rupturas α CO-N, características de péptidos7.

6
Mc Laferty FW. Tandem Mass Spectrometry. Wiley, New York, 1983.
7
Singh SB, Herath K, Guan Z, Zink D, Dombrowski A, Polishook JD, Silverman KC, Lingham RB, Felock
PJ, Hazuda DJ; Org. Lett. 4, 1431 (2002).

12

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CYTED
 m/z 368 m/z 580 m/z 750 m/z 948

m/z 142
O O
H m/z 1160
H N H O O
NH O O N N N
N NH O
O H H
N O O N
N H O m/z 665 HN
m/z 835
OH NH
HO m/z 467 O m/z 1245
m/z 255
O
O N

NH
O OH
HN
O m/z 1358
HO N
H
O
+ H ]+ m/z 1457
m/z 1556
m/z 1631
__
Figura 10. Fragmentos observados por ESI-EM/EM ( ) y FAB-EM/EM (---) del ion precursor m/z
1631.
Otra posible solución para subsanar la ausencia de fragmentos necesarios para establecer una
secuencia, es realizar espectrometría de masas tándem con iones fragmentarios en lugar de los iones
cuasimoleculares. En el ejemplo de la figura 8, podría haberse realizado ESI-EM/EM de los iones
de m/z 1457, 1160 y 255 para tratar de detectar los iones de m/z 1358, 948 y 142 respectivamente.
En realidad, en forma estricta, debería realizarse tándem sobre cada fragmento para asegurar la
relación de parentesco entre fragmentos sucesivos.

La espectrometría de masas es también una herramienta que permite determinar la posición

de subunidades estructurales en moléculas complejas, colaborando con la RMN en la elucidación
estructural.
En la figura 9 se presenta la estructura de pseudoanchynazina A (1), aislada de la esponja
Clathria sp., y uno de los productos de su metanólisis8. A pesar de que su estructura fue
determinada por RMN de la molécula entera y de sus productos de metanólisis, la ubicación del
etilo en posición 11´´ (*) resultaba no concluyente, debido a que las correlaciones correspondientes
en los espectros RMN 2D de larga distancia eran de muy baja intensidad. Por este motivo se realizó
un análisis detallado por espectrometría de masas tándem, sobre el producto de la metanólisis (2)
que se observa en la figura 9. El compuesto 2 presentó en su espectro de masas por EI, los iones de
m/z 508 (M+ •), 362 (pico base), 332 y otros fragmentos significativos. Por espectrometría de masas

8
Zuleta IA, Vitelli ML, Baggio R, Garland MT, Seldes AM, Palermo JA; Tetrahedron 58, 4481 (2002).

13

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de alta resolución se determinó la masa exacta, y por lo tanto la fórmula molecular, del fragmento
de m/z 362, que resultó ser C20H20N5O2. Esta fórmula era consistente con una estructura compuesta
por la molécula 2 fragmentada en el C-β de la cadena de triptofano (figura 9). Un espectro de iones
hijo del ion de m/z 362 presentó al ion m/z 332, con fórmula C18H14N5O2, establecida por alta
resolución. La diferencia entre ambas fórmulas corresponde a C2H6. Esta pérdida de etano, tan poco
frecuente, solamente podía ser explicada por la formación de un carbocatión muy estable, como se
esperaría en el caso de una fragmentación β a ambos anillos, indólico y pteridínico. Este resultado
confirmó la estructura planteada para el compuesto 1.

10'
O +
O CH2
7' N 5' O O
6'
8' NHC O
N N
*
9'
8a'
5a' N
H
* O H
N 4' 13'
1' N N N
3' N N
2' 11' 12'
N O
N O
O O O N
N O
O
O N α
m/z 362
H β C20H20N5O2
4
5 4a 3 12'' 13'' 2
2
1 11'' 4''
6
7a N 3'' N O
7 H 5a''
2'' 5''
1'' N N 6'' 10''
8a'' 8''
7''
N
9'' O
1
Figura 11. Pseudoanchynazina A (1), un producto de su metanólisis (2) y la posible
estructura del fragmento m/z 362.

Determinación de la posición de dobles enlaces

Cuando se realizan espectros de masas de compuestos que tienen dobles enlaces,

fundamentalmente en cadenas lineales, éstos pueden migrar en el proceso de la ionización, por lo
cual no es posible determinar su ubicación en la molécula. Se han desarrollado numerosas técnicas
para resolver este problema. Las técnicas clásicas se basan en la derivatización conveniente de los

14

Manual de Elucidación de Estructuras

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dobles enlaces y su posterior análisis por ionización por electrones. Son especialmente útiles los
derivados permetoxilados, sililados, etc9.
Se observó que en el caso de los derivados permetoxilados de ácidos grasos (fig. 10) al
realizar los espectros empleando ionización química con isobutano, se encontraban principalmente
los fragmentos diagnósticamente importantes10.

m/z 331
OCH3
OCH3 m/z 229
CO2CH3
7
H3C O OCH3
m/z 115
m/z 217

Figura 12. Iones diagnóstico obtenidos por ionización química con isobutano.

Empleando técnicas de espectrometría de masas tándem sobre sales de litio de ácidos grasos
en modo positivo, o de los correspondientes carboxilatos en modo negativo y colisionando con alta
energía, es posible observar fragmentaciones remotas de carga, por medio de las cuales se puede
determinar la posición de dobles enlaces11. En este caso, lo que se observa son fragmentos distantes
de 14 u correspondientes a las fragmentaciones con transferencia de H, que corresponden a
eliminaciones en paralelo de CH4, C2H6, etc, y que son producidas en las distintas posiciones de la
cadena alifática, excepto en aquellas posiciones ocupadas por el doble enlace y, en menor medida
las posiciones vinílicas. Se muestra en las figuras 11 y 12, el espectro FAB- EM/EM con alta
energía correspondiente al ácido oleico y la descripción de las fragmentaciones observadas en dicho
espectro, respectivamente.

9
Minnikin D E; Chem. Phys. Lipids 21, 313 (1978).
10
Suzuki M, Ariga T, Sekine E, Araki E, Miyatake T; Anal. Chem. 53, 985 (1981).
11
Gross M L. Int. J. of Mass Spectrom. & Ion Processes 116/119, 137-165 (1992).

15

Manual de Elucidación de Estructuras

CYTED
 Figura 13. Espectro FAB- EM/EM del ácido oleico.

m/z 237
H m/z 209
H m/z 181 m/z 113
H H
O-

H H O
m/z 195 m/z 127
H
m/z 223
Figura 14. Fragmentaciones remotas de carga observadas para el ácido oleico.

Determinación de la presencia de componentes específicos en extractos crudos

Conociendo las fragmentaciones características de familias de compuestos es posible analizar

la presencia de metabolitos en extractos crudos sin separación previa y con muy poca cantidad de
muestra.
Para realizar este análisis es necesario hacer espectrometría de masas-espectrometría de
masas seleccionando un ion precursor en el primer analizador, haciéndolo colisionar en una cámara
de colisión o en la misma fuente de ESI y observar los fragmentos característicos o las pérdidas
neutras preseleccionadas en el segundo analizador.
En la figura 13 se muestra el espectro ESI en modo negativo del extracto crudo de la
membrana celular de Lactobacillus acidophilus CRL 800. Se observa en la región de 700 a 850 u
una serie de iones que pueden corresponder, en función de sus pesos moleculares, a distintos
fosfatidildiacilgliceroles (PG).
Seleccionando cada ion en la región de masa determinada (en este caso m/z 730-840) y
haciéndolo colisionar con helio en una trampa iónica, se obtuvieron los correspondientes espectros

16

Manual de Elucidación de Estructuras

CYTED
 -
de iones producto, uno de los cuales, el correspondiente al ion m/z 788 (M – H) , se observa en la
figura 14.

O
sn-1
R1CH2 C O CH2
sn-2
R2CH2 C O CH O

O CH2 O P O CH2

- O CH OH

CH2 OH
PG-

-
Figura 15. Espectro ESI del extracto crudo de membrana de Lactobacillus acidophilus CRL 800.

Los iones m/z 431, 523 y 505, que se observan en la figura 14, corresponden a fragmentos, a
partir del precursor m/z 788, donde el ácido graso que se elimina, es el de la posición sn-2, mientras
que los iones m/z 417, 509 y 491 son los fragmentos equivalentes con eliminación del ácido en
12
posición sn-1 . Los iones m/z 431 y 417 son los fragmentos resultantes de la pérdida de 74 u
(C3H6O2 del glicerol) y RCO2H, los iones m/z 523 y 509 resultan de la pérdida de RCHO y H2O y
los iones m/z 505 y 491, la pérdida de RCHO, donde R es la cadena del ácido graso. Teniendo en
cuenta los valores numéricos de esos iones y las pérdidas que representan, es posible determinar que
el ácido graso que se encuentra en posición sn-2 es un ácido de 18 carbonos con una insaturación
mientras que el que se encuentra en posición sn-1 es uno de 19 carbonos con una insaturación.

12
Cabrera GM, Fernández Murga ML, Font de Valdez G, Seldes AM; J. Mass Spectrom. 35, 1452 (2000).

17

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CYTED
 De esta forma, seleccionando uno a uno cada ion observado en el espectro de la figura 13 es
posible determinar la estructura de todos los fosfolípidos presentes en el extracto crudo.

O
sn-1
R1CH2 C O CH2
sn-2
R2CH2 C O CH O

O CH2 O P O CH2

- O CH OH

CH2 OH
PG-

-
Figura 16. Espectro de iones producto del ion precursor de m/z 788 [M – H] del extracto de
Lactobacillus acidophilus CRL 800 obtenido por ESI-EM/EM.

Cabe destacar que la muestra cruda también contenía glicolípidos y glicéridos que no se
detectaron en modo negativo, mientras que sí lo hicieron en modo positivo. Efectuando un análisis
similar por FAB+ EM/EM se determinó la composición de dichos componentes.

Otra forma de obtener este tipo de información, cuando se conocen las fragmentaciones
características de los compuestos cuya presencia se quiere determinar, es seleccionar en un segundo
analizador un fragmento común a dichos compuestos, colisionar los iones entre el primer y el
segundo analizador, y realizar un barrido en el primer analizador (barrido de padres). De este modo
se obtiene un espectro en el cual se observan todos los iones precursores que se fragmentan dando
el fragmento seleccionado. Por ejemplo, las catequinas producen un fragmento m/z 125
correspondiente al anillo A (figura 15).

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 HO OH
_

OH
Figura 17. Ion m/z 125 característico de catequinas.

Cuando se selecciona este ion en el segundo analizador y se realiza un barrido de m/z en el

primero, se obtiene un espectro en el cual aparecen todos los iones que dieron origen al ion m/z 125,
-
es decir todos los (M-H) donde M representa a todos los pesos moleculares de las catequinas
presentes. De esta forma es posible determinar la presencia de catequinas en extractos crudos. Una
vez identificados los pesos moleculares de todas las catequinas presentes se puede analizar cada uno
como en el ejemplo anterior y estudiar las fragmentaciones de cada uno para intentar determinar sus
estructuras13. Además, todas las catequinas que contienen ácido gálico se fragmentan dando (M – H
-
– 152) , donde 152 es el PM del ácido gálico – H2O. Por lo tanto, se pueden determinar los PM de
todas las galatocatequinas, presentes en un extracto, buscando la pérdida neutra de 152. Para
realizar esto, en un triple cuadrupolo se puede hacer un barrido en el cual el primer y tercer
cuadrupolo se desfazan 152 u, se colisiona en el segundo cuadrupolo y se obtiene como resultado
un espectro en el que aparecen todos los iones que fragmentan perdiendo 152 u, es decir aparecen
todos los pesos moleculares (menos H) de las galatocatequinas (barrido de pérdidas neutras).

OH
OH CO2H
HO O

OH HO OH
OH OH

Figura 18. Catequina y ácido gálico.

Se puede comprobar a partir de estos ejemplos que conociendo las fragmentaciones de los
compuestos de interés, es posible planificar un gran número de estrategias y experimentos para
obtener información estructural importante aún partiendo de pequeñas cantidades de extractos
crudos.
Es importante mencionar que todas los experimentos planteados en este capítulo pueden
aplicarse tanto a muestras que se introducen en forma directa, como a picos cromatográficos,
eluídos tanto de GC como de HPLC. El sistema de introducción de la muestra se elige de acuerdo a

13
Miketova P, Schram K H, Whitney J, Li M, Huang R, Kerns E, Valcic S, Timmermann B N, Rourick R,
Khlor S; J. Mass Spectrom. 35, 860 (2000).

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las características particulares de la muestra a analizar, y simplemente debe ser compatible con el
método de ionización y el analizador empleados.

La espectrometría de masas es una técnica espectroscópica que después de muchos años de su

descubrimiento, se encuentra hoy en día en pleno desarrollo y modernización. El último desafío es
la puesta a punto de técnicas que permitan el análisis sin purificación previa de compuestos de alto
peso molecular, 100000 Da o más, y efectuar in situ la secuenciación de los mismos. Por otra parte,
su utilización como reactor para estudios cinéticos, de reordenamiento y de formación de iones en
fase gaseosa está efectuando aportes que no se han logrado por la vía húmeda.

Bibliografía general:

Gottlieb O; Introducción a la espectrometría de masa de sustancias orgánicas. Monografía n° 17. OEA.

(1976).

Mc Lafferty FW, Turecek F; Interpretation of Mass Spectra. 4th Ed. Univ. Science Books, 1993.
Davis R, Frearson M; Mass Spectrometry. John Wiley and Sons, 1987.

Chapman JR; Practical Organic Mass Spectrometry. 2nd Ed. J. Wiley and Sons, 1993.
Rose ME, Johnstone RAW. Mass Spectrometry for Chemists and Biochemists. Cambridge University Press,
1982.
Budzikiewicz H, Djerassi C, Williams DH; Mass Spectrometry of Organic Compounds. Holden Day Inc.,
1967.
Hoffman EDe, Charette J, Stroobant V; Mass Spectrometry. Principles and Applications. J. Wiley and Sons,
1996.

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